專利名稱：膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的新用途，尤其涉及作為皮 膚組織工程支架材料的研究。本發(fā)明還涉及膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的制 備方法。
背景技術(shù)：
在生物支架材料方面，目前開展的組織工程皮膚研究，其真皮基質(zhì)多選用4-硫酸 軟骨素、氨基葡聚糖、聚羥基乙酸等高分子蛋白或聚合物材料，應(yīng)用到創(chuàng)面后很快被降解吸 收，所以該組織工程皮膚也僅僅是一種暫時性的生物敷料。以脫細胞真皮基質(zhì)為支架，進行 表皮細胞培養(yǎng)構(gòu)建皮膚替代物，已有實驗證實激光微孔真皮基質(zhì)是較好的三維細胞培養(yǎng)支 架，有助于細胞種植生長及血管化。但由于真皮基質(zhì)在脫細胞處理過程中，表面的細胞錨點 被破壞，影響了細胞與真皮基質(zhì)的粘附。而膠原、殼聚糖已證實具有較好的生物相容性及細 胞粘附性，單純的膠原或殼聚糖載體從強度和降解速度上都難以滿足組織工程細胞培養(yǎng)的 需要，而將膠原和殼聚糖復(fù)合后，增加了載體機械強度。殼聚糖為直鏈氨基多糖，溶于弱酸， 極易成膜，機械強度高。當(dāng)與膠原分散液混合成膜時，在膠原纖維之間形成極薄的膜，增強 了纖維間的拉力。當(dāng)浸濕后，仍能保持挺括，易于操作。另外，殼聚糖延遲了復(fù)合載體降解 開始的時間。膠原纖維在體內(nèi)迅速降解，加入殼聚糖可延遲開始降解的時間，將有利于細胞 和自體組織的長入，這也正是理想的組織工程支架材料所具有的特點。單純的膠原_殼聚 糖膜在體內(nèi)仍能降解，且機械強度達不到要求，而激光微孔脫細胞真皮基質(zhì)在體內(nèi)短時間 內(nèi)不易降解，可滿足皮膚要求的機械強度，故膠原_殼聚糖_微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜在理論上 推測可成為理想的皮膚組織工程支架材料。專利號為ZL 03139063. 3的國家發(fā)明專利介紹的膠原復(fù)合支架材料包括膠原和 水溶性多糖，該支架雖具有良好的滲透性、透水汽性和吸收性。但該材料在體內(nèi)易降解，且 機械強度不夠，達不到臨床應(yīng)用要求。專利號為us 5282，859的美國專利介紹的雙層人工 皮膚，表皮層為高純度的微孔膠原凝膠膜，真皮層為培養(yǎng)有成纖維細胞的多孔膠原海綿，戊 二醛交聯(lián)提高它的抗張強度，但其抗張強度達不到臨床應(yīng)用的要求，而且降解速率太快、且 戊二醛對細胞有毒性。專利號為CN1387，923的中國專利公開了一種異種無細胞真皮支架 及其制備方法，該支架系用胰蛋白酶和戊二醛處理乳豬皮而得，其抗張強度高、降解速率可 控，組織相容性好，但滲透性差，創(chuàng)面易產(chǎn)生積液、積氣，血管化慢。本發(fā)明將膠原_殼聚糖 與微孔脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)合，采用干熱物理交聯(lián)，既克服了細胞吸附、生物相容性及滲透性 差等缺點，又克服了復(fù)合膜機械強度不夠的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)之一是膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制，即作為皮 膚組織工程生物支架材料。本發(fā)明的另一任務(wù)是提供膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制方法。
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本發(fā)明膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制方法，將膠原、殼聚糖溶液 按一定比例的混勻，注入模具中，將干燥的激光微孔真皮放入混合液中，經(jīng)冷凍干燥、真空 干熱交聯(lián)，形成膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜，再經(jīng)6°Co照射消毒備用。本發(fā)明膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制方法，其中所說的膠原與 殼聚糖的比例是將0.5%殼聚糖(1%乙酸溶解)，3g/L膠原溶液(0. 乙酸溶解)按3 7 的比例在冰浴條件下混合并注入模具中，將干燥后的微孔異體脫細胞真皮小心放入混合液 中并鋪平，-80°C冰箱預(yù)冷8小時；將模具轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的冷凍干燥機中，冷凍干燥24小時； 取出模具，Imol/LNaOH處理1小時后，用蒸餾水沖洗至中性，再次預(yù)冷后冷凍干燥，并置于 100°c，10_2mmHg真空干燥箱中24h干熱交聯(lián)，封裝后6°Co照射消毒備用。為了更好的理解本發(fā)明膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制效果，下 面通過實驗研究結(jié)果加以證明。掃描電鏡結(jié)果顯示復(fù)合膜支架有良好的微孔結(jié)構(gòu)，很多小孔均勻分布，小孔之間 互相連接無封閉空間(圖1)。成纖維樣細胞接種在復(fù)合膜支架上培養(yǎng)3天后可見細胞粘附 到支架表面，并且滲透到微孔內(nèi)部，多數(shù)為圓形。隨時間推移，細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，培 養(yǎng)5天的細胞其細胞外基質(zhì)的分泌明顯多于3天的細胞。培養(yǎng)7天后，細胞數(shù)目明顯增多， 在支架表面融合形成一細胞單層，支架被細胞覆蓋，細胞成多角形改變(圖2)。


圖1膠原-殼聚糖-激光微孔真皮復(fù)合膜的超微結(jié)構(gòu)圖2膠原_殼聚糖_激光微孔真皮復(fù)合膜大體觀察及細胞粘附生長情況
具體實施例方式膠原-殼聚糖_微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的制備和消毒處理將0. 5%殼聚糖(1%乙酸 溶解)，3g/L膠原溶液(0. 1 %乙酸溶解)按3 7的比例在冰浴條件下混合并注入模具中， 將干燥后的微孔異體脫細胞真皮小心放入混合液中并鋪平，_80°C冰箱預(yù)冷8小時；將模具 轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的冷凍干燥機中，冷凍干燥24小時；取出模具，Imol/LNaOH處理1小時后，用蒸 餾水沖洗至中性，再次預(yù)冷后冷凍干燥，并置于100°C，10_2mmHg真空干燥箱中24h干熱交 聯(lián)，封裝后6°Co照射消毒備用。將臍帶間充質(zhì)干細胞用0. 25%胰蛋白酶消化清洗后，用DMEM/F12混合培養(yǎng)基重 新懸浮制成細胞懸液，取出膠原-殼聚糖_微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜，用無菌剪刀剪成需要面積 大小的膜片放入培養(yǎng)皿中，將細胞懸液滴加至材料上，孵育2小時后，加入需要量的培養(yǎng)基 進行培養(yǎng)，每2天換液一次，觀察并記錄，以檢測復(fù)合膜的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物相容性。
權(quán)利要求
一種膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的制備方法，其特征在于將膠原、殼聚糖溶液按一定比例的混勻，注入模具中，將干燥的激光微孔真皮放入混合液中，經(jīng)冷凍干燥、真空干熱交聯(lián)，形成膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜，再經(jīng)60Co照射消毒備用。
2.如權(quán)利要求2所述的一種膠原_殼聚糖_激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的制備方法， 其特征在于將用乙酸溶解的0.5%殼聚糖，0.1%乙酸溶解的3g/L膠原溶液按3 7 的比例在冰浴條件下混合并注入模具中，將干燥后的微孔異體脫細胞真皮小心放入混合液 中并鋪平，-80°C冰箱預(yù)冷8小時；將模具轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的冷凍干燥機中，冷凍干燥24小時； 取出模具，Imol/LNaOH處理1小時后，用蒸餾水沖洗至中性，再次預(yù)冷后冷凍干燥，并置于 100°c，10_2mmHg真空干燥箱中24h干熱交聯(lián)，封裝后6°Co照射消毒備用。
全文摘要
膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的制備。本發(fā)明公開了膠原-殼聚糖的新用途，即體外構(gòu)建膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜。本發(fā)明還公開了膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜的研制方法，即將膠原、殼聚糖溶液按一定比例的混勻，注入模具中，將干燥的激光微孔真皮放入混合液中，經(jīng)冷凍干燥、真空干熱交聯(lián)，形成膠原-殼聚糖-激光微孔真皮基質(zhì)復(fù)合膜，再經(jīng)60Co照射消毒備用。本發(fā)明為皮膚組織工程提供了新型生物支架材料，其具有一定的機械強度，生物相容性好，無免疫原性，來源廣泛，易得，制備容易。
文檔編號A61L27/60GK101856516SQ20101019530
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者孫天駿, 宋慧鋒, 朱桂英, 李東杰, 楊紅明, 柴家科, 梁黎明, 陶然, 韓焱福 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院