專利名稱：菊科類型環(huán)肽，以其為活性成分的免疫抑制藥物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一類菊科類型環(huán)肽，作為免疫抑制劑，以其為有效成分的藥物組合物，其制備方法及其在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫調(diào)節(jié)是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。若免疫系統(tǒng)功能失調(diào)，機(jī)體對(duì)自身抗原產(chǎn)生過(guò)度免疫應(yīng)答反應(yīng)引起組織損傷，就會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病或過(guò)敏反應(yīng)等。免疫抑制劑是指能夠通過(guò)抑制細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，使組織損傷得以減輕的一類物質(zhì)。它對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)具有抑制作用，能夠抑制與免疫反應(yīng)有關(guān)細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞等巨噬細(xì)胞) 的增殖和功能，降低機(jī)體免疫反應(yīng)。免疫抑制劑目前廣泛應(yīng)用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、皮膚真菌病、膜腎球腎炎、炎性腸病和自身免疫性溶血性貧血等。目前已有許多免疫抑制劑被發(fā)現(xiàn)，主要分為化學(xué)合成制劑、激素、微生物代謝產(chǎn)物、中藥及其有效成分以及生物技術(shù)產(chǎn)品(細(xì)胞因子、蛋白、抗體)等，其中也有很多成功的藥物上市并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，如來(lái)源于微生物代謝產(chǎn)物的環(huán)孢菌素、化學(xué)制劑環(huán)磷酰胺、激素類的強(qiáng)的松等。但是現(xiàn)有的免疫抑制藥物中，多存在特異性差、毒副作用明顯、 治療窗窄和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，所以急待開(kāi)發(fā)高效低毒的免疫抑制新藥。中藥是中華民族的瑰寶，中藥免疫抑制劑因成分多樣化、藥理作用廣泛、副作用少、無(wú)依賴性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已同新型免疫抑制劑一起成為市場(chǎng)的主流。所以從祖國(guó)傳統(tǒng)中藥材中發(fā)現(xiàn)新型免疫抑制劑具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和很好的應(yīng)用前景。T淋巴細(xì)胞在各種自身免疫病以及移植排斥等的病理過(guò)程中占主導(dǎo)作用，抑制T 細(xì)胞是免疫抑制藥物發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。在免疫應(yīng)答過(guò)程中大多數(shù)T細(xì)胞經(jīng)歷著靜息、活化、效應(yīng)、凋亡的命運(yùn)。成熟的初始T細(xì)胞經(jīng)抗原識(shí)別后通過(guò)其抗原受體被激活，活化的T細(xì)胞以指數(shù)級(jí)速度進(jìn)行克隆擴(kuò)增，接下來(lái)分化成效應(yīng)細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子或直接殺傷靶細(xì)胞，最后進(jìn)入凋亡以維持T細(xì)胞種群的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。相對(duì)低毒的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A (Cyclosporin A, CsA)能選擇性地作用于T細(xì)胞激活階段，阻止其活化增殖，臨床上被廣泛用于抑制器官移植所引發(fā)的排斥反應(yīng)，但對(duì)自身免疫病的療效并不理想。這很可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)已活化的效應(yīng)T細(xì)胞抑制作用不強(qiáng)，無(wú)力阻止已啟動(dòng)的病理反應(yīng)對(duì)自身組織的損傷。許多研究也表明自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程中，自身反應(yīng)性T細(xì)胞處于受自身抗原刺激的持續(xù)活化狀態(tài)，不斷釋放炎癥細(xì)胞因子，而且能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體。為了抑制進(jìn)行中的病理性免疫應(yīng)答，活化的T細(xì)胞是免疫抑制藥物選擇性作用的良好靶標(biāo)?，F(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有菊科類型環(huán)肽作為免疫抑制劑的報(bào)道。菊科類型環(huán)肽在菊科植物中存在種類不多，目前僅從菊科紫菀屬紫菀中分離得到 9個(gè)。環(huán)肽因其溶解性不好含量較低等原因較難分離?，F(xiàn)有技術(shù)中，從紫菀屬植物中分離環(huán)肽類成分已公開(kāi)發(fā)表如下方法紫菀干燥根用甲醇提取，正丁醇萃取，得正丁醇和水兩個(gè)部位。正丁醇部位經(jīng)Diaion HP-20柱層析，(1:0-0:1)甲醇/水為洗脫劑，其中80% (甲醇/水)組分經(jīng)硅膠柱層析，(1:0-0:1) 二氯甲烷/甲醇為洗脫劑，其中10%(甲醇/ 二氯甲烷)組分經(jīng)ODS HPLC半制備柱分離純化，乙腈/水為洗脫劑，得到化合物Astin C。參見(jiàn)
Morita, H. ； Nagashima, S. ； Takeya, K. ； Itokawa, H. ； Iitaka, Y. , Structures and conformation of antitumour cyclic pentapeptides, astins A, B and C, from Aster
tataricus. Tetrahedron 1995,57 (4), 1121-1132。其缺點(diǎn)是分離純化中多次用到有機(jī)溶劑和水的混合溶劑系統(tǒng)，該混合溶劑回收溫度高，不利于溶劑的回收；HPLC方法中所有溶劑價(jià)格昂貴，使提取成本過(guò)高，同時(shí)HPLC技術(shù)也不利于工業(yè)化大量生產(chǎn)。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一類菊科類型環(huán)肽化合物；提供制備該類化合物的方法，該提取分離方法可控性和重現(xiàn)性好，樣品損失少，成本較低，操作方便，可較易分離得到環(huán)肽，溶劑可以反復(fù)回收利用，也適用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的目的還在于提供以菊科類型環(huán)肽化合物為有效成分的藥物組合物；該類化合物及其組合物在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案
菊科類型環(huán)肽化合物，是一類骨架含有β -苯丙氨酸，并以正常氨基酸肽鍵直接相連形成的單環(huán)均五肽化合物；一般含有一個(gè)V-β -苯丙氨酸、一個(gè)L-絲氨酸、一個(gè)L-脯氨酸衍生物和兩個(gè)其他氨基酸衍生物。本發(fā)明的環(huán)肽，優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物Astin C (1)、Astin B (2)、Astin D (3)、Astin H (4)、Tataricin A (5)。

發(fā)明內(nèi)容
R1, R2=芳基或烷基 R3, R4, 羥基或鹵原子 X，Y=不飽和鍵或飽和鍵
權(quán)利要求
1.菊科類型環(huán)肽化合物，為骨架含有苯丙氨酸，并以正常氨基酸肽鍵直接相連形成的單環(huán)均五肽化合物，含有一個(gè)L-A -苯丙氨酸、一個(gè)L-絲氨酸、一個(gè)L-脯氨酸衍生物和兩個(gè)其他氨基酸衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)肽，為具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物
3.制備權(quán)利要求1所述菊科類型環(huán)肽化合物的方法，取菊科紫菀屬植物的根莖，經(jīng)干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提?。粚⒓状冀嗉铀鞈液?，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃??；乙酸乙酯部分和正丁醇部分反復(fù)用硅膠、Sephadex LH_20、RP-18各種層析柱分離純化，再結(jié)合環(huán)肽的TLC檢測(cè)方法得菊科類型環(huán)肽化合物。
4.制備如下結(jié)構(gòu)式所示菊科類型環(huán)肽化合物AstinC(l),Astin B (2),Astin D (3)、 Astin H(4),Tataricin A(5)的方法，取紫菀根莖，經(jīng)干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，時(shí)間為每次1-3小時(shí)，提取液經(jīng)減壓濃縮得甲醇浸膏；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，回收溶劑得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；將乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析，用100:0，9:1，8:2，7:3，0:100的氯仿/甲醇梯度洗脫， 薄層層析，結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè)方法合并其中的9 1和8 1含有環(huán)肽的部分；以下的每一步驟都須結(jié)合環(huán)肽TLC檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行分離純化；合并后的浸膏再次經(jīng)硅膠柱層析，用20:1， 10:1，85:15，8:2，0:1的氯仿/甲醇梯度洗脫，根據(jù)環(huán)肽點(diǎn)的不同合并為八個(gè)組分Fr. 1 -Fr. 8 ；Fr. 2組分經(jīng)硅膠柱層析，2 1_1 2的石油醚/丙酮梯度洗脫，合并得到六個(gè)亞組分 Fr. 2-1 - Fr. 2-6 ；Fr. 2-5再經(jīng)硅膠柱層析，20:1，15:1，10:1，15:1的氯仿/甲醇梯度洗脫，合并得到五個(gè)亞組分Fr. 2-5-1 - Fr. 2-5-5 ；組分Fr. 2-5-1回收溶劑，蒸干后得到化合物Astin D(3);Fr. 3組分經(jīng)硅膠柱層析，用1 1_1 2石油醚/丙酮為洗脫劑分離得到兩個(gè)亞組分Fr. 3-1 - Fr. 3-2 ；其中Fr. 3-2組分再經(jīng)硅膠柱層析，用1 3_1 5氯仿/乙酸乙酯為洗脫劑分離得到兩個(gè)組分Fr. 3-2-1和Fr. 3-2-2 ；Fr. 3-2-2經(jīng)kphadex LH-20層析，1 1 的氯仿/甲醇為洗脫劑，得到富集環(huán)肽的部分；該部分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Astin C (1)； Fr. 4組分經(jīng)硅膠柱層析，1:1-1:2石油醚/丙酮進(jìn)行梯度洗脫，合并相似環(huán)肽點(diǎn)部分，得到兩個(gè)亞組分Fr. 4-1 - Fr. 4-2 ；亞組分Fr. 4-2再經(jīng)硅膠柱層析，2:1，1:1，1:2石油醚/丙酮進(jìn)行梯度洗脫，合并得到三個(gè)亞組分Fr. 4-2-1 - Fr. 4-2-3 ；其中Fr. 4_2_2經(jīng)kphadex LH-20進(jìn)行環(huán)肽富集，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑，再經(jīng)RP-18柱層析富集環(huán)肽，30 70-80 20 甲醇/水梯度洗脫；經(jīng)kphadex LH-20和RP-18富集環(huán)肽后，組分Fr. 4-2-2再經(jīng)硅膠柱層析，20:1，10:1，5:1氯仿/甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到四個(gè)亞組分Fr. 4-2-2-1 -Fr. 4-2-2-4 ；其中Fr. 4-2-2-2再經(jīng)硅膠柱層析20:1，10:1，5:1氯仿/甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到五個(gè)亞組分Fr. 4-2-2-2-1 - Fr. 4-2-2-2-5 ；其中Fr. 4-2-2-2-4直接經(jīng) Sephadex LH-20純化富集環(huán)肽部分，1 1氯仿/甲醇為洗脫劑，合并環(huán)肽部分，回收溶劑，蒸干得到化合物Astin H (4)；組分Fr. 4-2-2-4經(jīng)S印hadex LH-20純化富集環(huán)肽部分，1 1 氯仿/甲醇為洗脫劑，得到兩個(gè)組分Fr. 4-2-2-4-1 - Fr. 4-2-2-4-2 ；組分Fr. 4-2-2-4-1 回收溶劑，蒸干后得到化合物Tataricin A(5);Fr. 5組分經(jīng)硅膠柱層析，1 3_1 9氯仿/乙酸乙酯梯度洗脫，將環(huán)肽部分富集，該部分經(jīng)kphadex LH-20,1 1氯仿/甲醇為洗脫劑，得到兩個(gè)組分Fr. 5-1 - Fr. 5-2 ；其中組分Fr. 5_2經(jīng)硅膠柱層析，15 1_3 1氯仿/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，得到兩個(gè)組分Fr. 5-2-1 - Fr. 5-2-2;組分Fr. 5-2-1回收溶劑，蒸干后得到化合物 Astin B (2)，
5.藥物組合物，其中含有治療有效量的如下結(jié)構(gòu)式所示的菊科類型環(huán)肽化合物Astin C (1),Astin B (2),Astin D (3),Astin H (4),Tataricin A (5)或其藥理學(xué)上容許的鹽和藥學(xué)上可接受的載體，
6.以權(quán)利要求1中的菊科類型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分的免疫抑制劑。
7.以權(quán)利要求2 中的化合物 Astin C (l)、Astin B (2)、Astin D (3)、Astin H (4)、 Tataricin A (5)或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成分的免疫抑制劑。
8.權(quán)利要求1所述菊科類型環(huán)肽或其藥理學(xué)上容許的鹽在制備免疫抑制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2 中的化合物 Astin C (1)、Astin B (2)、Astin D (3)、Astin H (4)、 Tataricin A (5)在制備免疫抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
菊科類型環(huán)肽化合物，是指骨架含有β-苯丙氨酸，并以正常氨基酸肽鍵直接相連形成的單環(huán)均五肽化合物；一般含有一個(gè)L-β-苯丙氨酸、一個(gè)L-絲氨酸、一個(gè)L-脯氨酸衍生物和兩個(gè)其他氨基酸衍生物。其中結(jié)構(gòu)式為(1-5)的菊科類型環(huán)肽，為新型植物來(lái)源的免疫抑制劑。提供此類化合物的制備方法及在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。 R1,R2=芳基或烷基，R3,R4,R5=羥基或鹵原子，X,Y=不飽和鍵或飽和鍵。
文檔編號(hào)A61K38/12GK102174083SQ20111003906
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者吳雪豐, 周文兵, 徐會(huì)敏, 徐強(qiáng), 曾廣智, 沈燕, 羅瓊, 范君婷, 譚寧華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所, 南京大學(xué)