專利名稱：一種全人源抗vegf抗體、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種全人源抗體、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
腫瘤尤其是惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二位。而且近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率高，預后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放、化療和手術(shù)治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進一步提
聞。 腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長期轉(zhuǎn)為有血管的快速增殖期，血管的生成使腫瘤能獲得足夠的營養(yǎng)而完成血管切換期，如果沒有血管的生成，原發(fā)腫瘤的生長不超過l_2mm，轉(zhuǎn)移則無法實現(xiàn)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一類能促進內(nèi)皮細胞分裂增殖、促進新生血管的形成、提高血管通透性的生長因子，它與細胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，通過激活酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮功能。在腫瘤組織中，腫瘤細胞、腫瘤侵入的巨噬細胞和肥大細胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，誘導血管形成，促進腫瘤持續(xù)生長，并提高血管通透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進單核細胞、成纖維細胞內(nèi)皮細胞侵潤，有利于腫瘤基質(zhì)形成和腫瘤細胞進入新生血管，促進腫瘤轉(zhuǎn)移，因而抑制腫瘤血管生成被認為是當前最具有前途的腫瘤治療方法之一。貝伐單抗(Avastin,bevacizumab)是抗人 VEGF 的人源化抗體(Cancer Res 1997 ；57 :4593-9)，它于2004年被美國食品藥品管理局批準為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線治療藥物。但Trastuzumab是一個人源化抗體，保留了鼠源CDR區(qū)和少量FR區(qū)鼠源殘基，仍未能達到全人源化。進入上世紀90年代以后，抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)使人源化抗體的制備達到了一個全新的水平，它繞過了以往單抗研制過程中必需的雜交瘤途徑，甚至不需要經(jīng)過免疫，更為重要的是，它使人們長期以來期望獲得治療性人源抗體的夢想成為了現(xiàn)實，因而顯示出強大的生命力。噬菌體抗體庫是最早出現(xiàn)也是目前應用最為廣泛的抗體庫。噬菌體展示是由Smith (Science, 1985, 228 (4705) :1315-1317)首先建立起來的一種將外源蛋白基因與噬菌體的衣殼蛋白基因相融合后使外源蛋白表達呈現(xiàn)于噬菌體表面的技術(shù)。噬菌體抗體庫就是利用了以上原理使不同特異性的抗體表達在不同的噬菌體表面而用抗原對它們進行篩選(Science，1989,246(4935) :1275-1281 ;Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88 (18)7978-7982 ；Human Antibodies, 1997,8(4) :155-168) 用于構(gòu)建噬菌體抗體庫的靶細胞可以是雜交瘤細胞、免疫的人B細胞或未經(jīng)免疫的人B細胞。未經(jīng)免疫的人B淋巴細胞是目前應用最多的靶細胞，它庫容量大，理論上含有所有的人源抗體基因。噬菌體抗體庫的篩選就是模擬體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，用固相化抗原吸附表面表達特異性抗體的噬菌體庫，然后洗脫游離的噬菌體，用抗原吸附的噬菌體感染宿主菌增殖擴增后再進行多輪的“吸附-洗脫-擴增”直至篩選到特異的人源抗體。大容量抗體庫的建立是獲得高親和力人源抗體的關(guān)鍵，如果構(gòu)建的噬菌體抗體庫容量大于101(|，那就可能從中篩選得到高親和力(彡IO9M-1)的特異性抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建了大容量的天然人源 噬菌體抗體庫，從中篩選獲得了一株全人源抗VEGF抗體8B13，其重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO : 10，輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :12 ;本發(fā)明還公開了編碼上述全人源抗VEGF抗體8B13的核苷酸序列，其中編碼重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :9，編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :11。本發(fā)明利用得到的全人源抗VEGF抗體8B13進行了一系列實驗，實驗結(jié)果表明■ 與人源化抗體bevacizumab相比，8B13具有更高的與VEGF的親和力，明顯更強地抑制HUVEC增殖的能力與體內(nèi)抗腫瘤活性。


圖I細胞增殖實驗圖2腫瘤生長曲線
具體實施例方式實施例(I)人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術(shù)發(fā)展公司產(chǎn)品)分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取總RNA，根據(jù)文獻(Cell，1980，22 =197-207)和文獻(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)報道的序列分別設(shè)計引物采用 RT-PCR反應擴增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(Ch)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CJ的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/Q。(2)cDNA 的制備收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴細胞分離液(醫(yī)科院天津血研所生產(chǎn))分離單個核細胞。用Trizol試劑(Invitrogen公司)從分離的人外周血淋巴細胞中提取細胞的總RNA。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄出cDNA。以上步驟按照廠家提供的說明書進行。(3)引物設(shè)計參考文獻(Immunotechnology, 1998, 3 :271-278)設(shè)計并合成克隆人抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)基因的 VHBack，VaFor, VLBack 和 VLFor 引物。VaBack, VaFor,VljBack 和 VljFor 的序列請見(Immunotechnology, 1998, 3 :271-278)。其中在 VaBack 引物的5’端加上含有Sfi I位點的序列atg gcc cag ccg gcc atg @(^,在VHFor引物的5’端加上序列 gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VljBack 引物的 5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VljFor 引物的 5’端加上含有 NotI 位點的序列AT G CGG CCG C。(4).噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選采用實施例⑵中的cDNA和實施例(3)中的引物，利用recombinant Phageantibody system試劑盒(Amersham Biosciences公司)構(gòu)建卩遼菌體單鏈抗體庫,然后用特異性抗原對文庫進行淘選?？贵w庫構(gòu)建和淘選方法參照recombinant Phage antibodysystem試劑盒說明書進行，用于淘選的特異性抗原“重組人VEGF165蛋白”購自R&D公司。經(jīng)多次淘選抗體庫后獲得了一株抗人VEGF單鏈抗體8B13ScFv，測序后獲得其基因序列。SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6分別顯示了 8B13ScFv重鏈可變區(qū)Vh的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8分別顯示了 8B13ScFv輕鏈可變區(qū)ん的核苷酸序列和氨基酸序列。(5)全人源抗體在真核細胞中的表達
以8B13ScFv基因和pGEM_T/CH為模版，通過重疊PCR合成全人源抗體重鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。并使此全人源抗體重鏈基因的5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR 擴增產(chǎn)物，回收目的條帶并克隆到PGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，篩選陽性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體重鏈片段8B13VhCh,與用 HindIII 和 EcoR I 酶切的質(zhì)粒 pcDNA3. I (+) (Invitrogen 公司)進行連接，構(gòu)建成全人源重鏈真核表達載體pcDNA3. I (+) (8B13VhCh)。以8B13ScFv基因和pGEM-T/Q載體為模板，通過重疊PCR合成全人源化抗體輕鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘，得到PCR產(chǎn)物8B13\(^，其5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑選測序正確的克隆用 HindIII 和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體輕鏈片段8B13\(^，與用HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. I/ZEO (+) (Invitrogen公司)載體進行連接,構(gòu)建成全人源輕鏈真核表達載體 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (8B 13VlCl)。 于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞(ATCC CRL-9618)，細胞培養(yǎng)至90% -95%融合時進行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒IOiig (質(zhì)粒pcDNA3. 1(+) (8B 13VHCH) 4 y g，質(zhì)粒pcDNA3. I/ZEO (+) (8B 13VLCL) 6 u g)和 20 u lLipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司產(chǎn)品)按Lipofectamine2000Reagent試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染進行24h后細胞換含600 u g/ml G418 (Invitrogen 公司產(chǎn)品)和 250 u g/ml Zeocin (Invitrogen 公司產(chǎn)品)的DMEM培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗人IgG(Fe)(KPL公司)包被于ELISA板，4°C過夜，用2 % BSA-PBS于37°C封閉2h，加入待測的抗性克隆培養(yǎng)上清或標準品Human myeloma IgGl, k (Sigma), 37°C溫育2h,加入HRP-羊抗人IgG ( K ) ((Southern Biotechnology Associates 公司)進行結(jié)合反應，37°C溫育 Ih,加入TMB顯色液于37°C作用5min，最后用H2SO4終止反應，測A45tl值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用Protein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離純化全人源抗體8B13。將純化抗體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO :9和SEQ ID NO: 10分別顯示了全人源抗體8B 13的重鏈核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQ ID NO:12分別顯示了全人源抗體8B13的輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列。(6) VEGF抗體親和力測定運用Biacore TlOO (Biacore AB, Uppsala, Sweden)檢測 VEGF 抗體的親和力常數(shù)。將VEGF165(R&D公司產(chǎn)品)通過氨基共價結(jié)合與CM5生物傳感芯片(GE Healthcare)上，將全人源抗體8B13, Bevacizumab,和陰性對照抗體(rituximab)(以PBS/0. 05 %TWEEN-20 (ICI Americas)(去污劑)配)溶液，配成不同的濃度(2倍比濃度稀釋)，以 50iil/min的流速通過芯片。每次檢查之后，用5iU 50mM鹽酸水溶液以3 iil/min的流速洗漆，從而將殘留的抗體從固定化的配體上洗脫下來。用BIAevalution軟件(T100 evalution 2.0版,GE Healthcare公司)，通過非線性回歸法分析結(jié)合曲線。結(jié)果如表I所示，全人源抗體8B13的KD值顯著低于Bevacizumab,說明全人源抗體8B13對VEGF的親和力高于 Bevacizumab。
權(quán)利要求
1.ー種全人源抗VEGF抗體8B13，其重鏈氨基酸序列為SEQ ID N0:10，輕鏈氨基酸序列為 SEQ ID NO :12。
2.一種核苷酸分子，編碼權(quán)利要求I所述的全人源抗VEGF抗體8B13。
3.權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中編碼重鏈的核酸分子為SEQID NO :9，編碼輕鏈的核酸分子為SEQ ID NO =Il0
4.ー種載體，含有權(quán)利要求3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，其中載體可以為pcDNA3. 1，pcDNA3. 1/ZE0(+)之一。
5.—種宿主細胞，含有權(quán)利要求4所述的載體，為真核細胞。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細胞，為哺乳動物細胞。
7.權(quán)利要求6所述的宿主細胞，為CHO細胞。
8.ー種制備權(quán)利要求I所述的全人源抗VEGF抗體8B13的方法，該方法包括 a)在表達條件下，培養(yǎng)上述的宿主細胞，從而表達抗體； b)分離或純化所述的抗體。
9.權(quán)利要求I所述的全人源抗VEGF抗體8B13在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明全人源抗VEGF抗體8B13，其重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO10，輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO12；本發(fā)明還公開了編碼上述全人源抗VEGF抗體8B13的核苷酸序列，其中編碼重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO9，編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO11。本發(fā)明公開的全人源抗VEGF抗體8B13可以用于制備治療抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K39/395GK102757495SQ20111010577
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者張大鵬, 戴建新, 李博華, 郭亞軍, 錢衛(wèi)珠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學