專利名稱：：血管內皮生長因子－b的制作方法
背景技術：
：血管生成，即從原有血管增殖新的毛細血管，是組織正常生長和發(fā)育所必需的基本過程，其是血管樹的發(fā)育和分化以及各種基本生理過程如胚胎發(fā)生、體細胞生長、組織和器官修復和再生、黃體和子宮內膜的周期性生長和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化的先決條件。在女性生殖系統(tǒng)中，血管生成發(fā)生在發(fā)育的卵泡、排卵后的黃體以及懷孕的胎盤中。血管生成還作為機體修復過程的一部分而發(fā)生，例如在傷口愈合和骨折愈合中發(fā)生。血管生成還是腫瘤生長的因素，因為腫瘤必須持續(xù)刺激新的毛細血管的生長而生長。毛細血管由內皮細胞和周皮細胞(pericyte)組成，這兩種細胞攜帶了形成管、分支和整個毛細血管網(wǎng)的全部遺傳信息。特定的血管生成分子可以起始這一過程?？紤]到血管生成的生理學重要性，已做了很大的努力去分離、鑒別和純化能刺激血管生成的因子。已純化了許多刺激血管生成的多肽并鑒定了它們的分子特性、生化特性和生物學特性，這類血管生成調節(jié)劑的綜述見Klagsbrun等人，“血管生成調節(jié)劑”，生理學年度綜述53217-39(1991)，以及Folkman等人，“血管生成”，生物化學雜志26710931-934(1992)。最近的結果揭示了幾種在血管系統(tǒng)的建立和保持中的內皮受體酪氨酸激酶(RTK)。一種這類生長因子，其是高度特異的血管內皮細胞促分裂原，被命名為血管內皮生長因子(VEGF)，見Ferrara等人，“血管內皮生長因子多肽家族”，細胞生物化學雜志47211-218(1991)；Connolly，“血管通透因子血管功能的獨特調節(jié)劑”，細胞生物化學雜志47219-223(1991)。VEGF是一種強血管活性蛋白，其已在由許多細胞系如牛垂體濾泡細胞調節(jié)的培養(yǎng)基中檢測到。VEGF是由兩個24kD亞基組成的糖基化陽離子46-48kD二聚體，其被巰基還原劑失活，對酸性pH和加熱有抗性并與固定化肝素結合。VEGF有時也稱為血管通透因子(VPF)，因為皮內注射后它能增加血管的流體泄漏。它還被稱為血管趨向蛋白(vasculotropin)。已檢測出四種不同的VEGF分子型，165個氨基酸類型的VEGF分子量約為46kD，其是在正常細胞和組織中發(fā)現(xiàn)的主要分子形式。還已知一種次豐富的較短的形式，其在116-159位缺失44個氨基酸(VEGF121)；一種較長的形式，其在116位插入了24個高度堿性的氨基酸殘基(VEGF189)；以及另一種較長的形式，其帶有一41個氨基酸的插入(VEGF206)，它包括了在VEGF189中發(fā)現(xiàn)的24個氨基酸插入。VEGF121和VEGF165是可溶性蛋白，而VEGF189和VEGF206似乎大多是細胞結合的。所有的VEGF同種型均是生物學活性的，例如，當皮下應用時，每種分子型均能誘導Evans藍的外滲。各種VEGF類型均由相同的基因編碼并由信使RNA的不同剪接而得到，這一結論由人基因組DNA的Southern印跡分析得到支持，印跡分析顯示使用針對VEGF165的探針或含VEGF206的插入的探針得到的限制圖譜是相同的。分析推定的mRNA剪接區(qū)域的基因組克隆也顯示與不同剪接一致的內含子/外顯子結構。VEGF的不同類型具有不同的化學性質，其可以調節(jié)細胞釋放、區(qū)室化、生物應用性，并且還可能調節(jié)生長因子的信號性質。對VEGF基因的核苷酸序列的分析顯示VEGF是血小板衍生生長因子(PDGF)家族的一員。VEGF和PlGF是兩種內皮RTK即flt-1(VEGF受體1，VEGFR1)和flk-1/KDR(VEGF受體2，VEGFR2)的配體。VEGF的氨基酸序列顯示其與PDGF的A和B鏈的序列約有20％的同源性，以及在成熟PDGF兩條鏈中發(fā)現(xiàn)的8個半胱氨酸殘基的完全保守性。VEGF165、VEGF189和VEGF206在羧基末端區(qū)還含有另外8個半胱氨酸殘基。VEGF的氨基端序列之前是對應于典型的信號序列的26個氨基酸。成熟蛋白直接由切除信號序列后產(chǎn)生，其不帶任何間插序列原。在Asn74存在的潛在的糖基化位點與VEGF是一個糖蛋白的其它證據(jù)相一致，但是據(jù)報道該多肽即以糖基化形式又以去糖基化形式存在。與其它細胞因子類似，VEGF根據(jù)發(fā)現(xiàn)其的特定生物學前后順序可以有不同的作用。VEGF及其高親和性受體flt-1和KDR/flk-1對于血管系統(tǒng)的形成和保持以及生理性和病理性血管生成是必須的。VEGF是強內皮細胞促分裂原并且在正常胚胎發(fā)育、傷口愈合和組織再生和重組過程中通過促進內皮細胞生長而在體內直接誘導血管生成。VEGF還涉及在病理過程中如實體瘤的生長和轉移以及局部缺血誘導的視網(wǎng)膜疾病。VEGF的一個最重要的性質是其特異性。其在體外在1ng/ml時對于毛細血管內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞是促分裂性的，但是對于腎上腺皮質細胞、角膜或晶體上皮細胞、血管平滑肌細胞、角膜內皮細胞、粒細胞、角質形成細胞、BHK-21成纖維細胞、3T3細胞、大鼠胚胎成纖維細胞、人胎盤成纖維細胞和人肉瘤細胞卻不是促分裂性的。因此，VEGF的靶細胞特異性僅限于血管內皮細胞。在角膜和愈合骨骼移植模型中，VEGF可以引起導致血管生成的一系列的事件并在體內刺激血管生成。其能夠刺激從小血管和大血管中分離的內皮細胞的增殖。在卵巢黃體或在發(fā)育的腦中，VEGFmRNA的表達與毛細血管的生理性增殖在時間和空間上相關。VEGF的表達由供氧不足引發(fā)，因此內皮細胞增殖和血管生成似乎在局部缺血區(qū)域被特別刺激。VEGF還是單核細胞的強化學引誘物，另外，VEGF在內皮細胞中誘導纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活劑抑制劑。腫瘤細胞釋放血管生成分子如VEGF，抗VEGF的單克隆抗體已顯示抑制某些類型的腫瘤如橫紋肌肉瘤的生長，見Kim等人，“內皮生長因子誘導的血管生成在體內抑制腫瘤生長”，自然，362841-844(1993)。這提示阻斷VEGF作用對于治療一般腫瘤，特別是高度血管化的攻擊性腫瘤有潛在的治療意義。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的具有促進內皮細胞增殖性質的生長因子。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼一種新的促進內皮細胞增殖的生長因子的分離的DNA序列。本發(fā)明的再一目的在于提供能用于診斷和/或治療應用的新產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，這些及其它目的通過提供編碼具有下述特征性氨基酸序列(SEQIDNO16)并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖特性的蛋白質的分離的DNA而達到，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys所述的DNA選自圖1和2的DNA(SEQIDNO1)、圖3的DNA(SEQIDNO4)、圖5的DNA(SEQIDNO6)、圖7的DNA(SEQIDNO8)、圖10的DNA(SEQIDNO10)、圖12的DNA(SEQIDNO12)、圖14的DNA(SEQIDNO14)，以及在嚴格條件下與至少一種上述DNA序列雜交的DNA。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的目的還通過提供具有下述特征性氨基酸序列并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖特性的蛋白質而達到，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)所述的蛋白質包括基本上與選自如下一組的氨基酸序列對應的氨基酸序列，所述的一組為圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)、圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)、圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)、圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)、圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)、圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)、圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)和圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的目的通過提供包括這種蛋白質的藥物制備物而達到；以及通過提供與這種蛋白質反應或識別這種蛋白質的抗體而達到。本發(fā)明的新的生長因子以下稱為血管內皮生長因子B或VEGF-B，其與VEGF和胎盤生長因子(PlGF)具有緊密的結構相似性。所有的VEGF-B形式均含有如下特征性氨基酸序列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)(其中Xaa代表可變的殘基)，該序列是生長因子PDGF/VEGF家族的特征。這一特征性氨基酸序列可以在圖4、6、8、11、13和15中的氨基酸70-82位發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的臨床應用包括診斷應用、在傷口愈合中加速血管生成以及抑制血管生成。對癌癥活體檢查樣本中的VEGF-B的定量可以用作未來轉移危象的指示。將VEGF-B制備物局部應用于慢性傷口可以加速血管生成和傷口愈合。VEGF-B可以以與VEGF類似的方式應用。根據(jù)本發(fā)明的另外方面，本發(fā)明的目的可以通過提供典型地為試劑盒形式的診斷/預后工具。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中提供了一種診斷/預后試劑盒，該試劑盒包括針對本發(fā)明的新的生長因子的抗體以及檢測(更優(yōu)選為評價)所述抗體與本發(fā)明的新的生長因子之間的結合的工具。在本發(fā)明的診斷/預后工具的一個優(yōu)選實施方案中，抗體或新的生長因子是標記的，并且抗體或者新的生長因子是結合底物的，以便可以在抗體與生長因子結合后通過測定附著于底物的標記量來確定生長因子-抗體的相互作用。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，診斷/預后工具可以以常規(guī)的ELISA試劑盒的形式提供。在另一個實施方案中，診斷/預后工具可以包括PCR工具，所述的PCR工具用于確定受試個體的VEGF-B基因的基因組序列結構，并將這一序列與本申請披露的序列對比以檢測任何異常狀態(tài)，從而確定是否VEGF-B的異常表達與給定的疾病狀態(tài)相關。本發(fā)明的再一方面涉及識別VEGF-B并被合適標記的抗體。本發(fā)明的另一方面涉及提供一種包括VEGF-B或VEGF-B抗體的藥物組合物，包括VEGF-B蛋白的組合物還可任選地包括VEGF或肝素或者兩者都包括。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了藥物的制備，該藥物包括VEGF-B蛋白和肝素用于治療以缺乏血管生成或血管生成減少為特征的狀態(tài)。在另一方面，本發(fā)明涉及包括VEGF-B蛋白的蛋白二聚體，特別是二硫鍵鍵合的二聚體。本發(fā)明的蛋白二聚體包括VEGF-B蛋白的同二聚體和VEGF-B和VEGF的異二聚體。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了一種用于促進VEGF和/或VEGF-B從細胞釋放的方法，所述方法包括將表達一種或兩種上述生長因子的細胞與肝素接觸。本發(fā)明的另一方面涉及提供一種載體，該載體包括與至少一部分本文披露的編碼本發(fā)明的促進內皮細胞增殖的新的生長因子的DNA序列互補的反義核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，包括反義序列的這種載體可以用于抑制或至少降低VEGF-B的表達。當VEGF-B的表達與疾病相關時，例如當腫瘤產(chǎn)生VEGF-B以提供血管生成時，這種類型的載體在抑制VEGF-B的表達中的應用是有利的。用含反義核苷酸序列的載體轉化這種腫瘤細胞將抑制或延緩血管生成，因此將抑制或延緩腫瘤生長。附圖簡述圖1示出VEGF-B的(部分)cDNA克隆的核苷酸序列(SEQIDNO1)及由該cDNA的第一個讀框編碼的蛋白質區(qū)段的氨基酸序列(SEQIDNO2)；圖2示出VEGF-B的(部分)cDNA克隆的核苷酸序列(SEQIDNO1)及由該cDNA的第二個讀框編碼的蛋白質區(qū)段的氨基酸序列(SEQIDNO3)；圖3示出鼠VEGF-B167的全長cDNA克隆的編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO4)；圖4示出鼠VEGF-B167的氨基酸序列(SEQIDNO5)；圖5示出VEGF-B174的cDNA克隆的編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO6)；圖6示出VEGF-B174的氨基酸序列(SEQIDNO7)；圖7示出VEGF-B112的cDNA克隆的編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO8)；圖8示出VEGF-B112的氨基酸序列(SEQIDNO9)；圖9示出mVEGF-B167、mVEGF-B164、hPlGF、mPDGFA和mPDGFB的氨基酸序列的對比；圖10示出人VEGF-B167的核苷酸序列(SEQIDNO10)；圖11示出人VEGF-B167的氨基酸序列(SEQIDNO11)；圖12示出鼠VEGF-B186的核苷酸序列(SEQIDNO12)；圖13示出鼠VEGF-B186的氨基酸序列(SEQIDNO13)；圖14示出人VEGF-B186的核苷酸序列(SEQIDNO14)；圖15示出人VEGF-B186的氨基酸序列(SEQIDNO15)；圖16示出鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186的氨基酸序列的對比(SEQIDNOS5，11，13和15)；圖17示出小鼠和人的VEGF-B基因的示意性結構；圖18示出鼠VEGF-B167和VEGF-B186的親水性分析；圖19示出生長因子VEGF/PDGF家族的系統(tǒng)發(fā)育分析；圖20示出對于人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和牛毛細血管內皮(BCE)細胞由VEGF-B、VEGF和bFGF誘導的[3H]胸腺嘧啶的摻入；圖21是VEGF-B186轉錄物在幾種小鼠和人組織中的表達的Northern印跡分析；圖22示出用鼠VEGF-BcDNA瞬時轉染Cos-1細胞后對細胞培養(yǎng)基和去污劑溶解的細胞裂解物進行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的結果；圖23A示出對分別表達鼠VEGF-B186和人VEGF165的轉染的Cos-1細胞的細胞培養(yǎng)基進行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的結果；圖23B示出對共表達鼠VEGF-B186和人VEGF165的Cos-1細胞的細胞培養(yǎng)基(M)和去污劑溶解的細胞裂解物(L)進行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的結果；圖23C示出對來自分別表達鼠VEGF-B186和人VEGF或同時表達兩者的Cos-1細胞的細胞培養(yǎng)基以及來自模擬轉染的對照細胞的細胞培養(yǎng)基進行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的結果；圖24是VEGF-B啟動子-報道基因克隆的衍生示意圖；以及圖25示出1.55kb長的人VEGF-B啟動子片段的核苷酸序列(SEQIDNO17)。優(yōu)選實施方案的詳細描述因此本發(fā)明涉及新的血管內皮生長因子，以下稱為VEGF-B生長因子，其具有VEGF的血管生成特性和其它特性，但是它在組織中的分布和表達與VEGF不同。VEGF-B生長因子是血小板衍生生長因子家族的成員，并且是促進血管內皮細胞和/或中胚層細胞的有絲分裂和增殖的生長因子。它們通過與圖1和2(SEQIDNO1)、圖3(SEQIDNO4)、圖5(SEQIDNO6)、圖7(SEQIDNO8)、圖10(SEQIDNO10)、圖12(SEQIDNO12)或圖14(SEQIDNO14)所示的任一種DNA序列相對應的或在嚴格條件下與之雜交的DNA序列的表達而產(chǎn)生。本發(fā)明的范圍意在包括由在嚴格條件下與前述任一種DNA序列雜交的DNA序列編碼的所有血管生成蛋白。合適的雜交條件包括，例如，50％甲酰胺、5×SSPE緩沖液、5×Denhardts溶液、0.5％SDS和100μg/ml鮭精DNA，42℃過夜，而后在55℃于2×SSC中洗2×30分鐘。本發(fā)明還涉及對應于前述任一種DNA序列或在嚴格條件下與前述任一種DNA序列雜交的分離的和/或純化的DNA。在另一方面，本發(fā)明涉及VEGF-B生長因子的抗體，特別是單克隆抗體。據(jù)信VEGF-B蛋白與蛋白質酪氨酸激酶生長因子受體相互作用。這些受體的詳情是本領域公知的(見，例如，Wilks，A.F.，“在發(fā)育、分化和癌癥中的蛋白質酪氨酸激酶生長因子受體”，高級癌癥研究6043-73(1993))。用Northern印跡分析測試了各種成年小鼠組織對于對應于VEGF-B的轉錄物的表達。mRNA的大小為1.3-1.4kb。用衍生自上述pPC67酵母表達載體的約0.9kbSalI/NotI片段探查小鼠多種組織Northern印跡(MTN，Clontech)。通過隨機引導用32P-dCTP標記探針(比活為108-109cpm/μgDNA)。印跡在42℃用50％甲酰胺、5×SSPE緩沖液、2％SDS、10×Denhardts溶液、100μg/ml鮭精DNA和1×106cpm標記的探針/ml雜交過夜。在室溫于含0.05％SDS的2×SSC中洗印跡2×30分鐘，然后在52℃于含0.1％SDS的0.1×SSC中洗印跡2×20分鐘。然后將印跡用增感屏于-70℃中曝光3天，使用KodaXAR膠卷。由目測檢查膠卷確定的相對表達水平列于下表表1VEGF-B轉錄物在成年小鼠中的分布<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="600">組織相對表達水平心臟+++++腦+++脾(+)肺++肝+骨骼肌++++腎+++睪丸(+)</table></tables>+++++＝非常強的表達；++＝相對弱的表達；++++＝強的表達；+＝弱的表達；+++＝中等的表達；(+)＝非常弱的表達。用鼠部分cDNA探查來自Clontech的人多種組織Northern印跡(MNT)以確定在各種人組織中的相對VEGF-B表達水平，轉錄物的大小為1.3-1.4kb，條件與上述用于鼠Northern印跡的條件相同。下表2列出了人Northern印跡的相對VEGF-B轉錄物水平，為了對比，表2還列出了來自各種文獻中的VEGF在各種哺乳動物系統(tǒng)中的相對表達水平資料。表2</tables>由表1和表2的比較可以看出鼠和人組織中VEGF-B轉錄物的表達水平相當類似，最高的表達水平均在心臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，在腦和腎中可以看出明顯的差異。還應注意的是含高比例肌肉和上皮細胞的組織如前列腺、胰和結腸(它們會發(fā)生一些最常見的人腫瘤)表達相對高水平的VEGF-B。人組織中VEGF和VEGF-B的相對表達水平的比較顯示一些明顯差異，VEGF在人心臟組織中表達很弱，但VEGF-B在同一組織中表達非常強，另一方面，VEGF在人肺組織中表達很強，但VEGF-B在人肺組織中只有弱表達。在相似的靜脈中，人肝組織以中等強度表達VEGF，但VEGF-B僅微弱表達。這些數(shù)據(jù)證明盡管VEGF和VEGF-B有相似性，但是它們的作用并非完全相同。VEGF-B轉錄物在小鼠和人組織中的表達還用Northern印跡進行了分析并與VEGF轉錄物的表達做了比較。將小鼠和人多種組織Northern(MTN)印跡(Clontech)與32P標記的小鼠VEGF-B探針(克隆pcif2的約O.9kbSalI/NotI插入物)雜交，VEGF的表達用32P標記的VEGF165cDNA作為探針進行分析。雜交在50％去離子甲酰胺、5×SSCpH7.0、1％SDS、5×Denhardt’s溶液和100μg/ml變性鮭精DNA中于42℃進行，在含0.5％SDS的2×SSC中于52℃洗濾膜2×30分鐘，并用增感屏在-70℃將濾膜在柯達XAR膠卷上曝光2-5天。基本上按Korhonen等人，《血液》80，2548-55(1992)所述進行來自CBA小鼠的成年小鼠組織的原位雜交分析以及來自CBA和NMRI小鼠交配的胚胎的原位雜交分析。RNA探針(一個383bp反義探針和一個169bp有義探針)從含有衍生自pcif2cDNA克隆的440bpSalI/SacI片段的線性質粒產(chǎn)生。用T7和SP6RNA聚合酶和[35S]UTP(AmershamInc.)合成放射性標記的RNA。省略探針的堿裂解步驟。用蘇木精負染。使用有義鏈和RNAseA處理的切片的對照雜交沒有給出高于背景的信號。在小鼠組織中，1.4kbVEGF-B轉錄物的最豐富表達在心臟、腦、骨骼肌和腎中檢測到，主要3.7kbVEGF轉錄物在心臟、腦、肺、骨骼肌和腎中表達。在人組織中，1.4kbVEGF-B轉錄物和主要3.7kb及4.5kbVEGF轉錄物的最豐富表達在心臟、骨骼肌、胰和前列腺中檢測到。因此，盡管存在明顯的數(shù)量差異，但是看起來VEGF-B和VEGF在許多人和小鼠組織中共表達。還在成年小鼠心臟和骨骼肌切片以及早期(E10)小鼠胚胎切片中通過原位雜交檢測了VEGF-B轉錄物的表達。在成年心臟中，VEGF-B轉錄物主要在心肌中表達，而在動脈平滑肌中未檢測出特異信號。在成年橫紋肌中，VEGF-B轉錄物由一些肌纖維表達，而其它一些肌纖維似乎缺乏該轉錄物。在E10小鼠胚胎中，VEGF-B轉錄物主要在發(fā)育的心臟中檢測到。成年小鼠心臟的心肌有一強信號。在橫紋肌中，VEGF-B的表達在肌纖維亞群中可見，在E10小鼠胚胎的發(fā)育的心臟中也得到強信號。其它胚胎結構中VEGF-B轉錄物的表達水平較低或檢測不到。總之，這些試驗示出VEGF-B轉錄物主要在肌肉組織中表達。VEGF-B尤其在心臟和骨骼肌中豐富并在這些組織和其它組織中與VEGF共表達。在轉染的細胞中，當共表達時VEGF-B與VEGF形成結合在細胞表面的、二硫鍵鍵合的同二聚體和異二聚體。使用VEGF-B186特異探針對幾種小鼠和人組織中表達的VEGF-B186的Northern印跡分析示于圖21。VEGF-B基因的染色體位置通過體細胞雜合子的Southern印跡分析和聚合酶鏈反應分析和中期染色體的熒光原位雜交(FISH)確定。發(fā)現(xiàn)VEGF-B基因位于染色體11q13，與細胞周期蛋白D1基因相鄰。另人感興趣的是盡管細胞周期蛋白D1基因在一些人癌癥中擴增，但在含有擴增的細胞周期蛋白D1的幾種哺乳動物癌細胞系中未見VEGF-B基因擴增。然而，VEGF-B基因中的突變可能與血管畸形和/或心血管疾病有關。除非另有說明，下述實施例使用Ausubel等人(編輯)，分子生物學方法，JohnWiley&Sons，紐約(1992)中公開的標準分子生物學技術和程序。實施例1帶有兩個讀框的部分cDNA克隆如下所述鑒定一個編碼鼠VEGF-B的部分cDNA克隆。使用如GyurisJ.，GolemisE.，ChertkovH.和BrentR.，“Cdil，一種與Cdk2結合的人G1和S期蛋白磷酸酶”，細胞75791-803(1993)中所述的酵母兩雜合子相互作用捕獲篩選技術從一個cDNA文庫(E14.5)中篩選可能與細胞視黃酸結合蛋白I型(CRABP-I)強相互作用的細胞蛋白，該cDNA文庫衍生自從14.5天的小鼠胚胎分離的聚A+mRNA[ChevrayP.和NathansD.，“酵母中的蛋白相互作用克隆與亮氨酸拉鏈Jun反應的哺乳動物蛋白的鑒定”，美國國家科學進展895789-93(1992)]。這一篩選技術涉及一種含有一個已知是轉錄惰性的結合域(“誘餌”(bait))的融合蛋白；沒有本底轉錄并結合誘餌的報道基因；以及一個編碼以嵌合體表達的蛋白的表達文庫，所述蛋白的氨基端含有一個活化域和其它有用的基序(“上鉤者”(prey))。這一篩選的文庫是在酵母表達載體pPC67(得自約翰霍普金斯大學醫(yī)學院的PierreChevray博士，725NorthWolfeSt.，Baltimore，MD21205)中的14.5天小鼠胚胎質粒文庫。篩選中得到一個陽性cDNA克隆(pcif-2)，用熟知的常規(guī)技術對該陽性克隆測序，發(fā)現(xiàn)其編碼與VEGF和PDGF家族生長因子其它成員高度同源的蛋白。將質粒pPC67中的這一約0.9kbSalI/NotI插入片段克隆到pBluescript中并用T7和T3載體引物及內部引物進行全測序，pBluescript質粒商購自StratageneInc.，LaJolla，加利福尼亞。發(fā)現(xiàn)該cDNA插入片段為886bp長，編碼位于不同讀框中的兩個多肽，這兩個多肽分別與VEGF的N末端和C末端同源。這一新的生長因子以下稱為VEGF-B，這一克隆是部分的，缺少氨基末端區(qū)的幾個氨基酸和整個信號序列。圖1示出這一VEGF-B部分cDNA克隆的核苷酸序列(SEQIDNO1)及其第一個讀框編碼的氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖1的DNA序列由在酵母表達載體pPC67中的克隆(pcif-2)的常規(guī)測序得到。這一克隆包含886堿基對并編碼鼠VEGF-B的一部分。分離的cDNA序列將與含VEGF-B基因的哺乳動物基因組DNA例如鼠或人的基因組DNA雜交。除了編碼序列，基因組DNA還含有指導VEGF-B在一或多種特異組織中表達的一或多個啟動子序列，因此，VEGF-B的編碼序列可以與肌肉特異性啟動子元件相連，該啟動子元件特異于某些類型的肌肉纖維。該核苷酸序列在兩個不同的讀框中翻譯成兩個不同的氨基酸序列。在編碼序列的堿基對309-311處有一終止密碼子(TGA)，因此，VEGF-B有幾種剪接變異體。克隆的cDNA序列的5’末端編碼與VEGF、P1GF、PDGFA和B的N-末端區(qū)顯著同源的102個氨基酸長的蛋白。特別是，在這一族蛋白中有幾個半胱氨酸殘基是完全保守的。除了核苷酸序列(SEQIDNO1)，圖1還示出了此第一個蛋白的推導的氨基酸序列(SEQIDNO2)。在一不同讀框中的此cDNA的C末端(堿基對308-475)的翻譯產(chǎn)生一個與VEGF165、VEGF189和VEGF206的C末端部分高度同源的蛋白質。圖2又示出了圖1的核苷酸序列(SEQIDNO1)，但是其示出了第二種蛋白的推導的氨基酸序列(SEQIDNO3)，該蛋白是在第二個讀框中編碼并且為54個氨基酸長。因此，看起來VEGF-B基因使用初級轉錄物的不同剪接編碼不同的蛋白質。該克隆的編碼第二個肽的最后一部分可以作為VEGF-B其它剪接變異體中的功能蛋白表達。上述蛋白可以與另外約5-10個氨基酸的N-末端序列以及約21-28個氨基酸的前導序列結合存在。因為這種結合的氨基酸序列顯示促進內皮細胞的增殖的特性，并且編碼這種結合的肽序列的DNA序列將在嚴格條件下與圖1和2的DNA序列雜交，所以這種氨基酸序列和編碼其的DNA屬于本發(fā)明的范圍。實施例2克隆小鼠VEGF-B的全長cDNA使用實施例1中鑒定的cDNA克隆的約0.9kbSalI/NotIcDNA插入片段作為探針，通過標準技術篩選得自StratageneInc.，LaJolla，加利福尼亞的成年小鼠心臟λZAP-IIcDNA文庫。如所建議的滴定文庫并鋪板，制備濾膜。在50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、1％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA中于42℃進行預雜交后，在相同溫度和含變性放射標記探針的相同溶液中以106cpm/ml雜交溶液雜交濾膜，探針用隨機引物試劑盒(Amersham)標記，16小時后在含0.5％SDS的2×SSC中于52℃洗濾膜2×30分鐘，用增感屏在-70℃使濾膜曝光過夜。陽性克隆再重新篩選兩次，直至一個板上的所有空斑均為陽性。如廠商建議通過體內切割將來自幾個陽性克隆的插入片段亞克隆入質粒pBluescriptSK+。幾個克隆經(jīng)限制酶分析作圖發(fā)現(xiàn)分屬兩個不同的組，以Spe1/BamH1限制片段的長度為特征，第一組包括3個限制作圖克隆，每個具有240bpSpe1/BamH1限制片段，另一組包括一個克隆，其具有340bpSpe1/BamH1限制片段。這一片段的分析見實施例5。對顯示240bpSpe1/BamH1限制片段的三個克隆進行完全或部分測序(測序酶2.0，美國生物化學品公司)，這些克隆的特征總結如下核苷酸序列分析揭示雖然長度不同但有兩個cDNA克隆基本上是相同的，并且一個具有一突變。其中一個克隆是全長的且含有一個編碼188個氨基酸殘基(其中前21個氨基酸是可裂解信號序列)的開放讀框，兩個基本上相同的克隆的另一個在起始密碼子的G處終止。這可以從對另外的G前序列為ACCAT的克隆的序列分析中推斷出。兩個克隆發(fā)現(xiàn)具有相同的編碼區(qū)核苷酸序列，見圖3所示(SEQIDNO4)，該圖省略了在分離的克隆中不存在的起始密碼子(TAG)中的開頭的胸腺嘧啶和腺嘌呤。這兩個cDNA克隆的編碼區(qū)的開放讀框的推導的氨基酸序列示于圖4(SEQIDNO5)，由這一序列編碼得到的蛋白以下稱為VEGF-B167。在本文所用的蛋白質名稱中，下標的數(shù)字代表沒有信號序列的成熟蛋白中的氨基酸數(shù)。如所預期的，由這兩個克隆編碼的氨基酸序列與實施例1的cDNA克隆推導的部分氨基酸序列的對比顯示出驚人的相似性。然而，實施例1的克隆的兩個開放讀框，每個編碼與VEGF的不同部分同源的氨基酸序列，在實施例2的這兩個克隆中的同一讀框中同時存在。實施例1的克隆的移碼是由插入兩個另外的腺嘌呤單位導致的，這兩個腺嘌呤使實施例1的克隆的C末端移出讀框。這種情況的原因目前尚未清楚，但是可能是由于克隆假象所致。除了一個21bp插入外，第三個克隆的編碼部分具有與前兩個克隆相同的核苷酸序列，圖5示出此第三個克隆的核苷酸序列(SEQIDNO6)，為便于識別，該21個多出的堿基在圖中以下劃線示出，這一插入使成熟蛋白多出7個氨基酸殘基。因此，由此較長cDNA編碼得到的蛋白命名為VEGF-B174。由圖5的cDNA編碼的蛋白的氨基酸序列示于圖6(SEQIDNO7)，圖中為便于識別所述的7個多出的氨基酸也以下劃線示出。該多出的氨基酸插入到剪接位點的序列中，并且對小鼠基因組DNA克隆的測序表明這些多出的氨基酸是正確可變剪接的結果。另外，基于已知的PDGF受體結合位點的位置，該插入在蛋白中的位點可能是受體結合位點部分。因此，該插入可能影響受體結合比能在影響刺激劑和/或不同受體的特異性中有重要作用。實施例3雜交體cDNA克隆如前所述，實施例1的原始cDNA克隆不是全長的并可能含有假象。然而，如果加入編碼VEGF-B167和/或VEGF-B174的克隆的最5’端核苷酸序列，則開放讀框編碼133個氨基酸的蛋白質，產(chǎn)生112個氨基酸的成熟蛋白，因此命名為VEGF-B112。編碼VEGF-B112的雜交體cDNA序列(SEQIDNO8)示于圖7，其對應的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO9)示于圖8。圖9示出用于比較目的的多氨基酸序列對比，其中有小鼠血管內皮生長因子B的167個氨基酸變異體(mVEGF167)、小鼠血管內皮生長因子(mVEGF164)、人胎盤生長因子(hPlGF)、小鼠血小板衍生生長因子A(mPDGFA)以及小鼠血小板衍生生長因子B(mPDGFB)，與小鼠VEGF-B167相同的氨基酸殘基以方框框起。這些序列的同源性關系是明顯的，圖中清楚地示出屬于生長因子PDGF/VEGF家族的生長因子的保守結構，并且證明VEGF-B是這一族的其它生長因子的結構同源體。氨基酸序列的配對比較示出小鼠VEGF-B與小鼠VEGF-B167有約43％的相同性，與人PlGF有約30％的相同性，與小鼠PDGFA和B有約20％的相同性。尤其應注意保守的半胱氨酸殘基，可以看出五個生長因子的N-末端區(qū)域(即類PDGF區(qū)域)中的頭八個半胱氨酸在這一家族的所有成員中是共享的，因此證明涉及分子內和分子間二硫鍵結合的這八個半胱氨酸殘基在這些生長因子中是不變的。另外，小鼠VEGF-B167和VEGF164的C-末端區(qū)域也有八個另外的保守半胱氨酸殘基和幾個堿性氨基酸序列段的顯著的相似性。實施例4人VEGF-BcDNA的克隆根據(jù)標準程序，用小鼠VEGF-B克隆pcif2的約0.9kb插入片段篩選在λgt11中的人纖維肉瘤cDNA文庫HT1080(Clontech)的106個λ克隆。在幾個陽性克隆中，對一個命名為H.1的克隆進行更仔細的分析，并測定其核苷酸序列，核苷酸序列示出其編碼207個氨基酸形式的人VEGF-B。對這一同種型的分析在實施例6中有描述?；贖.1序列設計了兩個寡核苷酸用于擴增對應于小鼠VEGF-B167同種型的推定的人cDNA的整個編碼區(qū)，這兩個寡核苷酸是5’-CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3’(正向)(SEQIDNO18)5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(反向)(SEQIDNO19)這些寡核苷酸用于經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)擴增來自寡-dT引導的人紅白血病細胞(HEL)RNA的人VEGF-B的整個編碼區(qū)。將擴增產(chǎn)物克隆進TA克隆試劑盒(Invitrogen)的pCRII載體中并用標準技術測序，人VEGF-BcDNA克隆的核苷酸序列示于圖10(SEQIDNO10)，人VEGF-B167的推導的氨基酸序列如圖11所示(SEQIDNO11)。實施例2的全長小鼠cDNA克隆和實施例4的全長人cDNA克隆均編碼含N末端疏水推定信號序列的188個氨基酸多肽。與VEGF類似，信號肽酶裂解位點據(jù)信位于Ala21和Pro22之間，信號肽酶的推定裂解位點在圖16中以箭頭示出。因此，這兩個克隆的加工后的VEGF-B多肽含有167個氨基酸。實施例5分析了具有實施例2分離的340bpSpe1/BamH1片段的克隆，發(fā)現(xiàn)其主要部分與具有240bpSpe1/BamH1片段的實施例2的前兩個克隆相同，這一差異是由在序列的C末端部分有一插入存在所致。這一340bpSpe1/BamH1DNA片段編碼含有207個氨基酸的另一小鼠VEGF-B同種型，編碼這一蛋白的DNA編碼部分(SEQIDNO12)示于圖12，其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNO13)示于圖13。在切除21個氨基酸的前導序列后，成熟蛋白含有186個氨基酸并稱為mVEGF-B186。這一同種型很明顯是另外的DNA剪接的結果，如參照圖17如下所述。實施例6發(fā)現(xiàn)如實施例4所述分離的H.1克隆編碼人VEGF-B的207個氨基酸的同種型，編碼這一蛋白的DNA編碼部分(SEQIDNO14)示于圖14，其翻譯的氨基酸序列(SEQIDNO15)示于圖15。同樣，這一稱為hVEGF-B186的同種型似乎也是另外剪接的產(chǎn)物。實施例5的mVEGF-B186和實施例6的hVEGF-B186在VEGF-B167編碼序列的核苷酸414和415之間均包括一101bp的插入，插入后，這些cDNA克隆的核苷酸序列與對應的VEGF-B167序列相同。101bp插入的位置對應于VEGF中的外顯子5-外顯子6交界處，插入導致移碼，使兩個VEGF-B同種型的C末端區(qū)域完全不同。起自SEQIDNOS11和15(這兩個序列分別對應于兩個主要的VEGF-B同種型，VEGF-B167和VEGF-B186)的氨基酸116的C末端氨基酸序列的不同反應在這兩個同種型的不同的生物化學特征上。VEGF-B167的C末端區(qū)域呈強堿性(凈電荷+13)并結合肝素，而VEGF-B186的C末端區(qū)域呈弱堿性(凈電荷+5)并在其C末端有一段長疏水性氨基酸殘基。VEGF-B186的疏水尾不會起轉膜功能區(qū)的作用因為VEGF-B的這一變異體是從細胞中分泌的。因此，盡管N末端功能區(qū)相同，但是VEGF-B的這兩種同種型具有非常不同的生物化學性質。VEGF-B186缺少強堿性肝素結合區(qū)使得蛋白能從細胞中自由分泌，然而，VEGF-B186的分泌是非常慢的，在使用轉染細胞的脈沖追蹤實驗中，1個小時前在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)VEGF-B186同二聚體。相反，在30分鐘內VEGF同二聚體和VEGF-B186·VEGF二聚體就出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。圖16示出以單字母代碼表示的小鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186的氨基酸序列對比(SEQIDNOS5、11、13&15)，相同的殘基由方框框起，框外的是在小鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186同種型之間不同的氨基酸殘基。小鼠和人VEGF-B顯示約88％的氨基酸序列同一性，并且特別是在C末端區(qū)是強堿性的。小鼠和人VEGF-B186的C末端區(qū)在氨基酸水平約85％相同。兩種多肽均缺少用于N連接的糖基化作用的共有序列(N-X-T/S)。箭頭示出在Ala21和Pro22之間的推定的信號肽酶裂解位點。除去信號序列，小鼠和人VEGF-B167氨基酸序列是高度同源的，在167個殘基中僅有20個置換，置換集中在N末端，在氨基酸60和145兩個區(qū)域內。在兩種VEGF-B167蛋白的所有半胱氨酸殘基均是不變的，但在VEGF-B167C末端的8個半胱氨酸殘基在VEGF-B167同種型中不是保守的。應注意的是，在殘基66和129之間區(qū)域的小鼠和人序列除了一個進化保守的替換(Q105R)外均是相同的，這一點很重要，因為發(fā)現(xiàn)受體結合區(qū)在蛋白的這一部分(對比PDGF結構)，由此可推斷在受體水平小鼠和人VEGF-B可能會顯示交叉反應結合，因此顯示相同或相似的生物學活性。實施例7小鼠和人的VEGF-B基因的外顯子-內含子結構通過限制作圖和對采用人基因組DNA為模板的PCR反應得到的克隆PCR片段的核苷酸序列分析確定人VEGF-B基因的結構，但是第一個外顯子和內含子是從基因組λ-克隆鑒定。小鼠基因的結構是通過限制作圖和對使用不同引物組合擴增的克隆PCR片段的核苷酸序列分析而確定，在這些PCR擴增中使用一個含有整個小鼠VEGF-B基因的分離的λ克隆作為模板。程序如廠商建議從129/SwλFIX基因組文庫(Stratagene，Inc.)中分離用于小鼠VEGF-B基因的幾個λ克隆。使用pcif2cDNA的為VEGF-B的約0.9kbSalI/NotI插入片段(SEQIDNO1)作為探針。從平板裂解物中分離幾個陽性克隆的λDNA。其中一個陽性λ克隆(克隆10)作為BamH1片段亞克隆進pBluescriptSK(StratageneInc.)，從此相同克隆中分離的DNA也用作PCR反應中的模板(100ngλDNA/反應)，用引物的不同組合擴增小鼠VEGF-B的編碼部分。這些引物的核苷酸序列衍生自編碼鼠VEGF-B167和鼠VEGF-B186的cDNA克隆。使用TaqDNA聚合酶(2.5U/反應)。產(chǎn)生的PCR片段直接克隆進TA-克隆載體pCRII(InvitrogenInc.)。通過對亞克隆的BamHl基因組片段和克隆的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列分析推出小鼠VEGF-B的外顯子-內含子結構。使用跨越人VEGF-BcDNA5’序列的90bpPCR片段作為探針，在高度嚴格條件下通過篩選在EMBL-3SP6/T7中的人基因組文庫(Clontech)的1×106個克隆分離人基因組λ克隆。洗滌條件為一次在1×SSC中室溫洗30分鐘，二次在1×SSC中65℃洗30分鐘。PCR的引物為5’-CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3’(正向)(SEQIDNO18)以及5’-GGGCATCAGGCTGGGAGACAG-3’(反向)(SEQIDNO19)。陽性λ克隆作為SacI片段亞克隆進pGEM3Z載體(Promega)并發(fā)現(xiàn)其攜帶該基因的5’區(qū)。人VEGF-B基因的其余部分用基因組DNA作為模板經(jīng)PCR擴增，使用源自人cDNA序列的引物的不同組合，并使用DynazymeDNA聚合酶(2.5U/反應，F(xiàn)innzymes)。擴增的PCR片段直接克隆進TA-克隆載體pCRII(InvitrogenInc.)。通過使用載體特異性引物或源自cDNA序列的合適引物進行核苷酸序列分析來確定外顯子-內含子交界和小鼠和人VEGF-B基因的短內含子的長度。較大內含子的長度基于用瓊脂糖凝膠電泳分析的擴增PCR片段的長度而計算。結果結果顯示小鼠和人VEGF-B基因的編碼部分跨越約4kbDNA，兩個基因均分為長度從19bp(E7)至236bp(E6)的7個編碼外顯子。圖17是小鼠和人VEGF-B基因結構的示意圖，以堿基對表示大小的外顯子框于框中，內含子的大小在框與框之間注明，內含子并非按比例尺示出，小鼠和人VEGF-B基因的非翻譯側翼區(qū)結構未確定并用灰框表示。兩個基因中的外顯子-內含子交界列于下表3表3</tables>如前所述，外顯子6含有一另外剪接受體位點，其使基因產(chǎn)生兩種不同的轉錄物對應于不同的VEGF-B同種型。VEGF-B167使用外顯子1-5，外顯子6的最后部分以及外顯子7(TGA)；VEGF-B186使用外顯子1-5，外顯子6的第一部分并在外顯子6的最后部分終止(TAG)。在VEGF-B186中外顯子7不翻譯，因為外顯子6的第一部分的插入產(chǎn)生了移碼并在外顯子6的最后部分產(chǎn)生了終止密碼子，VEGF-B186的終止密碼子(TAG)的位置在外顯子6B中標出，VEGF-B167的終止密碼子(TGA)的位置在外顯子7中標出。兩個基因中的內含子從161bp至約2.6kb不等，在兩個基因中每個外顯子的長度以及剪接交界位置是相同的，所有剪接供體和受體位點均遵循不變的GT/AG規(guī)則，見Padgett等，生物化學年度綜述，551119-50(1986)。在小鼠和人的基因中的唯一不同是小鼠基因中內含子1、4和6的長度較長。發(fā)現(xiàn)所有外顯子-內含子交界處在VEGF-B和VEGF之間是保守的，但是VEGF-B基因中的內含子通常比VEGF基因中的內含子小。VEGF-B中的外顯子5之后的300bp內含子與VEGF中對應的內含子不同，其長度為3kb并含有在VEGF189和VEGF206轉錄物中發(fā)現(xiàn)的另外剪接的外顯子，編碼許多堿性氨基酸殘基。當更仔細地分析VEGF-B中的這一內含子時，未能發(fā)現(xiàn)對應于VEGF第6個外顯子的外顯子，相反，發(fā)現(xiàn)這一內含子的3’末端以及隨后的外顯子與編碼VEGF186的cDNA克隆的相應序列相同。這一點可用下列事實解釋，即VEGF-B186的mRNA是在mRNA剪接過程中由另外剪接受體位點形成的，在這些mRNA中產(chǎn)生101bp內含子的插入。圖18示出鼠VEGF-B167和VEGF-B186的對比親水性分析，該曲線是通過使用9個殘基的序列窗根據(jù)Kyle和Dolittle而產(chǎn)生的。正如所預期的，親水性/疏水性模式從氨基酸1至氨基酸115基本上是相同的，氨基酸115之后，親水性/疏水性模式發(fā)生變化，這是因為通過插入外顯子6的第一部分而發(fā)生了移碼。因此，可以預期VEGF-B167和VEGF-B186及顯示相似活性又顯示不相似活性。圖19是顯示生長因子VEGF/PDGF家族的5個成員的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關系的枝權圖，圖中由左至右置換或取代數(shù)逐漸下降?？梢钥闯鯲EGF-B位于VEGF和血小板衍生生長因子(PDGF)之間。圖9和圖16的多個氨基酸序列對比以及圖19的系統(tǒng)發(fā)育分析是根據(jù)Hein，酶學方法，183卷，626-45頁，學術出版社公司，圣地亞哥(1990)所述用PAM250距離圖(distancetable)進行。實施例8抗體產(chǎn)生a.針對小鼠VEGF-B的抗血清用與匙孔嘁血藍蛋白偶聯(lián)的、包含加工的VEGF-B的N-末端區(qū)域的18聚體寡肽免疫兔而產(chǎn)生針對小鼠VEGF-B的抗血清。使用SPDP(Pharmacia)引入半胱氨酸殘基作為N-末端和C-末端殘基以使肽與載體蛋白偶聯(lián)，寡肽的序列為C-P-V-S-Q-F-D-G-P-S-H-Q-K-K-V-V-P-C(SEQIDNO21)每只兔皮下注射300μg用弗氏完全佐劑乳化的肽綴合物，每兩個星期給予等量的用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行皮下加強免疫注射。第二次加強免疫注射后取血清。b.針對人VEGF-B的抗血清用包含下列N-末端區(qū)氨基酸殘基序列(SEQIDNO22)的分支23聚體寡肽免疫兔制備針對人VEGF-B的抗肽抗血清，所述的序列為S-Q-P-D-A-P-G-H-Q-R-K-V-V-S-W-I-D-V-Y-T-R-A-T分支23聚體寡肽根據(jù)Tam，“合成肽疫苗設計高密度多抗原肽系統(tǒng)的合成和性質”，美國國家科學進展，85卷，5409-413(1988)所述合成。在第一次免疫中，對兔皮下注射500μg用弗氏完全佐劑乳化的分支肽，在隨后的加強免疫中，注射200μg用弗氏不完全佐劑乳化的抗原。在第二次和第三次加強免疫后用常規(guī)技術收集抗血清。實施例9VEGF-B167的生物化學性質、同二聚化以及與VEGF的異二聚化在轉染的人胎腎293EBNA細胞(Invitrogen，Inc.)中檢測人VEGF-B167的生物化學性質。將編碼人VEGF-B167和人VEGF165(見Keck等，科學，卷246，1309-312(1989))的cDNA插入片段分別克隆到pREP7表達載體(Invitrogen，Inc.)中，用磷酸鈣沉淀法用各表達質粒經(jīng)瞬時轉染法而轉染人胎腎293EBNA細胞(表達Epstein-Barr病毒核抗原-1)，并溫育細胞48小時，作為對照，細胞還用含反向VEGF-B167cDNA的表達載體轉染。細胞單層在不含甲硫氨酸和不含半胱氨酸的培養(yǎng)基中溫育30分鐘，然后在相同培養(yǎng)基中用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(Promix，AmershamInc.)標記細胞2小時。標記培養(yǎng)基用無血清的正常培養(yǎng)基替換，并追蹤標記蛋白6小時，當有說明時在追蹤中加入肝素(100μg/ml)。追蹤期后收集培養(yǎng)基，將細胞溶于10mMTrispH7.5，50mMNaCl，0.5％去氧膽酸鈉，0.5％NonidetP-40，0.1％SDS和0.1U/ml抑蛋白酶。VEGF-B167在用含VEGF-B167DNA的質粒轉染的細胞中表達。將來自用肝素處理或未處理的細胞的培養(yǎng)物上清以及去污劑溶解的細胞裂解物的等份與實施例8得到的針對VEGF-B的特異抗肽抗血清進行免疫沉淀，并且除非另有說明在還原條件下用SDS-PAGE分析。數(shù)據(jù)顯示，VEGF-B167同二聚體和VEGF-B167-VEGF165異二聚體通過肝素從細胞中釋放出。通過肝素處理(1-100μg/ml)或1.2MNaCl處理，VEGF-B167從細胞中釋放并在上清中發(fā)現(xiàn)。如果細胞未用肝素處理，VEGF-B167仍是細胞結合的并且未釋放到培養(yǎng)基中。在相同條件下，不經(jīng)肝素處理VEGF165同二聚體即從細胞中分泌并在培養(yǎng)物上清中發(fā)現(xiàn)。在還原條件下，人VEGF-B167以Mr(分子量)為21kDa遷移。在非還原條件下對培養(yǎng)物上清的分析顯示VEGF-B167以Mr為42kDa遷移，提示為二聚體結構。這些結果提示VEGF-B167可能通過與胞外硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的離子相互作用而形成與細胞表面結合的二硫鍵鍵合的二聚體。這種結合易被C-末端堿性功能區(qū)調節(jié)，正如在較長的VEGF變異體中觀察到的。因為已顯示VEGF可與PlGF形成異二聚體，決定測試是否VEGF165也能與VEGF-B167形成異二聚體。為此目的，用編碼人VEGF165和人VEGF-B167的表達載體共轉染293EBNA細胞，并使VEGF-B167和VEGF165聯(lián)合表達。在肝素存在下追蹤代謝標記的蛋白，并與針對VEGF-B167或VEGF165的抗血清進行免疫沉淀，針對人VEGF的抗血清來自R&DSystems。在非還原條件下，VEGF-B167·VEGF165異二聚體以Mr為42-46kDa遷移。結果顯示VEGF-B能與VEGF形成二硫鍵鍵合的異二聚體，該異二聚體在肝素不存在時是細胞結合的。因為VEGF165同二聚體能有效地分泌到培養(yǎng)基中，因此VEGF-B似乎決定異二聚體的分泌。VEGF-B在源細胞的內質網(wǎng)中正常合成并隨后輸出。重組VEGF-B的生產(chǎn)可如下進行將編碼VEGF-B蛋白的DNA序列與合適的可操縱連接的啟動子和調控序列一起插入合適的載體，如公知的質粒pBR322或其衍生物，用得到的載體或現(xiàn)有技術中公知的其它系統(tǒng)轉化或轉染合適的宿主細胞如E.coli或Cos細胞，篩選表達VEGF-B的轉化子或轉染子，然后培養(yǎng)VEGF-B表達呈陽性的細胞系或細菌細胞菌株。根據(jù)待轉化或轉染的細胞類型可使用真核載體或原核載體。生產(chǎn)重組VEGF-B的特別優(yōu)選的系統(tǒng)是桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)，已證明其能以非常高的產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白。實施例10用桿狀病毒系統(tǒng)表達VEGF-B10.1帶有其本身信號肽的VEGF-Ba)克隆和轉染將完整的人VEGF-B167基因插入商購質粒pCRII(InvitrogenCorp.)中，然后將來自得到的質粒pCRII-VEGF-B167的HindIII-XbaI片段，該片段編碼VEGF-B167的整個開放讀框，克隆到pFASTBACl，并且對3’和5’交界處測序。根據(jù)“Bac-To-BacTM桿狀病毒表達系統(tǒng)”(LifeTechnologiesInc.)的廠商指導制備Bacmid-DNA，并脂轉染到Sf900II-適應的Sf9細胞(得自ChristianOker-Blom博士)，Sf9細胞來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏細胞株銀行，Rockville，MD(ATCCCRL-1711)。隨后在25cm2培養(yǎng)皿中用標準TMN-FH培養(yǎng)基培養(yǎng)轉染的細胞。b)分析蛋白質表達轉染后約72小時裂解細胞并用如實施例9所述的免疫沉淀和Western印跡分析1ml培養(yǎng)物上清和細胞裂解物中是否有表達的VEGF-B。來自四個獨立轉染的細胞培養(yǎng)物中的3個的細胞裂解物對于VEGF-B呈陽性，但是在Western印跡中的信號強度不同。發(fā)現(xiàn)在每種細胞裂解物中的表達的VEGF-B多肽的大小對應于實施例9的哺乳動物細胞表達的蛋白的大小。通過感染細胞并從培養(yǎng)基中收集新的病毒而將來自給出最強Western印跡信號的細胞的病毒儲液進行兩輪擴增，分析得到的上清，還分析了未感染的細胞作為陰性對照。時間過程分析顯示在感染后48-72小時之間收獲的細胞含有最大量的VEGF-B，感染后96小時，由于病毒誘導的細胞裂解，還可在培養(yǎng)物上清中通過免疫沉淀和Western印跡分析檢測到VEGF-B。重組VEGF-B可以在20％-40％(NH4)2SO4中從裂解物中沉淀出。10.2帶有蜂毒肽信號肽(pVTBac)的VEGF-Ba)克隆和轉染使用來自68-141位核苷酸的聚合酶鏈反應(PCR)片段在實施例10.1的質粒pCRII-VEGF-B167的信號裂解位點之后引入一BamHI限制位點。將來自此修飾的pCRII-VEGF-B167構建物的BamHI片段克隆到BamHI切開的pVTBac中(Tessier等，“與蜜蜂蜂毒肽信號肽融合的外源蛋白從昆蟲細胞的增強分泌”，基因，卷98，177頁(1991))。對3’和5’交界區(qū)測序。用含有人VEGF-B167基因的上述pVTBac載體和用線性化的桿狀病毒DNA(InsectinTM，InvitrogenCorp.)共轉染Sf9細胞，然后在TMN-FH培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉染細胞。b)分析蛋白質表達轉染后48小時收集上清并用免疫沉淀初級篩選，分離到4個陽性空斑。10.3將編碼小鼠VEGF-B186的一cDNA插入片段(來自小鼠VEGF-B186cDNA(SEQIDNO12)克隆的EcoR1酶切cDNA片段)克隆到pFASTBAC1，來自來自小鼠VEGF-B167(SEQIDNO4)的EcoR1酶切cDNA片段也克隆到pFASTBAC1，得到的質粒如上述10.1所述轉化細菌，分離重組質粒并脂轉染到Sf9和Sf21細胞。通過再進行幾輪Sf21細胞的感染擴增含重組桿狀病毒的上清，桿狀病毒儲液的最終滴度通過空斑滴定測定，發(fā)現(xiàn)每毫升儲液上清為1×108和2×109個桿狀病毒顆粒。實施例11重組VEGF-B的大規(guī)模生產(chǎn)用實施例10的桿狀病毒儲液以每個細胞10個病毒顆粒的感染復數(shù)感染Sf21細胞(見Vaughn等，InVitro，13213-17(1977))，感染的Sf21細胞在搖瓶中培養(yǎng)并以每毫升無血清培養(yǎng)基(Sf900II，Gibco-BRL)2×106個細胞的密度接種96小時，然后收集培養(yǎng)基和細胞。用SDS-PAGE分析細胞裂解物和培養(yǎng)基樣品，通過用考馬氏亮藍染色凝膠可看到總蛋白譜，用實施例8所述的抗人和小鼠VEGF-B的特異抗肽抗體通過免疫印跡可觀察表達的VEGF-B同種型的存在。分析揭示人和小鼠的VEGF-B167多肽均為預計的21.5kDa，兩個蛋白均留在感染細胞的胞內并未釋放到培養(yǎng)基中。相反，小鼠VEGF-B186以二聚體的形式穩(wěn)定地分泌到培養(yǎng)基中。VEGF-B186同二聚體以52-54kDa遷移，提示昆蟲細胞生產(chǎn)的蛋白質不象從轉染的Cos-1細胞分泌的VEGF-B186一樣被共價修飾。實施例12表達VEGF-B186的Cos-1細胞的轉染和分析將編碼小鼠VEGF-B186和人VEGF165的cDNA插入片段克隆到pSG5表達載體中(Grenn等，核酸研究，16369(1988))。在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和合適的抗生素的最小基本培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)Cos-1細胞，將細胞在90mm培養(yǎng)皿上鋪板以用于轉染。通過磷酸鈣沉淀法用表達載體(單獨或聯(lián)合)轉染細胞，并溫育36-48小時。細胞單層在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基中溫育30分鐘，然后在含100μCi/ml[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(Promix，AmershamInc.)相同培養(yǎng)基中溫育2小時。為進行脈沖追蹤實驗，將細胞標記30分鐘，用正常培養(yǎng)基洗2次，然后在無胎牛血清的MEM中溫育最多至6小時，追蹤期后收集培養(yǎng)基，將細胞溶于含50mMNaCl，0.5％去氧膽酸鹽，0.5％nonidetP-40，和0.1％SDS的10mMTris緩沖液pH7.5中。用來自實施例8a的針對小鼠VEGF-B的特異抗血清和購自R&DSystems的針對人VEGF的特異抗血清將培養(yǎng)基和細胞裂解物的樣品進行免疫沉淀，沉淀物用SDS-PAGE分析。實施例13在轉染的Cos-1細胞中表達的VEGF-B186的生物化學性質在用合適的表達載體如實施例12所述瞬時轉染的Cos-1細胞中檢測小鼠VEGF-B186的生物化學性質。將細胞代謝標記，用針對VEGF-B的抗肽抗體免疫沉淀來自標記細胞的蛋白質，在還原條件下將沉淀物進行SDS-PAGE分析，分析了細胞培養(yǎng)基(M)和去污劑溶解的細胞裂解物(L)，結果示于圖22?？梢钥闯鲈谶€原條件下細胞結合的VEGF-B186以約Mr24,000多肽遷移，相反，存在于轉染細胞培養(yǎng)基中的VEGF-B186以約Mr32,000多肽遷移，提示蛋白質在其胞內轉運和分泌過程中被共價修飾。在用作對照的模擬轉染的Cos-1細胞的細胞裂解物和培養(yǎng)基中未檢到相應的分子。在非還原條件下培養(yǎng)基的免疫沉淀和SDS-PAGE分析顯示一約Mr60,000的種類，提示VEGF-B186形成二硫鍵鍵合的同二聚體。在標記期間加入100ug/ml肝素不會影響VEGF-B186同二聚體從轉染細胞中分泌或釋放。實施例14VEGF-B186同二聚體的生物合成通過脈沖追蹤實驗檢測VEGF-B186同二聚體的生物合成。將轉染Cos-1細胞代謝標記30分鐘，然后追蹤最高達4小時。對去污劑溶解的細胞裂解物的免疫沉淀和SDS-PAGE分析顯示在整個追蹤期間一直能測到細胞結合的約Mr24,000的蛋白種類，這一分子量蛋白種類的量的降低與培養(yǎng)基中存在的Mr32,000蛋白的增加相伴，在追蹤1小時后，Mr32,000蛋白種類在培養(yǎng)基中出現(xiàn)。在4小時追蹤期后得到分泌型VEGF-B186的最高水平。在細胞裂解物中未發(fā)現(xiàn)中間體，但是分泌型Mr32,000蛋白似乎稍有異質，這一修飾的實質目前尚未知，但是這一修飾缺少共有位點所以可排除N-鍵合的糖基化作用。實施例15由VEGF-B186形成異二聚體如上所述，VEGF-B和VEGF在許多組織中共表達，并且在轉染細胞中共表達時一直能形成VEGF-B167·VEGF165異二聚體。為檢測VEGF-B186是否能與VEGF165形成異二聚體，如上所述用合適的表達載體單獨或聯(lián)合轉染Cos-1細胞，將來自轉染細胞的培養(yǎng)基中存在的代謝標記的蛋白用針對VEGF-B和VEGF的抗血清進行免疫沉淀。圖23示出在還原條件下來自分別表達VEGF-B186和VEGF的瞬時轉染的Cos-1細胞的培養(yǎng)基的免疫沉淀物的SDS-PAGE分析結果，可以看出抗血清分別特異于VEGF-B和VEGF，而沒有可檢測到的交叉反應性。用VEGF-B186和VEGF165的表達載體共轉染Cos-1細胞，將來自得到的共表達VEGF-B186和VEGF165的細胞的細胞培養(yǎng)基(M)和去污劑溶解的裂解物(L)進行免疫沉淀并在還原條件下進行SDS-PAGE分析，結果示于圖23B，測試顯示小鼠VEGF-B186和人VEGF165形成胞內的和分泌的異二聚體。將來自表達小鼠VEGF-B186和人VEGF165的細胞的培養(yǎng)基單獨或共同用針對VEGF-B和VEGF的抗體進行免疫沉淀并在非還原條件下用SDS-PAGE分析，作為對照，分析來自模擬轉染細胞的細胞培養(yǎng)基，結果示于圖23C。發(fā)現(xiàn)VEGF-B186形成分泌的二硫鍵鍵合的同二聚體，而VEGF-B186和VEGF165一起形成分泌的二硫鍵鍵合的異二聚體。為分析與VEGF形成異二聚體是否影響VEGF-B186的分泌和釋放，用經(jīng)VEGF-B186和VEGF165的表達載體瞬時轉染的Cos-1細胞進行脈沖追蹤實驗。在30分鐘標記期后可以回收細胞結合的二硫鍵鍵合的異二聚體，30分鐘追蹤期后已可以從培養(yǎng)基中回收分泌的異二聚體，分泌的異二聚體在培養(yǎng)基中積累最長至標記后2小時，在4小時追蹤時間點上培養(yǎng)基中的異二聚體的量下降，可能是由于復合物的降解。在整個追蹤期內一些VEGF-B186·VEGF異二聚體保持為細胞結合形式。這些結果提示與VEGF-B186同二聚體的分泌相比與VEGF形成異二聚體促進了VEGF-B186的分泌。另外，在30分鐘標記期后已存在異二聚體提示VEGF-B186同二聚體的慢釋放不是由于VEGF-B186二聚化能力不足。實施例16分泌的VEGF-B186同二聚體的純化如下所述從桿狀病毒感染的Sf21細胞的無血清培養(yǎng)基中分離分泌的VEGF-B186同二聚體a.初級分離在培養(yǎng)基中的主要雜質蛋白是桿狀病毒蛋白gp64/67，其是由桿狀病毒感染細胞分泌的酸性蛋白，為除去這一蛋白，用超濾將培養(yǎng)基濃縮20倍然后過SephadexG-25柱，該柱用含20mMNaCl的20mM磷酸鹽緩沖液pH6.5平衡。洗脫的蛋白然后過用相同緩沖液平衡的CM-Sepharos(Pharmacia)離子交換柱，用磷酸鹽緩沖液洗柱以除去未結合的蛋白，逐步增加洗脫緩沖液的NaCl濃度洗脫結合蛋白。主要gp64/67桿狀病毒編碼蛋白在這些條件下不與離子交換柱結合，而VEGF-B186同二聚體在NaCl濃度為90mM時洗脫。用SDS-PAGE分析洗脫組分，發(fā)現(xiàn)經(jīng)此步驟分離的VEGF-B186同二聚體的純度為5-15％。b.純化至均質在偶聯(lián)于FLPC系統(tǒng)(Pharmacia)的MonoS柱上將VEGF-B186同二聚體純化至均質，用在20mM磷酸鹽緩沖液pH6.5中的NaCl線性梯度洗脫結合蛋白。實施例17為發(fā)現(xiàn)兩個VEGF-B剪接異構體是否有不同的組織分布以及是否還存在其它的異構體，用從小鼠腦、心臟、肝臟和腎臟以及從人胎心和骨骼肌提取的總RNA進行RT-PCR分析。用分別覆蓋小鼠和人VEGF-B基因的外顯子4-7和外顯子3-7的4對特異引物經(jīng)PCR分析轉錄物。程序用Chirgwin等，生物化學，185294-99(1979)公開的標準程序分離來自小鼠和人組織的總RNA。每反應用2-5μg總RNA使用禽髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(20U/反應)進行第一鏈cDNA的合成，反應用寡(dT)18引導。這些反應的等份樣品用作使用TaqDNA聚合酶(2.5U/反應)的PCR的模板，為擴增小鼠cDNA，使用兩對引物，這些引物對是通過將定位于外顯子4的通用5’引物5’-CACAGCCAATGTGAATGCA(正向)(SEQIDNO23)與分別定位于外顯子6B和7的兩個不同3’引物(后一個引物在5’末端具有一個BglII位點和4個多出的堿基)5’-GCTCTAAGCCCCGCCCTTGGCAATGGAGGAA(反向)(SEQIDNO24)和5’-ACGTAGATCTTCACTTTCGCGGCTTCCG(反向)(SEQIDNO25)合并而得到的。用瓊脂糖凝膠電泳分析后將擴增條帶轉移到尼龍濾膜(GenescreenPlus)上并依次與特異于外顯子6A和6B的寡核苷酸探針雜交，寡核苷酸探針是5’-CTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTA(外顯子6A)(SEQIDNO26)和5’-TCAGGGCGTTGACGGCGCTGGGTGCAA(外顯子6B)(SEQIDNO27)，用末端轉移酶用[32P]dCTP標記寡核苷酸探針至高比活。使用1×106cpm標記探針/ml溶液，在含5×Denhard’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml鮭精DNA的6×SSC中于37℃進行雜交，在相同溫度下在含0.5％SDS的6×SSC中洗濾膜2×15分鐘并曝光。用于擴增人cDNA的兩對引物是通過將兩個不同5’引物即定位于外顯子3的引物5’-CCTGACGATGGCCTGGAGTGT(正向)(SEQIDNO28)和定位于外顯子4的引物5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC(正向)(SEQIDNO29)與定位于外顯子7的通用3’引物5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG(反向)(SEQIDNO19)合并而得到的。用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物的等份樣品，將樣品直接克隆到TA克隆載體pCRII(Invitrogen，Inc.)中，用核苷酸測序分析產(chǎn)生的質粒，GAPDH的擴增作為對照。結果擴增的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析顯示分別為215和316bp的兩條主帶，這些大小與對應于VEGF-B167和VEGF-B186的兩個mRNA一致。這兩條帶的亮度相同說明兩個異構體在所有檢測的小鼠和人組織中以幾乎相同的水平表達。為驗證來自小鼠組織的擴增產(chǎn)物，將PCR擴增的DNA轉移到濾膜并分別用對應于外顯子6A和6B的特異性寡核苷酸探針探查，放射自顯影顯示外顯子6特異性探針與316bp條帶雜交而外顯子6B特異性探針與215和316bp兩條擴增條帶均雜交。這些結果與外顯子6的受體位點的可變應用以產(chǎn)生VEGF-B的兩個異構體的結果一致，因此所有擴增產(chǎn)物與從VEGF-B167和VEGF-B186異構體的序列預期的相對應。對從人胎心和肌肉分離的總RNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析可見329bp和430bp的兩條主要擴增帶?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明VEGF-B167和VEGF-B186是組織中的兩個主要VEGF-B異構體。PCR產(chǎn)物譜和引物的定位提示如果還有更長的剪接VEGF-B異構體存在，則這種轉錄物使用比VEGF-B186情況下更略偏5’一側的剪接受體位點。另外，沒有檢測到對應于缺乏肝素結合區(qū)的VEGF121的PCR產(chǎn)物，即對應于VEGF-B的外顯子6的序列。然而，外顯子5至外顯子7的剪接將產(chǎn)生編碼對應于VEGF121的VEGF-B異構體的轉錄物，這一推測的VEGF-B異構體可能在不是本實施例中分析的其它組織中表達。實施例18細胞增殖的刺激通過在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和在牛毛細血管內皮(BCE)細胞中的[3H]胸腺嘧啶摻入分析確定VEGF-B167刺激內皮細胞增殖的能力。如上所述在1μg/ml肝素存在下用VEGF-B167，VEGF165的表達載體或空白載體(模擬)轉染293EBNA細胞。用各自培養(yǎng)基稀釋來自這些細胞的條件培養(yǎng)基并施加到人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和牛毛細血管內皮(BCE)細胞并測定[3H]胸腺嘧啶的摻入。作為陽性對照將重組bFGF加到BCE細胞。詳細地說，轉染48小時后，從在肝素(1μg/ml)存在下用合適的表達載體或空白載體(模擬)轉染的293EBNA細胞收集含有人VEGF-B和VEGF165的條件培養(yǎng)基。第二代HUVEC以補加10％胎牛血清的M-199培養(yǎng)基在96孔板上鋪板(4×103細胞/孔)并溫育24小時。用生長培養(yǎng)基稀釋條件培養(yǎng)基并刺激細胞48小時。將含10μCi/ml[3H]胸腺嘧啶(AmershamInc.)的新鮮條件培養(yǎng)基加到細胞中，并繼續(xù)刺激細胞48小時。細胞用PBS洗并胰酶化，摻入的放射活性用液閃計數(shù)測定。BCE細胞以補加10％胎牛血清的最小基本培養(yǎng)基(MEM)種于24孔板并生長至鋪滿，在補加3％胎牛血清的MEM中饑餓細胞72小時，將在無血清培養(yǎng)基中稀釋的條件培養(yǎng)基加到細胞并刺激細胞24小時，在刺激的最后4小時加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/ml)。用bFGF的刺激是如上所述使用6ng/ml重組bFGF(SynergenInc.)進行，用PBS洗細胞，用NaOH裂解，并用液閃計數(shù)測定摻入的放射活性。圖20是一條線圖，示出與由來自模擬轉染的細胞的條件培養(yǎng)基誘導的本底活性相比，在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和在牛毛細血管內皮(BCE)細胞中由VEGF-B167誘導的[3H]胸腺嘧啶摻入的倍數(shù)。為進行對比，由VEGF165和bFGF的誘導也示出。條線示出平行樣品的平均值±標準偏差。在幾個其它獨立實驗中得到相似結果。測試結果清楚地表明VEGF-B在HUVEC和BCE細胞中均誘導[3H]胸腺嘧啶摻入并在體外刺激內皮細胞的增殖，由此證明VEGF-B是一種內皮生長因子。實施例19人VEGF-B啟動子DNA克隆的鑒定及活性使用含有來自VEGF-B第一和第二個外顯子的序列的5’PCR片段作為探針篩選在噬菌體λEMBL中的人基因組DNA文庫，得到兩個陽性克隆，將其中一個作為SacI片段亞克隆到BluescriptSKII質粒。得到一1.4kb片段，其含有約0.4kb存在于cDNA中的NcoI位點上游的序列(位于ATG翻譯起始位點上游100bp之內)。另外，將來自另一λ克隆的約6kbXhoI片段亞克隆到pGEMEX質粒，這一亞克隆含有約1.5kb的NcoI位點上游序列。將SacI/NcoI片段和一EcoRI(多接頭)-NcoI片段以各自轉錄方向亞克隆到pGL3基本載體(Promega)中。將這些亞克隆的DNA以及來自含SV啟動子的pGL3對照載體的DNA用磷酸鈣沉淀法轉染進HeLa細胞，轉染后兩天，測定轉染細胞裂解物的螢光素酶活性。結果顯示400bpSacI/NcoI片段具有相當于pGL3對照載體啟動子活性的30％的啟動子活性，而1.5kb片段僅給出背景活性。使用較強或更活化的啟動子例如CMV啟動子或延伸因子1-α啟動子可以在人細胞和組織中給出更高的活性?？寺∑蔚慕Y構示于圖24。對1.5kb的NcoI位點上游序列測序，得到的序列(SEQIDNO17)示于圖25，該序列顯示有一推斷的沉默子(WeissmanandSinger，分子及細胞生物學，114228-234(1991))，其由在核苷酸166-187位之間的兩個8bp序列段組成(在圖中由框框起)，這一沉默子可能導致1.5kb片段活性的相對缺乏。實施例20在黑素瘤、正常皮膚和肌肉中由RT-PCR分析VEGF-BmRNA從赫爾辛基大學中心醫(yī)院放射治療和腫瘤學系的病人中獲取正常皮膚及黑素瘤組織，手術切除后立即制得4個轉移性黑素瘤樣品并立即包埋于Tissue-tek(Miles)并在液氮中冷凍。正常皮膚樣品得自進行乳腺癌手術及皮膚痣切除的自愿患者。所有樣品均經(jīng)病理學家檢查以證實診斷。用異硫氰酸胍程序(Chomczynski等，分析生物化學，162156-159(1987))分離總RNA，用0.2μg隨機六脫氧核苷酸引物、5單位鼠逆轉錄酶、作為模板的5μg總RNA以及第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia)合成cDNA，在37℃溫育1小時后，將反應混合物儲存于-70℃。PCR擴增的陰性對照樣品類似制備只是不加逆轉錄酶。還測試了β-肌動蛋白作為內標，因為它組成型高水平表達，并且其表達在不同細胞中并無很大差別。為PCR擴增，從VEGF-B和β-肌動蛋白基因中選擇引物序列，引物序列如下VEGF-B有義5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQIDNO19)VEGF-B反義5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQIDNO29)β-肌動蛋白有義5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQIDNO30)β-肌動蛋白反義5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQIDNO31)(β-肌動蛋白序列包括來自Ng等，分子細胞生物學52720-732(1985)的核苷酸2105-2125和2411-2432)。將來自cDNA反應產(chǎn)物的4μl等份樣品在94℃加熱5分鐘并用作模板與20pmol引物、10×PCR緩沖液、1μl20mMdNTPs和2.5UTaq聚合酶進行PCR擴增，用DEPC處理的水調整終體積為100μl。95℃1分鐘變性，62℃45秒退火，72℃50秒聚合，VEGF-B共進行35個循環(huán)，β-肌動蛋白共進行25個循環(huán)。每5個循環(huán)后取15μl樣品進行分析。5μlPCR反應混合物的電泳在含溴乙錠的2％瓊脂糖凝膠上進行，大小標記物DNA片段長度為24-726bp(ΦX174DNA/Hinfl標記物，來自Promega，Madison，WI，USA)。因此，測試樣品包括4個轉移性黑素瘤、肌肉、正常皮膚、陰性對照(不加逆轉錄酶)以及ΦX174DNA/HinfI大小標記物。對VEGF-B(PCR產(chǎn)物長度323和234bp)和β-肌動蛋白進行的RT-PCR分析的結果顯示VEGF-B在所有研究的黑素瘤中均高表達，其表達水平類似于在肌肉組織中的表達水平，相反，在正常皮膚中的VEGF-BRNA非常少。從Northern印跡分析和雜交分析中可得出類似結論。上述結果顯示VEGF-B是種新的內皮細胞生長因子，其在血管化特別是肌肉組織的血管化中起作用。使用Takeshita等，美國病理學雜志，1471649-60(1995)中所述的技術通過動脈給予VEGF-B大丸藥(bolus)可以促進局部缺血的心臟或四肢中的副動脈的生長。VEGF-B的細胞結合作用可以在調節(jié)血管化作用以及內皮細胞生長中有若干應用。在發(fā)育的胚胎和收縮組織中，細胞結合的VEGF-B在血管樹的建立和保持過程中可以向生長過快的內皮細胞提供空間信號(cue)。它還可以通過其細胞結合作用支持成人血管中受損內皮的再生。通過使用Asahara等，循環(huán)，91(11)2793-802(1995)所述的技術直接施用VEGF-B可以促進動脈損傷的重新內皮化作用。VEGF-B通過形成異二聚體而調節(jié)VEGF分泌的能力提示VEGF-B在VEGF信號傳送作用(signalling)中的間接作用，從而調節(jié)受體結合和/或活化，如Potgens等，生物化學雜志269(52)32879-85(1994)中損傷。這些生長因子形成多重異二聚化復合物可以提供內皮細胞調控信號的多種排列的基礎。VEGF-B可以作為內皮細胞體外群體化的生長因子。VEGF-B可以用于促進所需的血管生成，即形成新的血管和毛細血管，見Takeshita等，文獻同上。例如，其可用于促進黃體和子宮內膜的發(fā)育以有助于妊娠的起始和/或維持。它還可以通過其對內皮細胞的作用而用于骨骼修復。給予VEGF-B還可用于支持胚胎發(fā)生以及體細胞生長和血管發(fā)育及分化。在傷口區(qū)局部施用VEGF-B可以用于促進傷口愈合，而口服給予VEGF-B可以用于加速胃潰瘍和/或十二指腸潰瘍的愈合。VEGF-B通過形成異二聚體而調節(jié)VEGF分泌的能力可在需要VEGF興奮劑的疾病中提供VEGF-B的治療作用，見Potgens等，文獻同上。VEGF-B可直接或通過改善血液供應而激發(fā)中皮細胞的增殖作用。已發(fā)現(xiàn)VEGF-B在腫瘤如黑素瘤中過量表達，因此，VEGF-B表達的檢測可以用作腫瘤診斷的工具，并且例如用單克隆抗體對VEGF-B表達的抑制作用可以用于阻止腫瘤生長。分析腫瘤中的VEGF-B可以作為轉移危象的指示，例如，以類似于Takahashi等，癌癥研究，553964-68(1995)所述程序應用VEGF-B抗體以定量新生血管化和增殖可以用來指示結腸癌危象。通過組織化學分析體液或腫瘤本身的VEGF-B可以用作腫瘤預后因子。類似于Kondo等，生物化學和生物物理年報，1221(2)211-14(1994)所述程序的ELISA可以用于檢測VEGF-B正調節(jié)以作為腫瘤屏(screen)。使用Boocock等，國家癌癥研究雜志，87506-16(1995)所述的技術進行的VEGF-B表達的酶聯(lián)免疫吸附分析可用作卵巢癌的診斷指示。類似于Weindel等，神經(jīng)外科學，35439-48(1994)所述的VEGF分析的VEGF-B表達分析可用作腦腫瘤中惡性的指示。另外，因為腫瘤生長需要血管生成，所以給予VEGF-B還可以用于促進實驗動物的腫瘤生長以測試抗致瘤性藥物。VEGF-B還可用于增加腫瘤的供養(yǎng)不足區(qū)域的微血管化并使這些區(qū)域對輻射和輻射致敏藥物等敏感。VEGF-B的血管生成作用可用于治療局部缺血癥狀，通過Bauters等，美國生理學雜志，267(4-Pt2)H1263-71(1994)所述的技術給予VEGF-B的動脈內大丸藥可以用于治療下肢局部缺血并增加四肢充血。使用Mesri等，循環(huán)研究，76161-67(1995)所述的程序可以在注射有由表達VEGF-B的病毒轉導的成纖維細胞的組織中產(chǎn)生血管生成應答以治療組織局部缺血(例如心肌局部缺血)。在動脈和/或靜脈阻塞情況下，例如心肌梗塞、四肢缺血、深靜脈血栓形成和/或產(chǎn)后血管問題，VEGF-B或興奮劑可以用于刺激旁路循環(huán)的發(fā)育，見Takeshita等，文獻同上。VEGF-B/VEGF-B受體系統(tǒng)可用作檢測體系以檢測作為興奮劑/拮抗劑的小分子從而開發(fā)新藥?？梢詸z測的小分子的例子包括但不限于有機化學品、肽和RNA分子。通過將藥物學有效量的VEGF-B蛋白與一種或多種合適的載體或佐劑如水、礦物油、聚乙二醇、淀粉、滑石粉、乳糖、增稠劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑等混合可以生產(chǎn)藥物組合物，這種組合物可以為溶液、懸液、片劑、膠囊劑、乳液、油膏劑、軟膏或其它常規(guī)形式。如實施例7所證實，VEGF-B蛋白還可用于生產(chǎn)抗體，一般說來，可以使用常規(guī)的抗體生產(chǎn)技術來生產(chǎn)VEGF-B抗體，例如，可以通過用重組DNA表達得到的融合蛋白免疫而生產(chǎn)特異的單克隆抗體。標記的單克隆抗體尤其可用于篩選與體內不正常VEGF-B水平相關的癥狀，例如，通過類似于Fava等，實驗藥物雜志，180341-46(1994)所述的免疫熒光測定技術檢測滑液和/或關節(jié)組織中的VEGF-B可以用作風濕性關節(jié)炎的診斷指示。使用如Aiello等，新英格蘭藥物雜志，331(22)1480-87(1994)所述的技術對眼液中的VEGF-B進行放射免疫測定可用作糖尿病性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管化或視網(wǎng)膜靜脈閉鎖癥的診斷標志。血液、尿或其它體液中的VEGF-B水平的免疫分析可用作為腫瘤標志，見Kondo等，文獻同上。針對VEGF-B的這些單克隆抗體還可用于例如在哺乳動物中的快速增殖的依賴于血管生成的腫瘤中抑制與體內高水平VEGF-B相關的血管生成，從而可以阻止這類腫瘤的生長。使用類似于Kim等，自然，362(6243)841-44(1993)所述的技術用特異于VEGF-B的單克隆抗體的治療可以用于在體內抑制腫瘤生長。使用類似于Aasno等，癌癥研究，555296-5301(1995)所述的程序靜脈和/或皮下注射VEGF-B的單克隆抗體可以用于抑制實體腫瘤的新生血管化和原位和轉移生長。對于治療人類，優(yōu)選對這些單克隆抗體進行交叉化(chiaserization)或人源化?？赏ㄟ^例如每星期兩次腹膜內注射10-500μg、優(yōu)選50-100μg單克隆抗體而進行治療。VEGF-B拮抗劑如抗體還可用于抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病、關節(jié)病和/或血管腫瘤如血管瘤中的新血管，見Aiello等，文獻同上。上述描述及實施例僅僅是舉例描述本發(fā)明而非限制性的，由于本領域熟練技術人員對摻入本發(fā)明的實質和物質的所公開的實施方案可以作出修飾，所以本發(fā)明應理解為包括在所附權利要求書范圍內的所有物質及其等價物。序列表(1)一般信息(i)申請人烏爾夫·埃里克松，比吉塔·奧洛夫松，卡里·阿利塔洛，卡特里·帕尤薩拉(ii)發(fā)明名稱血管內皮生長因子-B及編碼其的DNA(iii)序列數(shù)31(iv)通訊地址(A)收信人Evenson，McKeown，Edwards&Lenahan(B)街道1200GStreet，N.W.，Suite700(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國家美國(F)郵編20005(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日1996年3月1日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/397,651(B)申請日1995年3月1日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/469,427(B)申請日1995年6月6日(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/569,063(B)申請日1995年12月6日(viii)律師/代理人信息(A)姓名EVANS，JosephD.(B)注冊號26，269(C)案號/文檔號1064/41979PCT(ix)電訊信息(A)電話(202)628-8800(B)傳真(202)628-8844(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度886bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型小鼠胚胎(vii)現(xiàn)來源(B)克隆pcif2(xi)序列描述SEQIDNO1CGGGACGCCCAGTGGTGCCATGGATAGACGTTTATGCACGTGCCACATGCCAGCCCAGGG60AGGTGGTGGTGCCTCTGAGCATGGAACTCATGGGCAATGTGGTCAAACAACTAGTGCCCA120GCTGTGTGACTGTGCAGCGCTGTGGTGGCTGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAATGTGTGC180CCACTGGGCAACACCAAGTCCGAATGCAGATCCTCATGATCCAGTACCCGAGCAGTCAGC240TGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACACAGCCAATGTGAATGCAGACCAAAAAAAAAAAGGA300GAGTGCTGTGAAGCCAGACAGCCCCAGGATCCTCTGCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGTCA360ACGCCCTGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGCTGCAGACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCA420AGGGCGGGGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTGTAGGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGACA480AGCTGCTTTCCAGACTCCACGGGCCCGGCTGCTTTTATGGCCCTGCTTCACAGGGACGAA540GAGTGGAGCACAGGCAAACCTCCTCAGTCTGGGAGGTCACTGCCCCAGGACCTGGACCTT600TTAGAGAGCTCTCTCGCCATCTTTTATCTCCCAGAGCTGCCATCTAACAATTGTCAAGGA660ACCTCATGTCTCACCTCAGGGGCCAGGGTACTCTCTCACTTAACCACCCTGGTCAAGTGA720GCATCTTCTGGCTGGCTGTCTCCCCTCACTATGAAAACCCCAAACTTCTACCAATAACGG780GATTTGGGTTCTGTTATGATAACTGTGACACACACACACACTCACACTCTGATAAAAGAG840AACTCTGATAAAAGAGATGGAAGACACTAAAAAAAAAAAAAAAAAA886(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度102個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型小鼠胚胎(xi)序列描述SEQIDNO2GlyArgProValValProTrpIleAspValTyrAlaArgAlaThrCys151015GlnProArgGluValValValProLeuSerMetGluLeuMetGlyAsn202530ValValLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGly354045GlyCysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHis505560GlnValArgMetGlnIleLeuMetIleGlnTyrProSerSerGlnLeu65707580GlyGluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLys859095LysLysArgArgValLeu100(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度55個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型小鼠胚胎(xi)序列描述SEQIDNO3LysProAspSerProArgIleLeuCysProProCysThrGlnArgArg151015GlnArgProAspProArgThrCysArgCysArgCysArgArgArgArg202530PheLeuHisCysGlnGlyArgGlyLeuGluLeuAsnProAspThrCys354045ArgCysArgLysProArgLys5055(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度565bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型成年小鼠心臟(xi)序列描述SEQIDNO4GAGCCCCCTGCTCCGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAGCTGGCTCGCACCCAGGC60CCCTGTGTCCCAGTTTGATGGCCCCAGCCACCAGAAGAAAGTGGTGCCATGGATAGACGT120TTATGCACGTGCCACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCTCTGAGCATGGAACTCAT180GGGCAATGTGGTCAAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTGCAGCGCTGTGGTGGCTG240CTGCCCTGACGATGGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACACCAAGTCCGAATGCAGAT300CCTCATGATCCAGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACACAGCCA360ATGTGAATGCAGACCAAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGAAGCCAGACAGCCCCAGGATCCT420CTGCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGTCAACGCCCTGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGCTG480CAGACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCAAGGGCGGGGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTG540TAGGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGA565(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度188個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型成年小鼠心臟(xi)序列描述SEQIDNO5MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuValAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaArgThrGlnAlaProValSerGlnPheAspGlyProSerHisGln202530LysLysValValProTrpIleAspValTyrAlaArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuSerMetGluLeuMetGlyAsnVal505560ValLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnIleLeuMetIleGlnTyrProSerSerGlnLeuGly100105110GluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLysLys115120125LysGluSerAlaValLysProAspSerProArgIleLeuCysProPro130135140CysThrGlnArgArgGlnArgProAspProArgThrCysArgCysArg145150155160CysArgArgArgArgPheLeuHisCysGlnGlyArgGlyLeuGluLeu165170175AsnProAspThrCysArgCysArgLysProArgLys180185(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度591bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型成年小鼠心臟(xi)序列描述SEQIDNO6ACCATGAGCCCCCTGCTCCGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAGCTGGCTCGCACC60CAGGCCCCTGTGTCCCAGTTTGATGGCCCCAGCCACCAGAAGAAAGTGGTGCCATGGATA120GACGTTTATGCACGTGCCACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCTCTGAGCATGGAA180CTCATGGGCAATGTGGTCAAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTGCAGCGCTGTGGT240GGCTGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACACCAAGTCCGAATG300CAGGTACCAGGGCCTATGGGTCAGATCCTCATGATCCAGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGG360GAGATGTCCCTGGAAGAACACAGCCAATGTGAATGCAGACCAAAAAAAAAGGAGAGTGCT420GTGAAGCCAGACAGCCCCAGGATCCTCTGCCCGCCTTGCACCCAGCGCCGTCAACGCCCT480GACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGCTGCAGACGCCGCCGCTTCCTCCATTGCCAAGGGCGG540GGCTTAGAGCTCAACCCAGACACCTGTAGGTGCCGGAAGCCGCGAAAGTGA591(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度195個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型成年小鼠心臟(xi)序列描述SEQIDNO7MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuValAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaArgThrGlnAlaProValSerGlnPheAspGlyProSerHisGln202530LysLysValValProTrpIleAspValTyrAlaArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuSerMetGluLeuMetGlyAsnVal505560ValLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnValProGlyProMetGlyGlnIleLeuMetIleGln100105110TyrProSerSerGlnLeuGlyGluMetSerLeuGluGluHisSerGln115120125CysGluCysArgProLysLysLysGluSerAlaValLysProAspSer130135140ProArgIleLeuCysProProCysThrGlnArgArgGlnArgProAsp145150155160ProArgThrCysArgCysArgCysArgArgArgArgPheLeuHisCys165170175GlnGlyArgGlyLeuGluLeuAsnProAspThrCysArgCysArgLys180185190ProArgLys195(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度405bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO8ACCATGAGCCCCCTGCTCCGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAGCTGGCTCGCACC60CAGGCCCCTGTGTCCCAGTTTGATGGCCCCAGCCACCAGAAGAAAGTGGTGCCATGGATA120GACGTTTATGCACGTGCCACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCTCTGAGCATGGAA180CTCATGGGCAATGTGGTCAAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTGCAGCGCTGTGGT240GGCTGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACACCAAGTCCGAATG300CAGATCCTCATGATCCAGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACAC360AGCCAATGTGAATGCAGACCAAAAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGA405(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度133個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO9MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuValAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaArgThrGlnAlaProValSerGlnPheAspGlyProSerHisGln202530LysLysValValProTrpIleAspValTyrAlaArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuSerMetGluLeuMetGlyAsnVal505560ValLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnIleLeuMetIleGlnTyrProSerSerGlnLeuGly100105110GluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLysLys115120125LysArgArgValLeu130(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度570bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型人纖維瘤(xi)序列描述SEQIDNO10ACCATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCCGCC60CAGGCCCCTGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGTGGTGTCATGGATA120GATGTGTATACTCGCGCTACCTGCCAGCCCCGGGAGGTGGTGGTGCCCTTGACTGTGGAG180CTCATGGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTGCCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCTGTGGT240GGCTGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAGCACCAAGTCCGGATG300CAGATCCTCATGATCCGGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACAC360AGCCAGTGTGAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAGACAGCCCCAGG420CCCCTCTGCCCACGCTGCACCCAGCACCACCAGCGCCCTGACCCCCGGACCTGCCGCTGC480CGCTGCCGACGCCGCAGCTTCCTCCGTTGCCAAGGGCGGGGCTTAGAGCTCAACCCAGAC540ACCTGCAGGTGCCGGAAGCTGCGAAGGTGA570(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長度188個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型人纖維瘤(xi)序列描述SEQIDNO11MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuAlaAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaProAlaGlnAlaProValSerGlnProAspAlaProGlyHisGln202530ArgLysValValSerTrpIleAspValTyrThrArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuThrValGluLeuMetGlyThrVal505560AlaLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnIleLeuMetIleArgTyrProSerSerGlnLeuGly100105110GluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLysLys115120125LysAspSerAlaValLysProAspSerProArgProLeuCysProArg130135140CysThrGlnHisHisGlnArgProAspProArgThrCysArgCysArg145150155160CysArgArgArgSerPheLeuArgCysGlnGlyArgGlyLeuGluLeu165170175AsnProAspThrCysArgCysArgLysLeuArgArg180185(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度624bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設無(vi)最初來源(F)組織類型小鼠(xi)序列描述SEQIDNO12ATGAGCCCCCTGCTCCGTCGCCTGCTGCTTGTTGCACTGCTGCAGCTGGCTCGCACCCAG60GCCCCTGTGTCCCAGTTTGATGGCCCCAGCCACCAGAAGAAAGTGGTGCCATGGATAGAC120GTTTATGCACGTGCCACATGCCAGCCCAGGGAGGTGGTGGTGCCTCTGAGCATGGAACTC180ATGGGCAATGTGGTCAAACAACTAGTGCCCAGCTGTGTGACTGTGCAGCGCTGTGGTGGC240TGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAATGTGTGCCCACTGGGCAACACCAAGTCCGAATGCAG300ATCCTCATGATCCAGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACACAGC360CAATGTGAATGCAGACCAAAAAAAAAGGAGAGTGCTGTGAAGCCAGACAGGGTTGCCATA420CCCCACCACCGTCCCCAGCCCCGCTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTACCCCGGGAGCATCC480TCCCCAGCTGACATCATCCATCCCACTCCAGCCCCAGGATCCTCTGCCCGCCTTGCACCC540AGCGCCGTCAACGCCCTGACCCCCGGACCTGCCGCTGCCGCTGCAGACGCCGCCGCTTCC600TCCATTGCCAAGGGCGGGGCTTAG624(2)SEQIDNO13的信息、(i)序列特征(A)長度207個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)最初來源(F)組織類型小鼠(xi)序列描述SEQIDNO13MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuValAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaArgThrGlnAlaProValAlaGlnPheAspGlyProSerHisGln202530LysLysValValProTrpIleAspValTyrAlaArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuSerMetGluLeuMetGlyAsnVal505560ValLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnIleLeuMetIleGlnTyrProSerSerGlnLeuGly100105110GluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLysLys115120125LysGluSerAlaValLysProAspArgValAlaIleProHisHisArg130135140ProGlnProArgSerValProGlyTrpAspSerThrProGlyAlaSer145150155160SerProAlaAspIleIleHisProThrProAlaProGlySerSerAla165170175ArgLeuAlaProSerAlaValAsnAlaLeuThrProGlyProAlaAla180185190AlaAlaAlaAspAlaAlaAlaSerSerIleAlaLysGlyGlyAla195200205(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長度624bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)最初來源(F)組織類型人(xi)序列描述SEQIDNO14ATGAGCCCTCTGCTCCGCCGCCTGCTGCTCGCCGCACTCCTGCAGCTGGCCCCCGCCCAG60GCCCCTGTCTCCCAGCCTGATGCCCCTGGCCACCAGAGGAAAGTGGTGTCATGGATAGAT120GTGTATACTCGCGCTACCTGCCAGCCCCGGGAGGTGGTGGTGCCCTTGACTGTGGAGCTC180ATGGGCACCGTGGCCAAACAGCTGGTGCCCAGCTGCGTGACTGTGCAGCGCTGTGGTGGC240TGCTGCCCTGACGATGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGGGCAGCACCAAGTCCGGATGCAG300ATCCTCATGATCCGGTACCCGAGCAGTCAGCTGGGGGAGATGTCCCTGGAAGAACACAGC360CAGTGTGAATGCAGACCTAAAAAAAAGGACAGTGCTGTGAAGCCAGACAGGGCTGCCACT420CCCCACCACCGTCCCCAGCCCCGTTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTGCCCCCGGAGCACCC480TCCCCAGCTGACATCACCCATCCCACTCCAGCCCCAGGCCCCTCTGCCCACGCTGCACCC540AGCACCACCAGCGCCCTGACCCCCGGACCTGCCGCCGCCGCTGCCGACGCCGCAGCTTCC600TCCGTTGCCAAGGGCGGGGCTTAG624(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長度207個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)最初來源(F)組織類型人(xi)序列描述SEQIDNO15MetSerProLeuLeuArgArgLeuLeuLeuAlaAlaLeuLeuGlnLeu151015AlaProAlaGlnAlaProValSerGlnProAspAlaProGlyHisGln202530ArgLysValValSerTrpIleAspValTyrThrArgAlaThrCysGln354045ProArgGluValValValProLeuThrValGluLeuMetGlyThrVal505560AlaLysGlnLeuValProSerCysValThrValGlnArgCysGlyGly65707580CysCysProAspAspGlyLeuGluCysValProThrGlyGlnHisGln859095ValArgMetGlnIleLeuMetIleArgTyrProSerSerGlnLeuGly100105110GluMetSerLeuGluGluHisSerGlnCysGluCysArgProLysLys115120125LysAspSerAlaValLysProAspArgAlaAlaThrProHisHisArg130135140ProGlnProArgSerValProGlyTrpAspSerAlaProGlyAlaPro145150155160SerProAlaAspIleThrHisProThrProAlaProGlyProSerAla165170175HisAlaAlaProSerThrThrSerAlaLeuThrProGlyProAlaAla180185190AlaAlaAlaAspAlaAlaAlaSerSerValAlaLysGlyGlyAla195200205(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO16ProXaaCysValXaaXaaXaaArgCysXaaGlyCysCys1510(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長度1550bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(線性)(xi)序列描述SEQIDNO17CTCGAGATCTGTTTGTTGTCTTGGAACAATACGGTTTAGAGGTGACTGGCGGGTGACGAG60AACATATGCGAGTTCACCTAAGAGAAAAGCTGAATGAGGCAATGCCTCTTCCTGACCATA120TCTCTTACTCAGATAACTATAGAATTTATTGTCCAGTAAAGGGTATATTAAAAAATCATA180TTAAAAGTCATACAGTGAAGTTGTCCAGGGAAATCAAGACTTAACAGTCTCACTCTGACA240ATAATGAACAGGGGGATTCCCTCAAGATAGACTAGGACATGACCCCACACTGGCAGGTAG300TAGTACCAGAAAAGAACGCATGGAAAATCTTTACCTTATGCTTGAGGTAGGGACCAGGCT360AAAGTGAAGGCCAGACCTAAAATTCTATCTAAAATAAATCCACAATCGAAGAAAATATGT420GGTGTACAGGTATAGAATGTCTTTACTGGATCATTGAAATAGTAAGATAAATTCAACTTT480TTACATTGTTTTCTTTTCCTCCAGTTAGGGCTTGAGACCTTCGTCTCTGGAGAGTGACTG540TCAATTGGAGCCCTGCTTTCTGGGTTTCTGGCCAGGGGGGTTGTGGATGCTTAACATGTG600CCTTTCACAGGACACTTCCTTACCCCAGCAGTGGCCANGTGTGCATCCCACGACCAGGCC660TCCCTCTCACGGAACATCTGTTGAGACTAGGAGATGCCTGGTGACTGTTGCCTGACCTGT720GTCCTGTGTATTTCTGACAAGAGCCACTCTCAAAGACCCTGGCCAGGAGGAGAGTTAGGT780TCCAGTGTAGGTCAGCTCAGACAGATGGAGGCCACAGAANCAAACATGGGAAATCACAGA840AGTAGGTTTATTACTCACAGATCCCTATCCCAACCACCCAGGTGCCCTCTCCTCCAGGGC900CAACAGAGGCATCCTTCAGCAGGAGCGACAACGGCTAGGGCAGCGGCAAGCCGCCACCAT960CCGAGCCAACCCAGGCCCCGAGATCGTGCCCCGGGGCGCCGGCCCCTGAGGGGCTCACCT1020GGATGGGGCCTGCATGCGTTCCCGCTTTGCTTCCTTCCCTGGACGGCCCGCTCCCCCGAA1080ACGCGCCGCCAATAAAGTGATTCGCAGAGCTCGTGTGCGGCTCCCTCCTTAAGGCCCGAC1140GCCCCCGGCCCCGGCCTCGCCAAGGGCAGCGCCCCGGCCTCCGGGTAGTGGCGGCCGGCG1200ACTGGGGAGCCCAGCCTCCTGGGCGGTGCGTCCCCTTCCCCCTGCCGCGGCGGGAGGCGG1260GAGGGGGTGTGTGGAGGAGGCGGGCCCCGCCGACGGCCTCGCCCCCCCACCCCGCCGCCC1320CGCCCCCGCCCCACGGGCCCGGTGGGGAGCGCGTGTCTGGGTCACATGAGCCGCCTGCCC1380GCCAGCCCGGGCCCAGCCCCCCGCCGCCCCCGCCGTCCCCGCCGCCGCTGCCCGCCGCCA1440CCGGCCGCCCGCCCGCCCGGCTCCTCCGGCCGCCTTCGCTGCGCTGCNTGCGCTGCCTGC1500ACCCAGGGCTCGGGAGGGGGCCGCGGAGGAGCCGCCCCCCGCGCCCGGCC1550(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO18CACCATGAGCCCTCTGCTCC20(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO19GCCATGTGTCACCTTCGCAG20(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO20GGGCATCAGGCTGGGAGACAG21(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO21CysProValSerGlnPheAspGlyProSerHisGlnLysLysValVal151015ProCys(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO22SerGlnProAspAlaproGlyHisGlnArgLysValValSerTrpIle151015AspValTyrThrArgAlaThr20(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO23CACAGCCAATGTGAATGCA19(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO24GCTCTAAGCCCCGCCCTTGGCAATGGAGGAA31(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長度28bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO25ACGTAGATCTTCACTTTCGCGGCTTCCG28(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO26CTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTA23(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長度27bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO27TCAGGGCGTTGACGGCGCTGGGTGCAA27(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO28CCTGACGATGGCCTGGAGTGT21(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO29TGTCCCTGGAAGAACACAGCC21(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO30CGGGAAATCGTGCGTGACAT20(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO31GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG21權利要求書按照條約第19條的修改1、一種分離的核酸，其編碼包括如下特征性氨基酸序列并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質的蛋白質，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)，所述的核酸選自圖1和2的DNA(SEQIDNO1)，圖3的DNA(SEQIDNO4)，圖5的DNA(SEQIDNO6)，圖7的DNA(SEQIDNO8)，圖10的DNA(SEQIDNO10)，圖12的DNA(SEQIDNO12)，圖14的DNA(SEQIDNO14)，以及在嚴格條件下與至少一種前述DNA序列雜交的核酸。2、權利要求1的核酸，其中所述的核酸是cDNA。3、權利要求1的核酸，包括對應于圖1和2的DNA(SEQIDNO1)的cDNA。4、權利要求1的核酸，其中所述的核酸序列是哺乳動物DNA。5、權利要求4的核酸，其中所述的核酸是小鼠DNA。6、權利要求4的核酸，其中所述的核酸是人DNA。7、權利要求1的核酸，其中所述的核酸編碼一種促進血管內皮細胞增殖的蛋白質。8、權利要求1的核酸，包括對應于圖3的DNA(SEQIDNO4)的cDNA。9、權利要求1的核酸，包括對應于圖5的DNA(SEQIDNO6)的cDNA。10、權利要求1的核酸，包括對應于圖7的DNA(SEQIDNO8)的cDNA。11、權利要求1的核酸，包括對應于圖10的DNA(SEQIDNO10)的cDNA。12、權利要求1的核酸，包括對應于圖12的DNA(SEQIDNO12)的cDNA。13、權利要求1的核酸，包括對應于圖14的DNA(SEQIDNO14)的cDNA。14、一種載體，包括與一啟動子序列可操縱連接的權利要求1的核酸。15、權利要求14的載體，其中所述的載體是真核載體。16、權利要求14的載體，其中所述的載體是原核載體。17、權利要求14的載體，其中所述的載體是質粒。18、一種分離的蛋白質，其顯示如下特征性氨基酸序列并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)，所述的蛋白質包括基本上對應于選自如下一組的氨基酸序列的氨基酸序列，所述的組為圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)，圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)，圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)，圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)，圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)，圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)，圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)，圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)。19、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)的氨基酸序列。20、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)的氨基酸序列。21、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)的氨基酸序列。22、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)的氨基酸序列。23、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)的氨基酸序列?；嵝蛄?SEQIDNO9)的氨基酸序列。24、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)的氨基酸序列。25、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)的氨基酸序列。26、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)的氨基酸序列。27、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質為哺乳動物蛋白質。28、權利要求27的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質是小鼠蛋白質。29、權利要求27的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質是人蛋白質。30、權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質促進血管內皮細胞的增殖。31、由選自如下一組的DNA表達而生產(chǎn)的分離的蛋白質，所述的組為圖1和2的DNA(SEQIDNO1)，圖3的DNA(SEQIDNO4)，圖5的DNA(SEQIDNO6)，圖7的DNA(SEQIDNO8)，圖10的DNA(SEQIDNO10)，圖12的DNA(SEQIDNO12)，圖14的DNA(SEQIDNO14)，以及在嚴格條件下與至少一種前述DNA序列雜交的DNA。32、一種藥物組合物，包括促進內皮或中胚層細胞增殖有效量的權利要求18的蛋白質，以及至少一種常規(guī)的藥物載體或稀釋劑。33、一種與權利要求18的蛋白質反應的抗體。34、權利要求33的抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。35、一種宿主細胞，其用權利要求14的載體轉化或轉染，從而所述的宿主細胞表達一種具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質的蛋白質。36、權利要求35的轉染的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是真核細胞。37、權利要求35的轉染的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是COS細胞。38、權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是原核細胞。39、權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是293EBNA細胞。40、權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是昆蟲細胞。41、一種用于定量檢測測試樣品中的VEGF-B的診斷工具，所述的工具包括權利要求33的抗體，該抗體與VEGF-B反應以檢測樣品中VEGF-B的量。42、權利要求41的診斷工具，其中所述的抗體是標記抗體。43、一種用于在測試樣品中檢測VEGF-B的診斷工具，所述的工具包括至少一對與權利要求1的核酸序列互補的引物，用于經(jīng)聚合酶鏈反應擴增測試的VEGF-B基因以實現(xiàn)測試的VEGF-B基因與權利要求1的核酸序列的序列對比。44、一種藥物組合物，包括結合VEGF-B有效量的權利要求33的抗體，以及至少一種藥物學可接受的載體或佐劑。45、一種藥物組合物，包括促進內皮或中胚層細胞增殖有效量的權利要求18的蛋白質，以及VEGF。46、權利要求45的藥物組合物，進一步包括肝素，肝素的量應足以保證促進細胞增殖量的所述的蛋白質游離存在，不與細胞結合。47、權利要求32的藥物組合物，進一步包括肝素，肝素的量應足以保證促進細胞增殖量的所述的蛋白質游離存在，不與細胞結合。48、一種藥物組合物，包括刺激血管生成有效量的權利要求18的蛋白質，以及肝素。49、一種分離的蛋白質二聚體，包括權利要求18的蛋白質。50、權利要求49的分離的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是所述蛋白質的同二聚體。51、權利要求49的分離的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是所述蛋白質和VEGF的異二聚體。52、權利要求49的分離的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是二硫鍵鍵合的二聚體。53、一種促進至少一種選自權利要求18的蛋白質和VEGF組成的一組的蛋白質從表達所述的至少一種蛋白質的細胞釋放的方法，所述方法包括將細胞與肝素接觸。54、一種載體，其包括一種與權利要求1的核酸序列的至少一部分互補的反義核苷酸序列。55、一種阻止VEGF-B從表達VEGF-B的細胞表達的方法，所述的方法包括用權利要求54的載體轉染所述的細胞。56、權利要求55的方法，其中所述的細胞是腫瘤細胞。57、一種分離的核酸，包括對應于圖25的序列(SEQIDNO17)的核苷酸序列或者在嚴格條件下與所述的核苷酸序列雜交的核酸。58、一種用載體轉化或轉染從而使其表達VEGF-B蛋白的宿主細胞，所述的載體包括與合適的啟動子可操縱連接的權利要求1的核酸序列。59、權利要求58的宿主細胞，其中所述的VEGF-B蛋白包括基本上對應于選自如下一組的氨基酸序列的氨基酸序列，所述的組為圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)，圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)，圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)，圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)，圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)，圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)，圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)，圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)。60、一種用于在測試樣品中檢測VEGF-B的診斷工具，所述的工具包括至少一對與權利要求1的核酸序列互補的引物。61、一種從細胞獲得至少一種選自權利要求18的蛋白質和VEGF組成的一組的蛋白質的方法，所述的細胞表達所述的至少一種蛋白質，所述方法包括將細胞與肝素接觸以誘導所述的至少一種蛋白質釋放，以及收集釋放的蛋白質。62、一種制備適于表達VEGF-B蛋白質的載體的方法，所述的方法包括將權利要求1的核苷酸序列以與合適的啟動子呈可操縱連接關系摻入載體。63、一種編碼人VEGF-B分子的分離的核酸分子，其中所述的分離的核酸分子與編碼小鼠VEGF-B的核酸分子于42℃在50％甲酰胺、5×SSCpH7.0或5×SSPE緩沖液、1％-2％SDS、5-10×Denhardt’s溶液和100μg/ml鮭精DNA中可雜交。權利要求1.一種分離的DNA，其編碼包括如下特征性氨基酸序列并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質的蛋白質，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)，所述的DNA選自圖1和2的DNA(SEQIDNO1)，圖3的DNA(SEQIDNO4)，圖5的DNA(SEQIDNO6)，圖7的DNA(SEQIDNO8)，圖10的DNA(SEQIDNO10)，圖12的DNA(SEQIDNO12)，圖14的DNA(SEQIDNO14)，以及在嚴格條件下與至少一種前述DNA序列雜交的DNA。2.權利要求1的DNA，其中所述的DNA是cDNA。3.權利要求1的DNA，包括對應于圖1和2的DNA(SEQIDNO1)的cDNA。4.權利要求1的DNA，其中所述的DNA序列是哺乳動物DNA。5.權利要求4的DNA，其中所述的DNA是小鼠DNA。6.權利要求4的DNA，其中所述的DNA是人DNA。7.權利要求1的DNA，其中所述的DNA編碼一種促進血管內皮細胞增殖的蛋白質。8.權利要求1的DNA，包括對應于圖3的DNA(SEQIDNO4)的cDNA。9.權利要求1的DNA，包括對應于圖5的DNA(SEQIDNO6)的cDNA。10.權利要求1的DNA，包括對應于圖7的DNA(SEQIDNO8)的cDNA。11.權利要求1的DNA，包括對應于圖10的DNA(SEQIDNO10)的cDNA。12.權利要求1的DNA，包括對應于圖12的DNA(SEQIDNO12)的cDNA。13.權利要求1的DNA，包括對應于圖14的DNA(SEQIDNO14)的cDNA。14.一種包括權利要求1的DNA的載體。15.權利要求14的載體，其中所述的載體是真核載體。16.權利要求14的載體，其中所述的載體是原核載體。17.權利要求14的載體，其中所述的載體是質粒。18.一種顯示如下特征性氨基酸序列并具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質的蛋白質，所述的特征性氨基酸序列為Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQIDNO16)，所述的蛋白質包括基本上對應于選自如下一組的氨基酸序列的氨基酸序列，所述的組為圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)，圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)，圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)，圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)，圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)，圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)，圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)，圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)。19.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖1的氨基酸序列(SEQIDNO2)的氨基酸序列。20.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖2的氨基酸序列(SEQIDNO3)的氨基酸序列。21.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖4的氨基酸序列(SEQIDNO5)的氨基酸序列。22.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖6的氨基酸序列(SEQIDNO7)的氨基酸序列。23.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖8的氨基酸序列(SEQIDNO9)的氨基酸序列。24.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖11的氨基酸序列(SEQIDNO11)的氨基酸序列。25.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖13的氨基酸序列(SEQIDNO13)的氨基酸序列。26.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質包括對應于圖15的氨基酸序列(SEQIDNO15)的氨基酸序列。27.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質為哺乳動物蛋白質。28.權利要求27的蛋白質，其中所述的蛋白質是小鼠蛋白質。29.權利要求27的蛋白質，其中所述的蛋白質是人蛋白質。30.權利要求18的蛋白質，其中所述的蛋白質促進血管內皮細胞的增殖。31.由選自如下一組的DNA表達而生產(chǎn)的蛋白質，所述的組為圖1和2的DNA(SEQIDNO1)，圖3的DNA(SEQIDNO4)，圖5的DNA(SEQIDNO6)，圖7的DNA(SEQIDNO8)，圖10的DNA(SEQIDNO10)，圖12的DNA(SEQIDNO12)，圖14的DNA(SEQIDNO14)，以及在嚴格條件下與至少一種前述DNA序列雜交的DNA。32.一種藥物組合物，包括促進內皮或中胚層細胞增殖有效量的權利要求18的蛋白質，以及至少一種常規(guī)的藥物載體或稀釋劑。33.一種與權利要求18的蛋白質反應的抗體。34.權利要求33的抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。35.一種宿主細胞，其用權利要求14的載體轉化或轉染，從而所述的宿主細胞表達一種具有促進內皮細胞或中胚層細胞增殖性質的蛋白質。36.權利要求35的轉染的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是真核細胞。37.權利要求35的轉染的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是COS細胞。38、權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是原核細胞。39.權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是293EBNA細胞。40.權利要求35的轉化的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是昆蟲細胞。41.一種用于定量檢測測試樣品中的VEGF-B的診斷工具，所述的工具包括權利要求33的抗體，該抗體與VEGF-B反應以檢測樣品中VEGF-B的量。42.權利要求41的診斷工具，其中所述的抗體是標記抗體。43.一種用于在測試樣品中檢測VEGF-B的診斷工具，所述的工具包括至少一對與權利要求1的DNA序列互補的引物，用于經(jīng)聚合酶鏈反應擴增測試的VEGF-B基因以實現(xiàn)測試的VEGF-B基因與權利要求1的DNA序列的序列對比。44.一種藥物組合物，包括結合VEGF-B有效量的權利要求33的抗體。45.一種藥物組合物，包括促進內皮或中胚層細胞增殖有效量的權利要求18的蛋白質，以及VEGF。46.權利要求45的藥物組合物，進一步包括肝素，肝素的量應足以保證促進細胞增殖量的所述的蛋白質游離存在，不與細胞結合。47.權利要求32的藥物組合物，進一步包括肝素，肝素的量應足以保證促進細胞增殖量的所述的蛋白質游離存在，不與細胞結合。48.一種藥物組合物，包括刺激血管生成有效量的權利要求18的蛋白質，以及肝素。49.一種蛋白質二聚體，包括權利要求18的蛋白質。50.權利要求49的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是所述蛋白質的同二聚體。51.權利要求49的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是所述蛋白質和VEGF的異二聚體。52.權利要求49的蛋白質二聚體，其中所述的蛋白質二聚體是二硫鍵鍵合的二聚體。53.一種促進至少一種選自權利要求18的蛋白質和VEGF組成的一組的蛋白質從表達所述的至少一種蛋白質的細胞釋放的方法，所述方法包括將細胞與肝素接觸。54.一種載體，其包括一種與權利要求1的DNA序列的至少一部分互補的反義核苷酸序列。55.一種阻止VEGF-B從表達VEGF-B的細胞表達的方法，所述的方法包括用權利要求54的載體轉染所述的細胞。56.權利要求55的方法，其中所述的細胞是腫瘤細胞。57.一種分離的DNA，包括對應于圖25的序列(SEQIDNO17)的核苷酸序列或者在嚴格條件下與所述的核苷酸序列雜交的DNA。全文摘要來自生長因子PDGF家族并具有促進血管內皮細胞有絲分裂和增殖性質的VEGF－B多肽,編碼這些多肽的DNA序列,含有它們的藥物組合物,以及與它們反應的抗體。所述的VEGF－B多肽可用于刺激血管生成以及用于診斷應用中。文檔編號A61K38/00GK1176603SQ96192203公開日1998年3月18日申請日期1996年3月1日優(yōu)先權日1995年3月1日發(fā)明者烏爾夫·埃里克松,比吉塔·奧洛夫松,卡里·阿利塔洛,卡特里·帕尤薩拉申請人:路德維格癌癥研究所,赫爾辛基大學許可貿易公司