專利名稱：單劑免疫破傷風(fēng)類毒素陽離子葡聚糖微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種載有破傷風(fēng)類毒素的甲基丙烯酸羥乙酯 陽離子葡聚糖微球制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
由世界衛(wèi)生組織等5個國際組織倡議的全球兒童疫苗計劃(CVI)主要宗旨是促進 開發(fā)及引入、改進現(xiàn)有疫苗及新創(chuàng)制的疫苗，以加強保護全球兒童免遭傳染病的侵害。研究 改進破傷風(fēng)類毒素的釋放系統(tǒng)是CVI的主要目標之一。破傷風(fēng)能否被控制和消除有賴于高 的接種，但目前破傷風(fēng)的基礎(chǔ)免疫需要三個月內(nèi)連續(xù)3次注射疫苗，接種次數(shù)多和接種周 期長使得輟種率高達70%，免疫效果差。微球技術(shù)已廣泛用于藥物、多肽和蛋白疫苗的研究與開發(fā)。長周期的可注射單次 免疫微球?qū)o料性質(zhì)提出了很高要求，即一個月甚至數(shù)月的持續(xù)有效釋藥，且所使用輔料 應(yīng)兼具功能性和生物可降解、生物相容性。對這類控制釋放體系的載體材料 ，國內(nèi)外曾采用 明膠、淀粉、白蛋白、脂質(zhì)體、海藻酸鈉等作為載體材料，但存在生物降解周期短的問題；目 前，國內(nèi)外較常應(yīng)用的微球材料多聚乳酸_聚乙醇酸共聚物(PLGA，簡稱聚乳酸)，PLGA在體 內(nèi)首先被降解為乳酸和羥基乙酸，又經(jīng)過三羧酸循環(huán)最終被完全降解為二氧化碳和水。如 國外的 Pal Johansen 等(Pharm Res，1998，15 :1103 1110)，GFA Kersten 等(Vaccine， 1996,14(17-18) :1627 1632)，以及 RK Gupta 等(Vaccine, 1997,15(6-7) :672 678)， 國內(nèi)的何應(yīng)等(北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，32 (3) :239 243)，郝國榮等(中國生物制品學(xué) 雜志，2002，15 (6) 346 349)，王繼麟等(中國藥學(xué)雜志，2001，36 (5) :318 322)，分別采 用上述載體復(fù)乳法制備了破傷風(fēng)類毒素微球，并具有較高的包封率，通過控制丙交酯和乙 交酯的分子量調(diào)節(jié)降解時間達到緩釋目的，體內(nèi)免疫的初步實驗證明了單劑量免疫微球的 可行性。但國內(nèi)外文獻報道的用聚乳酸及其共聚物制備的微球主要存在以下不足(1)作 為藥物載體的的聚乳酸及其共聚物是疏水性材料，對親水性的疫苗或藥物親和性不強，導(dǎo) 致包裹量和包封效率低；(2)制備中常采用復(fù)乳法所用有機溶劑易引起蛋白凝聚及沉淀， 使疫苗活性喪失；(3)釋藥初期突釋量較大，可達30% 40% ； (4)聚乳酸及其共聚物在降 解過程中產(chǎn)生酸性環(huán)境致蛋白或疫苗的天然構(gòu)想發(fā)生變化，抗原性降低。因此，對于蛋白和 疫苗類微球，制藥界迫切需要解決載體材料和藥物的親和性、制備工藝和釋放過程中藥物 活性保持等重要問題。利用水凝膠作為藥物載體系統(tǒng)具有載藥量大、釋藥與降解可控、生物相容性好等 特點，是目前控釋釋藥領(lǐng)域的研究熱點。近年來，引入功能基的葡聚糖水凝膠被廣泛作為 蛋白疫苗類藥物載體進行研究。我們合成了生物降解葡聚糖衍生物-甲基丙烯酸羥乙基 酯葡聚糖(Dextran-hydroxyethyl methacrylate，dex-HEMA)，近期研究資料顯示由這種化 合物聚合而來的水凝膠生理條件下的降解是通過存在于交聯(lián)處的可變形的碳酸酯酯團的 水解而產(chǎn)生的。而且這些水凝膠具有很好的生物相容性，因為它的降解產(chǎn)物是葡聚糖(用做血漿增容藥)以及2-聚羥乙基甲基丙烯酸(一種廣泛用于生化產(chǎn)品藥用的聚合物)。 HEMA-dex凝膠的降解進程可以通過改變交聯(lián)密度進行調(diào)整，降解所需時間可從幾天到幾個 月，其良好生物可降解性和降解時間可調(diào)性，成為長周期單次免疫微球的最適載體材料。目前葡聚糖微球的載藥方式多采用制備時加入藥物的前載法，如牛血清白蛋白、 生長因子等。因微球制備的雙水相工藝和蛋白水溶性較好，其包封率不高，載藥量低，如 Vlugt-Wensink 等(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutic,2007, 67 589-596)，包封率為50 %~70%,載藥量4. 16 % -5. 67 % ；而且乳化交聯(lián)法中所使用的交 聯(lián)劑往往會使蛋白或疫苗的結(jié)構(gòu)破壞。因此如何尋找能夠保持蛋白活性和高包封率的載藥 方式成為蛋白藥物葡聚糖微球制劑成功與否的重要內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種單劑免疫破傷風(fēng)類毒素控釋微球的制備方法，以甲基丙烯酸羥 乙基酯葡聚糖(dex-HEMA)為載體材料，并加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，應(yīng)用乳 化交聯(lián)法在雙水相中制備空白陽離子葡聚糖微球，最終采用后載法制備高包封率、高抗原 活性和長周期控制釋放的破傷風(fēng)類毒素(Tetanus Toxiod，簡稱TT)微球，提供一種給藥方 便、安全，接種一次就能奏效的長效控釋破傷風(fēng)類毒素疫苗微球劑型。本發(fā)明的破傷風(fēng)類毒素控釋微球減少破傷風(fēng)疫苗注射次數(shù)，提高接種覆蓋率，降 低輟種率，有效地預(yù)防破傷風(fēng)，提供具有長效作用的單劑破傷風(fēng)類毒素控釋疫苗制劑，實現(xiàn) 一次注射全程免疫。本發(fā)明基于兩種聚合物互不相容原理制備選用一種完全在水中乳化的技術(shù)制備 凝膠微球。很多水溶性聚合物(如葡聚糖、PEG、PVA、PVP、明膠膠、可溶性淀粉等)混合時 常產(chǎn)生互不溶現(xiàn)象，當超過一定濃度時聚合物仍存在與水相中，但整個體系分為兩相，將其 乳化后，分散相中的聚合物可以交聯(lián)形成具有凝膠性質(zhì)的微球。由于這種工藝中不使用有 機溶劑，降低生產(chǎn)過程中防護和安全措施費用。本發(fā)明從充分保持蛋白或疫苗藥物的生物活性和提高藥物包封率考慮，選用后載 法進行載藥。即首先制備陽離子空白葡聚糖凝膠微球，破傷風(fēng)類毒素的等電點為4. 7，在生 理條件下一般帶負電；利用靜電吸附原理載藥，載藥量在3. 84% -11. 5%范圍內(nèi)，包封率幾 乎達100%，顯著高于前載法，圖1為DMAEMA加入對微球電荷的影響，圖2為兩種載藥方式 下陽離子葡聚糖微球的包封率。由于藥物在乳化交聯(lián)工藝完成后加入，因此工藝對蛋白的 活性幾乎無影響。本發(fā)明的目的是通過如下方案實現(xiàn)的本發(fā)明的破傷風(fēng)類毒素制劑，由甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球和吸附在微球表面 或內(nèi)部的破傷風(fēng)類毒素組成，它由破傷風(fēng)類毒素通過靜電作用后載在陽離子甲基丙烯酸羥 乙酯葡聚糖微球上制備。微球平均粒徑優(yōu)選為5 100微米。本發(fā)明的微球制劑中，破傷風(fēng)類毒素重量占微球總重量的0. 5 15%。破傷風(fēng)類毒素重量占微球總重量的3-10%。本發(fā)明的破傷風(fēng)類毒素制劑的制備方法，依次包括a.甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖溶于水，攪拌下加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖相；b.聚乙二醇(PEG)溶于水中，得聚乙二醇相；c.攪拌下將甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；d.攪拌下，分別將四甲基乙二胺和過硫酸鉀加入到上述溶液中，停止攪拌后交 聯(lián)；e.用水在離心條件下洗去上清液，冷凍干燥得空白微球粉末；f.將空白微球粉末加入破傷風(fēng)類毒素溶液中孵化，離心清洗，即得。上述制備方法，其中聚乙二醇的分子量優(yōu)選為6kDa 20kDa，聚乙二醇相中聚乙 二醇的濃度優(yōu)選為20 40%，為重量百分比。甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖相中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的濃度優(yōu)選為0. 2 3% (w/w)。上述攪拌速度優(yōu)選為200rpm 3000rpm。其中交聯(lián)時間優(yōu)選為0.5 12小時。交聯(lián)溫度室溫即可，一般在交聯(lián)溫度為 25°C 40°C之間。甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖優(yōu)選如下結(jié)構(gòu)式葡聚糖的分子量為10kDa-70kDa，取代 度為2-20。 所述的dex-HEMA相和PEG相的體積比優(yōu)選為1 10 1 100。本發(fā)明制備的甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球外觀規(guī)整、光滑，見圖3，粒徑大小和 分布可控，微球平均粒徑在5-100微米范圍內(nèi)，見圖4，載藥量可達15 %，按常規(guī)的用藥量， 其載藥量可以控制在3. 84% -11. 5%范圍內(nèi)，包封率可達75% 100%。


圖1是不同量DMAEMA葡聚糖微球的(電位圖2是葡聚糖陽離子微球兩種載藥方式的包封率圖3是采用本發(fā)明所制備的破傷風(fēng)類毒素甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球的掃描 電鏡照片。圖4是采用本發(fā)明所制備的破傷風(fēng)類毒素甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球的粒徑 分布圖。圖5是采用本發(fā)明所制備的不同取代度葡聚糖微球的釋放曲線(葡聚糖分子量2 萬)。
具體實施例方式實施例1
(1)甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖(分子量2萬，DS = 3)71mg溶于1.577g水中，攪 拌下加入35 yl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相；(2)聚乙二醇2萬lg溶于3. 34ml水中，得聚乙二醇相；(3)在攪拌下(lOOOrpm)，將甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；(4)在攪拌下(500rpm)，分別將0. lml四甲基乙二胺(20%，V/V，4M鹽酸調(diào)中性) 和0. 18ml過硫酸鉀(50mg/ml)加入到上溶液中，停止攪拌后交聯(lián)lh(37度)；(5)用水在離心條件下洗去上清液，冷凍干燥得空白微球粉末。(6)稱取70mg空白微球粉末，加入lmg/ml破傷風(fēng)類毒素溶液5ml，孵化24h (4°C )， 離心清洗，得破傷風(fēng)類毒素陽離子葡聚糖微球。所得微球包封率99. 87 %，載藥量7.1%，粒徑10-20 u m.實施例2(1)甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖(分子量2萬，DS = 3)71mg溶于1.577g水中，攪 拌下加入35 yl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，形成甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相；(2)聚乙二醇2萬lg溶于5ml水中，形成聚乙二醇相；(3)在攪拌下(2000rpm)，將甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；(4)在攪拌下(500rpm)，分別將0. lml四甲基乙二胺(20%，V/V，4M鹽酸調(diào)中性) 和0. 18ml過硫酸鉀(50mg/ml)加入到上溶液中，停止攪拌后交聯(lián)lh(37度)；(5)用水在離心條件下洗去上清液，冷凍干燥得空白微球粉末。(6)稱取70mg空白微球粉末，加入0. 5mg/ml破傷風(fēng)類毒素溶液5ml，孵化 24h(4°C )，離心清洗，得破傷風(fēng)類毒素陽離子葡聚糖微球。 所得微球包封率99. 97 %，載藥量3.6%，粒徑5_10 u m。實施例3(1)甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖(分子量2萬，DS = 3)71mg溶于1.577g水中，攪 拌下加入35 yl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，形成甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相；(2)聚乙二醇60001g溶于5ml水中，形成聚乙二醇相；(3)在攪拌下(500rpm)，將甲基丙烯酸羥乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；(4)在攪拌下(500rpm)，分別將0. lml四甲基乙二胺(20%，V/V，4M鹽酸調(diào)中性) 和0. 18ml過硫酸鉀(50mg/ml)加入到上溶液中，停止攪拌后交聯(lián)lh(37度)；(5)用水在離心條件下洗去上清液，冷凍干燥得空白微球粉末。(6)稱取70mg空白微球粉末，加入1. 5mg/ml破傷風(fēng)類毒素溶液5ml，孵化 24h(4°C )，離心清洗，得破傷風(fēng)類毒素陽離子葡聚糖微球。所得微球包封率99. 61 %，載藥量10. 1 %，粒徑30-80 u m。
權(quán)利要求
一種破傷風(fēng)類毒素制劑，其特征是由甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球和吸附在微球表面或內(nèi)部的破傷風(fēng)類毒素組成。
2.權(quán)利要求1的破傷風(fēng)類毒素制劑，其中微球平均粒徑為5 100微米。
3.權(quán)利要求1的破傷風(fēng)類毒素制劑，其中破傷風(fēng)類毒素重量占微球總重量的0.5 15%。
4.權(quán)利要求3的破傷風(fēng)類毒素制劑，其中破傷風(fēng)類毒素重量占微球總重量的3 10%。
5.權(quán)利要求1的破傷風(fēng)類毒素制劑的制備方法，依次包括a.甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖溶于水，攪拌下加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙 烯酸羥乙酯葡聚糖相；b.聚乙二醇溶于水中，得聚乙二醇相；c.攪拌下將甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；d.攪拌下，分別將四甲基乙二胺和過硫酸鉀加入到上述溶液中，停止攪拌后交聯(lián)；e.用水在離心條件下洗去上清液，冷凍干燥得空白微球粉末；f.將空白微球粉末加入破傷風(fēng)類毒素溶液中孵化，離心清洗，即得。
6.權(quán)利要求5的制備方法，其中聚乙二醇的分子量為6kDa 20kDa，聚乙二醇相中聚 乙二醇的濃度為20 40%，為重量百分比。
7.權(quán)利要求5的制備方法，其中甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖相中甲基丙烯酸二甲氨基乙 酯的濃度為0.2 3%。w/w。
8.權(quán)利要求5的制備方法，其中攪拌速度為200rpm 3000rpm。
9.權(quán)利要求5的制備方法，其中交聯(lián)時間為0.5 12小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種單劑免疫破傷風(fēng)類毒素陽離子葡聚糖微球及其制備方法。其特征是由破傷風(fēng)類毒素通過靜電作用后載在陽離子甲基丙烯酸羥乙酯葡聚糖微球上制得。本發(fā)明的破傷風(fēng)類毒素控釋微球減少破傷風(fēng)疫苗注射次數(shù)，提高接種覆蓋率，降低輟種率，有效地預(yù)防破傷風(fēng)，提供具有長效作用的單劑破傷風(fēng)類毒素控釋疫苗制劑，實現(xiàn)一次注射全程免疫。
文檔編號A61K39/08GK101869704SQ201010193548
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者劉曉慶, 朱家壁, 趙玉娜, 鄭春麗 申請人:中國藥科大學(xué)