專利名稱：脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化的方法，特別是涉及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的方法，及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。研究較早和較深入的是來(lái)自于成人骨髓的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞?，F(xiàn)已從骨髓以外的其他許多組織(如脂肪、肌肉、胎盤、臍帶等)中分離得到MSCs。 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)取材于一直作為分娩廢棄物的臍帶組織。其取材方便、來(lái)源廣泛、具有與成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，同時(shí)來(lái)自于胎兒期的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)大的增殖能力、更廣譜的分化潛能、更低的免疫原性等。有望作為組織工程或細(xì)胞替代治療優(yōu)良的種子細(xì)胞。脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electyomagnetic fields，PEMFs)是由脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的脈沖電流進(jìn)而產(chǎn)生電磁場(chǎng)。脈沖發(fā)生器可以調(diào)控，因此可產(chǎn)生特定頻率、波形的脈沖電流， 從而產(chǎn)生特定的脈沖電磁場(chǎng)。因?yàn)殡姾痛艌?chǎng)是相輔相承、互相影響的，庫(kù)倫和高斯場(chǎng)能產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，每個(gè)場(chǎng)的改變程度是同時(shí)進(jìn)行的，因此能產(chǎn)生電磁場(chǎng)效應(yīng)，目前統(tǒng)稱為 PEMFs能量。PEMFs作為一種非侵入療法在骨科疾病治療中的應(yīng)用始創(chuàng)于1977年美國(guó)著名矯形外科專家Bassett應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)療法成功治療一例先天性脛骨假關(guān)節(jié)的病人。至今，脈沖電磁場(chǎng)在臨床促進(jìn)骨損傷修復(fù)、骨質(zhì)疏松等方面已取得了顯著療效。同時(shí)，組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)生與發(fā)展為嚴(yán)重的骨科疾患如骨缺損和骨不連等的治療帶來(lái)了新的希望。種子細(xì)胞的增殖與分化能力是組織工程研究與應(yīng)用的關(guān)鍵所在。然而，目前骨組織工程種子細(xì)胞的成骨分化多采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)或生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)方法。 這些化學(xué)試劑或生長(zhǎng)因子不能保證其在體內(nèi)以穩(wěn)定的濃度發(fā)揮作用，加大濃度又會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，超過(guò)生理劑量的滲漏會(huì)造成骨誘導(dǎo)因子的異位骨化作用。若能將PEMFs作為刺激間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的有效手段，將避免外源性化學(xué)誘導(dǎo)劑的使用。研究表明PEMFs 可以促進(jìn)成骨細(xì)胞系細(xì)胞增殖，及在分化階段的成骨分化，而MSCs是骨修復(fù)中骨細(xì)胞形成的重要的祖細(xì)胞之一。到目前為止，PEMFs對(duì)hUCMSCs的生物學(xué)影響尚未見(jiàn)報(bào)道；PEMFs能否促進(jìn)hUCMSCs成骨分化尚待研究證實(shí)。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的方法，特征在于將脈沖電磁場(chǎng)作為刺激間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的有效手段， 將避免外源性化學(xué)誘導(dǎo)劑的使用(使用化學(xué)試劑或生長(zhǎng)因子不能保證其在體內(nèi)以穩(wěn)定的濃度發(fā)揮作用，加大濃度又會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，超過(guò)生理劑量的滲漏會(huì)造成骨誘導(dǎo)因子的異位骨化作用)，避免使用外源性化學(xué)誘導(dǎo)劑或生長(zhǎng)因子引起的不良反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的間充質(zhì)干細(xì)胞是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的脈沖電磁場(chǎng)是由脈沖電信號(hào)發(fā)生裝
置產(chǎn)生的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，脈沖電磁場(chǎng)刺激參數(shù)為頻率50Hz ；電壓 500mv/cm ；波形矩形正脈沖；占空比50% ；刺激周期!3h/d。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的骨缺損是利用手術(shù)方法造成的節(jié)段性骨缺損。


圖1顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果ο圖2顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化21天，Von Kossa's染色結(jié)果。其中2A為傳統(tǒng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)液+脈沖成磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR+) ；2B為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加脈沖電磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR-) ；2C為化學(xué)試劑誘導(dǎo)組(PE-CR+) ；2D為基礎(chǔ)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)組(PE-CR-)。圖3顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化14天，茜素紅染色。其中 3A為傳統(tǒng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)液+脈沖成磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR+) ；:3B為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加脈沖電磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR-) ；3C為化學(xué)試劑誘導(dǎo)組(PE-CR+) ；3D為基礎(chǔ)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)組(PE-CR-)。圖4顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果。其中4A為RUNX2基因表達(dá)；4B為Collagen I基因表達(dá)；4C為OPN表達(dá)。圖5顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化western-blot檢測(cè)結(jié)果。其中 5A 為 western-blot 檢測(cè) Collagen I ;5B 為 western-blot 檢測(cè) RUNX2 ;5C 為 western-blot 檢測(cè) 0ΡΝ。圖6顯示脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物修復(fù)骨缺損的放射學(xué)檢查結(jié)果。其中6A為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞+羥基磷灰石+脈沖電磁場(chǎng)組；6B為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞+羥基磷灰石組；6C為空白對(duì)照組。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化的方法，特別是涉及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化，及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為多種組織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，因此又被稱為多能干細(xì)胞。MSCs分布廣泛，遍布于機(jī)體整個(gè)間充質(zhì)組織?，F(xiàn)已從骨髓、 脂肪、皮膚、骨、臍血、胎盤及外周血中分離到了 MSCs。除此之外，身體每一條血管旁的組織中都有間充質(zhì)細(xì)胞，其中部分為間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)正是從位于臍靜脈和臍動(dòng)脈血管周圍的沃頓膠中分離獲得的。 hUCMSCs具有與MSCs的相似的多分化潛能，現(xiàn)已證實(shí)，在體外誘導(dǎo)條件下，
4hUCMSCs不僅可以向多種中胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等， 還可以向外胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的神經(jīng)元樣細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的方法，特征在于將脈沖電磁場(chǎng)作為刺激間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的有效手段， 將避免外源性化學(xué)誘導(dǎo)劑的使用(化學(xué)試劑或生長(zhǎng)因子不能保證其在體內(nèi)以穩(wěn)定的濃度發(fā)揮作用，加大濃度又會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，超過(guò)生理劑量的滲漏會(huì)造成骨誘導(dǎo)因子的異位骨化作用)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的間充質(zhì)干細(xì)胞是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明以從流產(chǎn)胎兒臍帶沃頓膠中分離的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)為研究對(duì)象，對(duì)其形態(tài)學(xué)、免疫表型及多分化潛能等基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究。證實(shí)所分離的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。為下一步進(jìn)行脈沖電磁場(chǎng)誘導(dǎo)hUCMSCs向成骨細(xì)胞分化提供細(xì)胞來(lái)源，為 hUCMSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的脈沖電磁場(chǎng)是由脈沖電信號(hào)發(fā)生裝置產(chǎn)生的。脈沖發(fā)生器可調(diào)控，因此可產(chǎn)生特定頻率、波形的脈沖電流，從而產(chǎn)生特定的脈沖電磁場(chǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，脈沖電磁場(chǎng)刺激參數(shù)為頻率50Hz ；電壓 500mv/cm ；波形矩形正脈沖；占空比50% ；刺激周期池/d。干細(xì)胞的分化行為受其所處微環(huán)境影響。研究發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場(chǎng)對(duì)骨形成具有“窗口效應(yīng)”，即細(xì)胞只對(duì)特定頻率、強(qiáng)度的磁場(chǎng)產(chǎn)生反應(yīng)，磁場(chǎng)與細(xì)胞間的效應(yīng)不呈線性關(guān)系。不同頻率、強(qiáng)度的磁場(chǎng)會(huì)產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。骨折及骨損傷是臨床常見(jiàn)病，由于骨結(jié)構(gòu)特殊，即使能夠愈合，也需要長(zhǎng)達(dá)幾周至幾月的固定限制活動(dòng)，常導(dǎo)致肢體失用性萎縮、關(guān)節(jié)粘連、褥瘡、呼吸及泌尿系統(tǒng)感染等多種并發(fā)癥。嚴(yán)重骨折或大段骨缺損更是臨床難以解決的疾病，其對(duì)于移植物的數(shù)量、形態(tài)與受區(qū)結(jié)構(gòu)的匹配程度要求較高。單純靠植入骨的爬行替代和誘導(dǎo)成骨作用，成骨愈合較慢，嚴(yán)重影響患者勞動(dòng)能力和生存質(zhì)量。利用脈沖電磁場(chǎng)來(lái)刺激支架載體結(jié)合干細(xì)胞使其向成骨分化，并植入骨缺損處，從而促進(jìn)骨缺損愈合，有望成為骨組織工程修復(fù)骨缺損的良好途徑。本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)hUCMSCs增殖能力強(qiáng)大、免疫原性弱或無(wú)、具有成骨細(xì)胞分化能力，是理想的骨組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源；PEMFs能夠有效促進(jìn)hUCMSCs成骨分化。我們將 hUCMSCs與羥基磷灰石(HA)形成復(fù)合物，植入大段骨缺損處，進(jìn)行PEMFs刺激，可加快骨愈合，迅速恢復(fù)骨的完整性和生物機(jī)械性能(詳見(jiàn)實(shí)施例2)。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，脈沖電磁場(chǎng)可促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化， 脈沖電磁場(chǎng)可促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化
一、hUCMSCs的分離培養(yǎng)1. hUCMSCs 的分離取自愿捐獻(xiàn)人工流產(chǎn)胎兒尸體(胎齡為12 18周)，酒精浸泡消毒，剪下臍帶， PBS沖洗，剝離臍靜脈及臍動(dòng)脈。將沃頓膠剪成長(zhǎng)度約5mm的組織塊，采用酶消化法分離 hUCMSCs加入細(xì)胞分離液II(DMEM/F12、10% FBS.0. 01 % II型膠原酶、0. 05%透明質(zhì)酸酶)，在37°C、5% CO2和95%空氣的條件下消化12h。1500rpm離心lOmin，棄上清，用含 10% FBS的DMEM/F12懸浮細(xì)胞，以5X 104/ml的密度接種。2. hUCMSCs 原代培養(yǎng)所分離的細(xì)胞在37 °C、5 %的CO2、95 %的空氣氣相下培養(yǎng)4 后換液，先用PBS 輕輕沖洗3次，以去除大部分的未貼壁細(xì)胞，換上基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM/F12)， 37 °C、5 %的CO2、95 %的空氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3. hUCMSCs 傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)皿底面的80%時(shí)傳代，先吸去舊培養(yǎng)液，PBS洗2次，用細(xì)胞分離液消化至大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮，將要從培養(yǎng)皿底壁脫落時(shí)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化， 用吸管輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，以1 3的比例將細(xì)胞接種在另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。4. hUCMSCs的凍存與復(fù)蘇凍存細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)皿底面的80%時(shí)，消化并收集細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心 5min，棄上清液，以5X106cellS/ml的比例加入預(yù)冷凍存液，充分混勻后置預(yù)冷的凍存管中。按4°C 30min, -20°C 30min, _80°C過(guò)夜的程序進(jìn)行凍存。最后置于_150°C超低溫冰箱中保存。長(zhǎng)期凍存后應(yīng)間隔一定時(shí)間復(fù)蘇細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。復(fù)蘇從-150°C超低溫冰箱中取出凍存管，迅速投入37°C水浴中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解，要在1 anin內(nèi)完成復(fù)溫。然后吸出細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)皿中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37°C、5% C02、95%的空氣氣相下培養(yǎng)。復(fù)蘇后細(xì)胞接種密度可稍大，小部分細(xì)胞可能會(huì)失去活力不能貼壁，應(yīng)在第二天換液時(shí)除去。 二、PEMFs 作用于 hUCMSCs取P3對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUCMSCs，貼壁生長(zhǎng)到占培養(yǎng)皿底面積60%時(shí)，吸棄基礎(chǔ)培養(yǎng)液。D-Hanks液洗三次，0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化制成單細(xì)胞懸液。接種6孔板，接種密度為5X103cellS/cm2。接種細(xì)胞分成四個(gè)組，分別為①基礎(chǔ)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)組 (PE-CR-)；②基礎(chǔ)培養(yǎng)液加脈沖電磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR-)；③化學(xué)試劑誘導(dǎo)組(PE-CR+)；④ 傳統(tǒng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)液+脈沖成磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(PE+CR+)。所有細(xì)胞均置于37°C,5% CO2,95% 空氣條件下培養(yǎng)，每3d分別更換相應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液。脈沖電磁場(chǎng)誘導(dǎo)組(②、 ④組)脈沖電磁場(chǎng)刺激參數(shù)為頻率50Hz ；電壓500mV/cm ；波形矩形正脈沖；占空比50% ； 刺激周期池/d。三、細(xì)胞形態(tài)變化觀察給予PEMFs刺激后，倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化情況。 PE+CR-組、PE-CR+組和PE+CR+組細(xì)胞誘導(dǎo)7d左右，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，仍呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列仍呈放射或漩渦狀。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞胞體逐漸增大，由長(zhǎng)梭形變?yōu)闄E圓形或多角形。細(xì)胞外形符合成骨細(xì)胞形態(tài)鈣化結(jié)節(jié)周圍的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，放射狀分布。四、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)
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堿性磷酸酶分析使用ALP檢測(cè)試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書操作。堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力的高低。取P3hUCMSCs以5X104/ml接種 24 孔板，分為 PE-CR-組、PE+CR-組 PE-CR+組、PE+CR+組。分別于 ld、3d、5d、7d、14d、21d、 28d收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液lOOul，-80°C反復(fù)凍融3次，充分裂解細(xì)胞，12000g離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。在酶標(biāo)板中分別加入50ul 緩沖液、50ul基質(zhì)液、3ul細(xì)胞蛋白裂解液，37°C孵育15min后，加入150ul顯色液，520nm檢測(cè)每個(gè)樣品的光吸收。使用Pierce BCA Assay kit蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定取 25ul蛋白裂解液加入200ulBCA工作液，37°C孵育30min，562nm檢測(cè)光吸收，計(jì)算出細(xì)胞裂解液的蛋白濃度。ALP相對(duì)含量=0D520nm/蛋白濃度，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣求平均值，同時(shí)計(jì)算SD偏差。以時(shí)間為橫軸，相對(duì)定量為縱軸繪制ALP活性曲線。PE+CR-組、PE-CR+組和PE+CR+組的ALP活性均明顯增加，其中PE+CR-組刺激3d 時(shí)ALP明顯增加，14d可達(dá)高峰，后略有下降。PE+CR+的作用強(qiáng)度最強(qiáng)，可能是脈沖電磁場(chǎng)與化學(xué)試劑產(chǎn)生了協(xié)同誘導(dǎo)效應(yīng)(見(jiàn)附圖1)。五、Von Kossa' s 染色取P3的hUCMSCs接種于預(yù)先置入蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，待誘導(dǎo)至出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)后，PBS洗3次，以4%多聚甲醛室溫固定30min，蒸餾水沖洗，加入硝酸銀溶液避光 30min,日光或紫外線照射lOmin，蒸餾水沖洗，加入硫代硫酸鈉溶液室溫孵育lh，蒸餾水沖洗，干燥，中性樹膠封片。PE+CR-組14d左右開(kāi)始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，PE-CR+約21d左右出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。隨著刺激天數(shù)增加，結(jié)節(jié)數(shù)量及面積逐漸增多、增大。經(jīng)Von Kossa’ s染色呈棕黑色。PE-CR-組未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)且染色呈陰性。各組按鈣化結(jié)節(jié)形成時(shí)間、數(shù)量及面積的差別可排序?yàn)?PE+CR+ 組> PE+CR-組> PE-CR+ 組> PE-CR-組。(見(jiàn)附圖 2)六、茜素紅染色取P3的hUCMSCs接種于預(yù)先置入蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，誘導(dǎo)至出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)后， PBS洗3次，95%乙醇室溫固定lOmin，雙蒸水沖洗，茜素紅工作液37°C孵育30min，雙蒸水沖洗。倒置相差顯微鏡下觀察、攝相。PE+CR-組14d左右開(kāi)始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，PE-CR+約21d左右出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。隨著刺激天數(shù)增加，結(jié)節(jié)數(shù)量及面積逐漸增多、增大。茜素紅將其染成桔紅色，PE-CR-組未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)且染色呈陰性。PE+CR+組鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量較其他組多，時(shí)間相對(duì)較早。(見(jiàn)附圖3)七、Real-timePCR 檢測(cè)Trizol法提取空白組及誘導(dǎo)組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行Real-time PCR 相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)體系如Table 1所列Table 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組成
權(quán)利要求
1.一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，脈沖電磁場(chǎng)是由脈沖電信號(hào)發(fā)生裝置產(chǎn)生的。脈沖電磁場(chǎng)刺激參數(shù)為頻率50Hz ；電壓500mV/cm ；波形矩形正脈沖；占空比50% ；刺激周期3小時(shí)/天。
3.提供脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化的方法，特別是涉及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化方法，及脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合物在修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/44GK102485888SQ20101057348
公開(kāi)日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者王文加, 高海成 申請(qǐng)人:吉林康瑞再生醫(yī)學(xué)工程有限公司