專利名稱：腺病毒介導(dǎo)白介素-24制備放療增敏藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，具體涉及腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因在放療增敏 領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
放射治療是腫瘤治療的常規(guī)手段之一，70% 80%的惡性腫瘤患者在治療過程中 需接受放療。腫瘤對(duì)輻射不敏感或?qū)椛洚a(chǎn)生抗拒性，是放射治療難以根治惡性腫瘤的主 要原因之一。近年來，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病分子機(jī)制及細(xì)胞生長調(diào)控機(jī)理研究的深入，腫瘤基 因治療已取得一些令人振奮的成果，但針對(duì)單一環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)基因治療常常不能達(dá)到令人滿意 的治療效果。Weichselbaum等于1994年提出腫瘤基因-放射治療的新思路，其原理是將 輻射誘導(dǎo)型基因的調(diào)控序列與腫瘤殺傷基因相耦聯(lián)，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤實(shí)施局部照射 同時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)，通過射線與基因的雙重作用殺傷腫瘤，以達(dá)到降低照射劑量、緩解正常 組織損傷的目的。因此，將放射治療與基因治療相結(jié)合，事半功倍，已成為腫瘤治療研究的 重要方向之一，目前腫瘤基因聯(lián)合放射治療的有關(guān)機(jī)制主要有如下幾種(參見田玥，蘇成 海.國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志.2008 32(1))①免疫基因治療與放射治療的聯(lián)合；②抑癌 基因與放射治療的聯(lián)合；③自殺基因治療與放射治療的聯(lián)合；④抗血管生成基因治療與放 射治療的聯(lián)合；⑤特異性啟動(dòng)子基因治療與放射治療的聯(lián)合；⑥輻射保護(hù)性基因治療與放 射治療的聯(lián)合?，F(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于腺病毒介導(dǎo)白介素-24(Ad-IL_24)的報(bào)道，主要集中在其抑制 腫瘤方面的應(yīng)用，近年來國外大量研究資料已證明，Ad-IL-24對(duì)腫瘤有抑制生長和促進(jìn)凋 亡作用，并能調(diào)節(jié)IL-6，TNF-a，IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌；在國內(nèi)本課題組成員對(duì)此作了 大量的研究，研究結(jié)果顯示Ad-IL-24具有特異的抗腫瘤作用，對(duì)正常細(xì)胞無傷害作用；在 美國Ad-IL-24已經(jīng)進(jìn)入腫瘤基因治療的I期臨床。另外，申請(qǐng)?zhí)枮?00910025316.5的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書公開了人白介 素-24基因腺病毒載體在制備治療癌痛藥物中的應(yīng)用，包括以下步驟(1)構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pAdTrack-CMV-IL-24 ； (2)用測(cè)序正確的pAdTrack-CMV-IL-24按照常規(guī)方法制備陽性克 隆 pAdEasy-l-pAdTraek—CMV-IL-24 重組質(zhì)粒；(3)將 pAdEasy-l-pAdTraek-CMV-IL-24 基 因重組質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝，經(jīng)多輪擴(kuò)增后，可獲高滴度的重組腺病毒子(Ad-IL-24)。(4)用 Ad-IL-24感染腫瘤組織，并結(jié)合大鼠脛骨癌痛模型的鎮(zhèn)痛測(cè)試，結(jié)果不僅證明了 Ad-IL-24 具有共識(shí)的抑癌功能，而且腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因在細(xì)胞中的表達(dá)可以通過多種途徑 發(fā)揮抑制癌痛的作用。然而Ad-IL-24作為放療增敏劑的應(yīng)用國內(nèi)外至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24的新應(yīng)用，即腺 病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24制備放療增敏藥物的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載 體Ad-IL-24在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種放療增敏藥物，所述放療增敏藥物的活性成分包括腺病 毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24。本發(fā)明還提供了 一種應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24增強(qiáng)腫 瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的方法，放療前將腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24導(dǎo)入 腫瘤細(xì)胞，使人類IL-24基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，然后進(jìn)行放療。上述技術(shù)方案中，腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24的制備方法為現(xiàn) 有技術(shù)，可以參見申請(qǐng)?zhí)枮?00910025316. 5的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書。上述技術(shù)方案中，所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌腫瘤細(xì)胞。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述腺病毒介導(dǎo)的IL-24單基因表達(dá)具有顯著性抑制SPC-Al肺腺癌細(xì)胞 生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；Ad-IL-24聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和誘 導(dǎo)凋亡的作用高于Ad-IL-24單純組和單一放療組，均呈現(xiàn)明顯放療增敏協(xié)同效應(yīng)。


圖1為實(shí)施例一中重組腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因在SPC-Al細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄鑒定，其 中，1. PBS ；2. AdV ；3. Ad-IL-24 ；Μ. :DL2000marker ；圖2為實(shí)施例一中重組腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因在SPC-Al細(xì)胞中的表達(dá)鑒定，其 中，1. PBS ；2. AdV ；3. Ad-IL-24 ；圖3A為實(shí)施例一中Ad-IL-24等對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞生長的影響，Ad-IL-24組、 單純放療組、Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與PBS，AdV組比較，* P < 0. 01 ；Ad-IL-24+放療 聯(lián)合組分別與Ad-IL-24，放療組比較，Δ P < 0. 01 ；圖3Β為實(shí)施例一中Ad-IL-24等對(duì)SPC-Al細(xì)胞生長的抑制率結(jié)果比較， Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-IL-24組，放療組比較，* Q = 1. 17 ；圖4為實(shí)施例一中PI染色法檢測(cè)Ad-IL-24等對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞周期結(jié)果的比 較，Ad-IL-24組、單純放療組、Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與PBS，AdV組比較，* P < 0. 01 ； Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-IL-24，放療組比較，Δ P < 0. 01 ；分別與PBS，Ad組比較， ☆ P < 0. 05 ；圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad-IL-24等對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞凋亡率測(cè)定的結(jié)果比 較，Ad-IL-24組、單純放療組、Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與PBS，AdV組比較，* P < 0. 01 ； Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-IL-24，放療組比較，Δ P < 0. 01, Q = 1. 16 ；圖6為實(shí)施例二中各組瘤體體積_時(shí)間變化曲線，Ad-IL-24組、單純放療組、 Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與PBS組、AdV組比較，* P < 0. 01 ；Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別 與Ad-IL-24組、單純放療組比較，ΔΡ < 0. 01 ；圖7A為實(shí)施例二中各組瘤體實(shí)物圖；圖7B為實(shí)施例二中各組瘤體重量直方圖，Ad-IL-24組、單純放療組、Ad-IL-24+放 療聯(lián)合組分別與PBS組、AdV組比較，* P < 0. 01 ；Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-IL-24 組、單純放療組比較，ΔΡ < 0. 01 ；
圖8為實(shí)施例二中各組抑瘤率直方圖，Ad-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-IL-24組、 單純放療組比較，* P < 0. 01 ;Q = 1. 25。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述1、材料和試劑人肺腺癌細(xì)胞株SPC-Al，QBI-293A細(xì)胞及攜帶GFP綠色熒光蛋白的腺病毒空載體 AdV、Ad-IL-24由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室提供。培養(yǎng)基RPMI1640，胎 牛血清購自Gibcol Brl公司，MTT試劑購自Sigma公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自CORNING公 司，DL2000marker、Taq DNA聚合酶、dNTPmix、01igo d (T) 18、Ribonuclease Inhibitor購自 TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV購自MBI公司；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、瓊脂糖 等生化試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司。各基因其上、下游引物由上海生工(Sangon) 生物技術(shù)有限公司合成(如表1-1)。PI單染凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限 公司。Aposcreen Annexin-v-PE/7-AAD 凋亡試劑盒購于 SBA (southern biothech)公司。 Western blotting中，IL-24 —抗購自美國abeam公司，其二抗均購于碧云天生物技術(shù)研究 所，硝酸纖維素膜(NC膜)、Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑盒和暗盒購自上海普利萊基因 技術(shù)有限公司(蘇州金萊生物科技有限公司發(fā)貨)。3-4周齡、體重約20g/只雄性BALB/c nu/nu裸鼠購自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005)。免疫 組化 Caspase3、bax、bcl-2、cox-2、Fas-L、Survivin、VEGF —抗購自福州邁新(進(jìn)口分裝)， CD34 一抗購自武漢博士德生物有限公司，其所有二抗均購自福州邁新生物技術(shù)公司(進(jìn)口 分裝)。體外細(xì)胞輻照于蘇州大學(xué)輻照中心、鈷60(^射線)、劑量率167/!^11。動(dòng)物體內(nèi) 放療蘇大附一院放療科電子輻照(χ射線)，西門子Primus-m直線加速器購自德國西門子 公司(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院配置)。表1-1PCR擴(kuò)增所用引物及其序列
引物編號(hào)和名稱引物序列 實(shí)施例一(1)細(xì)胞培養(yǎng)=SPC-Al 細(xì)胞用 RPMI1640 完全培養(yǎng)基(10% FCS)，在 37°C，5% CO2 下培養(yǎng)。2 3天傳代一次。(2) AdV、Ad-IL-24腺病毒的擴(kuò)增與效價(jià)的測(cè)定用AdV、Ad-IL-24感染70%貼壁的QBI-293A細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液于-80°C及37°C反復(fù)凍融4次，取上清，反復(fù)擴(kuò)增，病毒保存于-80°C。將培養(yǎng)生長狀況良好的QBI-293A細(xì)胞，用胰酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度 為IO5個(gè)/ml后，在96孔板上按每孔100 μ 1接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，將收獲的重組病毒子按 10_4、10_5、10_6、10_7、10_8稀釋后，每個(gè)稀釋度按每孔100 μ 1接種1排，37°C、5% CO2細(xì)胞培 養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h后，熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)。按病毒效價(jià)(pfu/ml)=(熒光數(shù)XlO)/ 稀釋度計(jì)算病毒效價(jià)。結(jié)果為重組病毒子經(jīng)多輪感染后，檢測(cè)效價(jià)均達(dá)到109pfu/ml。(3) Ad-IL-24重組腺病毒感染SPC-A1細(xì)胞將處于對(duì)數(shù)生長期的SPC-Al細(xì)胞系，經(jīng)0. 25%胰酶消化后，用RPMI1640配成細(xì)胞 懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為ι χ 105/ml，每孔100 μ 1接種于96孔培養(yǎng)板，37°C,5% CO2培 養(yǎng)過夜。次日用AdV空載體腺病毒以1、10、25、50、100、200M0I不同劑量感染SPC-Al細(xì)胞， 以篩選和判定最佳感染劑量，并以最佳感染劑量感染SPC-Al細(xì)胞，共分為3組PBS細(xì)胞對(duì) 照組、AdV空載體組、Ad-IL-24單基因組。感染72h后，分別在普通光鏡視野下觀察SPC-Al 細(xì)胞生長形態(tài)和熒光視野下觀察GFP綠色熒光表達(dá)情況，以判斷重組腺病毒對(duì)SPC-Al細(xì)胞 生長的影響及其感染效率。結(jié)果為將空載體腺病毒AdV以1、10、25、50、100、200M0I不同劑量分別感染 SPC-Al細(xì)胞。感染72h后，在熒光顯微鏡下普通光鏡視野下觀察1、10、25、50U00M0I不同 劑量AdV空載體腺病毒感染SPC-Al組，細(xì)胞均形態(tài)正常，生長良好，與未感染腺病毒SPC-Al 細(xì)胞對(duì)照組幾乎無差別，而200M0I劑量感染SPC-Al組細(xì)胞圓縮、脫落，呈現(xiàn)明顯的由腺 病毒本身引起細(xì)胞毒性；在熒光視野下，50、100、200M0I不同劑量AdV空載體腺病毒感染 SPC-Al組細(xì)胞90 %以上細(xì)胞可觀察到綠色熒光，根據(jù)AdV空載體腺病毒對(duì)細(xì)胞感染效率最 高而毒性最低的病毒感染劑量為原則，提示50M0I作為腺病毒感染SPC-Al細(xì)胞最佳感染劑 量。并且，Ad-IL-24感染SPC-Al (50M0I)細(xì)胞72h后，能產(chǎn)生明顯的由腺病毒介導(dǎo) IL-24基因表達(dá)產(chǎn)物所引起的細(xì)胞毒性；AdV空載體腺病毒在相同劑量感染SPC-Al細(xì)胞 72h后均生長良好，與未感染細(xì)胞對(duì)照組相當(dāng)。結(jié)果初步提示，腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因表 達(dá)體外具有明顯抑制肺癌細(xì)胞生長的作用。(4)重組腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因在SPC-Al細(xì)胞中的表達(dá)鑒定1、RT-PCR法鑒定Ad-IL-24感染SPC-Al肺腺癌細(xì)胞后目的基因轉(zhuǎn)錄用50M0I的Ad-IL-24、AdV分別感染SPC-Al肺癌細(xì)胞、另加細(xì)胞對(duì)照組(PBS組)、 72h后，1500r/min離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2_3次，按RNA抽提試劑盒說明書操作提取總 RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。將上述cDNA模板和表1中的Pl、P2上下游引物在PCR儀 中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 的條件為 94°C 4min，94°C 30s,55°C 45s,72°C lmin、30cycle，72°C IOmin0 最后分別取10 μ 1產(chǎn)物與DNA Marker 一起行瓊脂糖凝膠電泳。重組腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因在SPC-Al細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄鑒定的結(jié)果如圖1所示，結(jié) 果顯示Ad-IL-24組在650bp位置可檢測(cè)到一條IL-24特異性條帶，而PBS，AdV對(duì)照組中 未出現(xiàn)預(yù)期條帶，RT-PCR鑒定結(jié)果表明Ad-IL-24重組腺病毒能介導(dǎo)外源性IL-24基因在 SPC-Al細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄。2、Western blotting法鑒定Ad-IL-24感染SPC-A1肺腺癌細(xì)胞后目的基因表達(dá)同樣按照上述方法分組，感染72h收集細(xì)胞按IO7細(xì)胞/ml細(xì)胞裂解液的比例加細(xì)
6胞裂解液(含終濃度為ImM PMSF蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解，充分裂解后12000r/min離心 5min，取總蛋白上清，并以4 1的比例與5XSDS蛋白上樣緩沖液混勻，100°C煮沸5min， 12000r/min離心5min，再用分離膠為12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(100V， 2h)，并300mA，2h將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用5 %脫脂奶粉37°C封閉 Ih ；用鼠抗人IL-24抗體在37°C作用lh, TBST洗滌3次，每次5min ；再分別加HRP (辣根過 氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗，37°C作用lh，TBST洗滌3次，每次5min ；最后將NC 膜與發(fā)光工作液(等體積A和B溶液混合)充分接觸，室溫孵育3min，暗室進(jìn)行壓片曝光、 顯影禾口定影。Western blotting結(jié)果如圖2顯示，Ad-IL-24組呈現(xiàn)出24kD的與抗人IL-24抗 體特異性結(jié)合的條帶；AdV空病毒感染組和細(xì)胞對(duì)照組在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)上述條帶，進(jìn) 一步表明Ad-IL-24腺病毒能介導(dǎo)外源性IL-24基因在SPC-Al細(xì)胞中成功表達(dá)IL-24蛋白。(5)不同照射劑量對(duì)SPC-Al細(xì)胞凋亡率的影響將呈指數(shù)生長期，細(xì)胞密度為70% SPC-Al細(xì)胞分為0、2、4、6、8Gy共5組，室溫下 采用6tlCo γ射線照射，吸收劑量率為lGy/min，由蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)輻照中心照射。37°C 5% C02相同條件下培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，用IXbinding buffer調(diào)節(jié)細(xì)胞至 IX IO6個(gè)/ml，取細(xì)胞100 μ 1于流式管中，加10 μ 1 Annexin-V-PE冰上混勻，避光15min。 再加IXbinding buffer380 μ 1，再加10 μ 1 7-AAD，上流式檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，旨在篩選 出最佳照射劑量，以供Ad-IL-24聯(lián)合放療研究生物學(xué)功能時(shí)參考。結(jié)果為SPC-A1細(xì)胞照射72h后，收集0、2、4、6、8Gy各組細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示各照射劑量組的凋亡率分別為(1.83士0.11)%、(12. 51 士0.95) %、 (24. 13士0. 60) (38. 46士2. 13) %及(57. 75士0. 83) %。為了利于觀察 Ad-IL-24 的放療 增敏作用，故實(shí)施例中選擇4Gy的適中照射劑量作為本實(shí)驗(yàn)使用的照射劑量。(6)MTT法檢測(cè)Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al細(xì)胞生長的影響1、實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理PBS 組1X 105/ml SPC-A1+0. lmol/L PBS ；AdV 組1 X 105/ml SPC-A1+50M0I AdV ；放療組1X 105/ml SPC-Al+48h 后輻照(4Gy)；Ad-IL-24 組1 X 105/ml SPC-A1+50M0I Ad-IL-24 ；Ad-IL-24 組 + 放療組1 X 105/ml SPC-A1+50M0I Ad-IL_24+48h 后輻照(4Gy)。2、Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al細(xì)胞生長的影響將處于對(duì)數(shù)生長期的SPC-Al細(xì)胞，胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成單細(xì)胞懸 液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度按每孔1 X IO4個(gè)/50 μ 1接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按上述實(shí) 驗(yàn)分組及細(xì)胞處理，每組均設(shè)3個(gè)平行孔，37V,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 4天，在不同時(shí)間 段觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長繁殖狀況，并每隔1天每孔加入10 μ 1 MTT(5mg/ml)，37°C下繼 續(xù)培養(yǎng)4h后再加入10% SDS-HCl終止液100 μ 1/孔，于37°C充分溶解后，在酶標(biāo)儀570nm 下測(cè)定吸光值(0D值)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間(D)為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。根據(jù)細(xì)胞生長 抑制率(％ ) = (1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照OD值)X 100%計(jì)算生長抑制率。結(jié)果如圖3A、3B所示，Ad-IL-24對(duì)SPC-Al細(xì)胞有不同程度的生長抑制作用，且呈 時(shí)間依賴性，與AdV組和PBS組比較呈顯著性差異(P < 0-01)，Ad-IL-24+放療組對(duì)SPC-Al
7細(xì)胞的生長抑制作用與Ad-IL-24單純組，單一放療組比較不僅呈顯著性差異(P <0.01)； 而且更優(yōu)于Ad-IL-24單純組及單一放療組，并呈現(xiàn)放療增敏的協(xié)同作用(Q= 1.17)。3、FCM檢測(cè)Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al細(xì)胞周期的影響按步驟1的方法實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理，37°C，5% CO2相同條件下培養(yǎng)72h后收集 細(xì)胞，PBS清洗2次，70%冰乙醇固定24h，PI染色30min，再用PBS清洗3次后上流式細(xì)胞 儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。PI染色法的FCM檢測(cè)的流式結(jié)果如圖4顯示Ad-IL_24感染SPC-A1細(xì)胞的G2/ M期為(15. 25 士 0. 67) %，放療組SPC-Al細(xì)胞G2/M期為(23. 98 士 2. 31) %，均顯著高于PBS 組的 G2/M 期(7. 64士0. 98) %和 AdV 組的 G2/M 期(11. 38 士 1. 14) % (P < 0. 01)，可導(dǎo)致該 細(xì)胞的G2/M期阻滯，而Ad-IL-24+放療組的G2/M期(57. 58 士 1. 76) %阻滯作用更明顯高于 單純 Ad-IL-24 組、單一放療組(P < 0. 01)，Ad-IL-24 組的 Gl 期細(xì)胞為(53. 87士 1. 33) %, Ad-IL-24+放療組為(17. 31 士 1.65) %，單純放療組為(37. 81 士 1.77) %與PBS對(duì)照組 (81. 51 士2.98% )及AdV對(duì)照組(70. 75士 1. 06% )的Gl期細(xì)胞比率分別比較均明顯減少 (P < 0. 05)。4、FCM檢測(cè)Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al細(xì)胞凋亡率的影響按步驟1的方法實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理，72h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次， 用IXbinding buffer調(diào)節(jié)細(xì)胞至IXlO6個(gè)/ml，取細(xì)胞100 μ 1于流式管中，加 10 μ IAnnexin-V-PE 冰上混勻，避光 15min。再加 1 Xbinding buffer 380 μ 1，再加 10 μ 17-AAD，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。Annexin-V-P/7-AAD雙染法流式檢測(cè)如圖5顯示Ad-IL_24及AdV作用后，SPC-A1 細(xì)胞凋亡率分別為(18. 38士 1. 41) %和(3. 93士 1. 17) %, PBS組及放療組的凋亡率分別為 (1. 94士0. 65) %和(24. 27士2. 02)%, Ad-IL-24組與AdV組及PBS組相比凋亡率明顯升高 (P < 0.01), Ad-IL-24+放療組(40. 57 士 3. 30) %凋亡率明顯高于單純Ad-IL-24及單一放 療組(P <0.01)，具有協(xié)同作用(Q= 1.16)。實(shí)施例二，Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤的抑瘤作用。(1) SPC-Al人肺腺癌荷瘤裸鼠模型的建立SPC-Al人肺腺癌細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10% FCS)完全培養(yǎng)于5% C02， 37°C常規(guī)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的SPC-Al人肺癌細(xì)胞用PBS洗滌后經(jīng)0. 25%胰酶消化， 并用無血清培養(yǎng)液中止后以lOOOr/min的轉(zhuǎn)速離心5min收獲細(xì)胞，并細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞 濃度制備3X 107ml的細(xì)胞懸液。取4周齡SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠25只，安爾碘于裸鼠 右前腋下常規(guī)消毒后，每只裸鼠皮下注射細(xì)胞懸液3. 0 X 106/100 μ 1，并觀察SPC-Al肺腺癌 細(xì)胞在裸鼠皮下的生長和成瘤情況。結(jié)果為裸鼠皮下接種SPC-Al肺腺癌細(xì)胞2 3天后，局部皮丘逐漸縮小、變實(shí)， 隨后瘤體體積不斷增殖，IOd后其直徑約為5mm。本實(shí)驗(yàn)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞接種裸鼠的成 瘤率為 100% (25/25)。(2)荷瘤裸鼠進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)裸鼠皮下接種SPC-Al肺腺癌細(xì)胞待其瘤體直徑約5mm左右時(shí)，對(duì)裸鼠進(jìn)行隨 機(jī)分組并進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分組(5只X5組)PBS組、AdV組、單純放療(IOGy) 組、Ad-IL-24組、Ad-IL-24+放療(IOGy)組。各組抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方案如下(I)PBS組=PBS
8量50 μ 1/只，瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，隔日一次，共5次；(2) AdV組、Ad-IL-24組各重組病毒量 1. 5 X 108pfu/50 μ 1/只，瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，隔日一次，共5次；(3)單純放療組抗腫瘤實(shí)驗(yàn)開 始后的第5d，先用10%水合氯醛(3ul/g)使裸鼠麻醉后固定在特制裝置上，以鉛板屏蔽除 局部腫塊以外的部位進(jìn)行局部瘤體照射，直線加速器電壓=5MeV、SSD = 100cm、劑量IOGy/ 只，共一次；(4) Ad-IL-24+放療聯(lián)合組Ad-IL-24劑量及方法同Ad-IL-24組；于Ad-IL-24 第3次注射前當(dāng)日，進(jìn)行局部瘤體照射，劑量及方法同單純放療組。(3)分析Ad-IL-24及聯(lián)合放療對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤的抑瘤作用1、瘤體體積觀察第一次治療前及開始治療后隔日測(cè)量各組瘤體的長徑(a)、短徑(b)，計(jì)算瘤體體 積(V = a * b2/2)，繪制瘤體體積_時(shí)間變化曲線，并進(jìn)一步分析IL-24及聯(lián)合放療對(duì)裸鼠 SPC-Al肺腺癌移植瘤的抑瘤作用。根據(jù)公式計(jì)算瘤體體積，并繪制瘤體體積_時(shí)間變化曲線，得圖6，結(jié)果表明，治療 15d后，Ad-IL-24組、單純放療組、Ad-IL-24+放療聯(lián)合組對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤均有 不同程度的抑瘤作用，與PBS組、AdV組比較有顯著性差異(P < 0. 01)，且Ad-IL-24+放療 聯(lián)合組的抑瘤作用優(yōu)于Ad-IL-24組和單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P < 0. 01)。2、瘤體質(zhì)量觀察治療15d后處死裸鼠，摘取瘤體組織(如圖7A)，電子天平稱瘤體重量(精確至
0.OOlg)并繪制瘤體重量直方圖，如圖7B，結(jié)果表明Ad-IL-24組、單純放療組、Ad-IL-24+ 放療聯(lián)合組的平均瘤體質(zhì)量分別為1. 335士0. 051，1. 232士0. 042,0. 683士0. 033，與 PBS 組為 1. 907士0. 103,AdV 組為 1. 882士0. 128 比較有顯著性差異(P < 0. 01) ,Ad-IL-24+ 放療聯(lián)合組的抑瘤作用優(yōu)于Ad-IL-24組、單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P < 0. 01)。3、抑瘤率觀察根據(jù)瘤重計(jì)算抑瘤率(E)，抑制率(％ ) = (1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤 重)X100% ；并按金正均法(計(jì)算Q值)判斷IL-24及聯(lián)合放療的放療增敏作用，Q值= E(a+b)/[Ea+(I-Ea) XEb]；進(jìn)一步分析IL-24及聯(lián)合放療對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤的抑瘤 作用。結(jié)果如圖8所示Ad-IL_24組、單純放療組、Ad-IL-24+放療聯(lián)合組對(duì)裸鼠SPC-Al 肺腺癌移植瘤均有明顯的抑瘤作用，分別為30. 00%,35. 40%,64. 18% ；Ad-IL-24+放療聯(lián) 合組較Ad-IL-24組和單純放療組有顯著性差異(P < 0. 01)，呈現(xiàn)放療增敏協(xié)同作用(Q =
1.25)。
權(quán)利要求
腺病毒介導(dǎo)白介素 24基因表達(dá)載體Ad IL 24在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用。
2. 一種放療增敏藥物，其特征在于所述放療增敏藥物的活性成分包括腺病毒介導(dǎo)白 介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24。
全文摘要
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，具體涉及腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因在放療增敏領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的方法，放療前將腺病毒介導(dǎo)白介素-24基因表達(dá)載體Ad-IL-24導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使人類IL-24基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，然后進(jìn)行放療。本發(fā)明所述腺病毒介導(dǎo)的IL-24單基因表達(dá)具有顯著性抑制SPC-A1肺腺癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；Ad-IL-24聯(lián)合放療對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和誘導(dǎo)凋亡的作用高于Ad-IL-24單純組和單一放療組，均呈現(xiàn)明顯放療增敏協(xié)同效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101912620SQ20101025027
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者凌春華, 楊吉成, 盛偉華, 謝宇鋒, 趙大國, 黃錦宏 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)