專利名稱：四價(jià)cd47-抗體恒定區(qū)融合蛋白用于治療的制作方法
四價(jià)CD47-抗體恒定區(qū)融合蛋白用于治療
本發(fā)明涉及用作藥物的、特別地用于預(yù)防或治療自身免疫病和炎性疾病(例如過(guò)敏性哮喘和炎性腸病)的可溶性SIRPa結(jié)合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及包含至少兩個(gè)雙價(jià)異源二聚體的復(fù)合物的可溶性SIRPa結(jié)合蛋白，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)的N端部分融合的第一 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)的N端部分融合的第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案進(jìn)一步由圖I顯示。
SIRPa (⑶172a)是由包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和常規(guī)樹(shù)狀細(xì)胞(DC)的髓系細(xì)胞表達(dá)以及在神經(jīng)元細(xì)胞上的免疫受體(van den Berg等人，2008, Trends in Immunol., 29(5) 203-6)。SIRPa 是 CD47 的低親和力配體(Rebres 等人，2001, J. Biol. Chem.； 276(37) :34607-16 ;Hatherley 等人，2007 J. Biol. Chem. ；282(19) 14567-75 ；Hatherley 等人，2008 ；Mol.Cell ;31 (2) 266-77)，并且SIRP α與CD47的相互作用組成了基于黏附和雙向信號(hào)傳導(dǎo)控制的細(xì)胞通訊體系，所述細(xì)胞通訊體系調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)元系統(tǒng)中的多種細(xì)胞功能。這些功能包括移行、細(xì)胞成熟、巨噬細(xì)胞吞噬作用和髓樣樹(shù)狀細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生(van den Berg 等人，2008 Trends in Immunol. 29 (5) 203-6 ；Sarfati 2009, Curr. Drug. Targets,9(10) 852-50)。
來(lái)自動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)表明SIRP α/⑶47相互作用可以有助于或甚至控制幾種病癥的發(fā)病機(jī)理，所述病癥包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人，2008，BBRC ；371 (3) 561-6 ;Tomizawa 等人，2007，J. Tmmunol ； 179 (2) :869_877);局部缺血性疾病(Isenberg 等人，2008, Arter. Thromb Vase. Biol. ,28(4) 615-21 ；Isenberg 2008, Am. J. Pathol., 173(4) : 1100-12)或腫瘤學(xué)相關(guān)疾病(Chan 等人，2009，PNAS，106 (33) : 14016-14021 ; Majeti等人，2009，Cell，138 (2) :286_99)。調(diào)節(jié)SIRP a/CD47途徑因此可以是用于多種疾病的有希望的治療性選項(xiàng)。
已經(jīng)建議使用針對(duì)⑶47、SIRPa或⑶47衍生的結(jié)合SIRP a的多肽的抗體作為治療手段(W0 1998/40940、WO 2004/108923、W02007/133811、WO 2009/046541)。此外，結(jié)合SIRPa的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-結(jié)腸炎(Fortin等人，2009，J Exp Med.，206(9) :1995_2011)、朗格漢斯細(xì)胞移行(J. Immunol. 2004,172 =4091-4099)和關(guān)節(jié)炎(VLST Inc, 2008, Exp. Opin. Therap. Pat. , 18 (5) :555_561))的動(dòng)物模型中是有效的。
此外，提出SIRP α/0)47參與控制吞卩遼作用(van den Berg等人，2008, Trends in Immunol. ,29(5) :203_6)，并且聲稱通過(guò)SIRP α結(jié)合多肽進(jìn)行干涉來(lái)增進(jìn)NOD小鼠系中的人干細(xì)胞植入(W0 2009/046541)，表明含有⑶47胞外結(jié)構(gòu)域(E⑶)的治療劑用于人干細(xì)胞移植中的潛在益處。
本發(fā)明提供了可溶性結(jié)合蛋白，它們包含第一和第二多肽鏈的異源二聚體，每種鏈包含與抗體恒定區(qū)序列融合的結(jié)合部分。這些可溶性蛋白用作治療劑。
本發(fā)明還提供用作治療劑的改進(jìn)的可溶性SIRP α結(jié)合蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)的⑶47 蛋白融合物相比，如本發(fā)明中所定義的結(jié)合SIRPa的抗體樣蛋白可以提供增加針對(duì)靶向的表達(dá)SIRPa的細(xì)胞的親合力，同時(shí)維持優(yōu)異的可發(fā)展性特征的手段。另外，不受任何理論約束，預(yù)期較高的親合力導(dǎo)致較長(zhǎng)的藥物動(dòng)力學(xué)半壽期，因而提供增強(qiáng)的治療效能。這些新的研究結(jié)果提供了靶向表達(dá)SIRPa的細(xì)胞的新治療工具并且代表治療性前景，特別地對(duì)于多種自身免疫病和炎性疾病、癌癥或干細(xì)胞移植而言是如此。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成toon] α)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)融合的相同結(jié)合分子的區(qū)域。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的ChI恒定重鏈區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的(V〖亙定輕鏈區(qū)融合的相同結(jié)合分子的區(qū)域。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種單鏈多肽是單價(jià)的，每個(gè)異源二聚體是二價(jià)的，并且每個(gè)復(fù)合物是至少四價(jià)的。本發(fā)明的異源二聚體和可溶性蛋白具有每條多肽鏈價(jià)態(tài)是I價(jià)。 與現(xiàn)有技術(shù)的分子相比，本發(fā)明的可溶性蛋白具有增加的價(jià)態(tài)。通過(guò)在每種第一和第二單鏈多肽中并入相同的結(jié)合分子，每個(gè)異源二聚體的價(jià)態(tài)是兩價(jià)，即，異源二聚體內(nèi)部的每條鏈可以結(jié)合一個(gè)單獨(dú)的結(jié)合配偶體或?qū)ο嗤慕Y(jié)合配偶體結(jié)合兩次。這將與其中第一和第二多肽鏈的異源二聚體的價(jià)態(tài)是I價(jià)(即，同時(shí)需要兩條鏈以結(jié)合這種結(jié)合配偶體)的現(xiàn)有技術(shù)分子(例如WO 01/46261中披露的那些)形成對(duì)比至這樣的程度兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物具有的價(jià)態(tài)是2價(jià)。因而，本發(fā)明的兩個(gè)二價(jià)異源二聚體的復(fù)合物具有四價(jià)態(tài)(四價(jià))，即，這個(gè)復(fù)合物可以結(jié)合多達(dá)四個(gè)結(jié)合配偶體，或?qū)ο嗤慕Y(jié)合配偶體結(jié)合多達(dá)四次。 本發(fā)明的異源二聚體是雙價(jià)，并且異源二聚體的復(fù)合物具有價(jià)態(tài)nx2，其中η是該復(fù)合物內(nèi)部所包含的異源二聚體的數(shù)目。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該復(fù)合物包含兩個(gè)異源二聚體并且具有價(jià)態(tài)4。包含多于兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物具有大于4的價(jià)態(tài)(例如6、8或10的價(jià)態(tài))。本發(fā)明可溶性蛋白的增加的價(jià)態(tài)導(dǎo)致較高的親合力，有利地影響半壽期和效能。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種具有至少4價(jià)(或至少是四價(jià))的可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)融合的相同哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種具有至少4價(jià)的可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的ChI恒定重鏈區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的(V〖亙定輕鏈區(qū)融合的相同結(jié)合分子的區(qū)域。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，該結(jié)合分子的區(qū)域是相同的。因此，本發(fā)明提供一種具有至少 4價(jià)的可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)融合的相同哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的相同區(qū)域。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種具有至少4價(jià)的可溶性蛋白，它包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的ChI恒定重鏈區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和
(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的(V〖亙定輕鏈區(qū)融合的相同結(jié)合分子的相同區(qū)域。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域與抗體序列的N端部分(SP， 與ChI區(qū)和Cl恒定區(qū))融合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子是細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、低分子量化合物(藥物)、配體或細(xì)胞表面受體。優(yōu)選地，該結(jié)合分子是哺乳動(dòng)物單體的或同型聚合的細(xì)胞表面受體。結(jié)合分子的區(qū)域可以是完整分子或其可以保留該結(jié)合分子的生物學(xué)活性的部分或片段。結(jié)合分子的區(qū)域可以是胞外區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物單體的或同型聚合的細(xì)胞表面受體包含免疫球蛋白超家族(IgSF)結(jié)構(gòu)域，例如它包含⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性蛋白是一種抗體樣蛋白(下文還稱作并定義為 Fusobody)，其中抗體的兩條臂的可變區(qū)由SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換，從而提供多價(jià)的可溶性蛋白。
這種結(jié)合SIRP α的Fusobody的一個(gè)實(shí)例在圖I中顯示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的可溶性結(jié)合SIRPa的蛋白質(zhì)或結(jié)合 SIRPa的Fusobody，其包含兩個(gè)二價(jià)異源二聚體的四價(jià)復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成
(i)第一單鏈多肽，其包含在抗體的恒SchI重鏈區(qū)的N端部分處融合的第一 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和，
(ii)第二單鏈多肽，其包含在抗體的恒定Q輕鏈區(qū)的N端部分處融合的第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody的每個(gè)異源二聚體的所述第一單鏈多肽還包含與所述ChI區(qū)融合的免疫球蛋白的Ch2和Ch3區(qū)，從而重構(gòu)抗體的全長(zhǎng)恒定重鏈。所述ChU Ch2和Ch3區(qū)可以衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4相應(yīng)區(qū)域的野生型或突變變體，其具有沉默的效應(yīng)子功能和/或減少的細(xì)胞殺傷性ADCC或CDC效應(yīng)子功能，例如減少的ADCC效應(yīng)子功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody與人SIRP α以 10 μ M或更小，例如4 μ M或更小，例如I μ M或更小，O. I μ M或更小的Kd結(jié)合，如表面等離子體共振法如BiaCORE測(cè)定法所測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的 Fusobody與人SIRP α以O(shè). I至10 μ M范圍內(nèi)的Kd結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody促進(jìn)SIRP a + 白細(xì)胞如SIRPa +U937細(xì)胞以20nM或更小，例如2nM或更小，例如200pM和20nM之間的 EC50的黏附，如基于板的細(xì)胞黏附測(cè)定法中所測(cè)量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRP α的Fusobody抑制體外產(chǎn)生的單核細(xì)胞衍生性樹(shù)狀細(xì)胞中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎細(xì)胞因子釋放。
例如，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody以2nM或更小、O. 2nM或更小、 例如20pM和2nM之間的IC5tl抑制體外產(chǎn)生的單核細(xì)胞衍生性樹(shù)狀細(xì)胞中金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎細(xì)胞因子釋放,如樹(shù)狀細(xì)胞細(xì)胞因子釋放測(cè)定法中所測(cè)量。
在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽由二硫鍵共價(jià)地結(jié)合，例如使用相應(yīng)ChI區(qū)和Q區(qū)的半胱氨酸殘基之間的天然二硫鍵。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)肽接頭分別與ChI區(qū)和 Q區(qū)融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二 SIRP α結(jié)合結(jié)構(gòu)域在肽接頭不存在下直接與相應(yīng)的ChI區(qū)和Q區(qū)融合。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody基本上由兩個(gè)異源二聚體組成，其中每個(gè)異源二聚體的所述第一單鏈多肽包含免疫球蛋白恒定部分的鉸鏈區(qū)，并且這兩個(gè)異源二聚體彼此通過(guò)半胱氨酸之間的二硫鍵在它們鉸鏈區(qū)處穩(wěn)定締口 ο
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性蛋白包含選自以下的至少一個(gè)SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域
⑴人⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域；
(ii)SEQ ID NO 4的多肽或保留SIRPa結(jié)合特性的SEQ ID NO 4的片段；和
(iii)與 SEQ ID NO :4 具有至少 60、70、80、90、95、96、97、98 或 99%序列同一性并保留SIRP α結(jié)合特性的SEQ ID NO :4的變體多肽。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，全部SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。例如， 全部 SIRP α 結(jié)合結(jié)構(gòu)域由 SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :21 或 SEQ ID NO 23 或 SEQ ID NO 27 組成。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述可溶性蛋白或結(jié)合SIRP α的Fusobody包含兩個(gè)異源二聚體，其中每個(gè)異源二聚體基本上由SEQ ID NO 5的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 6的第二單鏈多肽組成。與抗體的重鏈和輕鏈相似，所述第一和第二單鏈多肽至少經(jīng)一個(gè)二硫鍵穩(wěn)定締合。在相關(guān)的實(shí)施方案中，可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody包含兩個(gè)異源二聚體，其中每個(gè)異源二聚體的第一和第二單鏈多分別與相應(yīng)SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的第一和第二單鏈多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性， 同時(shí)保留如上文所述的結(jié)合SIRPa的Fusobody的有利功能特征。
具體而言，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這種可溶性蛋白或結(jié)合SIRPa的Fusobody與人SIRP α以10 μ M或更小、4 μ M或更小、或者2 μ M或更小、例如O. I μ M和10 μ M之間的Kd彡口口。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合SIRP α的Fusobody的四個(gè)SIRP α結(jié)合結(jié)構(gòu)域是在序列上相同的。例如，所述結(jié)合SIRPa的Fusobody分別由SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6的第一和第二單鏈多肽組成。
本發(fā)明還涉及用作藥物或診斷工具，例如用于自身免疫病和急性及慢性炎性病癥的治療或診斷中的此類可溶性蛋白或Fusobody、特別地是結(jié)合SIRPa的蛋白質(zhì)或 Fusobody。具體而言，結(jié)合SIRPa的蛋白質(zhì)或Fusobody用于治療選自Th2介導(dǎo)的氣道炎癥、過(guò)敏性病癥、哮喘、炎性腸病和關(guān)節(jié)炎的病癥。
本發(fā)明的可溶性蛋白或Fusobody也可以在有需求的受試者中用于治療或診斷局部缺血性病癥、白血病或其他癌癥或用于增加造血干細(xì)胞植入。
定義
為了可以更輕易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。額外的定義在遍及的詳細(xì)描述中給出。
術(shù)語(yǔ)SIRPa指顯示與⑶47整聯(lián)蛋白締合蛋白黏附的人信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α (也稱為CD172a或SHPS-1)。ASIRPa包括SEQ ID NO :1，但是還包括而不限于任何天然多態(tài)性變體，例如，包括人SIRPa的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或剪接變體。表I中描述了人類中在 SIRPa核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的剪接變體或SNP的實(shí)例。
表I :SIRPa蛋白的變體
權(quán)利要求
1.一種可溶性蛋白，包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和( )第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)融合的相同結(jié)合分子的區(qū)域。
2.一種可溶性蛋白，包含至少兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的ChI恒定重鏈區(qū)融合的哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的區(qū)域；和( )第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的Q恒定輕鏈區(qū)融合的相同結(jié)合分子的區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動(dòng)物結(jié)合分子的所述區(qū)域是相同的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動(dòng)物結(jié)合分子是蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、炎性介質(zhì)、低分子量化合物、配體、細(xì)胞表面受體或其片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動(dòng)物結(jié)合分子是單體的或同聚的細(xì)胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳動(dòng)物單體的或同聚的細(xì)胞表面受體包含IgSF結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的可溶性蛋白，其中哺乳動(dòng)物單體的細(xì)胞表面受體的所述胞外結(jié)構(gòu)域是CD47的胞外結(jié)構(gòu)域。
8.一種可溶性蛋白，包含兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含在抗體的ChI恒定重鏈區(qū)的N端部分處融合的第一 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和( )第二單價(jià)單鏈多肽，其包含在抗體的Q恒定輕鏈區(qū)的N端部分處融合的第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
9.一種可溶性蛋白，包含兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的重鏈恒定區(qū)融合的第一 SIRP a結(jié)合結(jié)構(gòu)域;和( )第二單價(jià)單鏈多肽，其包含與抗體的輕鏈恒定區(qū)融合的第二 SIRP a結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中所述第一和第二單價(jià)單鏈多肽分別與ChI恒定重鏈和Q恒定輕鏈的N端部分融合。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中所述第一和第二SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域在彼此之間共有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其以4μΜ或更小的KD與人 SIRPa結(jié)合，如BiaCORE測(cè)定法中所測(cè)量。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其促進(jìn)SIRPa+白細(xì)胞以2nM或更小EC5tl的黏附，如基于板的細(xì)胞黏附測(cè)定法中所測(cè)量。
14.根據(jù)權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其抑制體外產(chǎn)生的單核細(xì)胞衍生性樹(shù)狀細(xì)胞的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎細(xì)胞因子釋放。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的可溶性蛋白，其以O(shè).2nM或更小的IC5tl抑制體外產(chǎn)生的單核細(xì)胞衍生性樹(shù)狀細(xì)胞中金黃色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎細(xì)胞因子釋放，如樹(shù)狀細(xì)胞細(xì)胞因子釋放測(cè)定法中所測(cè)量。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至15中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中每個(gè)異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽由二硫鍵共價(jià)地連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求8至16中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中每個(gè)異源二聚體具有在肽接頭不存在下與相應(yīng)恒定區(qū)融合的其第一和第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
18.根據(jù)權(quán)利要求8至16中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中每個(gè)異源二聚體具有經(jīng)肽接頭與相應(yīng)恒定區(qū)融合的其第一和第二 SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的可溶性蛋白，其中所述肽接頭由5-20個(gè)氨基酸組成。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的可溶性蛋白，其中所述肽接頭是甘氨酸和絲氨酸氨基酸的聚合物、優(yōu)選地是(GGGGS)n，其中η是I和4之間的任何整數(shù)，優(yōu)選地是2。
21.根據(jù)權(quán)利要求I至20中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其基本上由兩個(gè)異源二聚體組成，其中每個(gè)異源二聚體的所述第一單鏈多肽包含免疫球蛋白恒定部分的鉸鏈區(qū)，并且所述至少兩個(gè)異源二聚體是彼此通過(guò)所述鉸鏈區(qū)處的二硫鍵穩(wěn)定締合的。
22.根據(jù)權(quán)利要求9至21中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中抗體的C0I區(qū)、Ch2區(qū)和CH3 區(qū)衍生自人IgGl、gG2、或IgG4相應(yīng)區(qū)域的沉默突變體，所述沉默突變體具有降低的ADCC效應(yīng)子功能。
23.根據(jù)權(quán)利要求8至22中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中至少一個(gè)SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自(i)人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域；(ii)SEQID NO 4的多肽或保留SIRPa結(jié)合特性的SEQ ID NO 4的片段；和(iii)SEQID NO :4 的變體多肽，其與 SEQ ID NO :4 具有至少 60、70、80、90、95、96、97、 98或99%序列同一性并保留SIRP a結(jié)合特性。
24.根據(jù)權(quán)利要求8至23中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，其中全部SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的可溶性蛋白，其中SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述相同氨基酸序列選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :23。
26.一種包含兩個(gè)異源二聚體的可溶性蛋白，其中所述異源二聚體包含(i)SEQ ID NO 5的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 6的第二單鏈多肽；(ii)SEQID NO 18的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 6的第二單鏈多肽；(iii)SEQID NO 19的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 20的第二單鏈多肽；(iv)SEQ ID NO 12的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 13的第二單鏈多肽；(V)SEQ ID NO 24的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 25的第二單鏈多肽；(vi)SEQ ID NO 36的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 37的第二單鏈多肽；(vii)SEQID NO 38的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 39的第二單鏈多肽；(viii)SEQID NO 40的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 41的第二單鏈多肽；(ix)SEQID NO 42的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 43的第二單鏈多肽；(x)SEQID NO 44的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 45的第二單鏈多肽；(xi)SEQID NO 46的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 47的第二單鏈多肽；(xii)SEQID NO 48的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 49的第二單鏈多肽；(xiii)SEQID NO 50的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 51的第二單鏈多肽；(xiv)SEQID NO 52的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 53的第二單鏈多肽；(Xv)SEQ ID NO 54的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 55的第二單鏈多肽；(xvi)SEQID NO 56的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 57的第二單鏈多肽；(xvii)SEQID NO 58的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 20的第二單鏈多肽；或(xviii)SEQID NO 29的第一單鏈多肽和SEQ ID NO 20的第二單鏈多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求9至25中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，包含與根據(jù)權(quán)利要求26所述的可溶性蛋白的相應(yīng)第一和第二單鏈多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性的所述第一單鏈和第二單鏈多肽序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求9至25中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，包含與根據(jù)權(quán)利要求26所述的可溶性蛋白的相應(yīng)第一和第二單鏈多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性的SIRPa結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求I至28中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，包含(i)由SEQ ID NO 10的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 11的核苷酸序列編碼的輕鏈，( )由SEQ ID NO 59的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列編碼的輕鏈，(iii)由SEQID NO 61的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 62的核苷酸序列編碼的輕鏈，(iv)由SEQID NO 63的核苷酸序列編碼的重鏈；和由選自SEQ IDNO 64的核苷酸序列編碼的輕鏈，(V)由SEQ ID NO 65的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 66的核苷酸序列編碼的輕鏈，(vi)由SEQID NO 67的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 68的核苷酸序列編碼的輕鏈，(vii)由SEQID NO 69的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 70的核苷酸序列編碼的輕鏈，(viii)由SEQID NO 71的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 72的核苷酸序列編碼的輕鏈，(ix)由SEQID NO 73的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 74的核苷酸序列編碼的輕鏈，(X)由SEQ ID NO 75的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 76的核苷酸序列編碼的輕鏈，(xi)由SEQID NO 77的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 78的核苷酸序列編碼的輕鏈，(xii)由SEQID NO 79的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 80的核苷酸序列編碼的輕鏈，(xiii)由SEQID NO :81的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO :82的核苷酸序列編碼的輕鏈，(xiv)由SEQID NO 83的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 84的核苷酸序列編碼的輕鏈，(XV)由SEQ ID NO 85的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 86的核苷酸序列編碼的輕鏈，(xvi)由SEQID NO 87的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列編碼的輕鏈，或(xvii)由SEQID NO 88的核苷酸序列編碼的重鏈；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列編碼的輕鏈。
30.根據(jù)權(quán)利要求I至29中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白，用作藥物或診斷工具。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可溶性蛋白，用于自身免疫病、急性和慢性炎性疾病的治療或診斷。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的可溶性蛋白，用于治療選自Th2介導(dǎo)的氣道炎癥、過(guò)敏性疾病、哮喘、炎性腸病和關(guān)節(jié)炎的疾病。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可溶性蛋白，用于局部缺血性疾病、白血病或其他癌癥的治療。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可溶性蛋白，用于在有需求的受試者中增加造血干細(xì)胞植入。
35.一種藥物組合物，包含與一種或多種可藥用載體組合的根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，額外地包含至少一種其他有效成分。
37.一種分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白的一個(gè)異源二聚體的至少一條單鏈多肽。
38.一種克隆載體或表達(dá)載體，其包含選自以下的至少一個(gè)核酸SEQID N010 ；SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、 SEQID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO 8USEQ ID NO :82、SEQID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、和 SEQ ID NO :88。
39.一種適用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白的重組宿主細(xì)胞， 包含編碼所述蛋白質(zhì)的所述異源二聚體的所述第一和第二單鏈多肽和任選地分泌信號(hào)的核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的重組宿主細(xì)胞，包含穩(wěn)定整合于基因組中的SEQID NO`10 ；SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO 63,SEQ ID NO :64、SEQID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO 75,SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、 SEQ ID NO :87、和 SEQ ID NO 88 的核酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或權(quán)利要求40所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
42.一種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求I至29中任一項(xiàng)所述的可溶性蛋白的方法，包括在產(chǎn)生所述可溶性蛋白的適宜條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞和分離所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作藥物的、特別地用于預(yù)防或治療自身免疫病和炎性疾病(例如過(guò)敏性哮喘和炎性腸病)的可溶性SIRPα結(jié)合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及包含兩個(gè)異源二聚體的復(fù)合物的可溶性SIRPα結(jié)合蛋白，其中每個(gè)異源二聚體基本上由以下組成(i)第一單價(jià)單鏈多肽，其包含在抗體的重鏈恒定區(qū)的N端部分處融合的第一SIRPα結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二單價(jià)單鏈多肽，其包含在抗體的CL輕鏈恒定區(qū)的N端部分處融合的第二SIRPα結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及如

圖1中所顯示的可溶性結(jié)合SIRPα的抗體樣蛋白。
文檔編號(hào)A61P11/06GK102939303SQ201080064426
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者T·胡貝爾, F·科爾賓格, M·薩爾法蒂, K·韋爾岑巴赫 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司