專利名稱：一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)皮膚組織工程領(lǐng)域，更具體的涉及一種異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
燒傷、創(chuàng)傷、戰(zhàn)傷等因素造成的皮膚缺損常遺留瘢痕增生和攣縮畸形，嚴(yán)重影響外觀和功能，Loewe最早證實(shí)真皮組織能增強(qiáng)移植皮的韌性、抑制肉芽組織的生長(zhǎng)和瘢痕形成，降低創(chuàng)面攣縮程度。若將重建真皮結(jié)構(gòu)與其他促進(jìn)創(chuàng)面愈合的措施結(jié)合起來，可有效減輕瘢痕的形成，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。皮膚一直的關(guān)鍵問題在于免疫排斥反應(yīng)，其免疫排斥反應(yīng)主要源于表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞成分。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(Acellular Dermal Matrix, ADM )是一種可用于全層皮膚缺損的真皮替代物，來源于天然皮膚。它是天然皮膚經(jīng)過一定的理化方法處理，去除了表皮和真皮中的細(xì)胞成分，但保留了真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分和其三維空間結(jié)構(gòu)。因去除了皮膚中抗原性較強(qiáng)的細(xì)胞成分而保留了抗原性微弱的膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時(shí)又具有天然真皮的三維超微結(jié)構(gòu)，可為皮膚再生提供“真皮模板”，誘導(dǎo)移植后宿主細(xì)胞成分如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等循支架結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)。真皮基質(zhì)還可以支持成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)、新血管的生成，使成纖維細(xì)胞合成和分泌具有正常結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞外基質(zhì)成分，使肉芽組織快速成熟及真皮深層再生，減少成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，從而減少達(dá)到減少疤痕或無疤痕的臨床效果。1995 ip Livesey ( Livesey, S. Α. , D. N. Herndon, et al. (1995). "Transplanted acellular allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction of viable dermis. 〃 Transplantation 60(1): 1-9.)等首先 艮道了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備，同年，Wainwright ( Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns. Burns. 1995;21:243-8.)首先報(bào)道了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的臨床應(yīng)用。美國(guó)LifeCell公司將這一成果商品化，用新鮮的人尸體皮膚制成脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，命名為Alloderm，并通過了美國(guó)FDA的批準(zhǔn)進(jìn)入了醫(yī)用生物材料市場(chǎng)。國(guó)內(nèi)陳壁等人最早開始對(duì)異體真皮脫細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，且目前已有Alloderm的類似產(chǎn)品上市，但由于人異體皮的來源有限， 且涉及到倫理道德問題，無法滿足臨床需求，因此異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)成為解決這一矛盾的有效途徑。然而現(xiàn)有的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備雖然已經(jīng)比較成熟，但在其制備過程中存在較多問題，如制備過程復(fù)雜，處理時(shí)間過長(zhǎng)，所用的方法對(duì)天然真皮超微結(jié)構(gòu)破壞性較大， 細(xì)胞外基質(zhì)成分保留較差，殘留較多的化學(xué)物質(zhì)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷而提供的一種異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備
3方法，其特點(diǎn)是采用健康哺乳動(dòng)物皮膚為材料，依次經(jīng)過真皮的制備、滲透休克處理、去污劑結(jié)合超聲波處理、環(huán)氧乙烷消毒后所得到的產(chǎn)品。具有制備過程簡(jiǎn)單、所需時(shí)間適中、細(xì)胞成分去除較徹底、細(xì)胞外基質(zhì)成分保留較好的特點(diǎn)。本發(fā)明所提供的上述一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，包括以下步驟
包括以下的步驟
(1)、對(duì)剝離的哺乳動(dòng)物皮膚進(jìn)行剔除毛發(fā)的處理；
(2)、用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡后再用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機(jī)械法制得網(wǎng)狀層真皮；
(3)、將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時(shí)-12小時(shí)，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0. 5小時(shí)-12小時(shí)；
(4)、重復(fù)步驟(3)1-6次；
(5)、將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時(shí)-48小時(shí)；
(6)、用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。在上述制備方法中，步驟(1)中可用于制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的哺乳動(dòng)物的選擇是多種多樣的，包括人、豬、牛、羊、大鼠或者兔等。步驟(1)中的哺乳動(dòng)物皮膚來源自出生不超過14天的健康哺乳動(dòng)物的皮膚。步驟(1)中所述的清除毛發(fā)是指采用機(jī)械方式去除。步驟(2)中所述的消毒液選自碘伏、75%酒精、碘酒等，優(yōu)先選擇碘伏。步驟(2)中所述的網(wǎng)狀層真皮的厚度為0. 1 mm -0. 5 mm，優(yōu)先選擇0. 3 mm。步驟(3)中所述的低滲溶液是指蒸餾水或者10 mM Trizma HCl和10 mM EDTA 的混合液，優(yōu)先選擇蒸餾水；高滲溶液是指1 M NaCl或者50 mM Trizma HC1、1 M NaCl 和10 mM EDTA的混合液，優(yōu)先選擇1 M NaCl。步驟(3)中所述的低滲溶液處理時(shí)間0. 5小時(shí)-12小時(shí)，優(yōu)先選擇2小時(shí)；高滲溶液處理時(shí)間0.5小時(shí)-12小時(shí)，優(yōu)先選擇2小時(shí)。步驟(3)中所述的震蕩處理，震蕩方式可以為水平，也可以為旋轉(zhuǎn)，震蕩頻率為50 -200/分。步驟(4)中所述的重復(fù)步驟(3) 1 - 6次，優(yōu)先選擇3次。步驟(5)中所述的洗滌劑為Tween-20、Tween-80、SDS、Triton X-100、Triton X-200、CHAPS中的一種或幾種組合，優(yōu)先選擇Triton X-100，Triton X-100濃度可以為 0.1%、0.5%、1.0%、2.0%，優(yōu)先選擇 0.5%。步驟(5)中所述的超聲波清洗器的頻率設(shè)定在20 kHz - 80 kHz之間，功率設(shè)定在 100 W - 400 W 之間。步驟(6)中所述的磷酸鹽緩沖液pH值在7.2 - 7. 4之間，洗滌時(shí)間在5 min -30 min之間。本發(fā)明提供了一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的簡(jiǎn)易方法。在該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備方法中采用了滲透壓休克法裂解細(xì)胞，配合后續(xù)的洗滌劑去除細(xì)胞成分，超聲波的使用提高了洗滌劑的洗滌效力，達(dá)到了較為理想的去除細(xì)胞的效果。由于沒有使用酶類， 比如胰蛋白酶、DNase、RNase等，避免了對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的較大破壞，進(jìn)而最大程度上保留了真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分，并且不涉及酶類物質(zhì)殘留引起移植后不利的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
(1)獲得的真皮基質(zhì)不含細(xì)胞成分，抗原性低；
(2)在一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的簡(jiǎn)易方法中，采用了簡(jiǎn)單的方法組合，所涉及方法對(duì)環(huán)境友好，制備工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，制作周期短，價(jià)格較低，適于規(guī)?；a(chǎn)。(3)制備過程中未使用固定劑、交聯(lián)劑等，因而所制備的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)保留了真皮的天然三維結(jié)構(gòu)。


圖1為異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)凍干后的照片； 圖2為處理之前真皮基質(zhì)組織學(xué)圖片；
圖3為處理之后真皮基質(zhì)組織學(xué)圖片； 圖4為處理之前真皮基質(zhì)DAPI染色； 圖5為處理之后真皮基質(zhì)DAPI染色；
圖6為脫細(xì)胞前后真皮基質(zhì)內(nèi)DNA的電泳圖；附圖6中MR代表Marker，為 D15000+2000，U代表經(jīng)本方法處理殘留在真皮內(nèi)的DNA，A代表未經(jīng)任何處理真皮內(nèi)的DNA， 由DNA電泳圖可看出，經(jīng)本方法處理后的真皮內(nèi)DNA含量明顯降低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、制備異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康新生牛皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0.2 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于蒸餾水內(nèi)震蕩處理2小時(shí)，再置于1M NaCl內(nèi)震蕩處理2小
時(shí)；
(4)重復(fù)步驟(3)3次；
(5)再將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Triton X-100內(nèi)用超聲波清洗器處理M小時(shí)，超聲波清洗器處理的頻率設(shè)定為40 kHz，功率為250 W；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。實(shí)施例2、制備異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康清潔級(jí)SD大鼠皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，碘伏消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0.3 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于蒸餾水內(nèi)震蕩處理1小時(shí)，再置于1M NaCl內(nèi)震蕩處理1小
時(shí)；
(4)重復(fù)步驟(3)3次；
(5)在將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Triton X_100內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時(shí)，頻率設(shè)
5定為40 kHz，功率為250 W ；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15 min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。 實(shí)施例3、制備異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)
(1)剝離健康兔皮皮膚，剃除毛發(fā)；
(2)用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡，75%酒精消毒皮膚5min，在無菌條件下用取皮鼓取厚度為0. 3 mm的網(wǎng)狀層真皮；
(3)將網(wǎng)狀真皮置于10mM Trizma HCl與10 mM EDTA的混合液內(nèi)震蕩處理2小時(shí)， 再置于1 M NaCl內(nèi)震蕩處理2小時(shí)；
(4)重復(fù)步驟(3)3次；
(5)再將網(wǎng)狀真皮置于0.5%Tween-20內(nèi)用超聲波清洗器處理20小時(shí)，超聲波清洗器處理的頻率設(shè)定為30 kHz，功率為250 W；
(6)用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15min，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，包括以下的步驟(1)、對(duì)剝離的哺乳動(dòng)物皮膚進(jìn)行剔除毛發(fā)的處理；(2)、用0.1%苯扎溴銨溶液清洗浸泡后再用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機(jī)械法制得網(wǎng)狀層真皮；(3)、將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時(shí)-12小時(shí)，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0. 5小時(shí)-12小時(shí)；(4)、重復(fù)步驟(3)1-6次；(5)、將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時(shí)-48小時(shí)；(6)、用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(1)中的哺乳動(dòng)物皮膚來源自出生不超過14天的健康哺乳動(dòng)物的皮膚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 所述哺乳動(dòng)物為豬、牛、羊、大鼠或者兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(2)中的消毒劑選自碘伏、75%酒精和碘酒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(2)中的網(wǎng)狀層真皮的厚度為0. 1 mm -0. 5 mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的低滲溶液是指蒸餾水或者10 mM Trizma HCl與10 mM EDTA的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的高滲溶液是指1 M NaCl或者50 mM Trizma HC1、1 M NaCl和10 mM EDTA的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(3)中所述的震蕩處理，震蕩方式可以為水平或旋轉(zhuǎn)，震蕩頻率為50 - 200/分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(4)所述的洗滌劑選自 Tween-20、Tween-80、SDS, Triton X-100、Triton X-200和 CHAPS，其濃度分別為0. 1% - 2. 5%ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其特征在于步驟(5)中超聲波清洗器的頻率為20 - 80 kHz，功率為100 - 400 W。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法。方法包括對(duì)剝離的哺乳動(dòng)物皮膚進(jìn)行剔除毛發(fā)的處理；用消毒液消毒皮膚，在無菌條件下并用機(jī)械法制得網(wǎng)狀層真皮；將真皮置于低滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時(shí)-12小時(shí)，再置于高滲溶液內(nèi)震蕩處理0.5小時(shí)-12小時(shí)；重復(fù)前步驟1-6次；將真皮置于洗滌劑內(nèi)用超聲波清洗器處理12小時(shí)-48小時(shí)；用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌1-6次，環(huán)氧乙烷消毒即得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，細(xì)胞去除較為徹底，制作周期短，對(duì)周圍環(huán)境友好，價(jià)格較低，適于規(guī)?；僮?。
文檔編號(hào)A61L27/60GK102225218SQ20111010526
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者彭代智, 陳博 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院