專利名稱：結(jié)合至血管內(nèi)皮生長因子2(vegfr-2/kdr)上并阻斷其活性的重組抗體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主要目的是獲得可以作為抑制劑參與血管生成的重組單鏈可變區(qū)片段抗體，其通過與VEGFR2 (細胞外結(jié)構(gòu)域)相互作用，在腫瘤發(fā)展中并因而在與血管生成相關(guān)的疾病機制中起關(guān)鍵性作用。
背景技術(shù)：
活組織的發(fā)育所需要的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)通過血管被運送到組織而廢物質(zhì)也通過血管被運出組織。雖然血管生成，從已經(jīng)存在的血管中生長新血管，是胚胎發(fā)生、傷口愈合、和女性生殖系統(tǒng)的月經(jīng)期間的生理現(xiàn)象，它病理性地出現(xiàn)在炎性疾病中，如關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、炎癥性腸道疾病、和牛皮癬以及各種組織的癌癥如乳腺、膀胱、結(jié)腸、肺、神經(jīng)母細胞瘤、黑色素瘤、腎、胰腺、子宮、子宮頸、和膠質(zhì)母細胞瘤，以及眼科疾病如老年相關(guān)的黃斑變性。血管生成在固體腫瘤的體內(nèi)形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的意義在1971年第一次被認定(Folkman J.，1971，N Eng J Med.，285，1182-1186)。通過毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖出現(xiàn)血管生成(Risau W，1997，Nature, 386，671-674)。與所有生物事件一樣，生物體通過分泌血管生成抑制因子對血管生成刺激做出反應(yīng)。在正常情況下血管生成促進因子和血管生成抑制因子處于平衡狀態(tài)，并且當這個平衡針對血管生成抑制因子被破壞時，血管生成開始。在1989 年 Ferrara 等人定義了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(Ferrara and Henzel, 1989BiochemBiophys Res Communl61, 851-858)。在血管生成中 VEGF 起著關(guān)鍵的作用(Ferrara N etal.，1996, Nature, 380:439-442)。在小鼠上的實驗表明，由于嚴重的血管問題,僅缺失關(guān)于 VEGF 的等位基因?qū)е略缙谂咛ニ劳?Carmilet P.et al.，1996，Nature, 380，435-439)。VEGF是重量為45kDa的以二硫鍵結(jié)合的結(jié)合肝素的同型二聚體堿性蛋白質(zhì)。目前已經(jīng)定義了其多個亞組，如VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D以及VEGF-E。在哺乳動物中，VEGF-A具有多種亞型，如VEGF121,、VEGF165, VEGF189, VEGF206和VEGF145 (基于氨基酸數(shù)目)。在這些亞型中，VEGF165 是主要的種類(Ferrara N., et al., 2009, Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.，29，789-791)。通過結(jié)合至細胞膜上的酪氨酸激酶受體，VEGF顯示其細胞內(nèi)作用。VEGF受體包含兩部分。第一部分是包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的細胞內(nèi)部分。第二部分是包含5至7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)(其包含配體結(jié)合區(qū)域)的細胞外區(qū)域(Ferrara N.et al., 2003, Nat.Med.9:669-676)。除了證明 Flt-1 (VEGFR-1 )，flk-l/KDR (VEGFR-2)，和 Flt_4 (VEGFR-3)為VEGF受體外，最近已經(jīng)定義了稱為跨膜蛋白-1 (neuropilin-1)和跨膜蛋白_2(neuropilin-2)(其在內(nèi)皮細胞表面上表達并且對VEGF-A具有低結(jié)合特性)的受體結(jié)構(gòu)。KDR (包含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體)已于1991年被Terman等人通過專利號PCT/US92/01300定義(Terman et al.，1991， 0ncogene6:1677-1683)。在 1991 年通過測序方法揭不 Flk-1的序列(Mathhews W et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A, 88:9026-9030)。這些研究已經(jīng)證明KDR是FLK-1受體的人類類似物。此外，KDR和FLK-1受體也被稱為VEGFR2。
最重要的VEGF受體是KDR (VEGFR-2)，其負責內(nèi)皮細胞的增殖和趨化作用(Ferrara N et al., 2003, Nat Med.，9，669-676，)。在血管內(nèi)皮細胞和造血細胞中VEGFR-2 (激酶插入結(jié)構(gòu)域受體/KDR)以高水平表達(Asahara T.，etal.,1997,Science,275, 964-967、Ziegler B1.et al.,1999,Science, 285, 1553-1558、Peichev M., et al.，2000，Blood, 95，952-958)。存在于KDR的細胞外部分中的7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域使得來自環(huán)境的信號能夠被轉(zhuǎn)導到細胞的細胞質(zhì)中。KDR的細胞內(nèi)部分介導了細胞質(zhì)內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。因此，以抑制VEGF和KDR的相互作用為目標的任何分子應(yīng)該靶向受體的1-7個免疫球蛋白樣細胞外結(jié)構(gòu)域(LU D.ve ark.，2000, JBC, 275，14321-14330)。目前進行的幾項研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多類型的癌癥中VEGF增加，如膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金病、和骨髓瘤(Ranieri G et al., 2006, Curr Med Chem.，13，1845-1857)。因此，在血管生成的抑制中VEGF和VEGF受體是優(yōu)先的目標。通過從不同角度抑制由VEGF結(jié)合到具有針對VEGF和VEGF受體開發(fā)的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)皮細胞上的跨膜酪氨酸激酶受體上所觸發(fā)的信號通路，可以防止VEGF起作用。雖然與VEGFR-2 (KDR)相比，VEGF對VEGFR-1 (Flt-1)的結(jié)合親和力高50倍，由于其與KDR的關(guān)聯(lián)，發(fā)生VEGF的血管生成特性、內(nèi)皮細胞增殖以及其對趨化作用的影響(Cross M.et al., 2003, Trends in Biochemical Sciences、28.488-494)。已經(jīng)證明當將編碼VEGFR2的質(zhì)粒給予缺乏VEGFR2的豬主動脈內(nèi)皮細胞時，這些細胞經(jīng)歷有絲分裂并參與趨化作用(Shibuya M et al.，1990，Oncogene, 8:519-524)。一些小鼠上的研究顯示，在VEGFR2缺乏或缺陷表達方面這些動物缺乏有組織的血管。Shalaby等人展示由于內(nèi)皮細胞和造血祖細胞的發(fā)育缺陷，在胚胎早期缺乏VEGFR2表達的小鼠胚胎死亡(Shalaby F etal.，1995, Nature.376(6535):62_6)。使用這個實驗，已經(jīng)證明阻斷VEGF與KDR之間的聯(lián)系在血管生成的抑制方面是很重要的。1971年，J.Folkm an認定，腫瘤的生長依賴于由位于腫瘤附近的血管發(fā)育的新生毛細血管帶來的氧氣和能源并宣稱在防止癌癥發(fā)展中，血管生成抑制的嘗試可能是有效的方法。腫瘤生長與血管生成活性的密切結(jié)合導致研究血管生成藥劑作為癌癥治療中的治療的另外的選擇。在體內(nèi)開發(fā)的抗VEGF的抗體抑制腫瘤生長的事實的說明(Kim KJ etal.，1993, Nature362:841-844)已顯示在治療中VEGF拮抗劑可以作為腫瘤血管生成的抑制劑?，F(xiàn)今，在血管生成的抑制中并因此在腫瘤學中，VEGF和VEGF受體是優(yōu)先的目標(Ferrara N and Kerbel R.S., 2005, Nature.438:967-974)。近年來已經(jīng)開發(fā)了基于阻斷VEGF/受體的關(guān)系的幾種抗血管生成策略。在此框架內(nèi)，這類多種結(jié)構(gòu)，如防止VEGF/KDR相互作用和/或抑制KDR信號傳輸用于抑制血管生成和腫瘤的抗 VEGF 抗體(Kanai et al., 1998, J.Cancer77, 933-936、Margolinet al., 2001, J.Clin.0ncol.19, 851-856)；抗 KDR 抗體(Zhu et al., 1998, CancerRes.58，3209_3214、Zhu et al., 2003, Leukemial7, 604-611>Prewett et al., 1999, CancerRes.59, 5209-5218)；抗 VEGF 免疫毒素(Olson et al.1997, Int.J.Cancer73, 865-870)；核酶(Pavco et al., 2000, Clin.Cancer Res.6，2094-2103);可溶性受:體(Holash etal., 2002, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99, 11393-11398);酪氨酸激酶抑制劑(Fong etal., 1999, Cancer Res59, 99-106、Wood et al., 2000, Cancer Res60, 2178-2189、Grosioset al.，2004，Inflamm.Res.53 (4): 133-42);抗 VEGF 反義(Forster et al.2004, CancerLett.20; 212 (I):95-103);和 RNA 干擾(Takei et al.2004, Cancer Res.64 (10): 3365-70、Reich et al., 2003, Mol Vis9:210_6)。已經(jīng)增強了通過靶向VEGF和受體集中于抑制血管生成的研究。為此，已經(jīng)開發(fā)了許多策略。rhuMab VEGF (貝伐珠單抗)(Bevacizumab),具有抗血管生成和抗腫瘤活性的重組人類單克隆 VEGF 抗體(Monk B.J.et al.，2005，Gynecologic Oncology, 96，902-905，)，和2006年由Wu Y等人針對VEGFR-l’e開發(fā)的單克隆人類抗體(Wu Y，et al., 2006Clin.Cancer Res.，12 (21)，6573-84)是最重要的。結(jié)果顯示，具有結(jié)合至人IgGl恒定區(qū)的VEGFRl和VEGFR2雜交結(jié)構(gòu)的VEGF-Trap神經(jīng)膠質(zhì)瘤-動物模型可以用于治療初期和晚期的腫瘤(Gomez-Manzano C.et al., 2008, Neuro-Oncology, 10, 940.) 雷珠單抗(ranibizumab),48kDa,由抗-VEGF單克隆抗體的Fab (抗原結(jié)合)部分組成，比其從中衍生的單克隆抗體貝伐珠單抗(148kDa)更輕和更薄，并且因此，在玻璃體內(nèi)應(yīng)用中能夠通過內(nèi)膜并抑制所有 VEGF 亞型(Gaudreault J.et al., 1999, Am Assoc Pharm Sci Pharm SciSuppl, I, 2142)?，F(xiàn)今，在雷珠單抗用于治療老年相關(guān)的黃斑變性的用途中已獲得了有前途的結(jié)果(Rosenfeld P.J., et al.，2006，N Engl J Med.，355，1419-1431 )。除了單克隆抗體結(jié)構(gòu)，使用小分子(例如通過作為VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑起作用的VEGF拮抗劑)也是可能的。在由Bainbridge J.ff.B.等人在2003年進行的研究中，體外確定了通過從其中VEGF分子與KDR相互作用的外顯子6區(qū)域中分開通過阻斷VEGF與其受體相互作用抑制血管生成的7個氨基酸結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的肽結(jié)構(gòu)。最近，舒尼替尼和索拉非尼，兩種小分子VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)開始用于癌癥治療(K0 J.S etal.,2009,Clin.Cancer Res.，15(6)，2148-2157，、Jilaveanu L.et al., 2009, ClinicalCancer Research, 15, 1076)。近年來，隨著基因工程的發(fā)展，已經(jīng)可以形成模仿抗體分子的抗原識別的功能性重組抗體片段。作為抗體片段表達，單鏈可變區(qū)片段經(jīng)由肽橋通過結(jié)合重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')而組成。這些抗體片段稱為單鏈可變區(qū)片段(scFv)(美國專利號4，946778Lander et al.;W088/09344, Huston et al.)。因為 ScFv 結(jié)構(gòu)包含抗原結(jié)合可變區(qū)(Fv)，它們具有以最小結(jié)構(gòu)提供抗體分子的結(jié)合特征的特性。另一方面，單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)構(gòu)可以有效地結(jié)合到靶抗原結(jié)構(gòu)上。1993年，Jeffrey等指出在開發(fā)的抗地高辛抗體的地高辛結(jié)合中，重鏈是重要W (Jeffrey, P.D.et al.Proc.Nat.Acad.Sc1.，USA1993, 90:10310-103149)。在最近的研究中已證明由開發(fā)的抗表皮生長因子受體(EGFR)的抗體的重鏈可變區(qū)片段組成的“納米體”(nanobody )結(jié)構(gòu)阻止了表皮生長因子(EGF )結(jié)合到EGFR上(Roovers R.etal., 2007, Cancer Immunologyl5:303-317)。在卩遼菌體展不技術(shù)中，ScFv在絲狀卩遼菌體的表面上出現(xiàn)(W092/01047Mc Cafferty et al.)。使用該方法可能開發(fā)抗VEGFR的納米抗體結(jié)構(gòu)。然而，從約15KD的納米抗體結(jié)構(gòu)的循環(huán)中快速去除導致在治療應(yīng)用中的保留。然而，通過將它們重建為50kD的多價態(tài)，這些納米抗體結(jié)構(gòu)能夠在循環(huán)中停留更長的時間以確保它們提供結(jié)合到白蛋白上的特征(Tijink B et al.2008, Mol CancerTherapy.7(8):2288-2297)。在噬菌體展示技術(shù)中絲狀噬菌體的使用帶來了多種優(yōu)點。來自培養(yǎng)上清的噬菌體顆粒的易純化性、遺傳和序列數(shù)據(jù)的可接入性、以及使用“生物淘洗”(生物淘選，biopanning)”方法從眾多抗原中選擇可以識別祀抗原的少數(shù)曬菌體克隆的機會是這些優(yōu)點的一部分。為了利用噬菌體展示技術(shù)中的這些便利，優(yōu)選包含噬菌體復制起點和質(zhì)粒復制起點的噬粒載體。這些噬粒載體中的多克隆位點(MCS)位于屬于噬粒的鞘結(jié)構(gòu)蛋白(如，gill)的基因的起始位點處。因此，由于鞘蛋白的融合而獲得的產(chǎn)物可以模仿位于在正常的環(huán)境中在免疫系統(tǒng)中存在的B-淋巴細胞的表面上的抗體。然而，這個過程取決于宿主細菌如何讀取位于抗體基因和gill之間的琥珀終止密碼子。如果噬菌體supE生長于抑制性宿主(例如，大腸桿菌TGl)上，抗體片段融合至較小鞘蛋白上并停留在噬菌體表面上。噬菌體表面上的這種結(jié)構(gòu)可以作為檢測如B表面抗體的外來結(jié)構(gòu)的受體。如果噬菌體生長于非抑制性(sup_)大腸桿菌菌株(如HB2151)上，則琥珀密碼子將被讀取為終止密碼子并且抗體顆粒將以可溶形式從細菌中分泌。這樣，使用噬粒載體模擬從漿細胞合成的抗體成為可能。當溶解在非-抑制性細菌中時，在噬粒載體上由6個組氨酸組成的區(qū)域，在克隆基因片段至多克隆位點表達后，能夠使用Zn++、Ni++或Co++帶電荷的親和柱從環(huán)境中容易地純化該重組蛋白(Weiner L.M, 1996，J.Mol.Biol.，255 (I)，28-43)。由于噬菌體展示技術(shù)的技術(shù)便利性，在許多學科中scFv結(jié)構(gòu)帶來了廣泛的利用機會。與整個抗體分子的約150kDa的尺寸相對，抗體的scFv結(jié)構(gòu)(其尺寸為約30kDa并且缺乏抗體的恒定區(qū)域和Fe部分)，正在越來越多地用于致力于診斷和治療的當代醫(yī)學研究中(Bradbury A.R.M.et al., 2004, Journal of Immunological Methods, 290，29-49)。本發(fā)明中提及的KDR1.3和2.6scFv抗體結(jié)構(gòu)通過結(jié)合至細胞表面上的VEGFR-2的細胞外部分(1-7免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)通過阻斷VEGFR-2的細胞內(nèi)信號傳導活性以及通過抑制VEGF依賴性細胞增殖提供了抗血管生成特性。本發(fā)明旨在解決的技術(shù)問題1971年，J.Folkman指出腫瘤生長依賴于由位于腫瘤附近的血管發(fā)展的新毛細血管攜帶的氧氣和 能源，并且宣稱在預防癌癥發(fā)展方面阻止血管生成的嘗試可能是有效的方法(Folkman J.，1971N Eng J Med.，285，1182-6)。多項研究已經(jīng)證明在癌癥治療中抗血管生成方法是有希望的(Kim KJ et al.，1993Nature362:841_844)。，癌癥發(fā)展(由于高死亡率導致的最重要的病理現(xiàn)象)與血管生成活性的緊密聯(lián)系特別地導致研究抗血管生成藥劑作為癌癥治療中的新選項。近年來，在血管生成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用的VEGF和VEGF受體已經(jīng)成為抗血管生成結(jié)構(gòu)的開發(fā)的目標。顯示開發(fā)的抗VEGF的結(jié)構(gòu)可能在癌癥治療中有效的第一個標記是獲自使用中和抗體創(chuàng)建的小鼠神經(jīng)母細胞瘤模型(Mordenti J, 1999ToxicolPathol.27(1): 14-21)。此項研究表明，抗VEGF中和抗體結(jié)構(gòu)阻斷腫瘤生長。此研究的結(jié)果鼓勵了旨在開發(fā)阻斷VEGF及其受體的結(jié)構(gòu)以阻止腫瘤生長的研究。這些研究有可能獲得可用于抗癌癥治療活性的新結(jié)構(gòu)，如抗-HIF (抗低氧誘導因子)藥劑、VEGF反義寡核苷酸、VEGF核糖體、可溶性VEGF受體、抗VEGF受體抗體、和VEGF DNA疫苗(Ferrara N.，etal.., 2003, Nat Med., 9, 669-676)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)開發(fā)的抗VEGF抗體減緩腫瘤生長(Hicklin etal.，2001，DTT6:517-528)。雖然在臨床實驗室診斷中廣泛使用小鼠單克隆抗體，在人類的治療應(yīng)用中它們的成功是有限的。主要的原因是在使用小鼠抗體治療的約80%的患者中，在反復給藥后激活了針對小鼠抗體發(fā)展的免疫應(yīng)答。此外，在人類免疫系統(tǒng)中小鼠抗體的Fe部分不太有效并且與人類抗體相比在治療應(yīng)用中小鼠抗體具有更短的半壽期。這些原因限制了小鼠抗體用于治療應(yīng)用。在2000年，Genetech Inc推出了重組人源化抗VEGF單克隆抗體結(jié)構(gòu)(貝伐珠單抗，美國專利號US6054297)。現(xiàn)在在結(jié)腸癌的治療中使用此抗體結(jié)構(gòu)并且正在其他類型的腫瘤細胞上進行試驗。據(jù)估計，基于貝伐珠單抗的治療帶來每位患者42.800至55.000美元的額外治療費用并且因此，僅在美國，對于晚期結(jié)腸癌治療將產(chǎn)生15億美元的額外支出。因此，需要開發(fā)新型抗血管生成結(jié)構(gòu)作為替代物，如重組抗體，其成本較低地在細菌中大量生產(chǎn)并且因此,將降低治療成本。迄今為止進行的各種研究已經(jīng)表明，在可以防止血管生成的新重組抗體結(jié)構(gòu)的識別中，噬菌體展示技術(shù)可以是一種有效的方法。用通過人胎盤堿性磷酸酶融合生產(chǎn)的KDR (KDR-AP)的胞外結(jié)構(gòu)域免疫BALB/c小鼠之后獲得了單鏈可變區(qū)片段形式的抗體結(jié)構(gòu)(W000/44777, Zhu Z，2000)。使用噬菌體展示技術(shù)并使用人類抗體庫，已開發(fā)了作為以Fab和嵌合抗體形式用于抗KDR抗血管生成應(yīng)用的候選物的抗體結(jié)構(gòu)(PCT/US03/06459，ZhuZ, 2003.)。與上文所述的針對抗血管生成應(yīng)用開發(fā)的研究不同，在此提供的本專利中，不使用尺寸約150kDa的抗體，在從使用重組KDR (1_7)在BALB/cJ小鼠中誘導免疫后開發(fā)的重組抗體庫中針對抗KDR (1-7)進行選擇之后，采用噬菌體展示法獲得尺寸為33kDa的重組單鏈可變區(qū)片段抗體。在這些抗體結(jié)構(gòu)的開發(fā)中使用的抗原和在選擇后獲得的重組抗體的互補決定區(qū)(CDR)的序列與上面提到的研究以及專利中的不同。


圖1:產(chǎn)生的抗KDR的scFv的可變輕鏈和重鏈的瓊脂糖凝膠電泳圖。l_pUC19/Hinf I 消化；2-VHPCR 產(chǎn)物；3_VlPCR 產(chǎn)物圖2:通過將可變輕鏈和重鏈與編碼(Gly4Ser)3的接頭連接產(chǎn)生的單鏈可變區(qū)片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。1-ScFv標記(marker) (750bp) ;2_ScFv庫；3_ScFv庫圖3:通過用KDR1.3scFv的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細菌獲得的隨機選擇菌落的菌落 PCR 結(jié)果。l-pUC19/Hinf I 消化；2_ScFv 標記(750bp);3_ 對照 ScFv 的 PCR ;4_PCR的陰性對照；5_空；6-菌落PCR ;7_菌落PCR ;8_菌落PCR ;9_菌落PCR; 10-空；11-菌落PCR ; 12-菌落 PCR; 13-菌落 PCR ;14_ 菌落 PCR (存在 KDR1.3scFv)。圖4:通過用KDR2.6scFv的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細菌得到的隨機選擇菌落的菌落PCR結(jié)果。l-pUC19/Hinf I消化；2-ScFv標記(750bp);3_PCR的陰性對照；4_對照ScFv 的 PCR ；5-空；6_ 菌落 PCR ;7_ 菌落 PCR ;8_ 菌落 PCR ;9_ 菌落 PCR ; 10-空；11-菌落PCR (存在印! 2.68。 ￥);12-菌落？0 ;13-菌落？0 ;14-菌落？0 (存在 KDR1.3scFv)。圖5:KDR1.3 和 KDR2.6scFv 克隆的 BstnI 消化曲線。1-標記；2_KDR1.3scFv ；3-Bstn I 消化的 KDRl.3scFv ;4_Bstn I 消化的 KDR2.6scFv ;5_KDR2.6scFv。圖6:KDR1.3scFv的DNA序列和由MGT網(wǎng)站預測的CDR區(qū)域的位置。圖7:KDR2.6scFv的DNA序列和由MGT網(wǎng)站預測的CDR區(qū)域的位置。

圖8 =KDRl.3重組抗體的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。A ;純化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色。B ;純化的KDR1.3scFv的蛋白質(zhì)印跡分析。對于兩塊凝膠上樣順序和上樣量是相同的。1-標記(Fermentas SM0441);2_誘導4小時后的沉淀物,T4 ；3-第一步純化后的上清液；4_第二步純化后的上清液；5_第三步純化后的上清液；6-第四步純化后的上清液；7_第五步純化后的上清液；8_第六步純化后的上清液；9_第六提取步驟后的沉淀物；10_對照ScFv (Lig7)。圖9:KDR2.6重組抗體的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。A ;純化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色。B ;純化的KDR2.6scFv的蛋白質(zhì)印跡分析。兩塊凝膠的上樣順序和上樣量是相同的。1-標記(Fermentas SM0441) ;2_誘導4小時后的沉淀物，T4;3-第一步純化后的上清液；4_第二步純化后的上清液；5_第三步純化后的上清液；6-第四步純化后的上清液；7_第五步純化后的上清液；8_第六步純化后的上清液；9_第六提取步驟后的沉淀物；10_對照ScFv (Lig7)。圖10 =TALON親和柱純化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。A ；TALON親和柱純化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色。B ；TALON親和柱純化的KDR1.3scFv的蛋白質(zhì)印跡分析。兩塊凝膠的上樣順序和上樣量是相同的。1_標記(Fermentas SM0441) ;2_第六步純化后透析的上清液；3_第一 TALON親和柱洗脫管；4_第二 TALON親和柱洗脫管；5_第三TALON親和柱洗脫管；6-第四TALON親和柱洗脫管；7_第五TALON親和柱洗脫管；8_第六TALON親和柱洗脫管；9_第七TALON親和柱洗脫管；10_對照 ScFv (Lig7)。圖11:TAL0N親和柱純化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。A ；TALON親和柱純化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色。B ；TALON親和柱純化的KDR2.6scFv的蛋白質(zhì)印跡分析。兩塊凝膠的上樣順序和上樣量是相同的。1_標記(Fermentas SM0441) ;2_第六步純化后透析的上清液；3_第一 TALON親和柱洗脫管；4_第二 TALON親和柱洗脫管；5_第三TALON親和柱洗脫管；6-第四TALON親和柱洗脫管；7_第五TALON親和柱洗脫管；8_第六 TALON親和柱洗脫管；9_第七TALON親和柱洗脫管；10_對照 ScFv (Lig7)。圖12:TALON 純化的 KDR1.3,2.6 和 Lig7 (對照)scFv 的 ELISA 結(jié)果。A ;以黑色箭頭顯示用抗原涂覆過夜的孔。以紅色箭頭顯示在抗原涂覆后添加抗體。B ；A中提及的孔的 ELISA 0D405 值。圖13:通過細胞增殖測定重組抗體對VEGF-HUVEC相互作用的影響。在含有2%FBS和兩種不同濃度(0.1和I ii g/ml)的多種抗體(如Ab293、KDRl.3,2.6和作為陰性對照scFv的Lig7)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自第5代的HUVE細胞。圖14:角膜血管生成應(yīng)用的示意圖和照片圖(Konya D.et al, Neurosurgery, 2005,Volume56, No:6，June p:1339-1346)。圖15:在角膜血管生成模型上抗體的抗血管生成作用。在第3、5、7和9天重組抗體對移植在大鼠角膜中的動靜脈畸形組織的血管生成抑制作用實驗的大鼠角膜照片。圖16:抗體的抗血管生成作用之間的差異。在第3、5、7和9天重組抗體對移植在大鼠角膜中的動靜脈畸形組織的血管生成抑制作用的實驗期間內(nèi)形成的血管數(shù)。表1:用于選擇和富集可結(jié)合至sKDRl-7的scFv的生物淘洗步驟。
具體實施例方式本發(fā)明提供了通過結(jié)合到細胞表面上的VEGFR2 (1-7免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的細胞外部分上通過阻斷VEGFR-2的細胞內(nèi)信號傳導活性以及通過抑制VEGF依賴性細胞增殖具有血管生成特性的重組抗體結(jié)構(gòu)。已經(jīng)使用抗體阻斷了血管生成。針對抗血管生成實踐開發(fā)的市售抗VEGF抗體，由于其148kDa的分子量，不能進入視網(wǎng)膜并難以通過血管內(nèi)皮。然而，具有低分子量的小重組抗體結(jié)構(gòu)沒有這些缺點。通過以上的研究已經(jīng)證實，在抑制血管生成的定義的新抗體片段中噬菌體展示技術(shù)可能是有效的方法。然而，迄今為止，分離的抗血管生成抗體片段是例如人類抗 VEGF 重組抗體(Zhihua et al Appl Biochem Biotechnol (2008) 144:15-26)、針對VEGFR2_Fc融合蛋白篩選的抗VEGFR2Fab片段、雙特異性抗體(Shen et al: the journalof biological chemistry vol (2006) 281，16: 10706-10714，)或使用 KDR-AP免疫獲得的單鏈小鼠抗體(Zhu et al, 1998, Cancer Res.58，3209-3214)。由于 VEGF 與 KDR 細胞外 1-7結(jié)構(gòu)域的關(guān)系產(chǎn)生VEGF的血管生成特征、內(nèi)皮細胞增殖及其對細胞趨化的作用。在本發(fā)明中，VEGFR2的可溶性細胞外1-7結(jié)構(gòu)域可用于免疫以及用于篩選噬菌體展示抗體庫。因此，發(fā)現(xiàn)阻斷VEGF活性的重組抗體、確定編碼該抗體結(jié)構(gòu)的核苷酸序列、定義編碼這些序列的新噬菌體、開發(fā)通過消除VEGF與其受體之間的相互作用用于抑制內(nèi)皮細胞增殖的抗體結(jié)構(gòu)的血管生成的新方法，是本發(fā)明的目標。術(shù)語“重組抗體”是指全抗體和任何抗原結(jié)合片段(S卩，“抗原結(jié)合部分”，“抗原結(jié)合多肽”或“免疫粘合劑”)或其單鏈。術(shù)語“抗原結(jié)合”是指特異性地結(jié)合至抗原的能力。已經(jīng)證明，抗體的抗原結(jié)合功能可以由以下各項完成:全長抗體的片段、由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段、(V)單個結(jié)構(gòu)域或由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward et al., (1989) Nature341:544-546)、和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)或(vii)可任選地通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域，VL和VH，由單獨的基因編碼，它們可以使用重組方法通過使它們能 夠成為單個蛋白鏈的合成接頭結(jié)合，其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈 Fv (scFv)，參見例如，Bird et al.(1988) Science242:423-426 ;和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且使用與完整抗體相同的方式篩選片段以便使用。本發(fā)明的范圍內(nèi)所用的術(shù)語抗體是指scFv抗體或結(jié)合選定抗原的抗體片段。因此，本發(fā)明的scFv抗體可以是包含VL和VH結(jié)構(gòu)域的全scFv，它們由包含序列GGGSGGGGSGGGGSSGGGS (SEQ ID No: 33)的接頭的短連接肽連接。VL和VH的連接可以是任一方向，VL-接頭-VH或VH-接頭-VL0在本發(fā)明中，scFv結(jié)構(gòu)是VH-接頭-VL方向?？梢赃M一步將VH和VL區(qū)細分為高度可變區(qū)域，稱為互補決定區(qū)(⑶R)，被更保守的、稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域穿插其中。每個VH和VL由3個⑶R和4個FR組成，它們按照以下順序從氨基末端到羧基末端排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的多肽可以包含在一個或更多非必需氨基酸殘基上的保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲杏镁哂蓄愃苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代氨基酸殘基的一種取代。現(xiàn)有技術(shù)中定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、^ -支鏈的側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選地使用來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基取代多肽中的非必需氨基酸殘基。在另一個實施方式中，可以使用順序和/或組合不同的側(cè)鏈家族成員的結(jié)構(gòu)類似序列替換氨基酸序列?？商娲?，在另一個實施方式中，可以沿免疫球蛋白編碼序列的全部或部分隨機引入突變，如通過飽和誘變，并且得到的突變體可以結(jié)合到本發(fā)明的多肽中并篩選其結(jié)合到所希望的目標上的能力。在本發(fā)明的另一方面中，KDR1.3和KDR2.6scFv具有79%的對比得分。在本發(fā)明中提到的兩個scFv的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)顯示90%的對比得分并且重鏈可變結(jié)構(gòu)域顯示了 60%的對比得分。在KDR1.3和KDR2.6scFv以及Zhu等人于2000年取得專利權(quán)(W000/44777)的scFv的⑶R區(qū)之間比較了互補決定區(qū)(⑶R)的序列。對于⑶RLl區(qū)域，在KDR1.3和KDR2.6(SEQ No:4和SEQ No:20)之間發(fā)現(xiàn)完全比對，并且發(fā)現(xiàn)Zhu的scFv的CDRLl區(qū)域的一部分包含與SEQ No:4和 SEQ No:20相同的序列。Zhu的scFv的CDRL2區(qū)域與KDR2.6CDRL2區(qū)域(SEQ No:21)具有75%的比對得分并且與KDR1.3CDRL2區(qū)域(SEQ No:5)具有66%的比對得分。對于CDRL2區(qū)域，KDR1.3和KDR2.6的scFv的比對得分為66%。KDR1.3和KDR2.6的CDRL3區(qū)域與Zhu的scFv的CDRL3區(qū)域比對，具有55%的得分但是對于KDR1.3和KDR2.6之間相同區(qū)域比對得分僅為22%。三個⑶RL3區(qū)域具有全部9個氨基酸，并有共有序列(-Q-S—T)，這可能意味著對于scFv與KDR的相互作用，谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸氨基酸是重要的。在KDR1.3與Zhu的scFv的⑶RH3區(qū)域之間僅有50%的相似性。與用于識別KDR分子的重鏈可變區(qū)相比，這些結(jié)果表明輕鏈可變區(qū)和其CDR區(qū)的高度序列保守性。本發(fā)明包括與公開的任何一種VL序列結(jié)合的公開的任何一種VH序列，只要保持目標結(jié)合特異性即可。主要通過ELISA方法檢測了結(jié)合至VEGFR-2的噬菌體，用來檢查關(guān)于VEGF與在其表面上表達VEGF受體的人臍帶內(nèi)皮細胞(HUVEC)之間相互作用的阻斷特性的它們的先前發(fā)現(xiàn)。作為ELISA的結(jié)果，定義了 KDR1.3和KDR1.6，檢測了它們對細胞增殖的影響，并且這兩種重組體均顯示對細胞增殖具有不利影響。本發(fā)明的一個方面，提供了特異地結(jié)合VEGFR-2并在體外抑制VEGF誘導的內(nèi)皮細胞增殖以及體內(nèi)血管生成的重組抗體(KDR1.3和KDR2.6)。證實了在體內(nèi)模型中在大鼠角膜上它們的抗血管生成作用。這種方法具有以下優(yōu)點:新血管很容易被檢測到，并且在正常的血管性角膜中基本上必須是新形成的血管。統(tǒng)計評價顯示KDR1.3和KDR2.6抗體的抗血管生成活性是統(tǒng)計顯著的(KDR1.3 ；P<0.05和KDR2.6 ；P<0.05)。但當使用KDR2.6抗體時發(fā)生大鼠死亡。體內(nèi)實驗表明，KDR1.3抗體是體內(nèi)使用的最有效的抗血管生成的分子。結(jié)論表明，兩種重組抗體均具有對VEGF活性的拮抗劑作用，它們被認為是血管生成抑制劑。實施例實施例部分包括重組抗體的結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生、表達、質(zhì)量控制和抗體結(jié)構(gòu)對細胞增殖的作用檢測以幫助理解本發(fā)明。實施例包括在本發(fā)明的過程中使用的常規(guī)的(已知的)方法如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、基因轉(zhuǎn)移進入載體、重組載體轉(zhuǎn)化導入宿主細菌。這些方法中已在多種出版物中描述(Samsbrook, J.，F(xiàn)ritsch, E.F and Maniatis, T.(1989)Molecular Cloning:2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)并且為此目的將不在實施例部分中對其進行描述。免疫對于免疫研究，使用了 3只7周齡雄性Balb/cJ小鼠。通過在每只小鼠的臂凹皮膚(腋窩皮膚，arm pit skin)下注射 300 y I 含有 150 y I 的 PBS和 150 y I 含有 10 y g sKDRl-7(重組人(SVEGFR2) sKDR DL-7，Research Diagnostics Inc)的弗氏完全佐劑的溶液完成第一次注射。在第一次免疫后第三周，制備相同量的混合物，并通過使用弗氏不完全佐劑注射到小鼠體內(nèi)。第二次免疫后的一個月休息期后兩只小鼠經(jīng)受從尾靜脈注射150iU含有IOug sKDRDl-7的PBS溶液。四天后獲取這些小鼠的脾臟以獲得總RNA。RNA 提取使用EZ-RNA 總 RNA 提取試劑盒(Biological Industries, Israel)用于從脾臟中分離總RNA。在Iml “變性溶液”中將小鼠脾臟均化(Janke&Kunkel Ika Werk RW20)。勻漿組織在室溫下孵育5分鐘后，加入Iml “提取溶液”并且將樣品充分混合15秒。此后將樣品在室溫下孵育10分鐘然后將其在12000g、+4° C下離心15分鐘。離心后將上清轉(zhuǎn)移到新的試管中并且加入Iml異丙醇(Merck)并混合樣品。將樣品在室溫下孵育10分鐘后，樣品在12000g、+4° C下離心8分鐘。除去上清液并通過渦旋使用2ml的75%乙醇(Merck，目錄號1009862500)洗滌RNA沉淀物(pellet)。含有RNA的試管在7500g、+4° C下離心5分鐘并且將沉淀物放置在室溫下干燥。添加100 U I DEPC處理的dH20后，試管在55° C下孵育15分鐘以溶解RNA。VH和VL庫構(gòu)建在用目標分子sKDR”免疫后，獲取Balbc/J小鼠的脾臟并分離總RNA。分光光度法檢查RNA并且OD26tlAD28tl比率計算為1.9。使用以六聚體引物為基礎(chǔ)的標準方法(Samsbrook, Cold Spring Harbor Laboratory Pressl989, second edition)從獲得的總RNA中產(chǎn)生cDNA。產(chǎn)生的cDNA用作模板用于通過PCR擴增免疫球蛋白重鏈(VH，340bp)和輕鏈(VL，325bp)可變區(qū)。在含有5 ii ITaq 聚合酶緩沖液(10X)、3ii IMgCl2 (25mM)U U ldNTP/10mM (每種)、lyl 重鏈引物 I (Amersham Pharmacia, 27-1586-01 )、I U I 重鏈引物 2 (AmershamPharmacia, 27-1586-01 )、2 U I 模板 cDNA、I U I 的 Taq 聚合酶(IU/U I) (Fermentas)的50u I總體積中進行重鏈(Vh)可變區(qū)擴增。在包含1139聚合酶緩沖液(10父)、311 IMgCl2 (25mM)U U ldNTP/lOmM (每種)、Iyl 輕鏈引物混合物(Amersham Pharmacia, 27-1583-01 )、2 U I 模板 cDNA、l U I Taq 聚合酶(IU/ u I) (Fermentas)的50 y I總體積中進行輕鏈(Vlj)可變區(qū)擴增。用于重鏈(Vh)和輕鏈(')可變區(qū)擴增的PCR程序設(shè)定為在94° C下孵育5分鐘并且進行30個循環(huán)，每個循 環(huán)對應(yīng)于在94° C下lmin、在55° C下2min和在72° C下2min。通過在72° C下孵育10分鐘完成PCR反應(yīng)。在1.5%瓊脂糖凝膠上檢查PCR產(chǎn)物。使用BioRad Gel Doc2000成像系統(tǒng)(圖1)分析DNA降解或DNA斷裂。單鏈可變區(qū)片段(SCFV)庫構(gòu)建
為了獲得，使用“羅氏瓊脂糖凝膠DNA提取”試劑盒(ROCHE AGAROSE GEL DNAExtractionK IT, CATALOG NO: 1696505)從瓊脂糖凝膠進行條帶分離從而獲得340bp的Vh和325bp的\的純PCR產(chǎn)物。通過兩階段PCR反應(yīng)進行單鏈可變區(qū)片段(scFv)的構(gòu)建。第一階段，在包含5iil Taq 聚合酶緩沖液(10X)、3iil MgCl2 (25mM)Uu IdNTP/10mM (每種)、3y IVhPCR 產(chǎn)物(IOOng/y I )、3y IVlPCR 產(chǎn)物(IOOng/y I )、4y I 接頭引物(Amersham Pharmacia, 27-1588-01 )、I U ITaq 聚合酶(IU/U I) (Fermentas)的總計50 ii I反應(yīng)混合物中進行。將包含該反應(yīng)混合物的試管放入Biometra Trioblock加熱塊設(shè)備中并應(yīng)用7個循環(huán)的反應(yīng)程序(94° C，1分鐘，63° C，4分鐘)。在第二階段，在7個循環(huán)結(jié)束時將50iU的混合物(34iU dH20、5iil Taq聚合酶緩沖液(10X)、3iU氯化鎂(25mM)> I u I dNTP/10mM(每種)、4 u I RS 引物混合物(Amersham Pharmacia, 27-1589-01),Iul Taq聚合酶(IU/ill XFermentas))添加至反應(yīng)混合物中。然后應(yīng)用25個循環(huán)(94° C下lmin、55° C下2min、72° C下2min。)的反應(yīng)程序。在1.2%瓊脂糖凝膠(圖2)中檢測ScFv PCR產(chǎn)物。分別用SfiI和NotI消化ScFv結(jié)構(gòu)和pDUCK載體并且隨后彼此連接。連接后，在70° C下孵育連接產(chǎn)物10分鐘并轉(zhuǎn)移到大腸桿菌TGl細菌中。感染性噬菌體的生產(chǎn)將含有scFv庫的細菌接種至5ml LB培養(yǎng)基(對于1L2 X TY:1Og細菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg NaCl)中并在37° C和220rpm (孵育搖床,Innova)下孵育過夜。第二天，以1:100的稀釋系數(shù)將過夜培養(yǎng)物接種到50ml的2XTY/Amp培養(yǎng)基中并且在37° C和220rpm (孵育搖床，Innova)下孵育該培養(yǎng)物直到O D_值達到0.5。當培養(yǎng)物O D6tltl值達到0.5時，將IOml的細菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到含有IO11Cfu M13K07輔助噬菌體的新的50ml2XTY/Amp培養(yǎng)基中并且在37° C、不震蕩下孵育該培養(yǎng)物45min然后在37° C、220rpm振蕩下孵育45min。孵育后在室溫下在3000g (Sorvall RC5C+)下離心細菌培養(yǎng)物IOmin并棄去上清液。在30ml2XTY/Amp/Kan培養(yǎng)基(對于I升2XTY:1OOmg氨芐青霉素和50mg卡那霉素)中重新懸浮沉淀物，并在3 7° C、220rpm下孵育過夜。第二天在+4° C下在7000g (冷凍離心機，Sorvall RC5C+)下離心細菌培養(yǎng)物lOmin。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中并在相同條件下再次離心。將20ml的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中并加入5ml的PEG/NaCl(20% (w/v)聚乙二醇6000、2.5M NaCl)0在冰上孵育該混合物兩小時用于噬菌體沉淀。然后在+4° C下在7000rpm (冷凍離心機，Sorvall RC5C)下離心卩遼菌體45min并棄去上清液。用 Iml 的 PBS (3.2mM Na2HPO4X2H20、1.4mM KH2PO4,2.7mM KCl、137mM NaCl)溶解沉淀物并轉(zhuǎn)移至無菌微量離心管中。懸浮液與250 iUPEG/NaCl (20% (w/v)聚乙二醇6000、
2.5M NaCl)混合然后在冰上孵育30分鐘。懸浮液在+4° C、7000rpm下(Microsantrifuge,Eppendorf，5415C)離心 20 分鐘并棄去上清液。使用 200 U I 的 PBS(3.2mM Na2HPO4X 2H20、1.4mM KH2PO4,2.7mM KCl、137mM NaCl)溶解沉淀物并進行噬菌體滴定用于測定噬菌體量。噬菌體滴定對于噬菌體滴定，首先制備基本平板。對于IOOml的基本培養(yǎng)基:50ml的2XM9培養(yǎng)基(12g Na2HPO4.2H20、6g KH2HPO4Ug NaCl、2gNH4Cl 達到 I 升并在 121° C 下高壓滅菌20分鐘)與50ml融化的3%瓊脂、200 u IlM MgSO4和10 yl CaCl2混合。當混合物冷卻后，加入2ml過濾滅菌的(0.22 u M TPP,目錄號:99522)葡萄糖(20%)和IOOyl過濾滅菌的(0.22 u M TPP,目錄號:99522)硫胺(Sigma T4625，10mg/ml)并將培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿(petridishes，皮氏培養(yǎng)皿)上。將F’雄性細菌(大腸桿菌TGl)鋪涂在含有基本培養(yǎng)基的平板上并在37° C下孵育過夜。第二天，挑選一個F’雄性細菌(大腸桿菌TGl)菌落并接種到LB培養(yǎng)基中(對于I升:10g細菌用胰蛋白胨(BD，目錄號:21705)、5克酵母提取物(BD，目錄號:211929)、10g NaCl (Applichem，目錄號:A2942)。在 37。C 下，在培養(yǎng)搖床(Innova，4230)中孵育細菌直到OD6tltl值達到0.5 (Smart Spec 3000BioRad)。在等待步驟中，使用PBS (8mM Na2HPO4UmM KH2PO4,2.7mM KCl 和 137mM NaCl)制備適當?shù)氖删w稀釋液(10'10_4'10_6、10_8、10_1CI)。當細菌的 0D_ 值達至Ij 0.5 時(Smart Spec 3000BioRad)，將 IOOu I的細菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入無菌微離心管中。將10 ill的每個稀釋的噬菌體與細菌混合并在37° C下孵育30分鐘。當孵育結(jié)束時，將感染的細菌鋪涂在LB/Amp平板上(I升融化的LB/瓊脂與IOOmg氨芐青霉素混合)并且在37° C下將平板上下倒置地放在培養(yǎng)箱(Nuve EN500)中過夜。第二天對形成的細菌菌落的數(shù)量進行計數(shù)并確定原液的噬菌體濃度。使用生物淘洗(B10PANNING)選擇對KDR具有特異性的重組噬菌體根據(jù)Smith et al.1993 (Smith, G.P., and Scott, J.K.1993, Librariesof peptides and proteins displayed on fiamentous phage.1n methods inEnzymology217:228-257)完成VEGFR-2結(jié)合重組抗體的選擇。在此工作中，將含有250ng的SKDIV7的500 U I的涂覆溶液(0.1MNaHCO3, pH8.6)涂覆在生物淘洗管(75mmX 12mm免疫管,Nunc,Maxisorb)中。一天后，棄去涂覆溶液并使用封閉緩沖液(PBS+1% BSA)封閉免疫管一小時。在孵育結(jié)束時，用TPBS (PBS+0.1% [v/v]Tween-20)溶液洗滌免疫管 6 次。然后加入在 500 U I 的 TPBS (PBS+0.1% [v/v]Tween-20)中的IO11Cfu的噬菌體展示scFv庫)。在室溫下孵育2小時后，通過使用TPBS (PBS+0.1%[v/v]Tween-20)洗滌30次隨后使用PBS洗滌30次棄去未結(jié)合的噬菌體。在洗滌步驟之后，通過添加500 Ul的洗脫溶液(甘氨酸(0，2M PH:2.2)、lmg/ml BSA) (Roche,目錄號:735086)洗脫結(jié)合至目標 分子的噬菌體。使用75iU的IM Tris-HCl (pH9.1)中和含有噬菌體的洗脫溶液。通過洗脫的噬菌體的I U l>10u I和1/10 ii I的滴定獲得洗脫的噬菌體的量。擴增剩余的噬菌體用于第二生物淘洗步驟(表I)。在第二生物淘洗步驟后沒有觀察到sKDR結(jié)合噬菌體的增加但是在第三步驟后觀察到富集。在第三生物淘洗的洗脫步驟后，在37° C下孵育大腸桿菌TGl細菌30分鐘并且將細菌鋪涂在LB/Amp/瓊脂平板上。第二天通過菌落PCR法檢測在細菌菌落中scFv基因的存在。菌落PCR通過菌落PCR法檢測細菌菌落中scFv基因的存在。將從菌落中挑選的細菌溶解在含有15ii I蒸餾水的0.5ml Eppendorf離心管中。在95° C下孵育離心管3分鐘并離心，上層液體用作聚合酶鏈式反應(yīng)的模板。分別使用引物458:5’ttt tgt cgt ctt tec agacgt t3’和引物459:5’tat gac cat gat tac gee aag3’作為正向和反向引物。PCR程序設(shè)定為在94° C下5分鐘，然后94° C下lmin、55° C下2min，72° C下2min進行30個循環(huán)，然后是在72° C下10分鐘的延長步驟。PCR后，在1.2%瓊脂糖凝膠中檢查產(chǎn)物(圖3和圖4)并鑒定了兩個scFv克隆(KDR1.3和KDR2.6)。通過使用Bstn I酶消化scFv PCR產(chǎn)物通過DNA指紋法檢查了兩個克隆之間的差異并進行DNA指紋研究(圖5)。通過噬菌體ELISA法選擇能夠結(jié)合至VEGFR-2的噬菌體展示重組抗體
為了鑒定被確定為兩個不同的克隆的KDRl.3和KDR2.6的結(jié)合特性進行噬菌體-ELISA。為了獲得展示KDR1.3和KDR2.6的噬菌體，使用含有scFv基因的細菌以產(chǎn)生感染性噬菌體，在噬菌體ELISA試驗中使用感染性噬菌體。在+4° C下使用含有500ng的sKDRl-7的IOOu I的涂覆緩沖液(0.1M NaHCO3PH:8.6)涂覆96孔ELISA板的每個孔(Falcon，目錄號:353912)過夜。第二天使用 200 的 TPBS ( % 0.lTween20，含有 PBS(3.2mM Na2HPO4X 2H20、1.4mM KH2PO4,2.7mMKCU137mMNaCl ；pH7.4))洗滌孔三次，將 200 y I的封閉緩沖液(1% BSA+TPBS)加入到孔中并且在室溫下孵育板I小時。然后使用TPBS洗滌孔三次)并且加入含有展示VEGFR-2特異性重組抗體(IO11Pfu)的噬菌體的100 ill的封閉緩沖液(PBS+2%脫脂牛奶)，并在室溫下孵育2小時。孵育后，用TPBS洗滌孔6次，然后將含有1:1000稀釋的抗-M13辣根過氧化物酶結(jié)合的抗體(Pharmacia)的100 U I封閉緩沖液加入到各孔中。在室溫下孵育I小時后使用TPBS洗滌孔6次。將100 u I的ABTS (PharmaciaBiotech,目錄號27-9402-01)底物溶液加入各孔用于酶的檢測。在室溫下孵育I小時后，使用ELISA酶標儀(Bio-Tech ELISA酶標儀)讀取每個孔的0D405值。重組抗體的序列分析根據(jù)Beckman Coulter GenomeLab Methods Development 試劑盒(608000)方案完成對KDR1.3和2.6scFv的DNA測序反應(yīng)。分別使用引物459和458用于正向和反向讀數(shù)。使用CEQ8800Dye Terminator循環(huán)測序自動測序系統(tǒng)CEQ8800分析測序反應(yīng)。使用Workbench ^CLUSTALff-Multiple Sequence Aligment，，程序(http://workbench, sdsc.edu)相互比對屬于KDR1.3和2.6克隆的DNA序列并且序列差異證實了Bstn I酶的消化結(jié)果。在圖6和圖7中給出KDR1.3和KDR2.6的DNA序列。根據(jù)測序結(jié)果KDRl 3KDR2.6scFv 分別為 747bp 和 762bp 的長度。細菌中SCFV的生產(chǎn)、表達的SCFV的復性、折疊和純化在大腸桿菌細胞中重組抗體的生產(chǎn)為了生產(chǎn) 重組抗體，將在pDUCK噬粒載體中含有KDR1.3或2.6scFv克隆的每種大腸桿菌HB2151菌株接種于含有100 u g/ml氨芐青霉素的50ml的2XTY中并在30° C下生長過夜。第二天，將過夜培養(yǎng)物接種(OD6J).05)至含有IOOii g/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的新鮮的500ml的2XYT培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在37° C、250rpm下生長直到OD6tltl達到0.5-0.6。然后將細菌在室溫、3500rpm下離心10分鐘。將得到的沉淀物溶解在含有ImMIPTG(異丙基P -D-1-硫代吡喃半乳糖苷)和氨芐青霉素(100g/ml)的500ml的新鮮2 X TY培養(yǎng)基中并使其在 30° C、250rpm 下生長另外的 4h (SANCHEZ L, et al..J Biotechnol.，72 (1-2), 13-20, (1999))。培養(yǎng)物在4000rpm下離心IOmin并棄去上清液。為了檢測ScFv的生產(chǎn)，將在即將誘導前(Ttl)的和誘導4小時后(T4)獲取的試樣上樣至SDS-PAGE上。從細菌培養(yǎng)物純化重組抗體結(jié)構(gòu)誘導后，進行胞質(zhì)提取(periplasmic extraction)用于蛋白質(zhì)純化(Sanchez, 1999)。將細菌沉淀物重懸浮于5.3ml的TES (Tris-HCl和EDTA)中并在冰上孵育5min。然后加入6ml的胞質(zhì)提取緩沖液的1/3稀釋液并且在冰上偶爾搖動地孵育細菌20min。在+4° C下在14000rpm下離心細胞提取物lOmin。因為沒有在上清液中觀察到scFv，對沉淀物進行包涵體提取方案(DAS，2004)。首先，在5ml的含有0.2mg/ml的溶菌酶的裂解緩沖液(50mM Tris pH8.0、200mM NaClUmM EDTA)中溶解沉淀物并在冰上孵育30分鐘。在冰上對懸浮液進行超聲處理6次持續(xù)10秒。然后在+4° C下在12，OOOrpm下離心細菌懸浮液15min。將第一上清液儲存于+4° C。將沉淀物重新懸浮在12ml的含有0.2mg/ml溶菌酶的裂解緩沖液中。在室溫下孵育15分鐘后，進行第二超聲處理(6次，10秒)。在+4° C下在12000rpm下離心細菌懸浮液30分鐘。將第二上清液儲存于4° C。在12ml裂解緩沖液中重新懸浮沉淀物并在室溫下孵育15分鐘。然后超聲處理細菌懸浮液6次，每次10秒。超聲處理后加入SDS至I %的最終濃度并在室溫下孵育懸浮液30分鐘然后在+4° C下在12000rpm下離心30分鐘。將第三上清液儲存在+4° C。在12ml裂解緩沖液中重新懸浮沉淀物并在+4° C下在12000rpm下離心20分鐘。將第四上清液儲存在+4° C。在含有6M脲的50mM Tris緩沖液pH8.0中重新懸浮沉淀物并在冰上孵育45分鐘。然后在12000rpm下離心樣品30分鐘(DASA D.，et al.2004，J VirolMethods, 117(2)，169-77)。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析檢測在該純化過程中獲得的所有上清液。KDR1.3scFv和KDR2.6的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果分別示于圖8和圖9中。對于兩個克隆(KDR1.3和KDR2.6)，第六上清液含有最純的scFv，因此選擇這些上清液用于進一步的純化步驟。在+4° C下這些上清液針對含有L-精氨酸的再折疊緩沖液透析兩晚。然后這些上清液針對超聲緩沖液透析另外兩晚。透析后，使用金屬親和柱(TALON-BD Bioscience)進行樣品純化。對于這項研究,在50ml試管中在1300rpm下離心樹脂5分鐘并除去上清液。使用10樹脂體積的超聲緩沖液平衡該樹脂并在室溫下在1300rpm下離心3分鐘。棄去上清液，并在試管中加入透析樣品。孵育混合物30分鐘并隨后在室溫下在1300rpm下離心5分鐘。棄去上清液并且使用10樹脂體積的超聲緩沖液洗滌樹脂2次持續(xù)10分鐘。然后使用I體積的超聲緩沖液將樹脂重新懸浮并將懸浮液轉(zhuǎn)移到端蓋柱(end cap column)中。在漢析 樹脂后,用I樹脂體積的超聲緩沖液洗漆柱3次。然后使用5樹脂體積的IX洗脫緩沖液從柱中洗脫重組抗體。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析洗脫樣品。在圖10和圖11中示出KDR1.3和KDR2.6克隆的TALON純化結(jié)果。 為了分析在VEGF相關(guān)的HUVE細胞增殖測定上KDR1.3和2.6重組抗體的作用，使用開發(fā)的抗B型肝炎病毒表面抗原的Lig7重組抗體作為陰性對照。TALON純化的KDR1.3和2.6scFv和Lig7洗脫樣品的第二洗脫管針對PBS透析過夜并在細胞培養(yǎng)測定中以及過濾滅菌后使用。使用BCA法(Pierce23225)測定scFv濃度。在500ml的培養(yǎng)基中重組抗體的誘導過程后，獲得了 500 U 1TAL0N純化的scFv。純化的KDR1.3scFv的量在85ng/至156ng/iil之間變化并且具有120ng/iil的平均值并且對于KDR2.6，scFv的量在88ng/至125ng/iil之間變化并且具有105ng/iil的平均值。重組抗體純化產(chǎn)品的量和活性之間的差異可能由于在純化步驟期間抗體結(jié)構(gòu)折疊的差異引起 CWulfing, C.And Plunckthun, A., 1994，J.Mol.Biol.，242，655-669，)；DasaD., et al.2004, J Virol Methods, 117 (2)，169-77)。這些折疊的變化可能是由于序列的差異，這些序列差異還可能干擾宿主細胞的遺傳穩(wěn)定性(Knappik, A.，et al.1993, Bio/Technology, 11, 77-83)。通過ELISA測定可溶性KDR1.3和KDR2.6SCFV相對于可溶性KDR的結(jié)合特性通過ELISA法測定了 KDR1.3和KDR2.6scFv的結(jié)合特性。在+4° C下使用IOOyl靶抗原(0.5 u g)涂覆ELISA孔板的每個孔過夜。第二天使用200 U I的TPBS (含有PBS的0.1% Tween20)洗滌孔三次，然后在室溫下使用200 的封閉緩沖液(PBS+1 % BSA)封閉I小時。使用TPBS洗滌孔三次，然后將含有抗KDR重組抗體( I y g)或沒有重組抗體(作為陰性對照)的100 u I封閉緩沖液加入到孔中并在室溫下孵育2小時。孵育后使用TPBS洗滌孔6次，然后將含有1:5000抗Myc標記的辣根過氧化物酶結(jié)合抗體(Sigma)的100 yl封閉緩沖液加入到各孔中并在室溫下孵育I小時。使用TPBS洗滌6次后，將100 u I的ABTS底物溶液(Pharmacia Biotech，目錄號27_9402_01)加入各孔中。在室溫下孵育一小時后，使用ELISA酶標儀(Bio-Tech ELISA酶標儀)檢測各孔的OD405值。在圖12中給出ELISA的結(jié)果。當陰性對照的OD405值為約0.09時，KDR1.3、KDR2.6和Lig7的第二洗脫管的OD405值是0.250,0.512和0.605。因此可溶性表達的KDR1.3和KDR2.6scFv仍然結(jié)合至KDR并可以用于細胞培養(yǎng)實驗。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的分離和體外培養(yǎng)根據(jù)上面引用的描述獲得的重組抗體的預期特性是通過阻斷VEGFR-2的活性來抑制細胞增殖。為此目的，測定了對于抑制HUVEC增殖所必需的重組抗體濃度以及在體外細胞增殖試驗中抑制的百分數(shù)。使用Jaffe et al所描述的方法的修正形式(Jaffe et al., J ClinInvest.1973;52:2745-56)純化和培養(yǎng)HUVE細胞。在用人類血漿纖連蛋白(40 y g/ml)涂覆的組織培養(yǎng)板中，在含有20%胎牛血清、20mM HEPES pH7.4、盤尼西林(100 y g/mL)、鏈霉素(IOOii g/mL)和肝素(5ii/mL)的M199內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(BiologicalIndustries, Israel)中維持細胞。HUVEC BRBU 增殖測定為了檢測重組抗體對細胞增殖的KDR阻斷活性，使用了能夠測量核苷酸類似物(BrdU)結(jié)合到復制的DNA中的試劑盒。為此目的，使用Roche BRDU試劑盒(Roche，目錄號1444611)。BrdU是在細胞分裂過程中結(jié)合到復制DNA中的核苷酸類似物。然后，通過熒光標記物結(jié)合的抗BrdU抗體測量進入細胞中的BrdU的攝入量。對于BRDU測定，如上所述將HUVE細胞鋪于96孔組織培養(yǎng)板上并進行培養(yǎng)。對于這些實驗，以5000個細胞/孔的密度將HUVE細胞接種在用I %明膠涂覆的96孔組織培養(yǎng)板中。使細胞附著3h后，將培養(yǎng)基更換為含2% FBS的M199培養(yǎng)基并且培養(yǎng)細胞16小時。在室溫下將抗體稀釋在含有5或10ng/ml的VEGF的培養(yǎng)基中并將此新鮮制備的抗體稀釋液每天加入細胞培養(yǎng)物中持續(xù)兩天。在實驗結(jié)束前的16小時，將BrdU添加到細胞中至10 ii M的終濃度。在實驗結(jié)束時，洗滌并固定細胞。根據(jù)制造商的說明書進行BrdU標記。用分光光度法在405nm處讀數(shù)測定各孔中BrdU結(jié)合量。對每個樣品，從405nm處的吸光度值中減去490nm處的吸光度值。在接下來的實驗中，分析了在不同時間不同的KDR1.3和KDR2.6重組抗體濃度對HUVE細胞增殖的影響(圖13)。根據(jù)四個不同增殖測定的平均值計算出對于I U g/毫升的重組抗體濃度HUVE細胞增殖的抑制百分比。Ab293:%84±20.1 KDR1.3:%60±23.7
KDR2.6:%40±17.4角膜血管生成模型中重組可溶性抗體的體內(nèi)抗血管生成作用的研究在馬爾馬拉大學神經(jīng)科學研究所通過外科手術(shù)獲得了在角膜血管生成模型中使用的動靜脈畸形(AVM)組織，并且在這些模型中測試了 KDR1.3、KDR2.6和LIG-7重組抗體。角膜血管生成模型角膜是無血管的組織，其通常不包括血管。當將血管生成活性組織放置在角膜表面上的微囊(micropocket)中時,在第3或第4周，角膜開始形成血管。角膜的這種特性為研究體內(nèi)血管生成提供了途徑(Barbel M et al, Inv.0phthalmology&Vis.Sc1., 1996, Vol:37,No:8p.1625-1632)。將有待接種到角膜中的每個組織樣本(AVM在液氮中，在-187° C下)升至室溫，使用二甲亞砜洗滌，并在顯微鏡下切成合適尺寸(約2至3_直徑)的塊。在這項研究中使用了 10只Sprague-Dawley大鼠。由于感染,從研究中去除其中一只大鼠。通過按照先前發(fā)表的文獻(Polverini PJ, et al, Lab.1nvest., 1984, 51, 635-642)完成角膜植入程序中的步驟，并在圖14中示出。通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮來麻醉每只大鼠，并且所有的操作均在無菌條件下在顯微鏡下進行。使用外用0.5% propacaine麻醉每個動物的兩個角膜，并且使用珠寶鑷輕輕地脫出每個眼球。在手術(shù)顯微鏡下，使用蛛網(wǎng)膜刀片(arachnoid blade)進行近中心的基質(zhì)內(nèi)線性角膜切開術(shù)(paracentral intrastomallinear kera-totomy)(約4mm長并與角膜緣(limbus)成直角)。然后,使用微型鉤以在角膜組織內(nèi)形成微囊(micropocket)。在角膜的兩個上皮層之間的微囊中植入均勻量的組織。將進行程序的日期記為第0天。大鼠角膜血管生成測定中重組抗體的抗血管生成作用的研究

所有實驗使用了體重300至400克的Sprague-Dawley大鼠。9只大鼠被用于角膜血管生成測定。向角膜中攜帶AVM的大鼠體內(nèi)每天同時靜脈注射KDR1.3、KDR2.6和LIG-7抗體(25ng/iil)并在10天期間這些組按此操作。在這項研究中，LIG-7用作陰性對照，在第3、第5、第7和第9天拍照每個角膜并計算新形成的血管用于評估。在10天期間對觀察的大鼠角膜拍照并且圖片如圖15所示。當用使用了 KDR1.3的組與對照組相比時，可見血管形成的退化。在KDR2.6組中也可見血管形成的退化，但由于衰弱在第9天發(fā)生了大鼠死亡。對于KDR1.3、KDR2.6和對照組進行了血管生成活性的測定并且隨后使用SPSS15.0版進行了一般線性模式(GLM)、單變量變化分析測試用于統(tǒng)計地比較第3、第5、第7和第9天的血管數(shù)并且使用Tukey HSD和Student-Newman-Keuls檢驗進行事后比較(Post-hoc comparison)o統(tǒng)計評估顯示,KDR1.3和KDR2.6抗體的抗血管生成活性是統(tǒng)計顯著的(KDR1.3 ;P〈0.05且KDR2.6 ;P〈0.05)。但當使用KDR2.6抗體時發(fā)生大鼠死亡。體內(nèi)實驗表明，KDR1.3抗體是體內(nèi)使用最有效的抗血管生成分子。已經(jīng)證明了本專利提及的兩種重組抗體(KDR1.3和KDR2.6)對HUVE細胞增殖的阻斷能力以及在體內(nèi)模型中它們對大鼠角膜的抗血管生成作用。1998年，Zhu等人通過使用KDR-AP免疫小鼠生產(chǎn)了具有2.1mM親和性的抗KDR的scFv (plCll)并使用I y g/ml濃度 KDR 獲得對 HUVE 細胞增殖 48% 的抑制(Zhu et al, 1998, Cancer Res.58，3209-3214)。此外，開發(fā)的抗Flkl大鼠單克隆抗體顯示了對G55細胞的25%的抑制作用(Kunkel P veark.2001, Cancer Research61, 6624-6628)。開發(fā)的抗 KDR 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 III (Igdomain III)的單克隆抗體(YcomB3)在0.5mg/L的濃度下顯示了對HUVE細胞的50%的抑制作用并且該抗體被提出作為抗血管形成應(yīng)用的候選藥物(Li R et al.2004;ActaPharmacolSin25(10):1292-1298)。存在對于增加抗體結(jié)構(gòu)親和性的研究。1996年，Davies和Riechmann已說明重鏈可變區(qū)的突變涉及CDRL親和性。抗體的親和性從160nM下降至25nM (Daves and Rechmann, 1996Immunotechnology, 2, 169-79，(1996) )。Lippow 等人在 2007 年說明，在抗溶菌酶的抗體的輕鏈區(qū)中4個氨基酸的改變，將親和性增加了 140倍(30pM) (Lippow S.M etal.2007, Nat.Biotechnol., 25, 1171-1176)?，F(xiàn)今，用于抑制血管生成的雷珠單抗，是貝伐珠單抗在可變區(qū)中5個氨基酸改變以及在恒定區(qū)中I個殘基改變的衍生物。這些改變將抗VEGF抗體的親和性增加上百倍(192pM)?？傊?，可以通過修改KDR1.3和2.6重組抗體結(jié)構(gòu)的序列來增加它們的親和性以及由此增加它們的抗血管生成的特性。SEQUENCE N0.1G D S I T S G NSEQUENCE N0.2ISYSGSTSEQUENCE N0.3ARYGGNYEDYSEQUENCE N0.4SSVSYSEQUENCE N0.5DTSSEQUENCE N0.6FOGSGYPLTSEQUENCE N0.權(quán)利要求
1.一種基于在表達VEGF受體2 (VEGFR-2)的細胞中抑制細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和增殖的噬菌體展示技術(shù)的重組抗體選擇方法，其特征在于通過重組抗體庫獲得阻斷VEGFR-2活性的重組抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的scFv庫，是在其表面以融合蛋白形式攜帶重組抗體的噬菌體結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗體，是特異性地結(jié)合至VEGFR-2的1-7免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的小鼠重組抗體。
4.阻斷根據(jù)權(quán)利要求1所述的VEGFR-2活性的重組抗體結(jié)構(gòu)，是在針對根據(jù)權(quán)利要求2所述的VEGFR-2選擇之后獲得的結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小鼠重組抗體，包含重組抗體，如單鏈可變片段、Fab、單鏈抗體、雙體抗體、三體抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其特異性地結(jié)合至包括癌癥細胞在內(nèi)的、在其表面上表達VEGFR-2的所有細胞類型的1-7免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； ⑶RHl，具有在SEQUENCE N0.1中示出的氨基酸序列， ⑶RH2，具有在SEQUENCE N0.2中示出的氨基酸序列， ⑶RH3，具有在SEQUENCE N0.3中示出的氨基酸序列，⑶RL1，具有在SEQUENCE N0.4中示出的氨基酸序列， ⑶RL2，具有在SEQUENCE N0.5中示出的氨基酸序列， ⑶RL3，具有在SEQUENCE N0.6中示出的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； a.氨基酸序列SEQUENCE N0.1、SEQUENCE N0.2、SEQUENCE N0.3、SEQUENCE N0.4、SEQUENCE N0.5 和 SEQUENCE N0.6 中至少一種， b.來自序列SEQUENCE N0.1、SEQUENCE N0.2、SEQUENCE N0.3、SEQUENCE N0.4、SEQUENCE N0.5和SEQUENCE N0.6的至少三個連續(xù)的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含編碼可變重鏈或可變輕鏈的序列SEQUENCEN0.7 或 SEQUENCE N0.8 中至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含氨基酸序列SEQUENCEN0.1、SEQUENCEN0.2、SEQUENCE N0.3、SEQUENCE N0.4、SEQUENCE N0.5、和 SEQUENCE N0.6 的任何組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； ⑶RHl，具有在SEQUENCE N0.9中示出的核酸序列， ⑶RH2，具有在SEQUENCE N0.10中示出的核酸序列， ⑶RH3，具有在SEQUENCE N0.11中示出的核酸序列， ⑶RLl，具有在SEQUENCE N0.12中示出的核酸序列， ⑶RL2，具有在SEQUENCE N0.13中示出的核酸序列， ⑶RL3，具有在SEQUENCE N0.14中示出的核酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含核酸序列SEQUENCEN0.9、SEQUENCEN0.10、SEQUENCE N0.11、SEQUENCE N0.12、SEQUENCE N0.13、和 SEQUENCE N0.14 中至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含在SEQUENCEN0.15中示出的所述可變重鏈核酸序列或在SEQUENCE N0.16中示出的所述可變輕鏈核酸序列或兩者。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，包含氨基酸序列在SEQUENCE33中示出，并且核酸序列為SEQUENCE34的，連接輕鏈和重鏈可變鏈的至少14個氨基酸的接頭。
15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； a.將任何氨基酸序列SEQUENCE N0.1、SEQUENCE N0.2、SEQUENCE N0.3、SEQUENCEN0.4、SEQUENCE N0.5和SEQUENCE N0.6用作肽或用作嵌合抗體或人源化抗體的一部分的用途， b.將來自序列SEQUENCE N0.1、SEQUENCE N0.2、SEQUENCE N0.3、SEQUENCE N0.4、SEQUENCE N0.5和SEQU ENCE N0.6的任何三個連續(xù)的氨基酸序列用作肽或用作嵌合抗體或人源化抗體的一部分的用途， c.將任何核酸序列SEQUENCE N0.9、SEQUENCE N0.10、SEQUENCE N0.11、SEQUENCEN0.12,SEQUENCE N0.13和SEQUENCE N0.14用于肽的合成或嵌合抗體或人源化抗體的生產(chǎn)的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； ⑶RHl，具有在SEQUENCE N0.17中示出的氨基酸序列， ⑶RH2，具有在SEQUENCE N0.18中示出的氨基酸序列， ⑶RH3，具有在SEQUENCE N0.19中示出的氨基酸序列， ⑶RLl，具有在SEQUENCE N0.20中示出的氨基酸序列， ⑶RL2，具有在SEQUENCE N0.21中示出的氨基酸序列， CDRL3，具有在SEQUENCE N0.22中示出的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含；a.氨基酸序列SEQUENCE N0.17、SEQUENCE N0.18、SEQUENCE N0.19、SEQUENCE N0.20、SEQUENCE N0.21 和 SEQUENCE N0.22 中至少一種，b.來自序列SEQUENCE N0.17、SEQUENCE N0.18、SEQUENCE N0.19、SEQUENCE N0.20、SEQUENCE N0.21和SEQUENCE N0.22中至少三個連續(xù)的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含在SEQUENCEN0.23中示出的所述可變重鏈氨基酸序列或在SEQUENCE N0.24中示出的所述可變輕鏈氨基酸序列或兩者。
19.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含編碼氨基酸序列SEQUENCEN0.17、SEQUENCE N0.18、SEQUENCE N0.19、SEQUENCE N0.20、SEQUENCE N0.21 和 SEQUENCE N0.22的核酸的任何組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； ⑶RH1，具有在SEQUENCE N0.25中示出的核酸序列， ⑶RH2，具有在SEQUENCE N0.26中示出的核酸序列， ⑶RH3，具有在SEQUENCE N0.27中示出的核酸序列， ⑶RL1，具有在SEQUENCE N0.28中示出的核酸序列， ⑶RL2，具有在SEQUENCE N0.29中示出的核酸序列， ⑶RL3，具有在SEQUENCE N0.30中示出的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含核酸序列SEQUENCEN0.25、SEQUENCEN0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCE N0.28、SEQUENCE N0.29 和 SEQUENCE N0.30 中至少一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含在SEQUENCEN0.31中示出的所述可變重鏈核酸序列或在SEQUENCE N0.32中示出的所述可變輕鏈核酸序列或兩者。
23.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體，其包含； a.將任何氨基酸序列SEQUENCE N0.25、SEQUENCE N0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCEN0.28,SEQUENCE N0.29和SEQUENCE N0.30用作肽或用作嵌合抗體或人源化抗體的一部分的用途，b.將來自序列SEQUENCE N0.25、SEQUENCE N0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCE N0.28、SEQUENCE N0.29和SEQUENCE N0.30的任何三個連續(xù)的氨基酸序列用作肽或用作嵌合抗體或人源化抗體的一部分的用途， c.將任何核酸序列SEQUENCE N0.25、SEQUENCE N0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCEN0.28、SEQUENCE N0.29和SEQUENCE N0.30用于肽的合成或嵌合抗體或人源化抗體的生產(chǎn)的用途。
24.包含核酸序列SEQUENCE N0.9、SEQUENCE N0.10、SEQUENCE N0.11、SEQUENCEN0.12、SEQUENCE N0.13、SEQUENCE N0.14、SEQUENCE N0.25、SEQUENCE N0.26、SEQUENCEN0.27、SEQUENCE N0.28、SEQUENCE N0.29 和 SEQUENCE N0.30 的重組載體。
25.包含下列序列中至少一種的重組載體:SEQUENCEN0.9、SEQUENCE N0.10,SEQUENCEN0.11、SEQUENCE N0.12、SEQUENCE N0.13、SEQUENCE N0.14、SEQUENCE N0.25、SEQUENCEN0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCE N0.28、SEQUENCE N0.29 和 SEQUENCE N0.30，包括細菌載體、哺乳動物細胞載體和 酵母載體。
26.包含下列蛋白或DNA序列的藥用組合物:SEQUENCEN0.1,SEQUENCE N0.2,SEQUENCEN0.3、SEQUENCE N0.4、SEQUENCE N0.5、SEQUENCE N0.6、SEQUENCE N0.9、SEQUENCE N0.10、SEQUENCE N0.11、SEQUENCE N0.12、SEQUENCE N0.13、SEQUENCE N0.14、SEQUENCE N0.17、SEQUENCE N0.18、SEQUENCE N0.19、SEQUENCE N0.20、SEQUENCE N0.21、SEQUENCE N0.22、SEQUENCE N0.25、SEQUENCE N0.26、SEQUENCE N0.27、SEQUENCE N0.28、SEQUENCE N0.29 和SEQUENCE N0.30，以及它們用作藥學上可接受載體的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體用于抑制VEGF和VEGFR-2之間的相互作用，VEGF調(diào)節(jié)的血管上皮細胞增殖、血管再生，通過提供受控釋放進入環(huán)境的血管再生的用途。
28.包含用于抑制血管生成相關(guān)疾病例如癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血液性腫瘤和新生血管綜合癥中血管生成的根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體的藥物化合物的制造。
29.包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽的VEGF標記或捕獲試劑的開發(fā)。
30.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體與標記藥劑結(jié)合用于治療目的的用途。
31.放射性化合物和熒光化合物、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、生物素、鏈親和素、納米顆粒(如金和磁性顆粒、納米管、量子點)用作標記藥劑用于標記根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組抗體的用途。
全文摘要
開發(fā)了噬菌體展示重組抗體庫并且對VEGFR-2篩選該庫。篩選和ELISA實驗后獲得了顯示對VEGFR-2的結(jié)合特性的兩種重組抗體。通過DNA序列分析證明了這兩種重組抗體與已經(jīng)開發(fā)的重組抗體的差異。使用細胞測定證明了這兩種重組抗體對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。因此，這些重組抗體可以用作VEGF相關(guān)的血管生成抑制劑。
文檔編號A61P35/00GK103119063SQ201080069006
公開日2013年5月22日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者博塔恩·科拉伊·巴爾希歐格魯, 艾林·歐茲代米爾巴哈德爾, 艾丁·巴哈爾, 卡邁勒·巴伊薩爾, 穆熱·塞爾哈特里, 奧默·卡察爾, 圖爾克·基利克, 埃姆爾·阿克古恩, 阿卜杜勒卡迪爾·歐茲坎 申請人:土耳其科學技術(shù)研究理事會