專利名稱：具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，特別是指一種將龍眼花經(jīng)由超音波萃取出具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物。
背景技術(shù)：
所謂的神經(jīng)退化性疾病是神經(jīng)細(xì)胞遭受破壞，漸進(jìn)喪失神經(jīng)元，認(rèn)知能力或運(yùn)動功能也會伴隨著衰退，如阿滋海默癥(Alzheimer’ s Disease)就是老年人口中最常見的疾病，此一病癥對患者及其家屬的生活質(zhì)量有著非常大的影響。罹患神經(jīng)退化性疾病患者的大腦皮質(zhì)(Cerebral cortex)與海馬回區(qū) (Hippocampus)?？砂l(fā)現(xiàn)由Αβ蛋白沉積所形成的老年瘢塊(Senile plaque)并伴隨著發(fā)炎細(xì)胞，例如神經(jīng)膠細(xì)胞(Microglial)活化與T淋巴細(xì)胞浸潤與高濃度IL-I β、TNF-α、 IFN-Y等發(fā)炎因子產(chǎn)生，亦有氧化壓力(Oxidative stress)出現(xiàn)例如NO產(chǎn)生，進(jìn)而造成神經(jīng)細(xì)胞的破壞。神經(jīng)退化性疾病最有希望的治療方法之一為神經(jīng)干細(xì)胞的移植，以補(bǔ)救受損的神經(jīng)干細(xì)胞，惟，干細(xì)胞數(shù)量稀少，其來源及臨床的應(yīng)用備受爭議，且侵入性的治療風(fēng)險(xiǎn)較高， 因此，一低風(fēng)險(xiǎn)且非侵入性的治療方法是有迫切的需要。近年來藥理學(xué)家強(qiáng)調(diào)要治療神經(jīng)退化性疾病，必須以多功能藥理活性(Multiple pharmacological effects)開發(fā)為策略，由免疫調(diào)控、消除氧化壓力與神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)多種藥物功能組成合并治療策略，方能達(dá)成有效治療結(jié)果延長患者的生命。習(xí)知植物中多酚類的化合物對于抗氧化有很好的功效，龍眼花中雖含有豐富的多酚類化合物，但迄今未見使用龍眼花萃取物來進(jìn)行治療神經(jīng)退化性疾病，因此若能將龍眼花運(yùn)用于保護(hù)神經(jīng)上，對于治療神經(jīng)退化性疾病將有很大的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的，旨在提供一種具有神經(jīng)保護(hù)作用龍眼花萃取物的制備方法， 特別是指將龍眼花先經(jīng)過初粉碎處理及清洗后，由超音波方式萃取出的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用龍眼花萃取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的為提供一具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，讓萃取物的取得及質(zhì)量的控管較為容易，可獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。為達(dá)上述目的，本發(fā)明揭露一具有神經(jīng)保護(hù)作用龍眼花萃取物的制備方法，為達(dá)成較佳的萃取效果，于進(jìn)行龍眼花萃取前，先將龍眼花原料以搗碎、研磨、切碎等其中一種物理方式來做初粉碎處理，盡可能讓其變?yōu)檩^小顆粒，以利后續(xù)萃取動作；并將龍眼花原料倒入液體內(nèi)，略為攪動清洗及浸泡后放置于超音波萃取機(jī)械內(nèi)，并倒入特定比例的溶劑，讓原料與溶劑均勻混合后，于一預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行萃?。惠腿⊥戤吅?，將產(chǎn)物靜置沉淀，直到液體與固體分離后取上層液體進(jìn)行抽氣過濾，其產(chǎn)物為具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物。其中，上述龍眼花原料是以搗碎、研磨、切碎的其中一種物理方式進(jìn)行初粉碎處
3理；上述液體為蒸餾水，上述溶劑為醇類或蒸餾水或其混合物的其中一種，而上述萃取用機(jī)械為超音波萃取機(jī)(Room Temperature Super Extraction System)。于一較佳實(shí)施例中，上述醇類為食用酒精(EtOH)，該食用酒精的濃度為60%，而上述超音波萃取機(jī)的預(yù)設(shè)溫度介于攝氏25度至攝氏40度之間。本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物具有如下的特點(diǎn)1.抑制麩胺酸釋放；2.降低iNOS基因的表現(xiàn)；3.降低T淋巴細(xì)胞活化增生；4.降低IFN-Y產(chǎn)生的成分；5.提伸人類神經(jīng)膠細(xì)胞的存活率；以及6.促進(jìn)β-catenin訊息傳導(dǎo)的活化。由于本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物具有抑制麩胺酸的釋放，降低iNOS基因表現(xiàn)， 降低T淋巴細(xì)胞活化增生，降低IFN- γ產(chǎn)生，降低神經(jīng)細(xì)胞死亡及促進(jìn)β -catenin訊息傳導(dǎo)活化的功效，因此，本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物更進(jìn)一步具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的功能。本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物也可另外添加本領(lǐng)域中具有通常知識者所熟知的添加劑，如一或多種以上藥理學(xué)上可接受的佐劑或賦型劑等，作為具有神經(jīng)保護(hù)作用的保健食品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種具有神經(jīng)保護(hù)作用龍眼花萃取物的制備方法，特別是指將龍眼花先經(jīng)過初粉碎處理及清洗后，由超音波方式萃取出的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，及一具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，讓萃取物的取得及質(zhì)量的控管較為容易，可獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是本發(fā)明龍眼花萃取物制備方法的流程圖；圖2是顯示實(shí)施例二中，本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物可降低對神經(jīng)細(xì)胞中麩胺酸釋放；圖3是顯示實(shí)施例三中，本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于Αβ刺激人類神經(jīng)膠細(xì)胞所引起的iNOS基因表現(xiàn)的影響；圖4是顯示實(shí)施例三中，本發(fā)明所制備的定量龍眼花萃取物對于Αβ刺激人類神經(jīng)膠細(xì)胞所引起的iNOS基因表現(xiàn)的影響；圖5是本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于人類T淋巴細(xì)胞活化增生的影響；圖6是本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于小鼠T淋巴細(xì)胞活化增生的影響；圖7是本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于小鼠T淋巴細(xì)胞中IFN-Y產(chǎn)生的影響；圖8是本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于人類神經(jīng)膠細(xì)胞存活率的影響；圖9是本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于β -catenin訊息傳導(dǎo)活化的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供一種具有神經(jīng)保護(hù)作用龍眼花萃取物的制備方法，為達(dá)成較佳萃取效果，于進(jìn)行萃取前，先將龍眼花的原料以搗碎、研磨、切碎等物理方式做初粉碎處理，盡可能使其變?yōu)檩^小顆粒，以利后續(xù)萃取動作。在一較佳實(shí)施例中，龍眼花原料是以搗碎、研磨、切碎的其中一種物理方式進(jìn)行初粉碎處理。在一更佳實(shí)施例中，粉碎后龍眼花原料的粒徑大小約5微米(μπι)至10微米
(μ m) ο將上述原料倒入液體內(nèi)，略為攪動清洗及浸泡后放置于萃取用機(jī)械內(nèi)，并倒入溶劑使原料與溶劑均勻混合后，于一預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行萃取。在一較佳實(shí)施例中，上述液體為蒸餾水，浸泡時(shí)間于30分鐘以內(nèi)，溶劑為醇類或蒸餾水或其混合物，萃取用機(jī)械為超音波萃取機(jī)(Room Temperature Super Extraction System)。在一更佳實(shí)施例中，上述醇類為食用酒精(EtOH)，該食用酒精的濃度為60%，上述超音波萃取機(jī)的預(yù)設(shè)溫度介于攝氏25度至攝氏40度。萃取完畢后，將產(chǎn)物靜置沉淀，直到液體與固體分離后取上層液體進(jìn)行抽氣過濾， 其產(chǎn)物為具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物。在一較佳實(shí)施例中，上述靜置沉淀的時(shí)間約為M小時(shí)。
據(jù)上述方法所制備的龍眼花萃取物具有如下的特點(diǎn)
1.可抑制麩胺酸釋放；
2.可降低iNOS基因的表現(xiàn)；
3.可降低T淋巴細(xì)胞活化增生；
4.可降低IFN-Y產(chǎn)生的成分；
5.能提伸人類神經(jīng)膠細(xì)胞的存活率；
6.能促進(jìn)β-catenin訊息傳導(dǎo)的活化。
實(shí)施例實(shí)施例一龍眼花萃取物的制備由臺灣大樹鄉(xiāng)取得130公斤的龍眼花原料，取65公斤龍眼花原料并以習(xí)知粉碎用機(jī)械做初粉碎處理至粒徑大小約5微米(μ m)至10微米(μ m)。將粉碎后龍眼花原料倒入蒸餾水內(nèi)，略為攪動后浸泡，浸泡時(shí)間于30分鐘以內(nèi)。浸泡完畢后，將雜質(zhì)撈起并將清洗后的原料放置于超音波萃取機(jī)(Room Temperature Super Extraction System ；RTSES), 并以1 : 1的比例加入蒸餾水及食用酒精，該食用酒精的濃度為60%，于攝氏25度至攝氏 40度之間，人工混合上述液體及龍眼花原料至完全混合后以超音波萃取機(jī)(RTSEQ進(jìn)行萃取。萃取完畢后，將產(chǎn)物靜置沉淀約M小時(shí)，直到液體與固體分離后取上層液體進(jìn)行抽氣過濾，其產(chǎn)物為具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物。實(shí)施例二本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于抑制神經(jīng)細(xì)胞中麩胺酸釋放的影響以下步驟依據(jù)已發(fā)表論文而來[Wang and Chen，2007]，麩胺酸釋放(Glutamate release assay)由在線熒光測定法(on-line fluorimetry)所測得。神經(jīng)鍵體沉淀物 (synaptosomal pellet)用^il HBM使其懸浮在石英管中，五分鐘之后加入ImM煙堿酰胺腺嘌呤雙核甘酸鹽(NADP+)，50U/ml麩胺酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)與ImM氯化鈣(CaCl2)，10分鐘之后，再加入刺激劑如4-胺基比啶(4-aminopyridine ；4-AP)、高濃度氯化鉀(KCl)、離子霉素(ionomycin)、蔗糖(sucrose)使神經(jīng)鍵體(synaptosomes)去極化而釋放麩胺酸(glutamate)或龍眼花萃取物在刺激劑之前先處理10分鐘。麩胺酸釋放可由測量煙堿酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸酯(NADPH)在340nm激發(fā)波長及460nm放射波長所放出的熒光來監(jiān)測。數(shù)據(jù)使用Lotusl-2-3與MicroCal Origin程序分析，麩胺酸單位為nmol 麥夫月安酸(glutamate)/mg神經(jīng)鍵體蛋白質(zhì)(synaptomal protein)。將大鼠的神經(jīng)細(xì)胞(synaptosomes)以本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物(200，100， 50,25,12.5yg/ml)處理，于4-胺基比啶0-ΑΡ)刺激下，進(jìn)行麩胺酸釋放的檢測。結(jié)果如圖2所示，與對照組(Control ；不處理藥物組)相比，不同濃度的龍眼花萃取物可有效抑制 4-胺基比啶G-AP)所引起的麩胺酸釋，并隨著龍眼花萃取物濃度增加而抑制活性隨著增加。由此實(shí)驗(yàn)可得知，本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物可藉由抑制麩胺酸釋放，使得麩胺酸所造成的神經(jīng)細(xì)胞破壞降低，而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的效果。實(shí)施例三以RT-PCR偵測本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于人類神經(jīng)膠細(xì)胞中 iNOS基因表現(xiàn)的影響由于iNOS過度表現(xiàn)會引起氧化壓力增加，科學(xué)家研究結(jié)果得知氧化壓力增加會造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，為了了解本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物是否有降低iNOS表現(xiàn)活性，實(shí)驗(yàn)中將不同濃度的本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物O00，100，50，25，12.5yg/ml)處理人類神經(jīng)膠細(xì)胞，以反轉(zhuǎn)錄-聚合酵素鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測其iNOS基因表現(xiàn)。以下步驟依據(jù)已發(fā)表論文而來[Chen et al.，2007]，誘發(fā)性一氧化氮合成胸 (iNOS)是調(diào)控一氧化氮(NO)產(chǎn)生的重要酵素，以iNOS基因的引子(Primers)，將人類神經(jīng)膠細(xì)胞(Microglial cells)先以龍眼花萃取物前處理30分鐘，接著于乙型類淀粉蛋白斑塊(Αβ)刺激3小時(shí)后，萃取細(xì)胞核糖核酸(RNA)，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核醣核酸(cDNA)，再以聚合胸連鎖反應(yīng)(PCR)方法檢測信使核醣核酸(mRNA)表現(xiàn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，對照于未刺激的細(xì)胞(Lane 1)，Αβ可引起iNOS基因表現(xiàn)(Lane 2),12.5 μ g/ml(Lane 3)、25μ g/ml(Lane 4)、50μ g/ml(Lane 5)與 100 μ g/ ml (Lane 6)對于iNOS基因表現(xiàn)不具影響，但200 μ g/ml (Lane 7)龍眼花萃取物可降低 iNOS基因表現(xiàn)。將此實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過密度掃瞄儀定量，仍可見到200 μ g/ml龍眼花萃取物可降低iNOS基因表現(xiàn)(如圖4所示)。由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，本發(fā)明所制備的高劑量的龍眼花萃取物可降低iNOS基因的表現(xiàn)，故能降低氧化壓力成分，而具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的功效。實(shí)施例四本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于T淋巴細(xì)胞活化增生的影響中樞神系統(tǒng)過度發(fā)炎反應(yīng)現(xiàn)象，會傷害神經(jīng)細(xì)胞，為了解本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物是否具有免疫調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)中以人類及小鼠的T淋巴細(xì)胞為標(biāo)的細(xì)胞，檢測本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于細(xì)胞活化增生的影響。以人類T淋巴細(xì)胞為標(biāo)的細(xì)胞，檢測本發(fā)明所制備的龍眼花萃取物對于細(xì)胞活化增生的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。抽取100ml的健康人外圍血(Peripheral blood)，以離心方法去掉血漿部份，血球部份則以PBS溶液稀釋。稀釋的血球以FicolI-Hypaque溶液離心，取出單核細(xì)胞層。單核細(xì)胞去掉紅血球，以RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)于培養(yǎng)盤中一小時(shí)，以去除單核細(xì)胞(Monocytes)。收集懸浮的細(xì)胞，以Nylon wool吸附法取得T淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)于2 X 106/ml以備用。將2X105T淋巴細(xì)胞與PHA^yg/ml)及不同濃度的龍眼花萃取物Q00，100，50，25，12. 5 μ g/ml)共同培養(yǎng)，三天之后加入3H胸腺嘧啶(3H-thymidine)以測其DNA合成的能力。加入3H-thymidine 16-18小時(shí)之后，以自動細(xì)胞收集器(Automatic harvester) 將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上，干燥的玻璃纖維濾紙加入計(jì)數(shù)液(Counting solution)以 β -Counter儀器計(jì)算其中放射線強(qiáng)度，以放射線強(qiáng)度代表細(xì)胞增生的能力。利用下列公式可算出龍眼花萃取物的抑制百分比
權(quán)利要求
1.一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于至少包含下列步驟A.取龍眼花原料并粉碎處理；B.將上述經(jīng)粉碎處理的產(chǎn)物浸泡于液體中清洗；C.將上述經(jīng)液體清洗的產(chǎn)物放置于能預(yù)設(shè)溫度的萃取用機(jī)械中；D.以特定比例添加水及醇類至能預(yù)設(shè)溫度的萃取用機(jī)械中，均勻混合并進(jìn)行龍眼花的萃??；E.將上述于萃取用機(jī)械中萃取后的產(chǎn)物沉淀分離，取出上層液體；以及F.將上述經(jīng)萃取所得的液體過濾，進(jìn)而取得龍眼花萃取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述液體為蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述醇類為食用酒精。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述食用酒精濃度為60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述特定比例為1 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述能預(yù)設(shè)溫度的萃取用機(jī)械為超音波萃取機(jī)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述能預(yù)設(shè)溫度的萃取用機(jī)械為超音波萃取機(jī)預(yù)設(shè)萃取溫度介于攝氏25度至攝氏40度之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述沉淀分離為靜置分離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述過濾為抽氣過濾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指抑制神經(jīng)細(xì)胞中麩胺酸釋放的萃取物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指降低iNOS基因表現(xiàn)的萃取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指降低T淋巴細(xì)胞活化增生的萃取物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指降低IFN-Y產(chǎn)生的萃取物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指提升神經(jīng)細(xì)胞存活率的萃取物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，其特征在于 所述具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，是指促進(jìn)β -catenin訊息傳導(dǎo)活化的萃取物。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物的制備方法，特別是指將龍眼花經(jīng)由超音波方式萃取出的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的龍眼花萃取物，該龍眼花萃取物具有可抑制神經(jīng)細(xì)胞中麩胺酸的釋放、降低iNOS基因的表現(xiàn)、降低T淋巴細(xì)胞的活化增生、降低IFN-γ的產(chǎn)生以及提升神經(jīng)細(xì)胞的存活率等功效，藉以防止神經(jīng)細(xì)胞被破壞，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功效。
文檔編號A61P25/00GK102370779SQ201010255130
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者吳岱锜 申請人:康達(dá)生命科學(xué)有限公司