專利名稱：抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種具有中和破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體。另外，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
破傷風(fēng)(Tetanus)是一種人畜共患的嚴(yán)重感染疾病，由破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌 (Clostridium tetani)感染引起。在厭氧條件下細(xì)菌于創(chuàng)口生長繁殖，產(chǎn)生大量的毒素， 毒素侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者全身性肌肉強(qiáng)直性痙攣，形成破傷風(fēng)特有的牙關(guān)禁閉、角弓反張等癥狀，嚴(yán)重者最后會(huì)死于窒息及全身性衰竭。目前，在大部分發(fā)展中國家破傷風(fēng)仍然是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，每年大約有100萬人死于破傷風(fēng)，其中新生兒占死亡總數(shù) 80%。破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌，長4 8 μ m，寬0. 3 0. 8 μ m，經(jīng)常以相當(dāng)長的細(xì)絲形式存在，形成芽胞時(shí)，細(xì)菌呈特殊的鼓槌狀，芽胞為卵圓形。破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌為嚴(yán)格厭氧菌， 其芽胞可抗高溫抗干燥，對(duì)大多數(shù)防腐劑由抗性，但對(duì)碘的水溶液及中性戊二醛溶液敏感， 可在短時(shí)間內(nèi)被這些試劑殺滅。破傷風(fēng)梭菌可以產(chǎn)生兩種外毒素一種是具有溶血作用的破傷風(fēng)溶血毒素；另一種是破傷風(fēng)痙攣毒素，即常說的破傷風(fēng)毒素。破傷風(fēng)毒素是由破傷風(fēng)梭狀桿菌產(chǎn)生并分泌至菌體外的一種蛋白質(zhì)，由1315個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為150700Da。破傷風(fēng)毒素的基因存在于一個(gè)75Kb的質(zhì)粒上，編碼基因長約4Kb。破傷風(fēng)毒素在菌體內(nèi)表達(dá)后是單一的一條蛋白質(zhì)鏈，在分泌過程中被蛋白酶裂解成由二硫鍵鏈接的輕鏈和重鏈。根據(jù)毒素在體內(nèi)的作用，破傷風(fēng)毒素分子分為A、B、 C三個(gè)部分，毒素的輕鏈片段為A片段，重鏈N末端的一半為B片段，另一半為C片段。破傷風(fēng)毒素是已知最毒的毒素之一，經(jīng)純化的破傷風(fēng)毒素對(duì)小鼠的致死劑量為 0. lng/kg，對(duì)豚鼠的致死劑量為0. 3ng/kg，推測(cè)對(duì)人的致死劑量為0. 25ng/kg。它的作用過程一般為結(jié)合、導(dǎo)入和作用三步。研究結(jié)果表明毒素的C片段可以和毒素的受體結(jié)合，毒素的受體一般認(rèn)為是神經(jīng)節(jié)苷脂，毒素的C片段具有逆行軸突運(yùn)輸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，已被用于研究亞單位疫苗；B片段可以在人工磷脂膜上形成離子通道，將毒素的活性片段導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)；毒素的A片段分子是Si蛋白酶，具有蛋白酶活性，它可以裂解神經(jīng)細(xì)胞膜上的傳送神經(jīng)遞質(zhì)的蛋白質(zhì)-囊泡相關(guān)膜蛋白，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使興奮的沖動(dòng)不停傳遞，導(dǎo)致患者產(chǎn)生強(qiáng)直性痙攣的臨床癥狀。然而，從破傷風(fēng)毒素中直接提取和純化C 片段亦有許多弊端破傷風(fēng)毒素毒性高，易形成芽胞進(jìn)行傳播，培養(yǎng)、分離過程復(fù)雜、回收率不高，且具有一定危險(xiǎn)性。破傷風(fēng)類毒素疫苗作為主動(dòng)免疫療法被應(yīng)用于破傷風(fēng)的預(yù)防。破傷風(fēng)類毒素是用破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌菌種在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素，經(jīng)甲醛脫毒、精制并加入氫氧化鋁佐劑后制成的疫苗。類毒素接種過程中雖然消除了培養(yǎng)基成分或多次加強(qiáng)注射等引起的過敏因素，還是有一定的不良反應(yīng)發(fā)生(如類毒素疫苗制品純度不高、致敏性強(qiáng)等)， 臨床上較難推廣。而且類毒素疫苗在我國是作為計(jì)劃免疫接種的，用量很大，其質(zhì)量尤為重要，這極大限制了類毒素疫苗的應(yīng)用。破傷風(fēng)毒素毒性極強(qiáng)，作用迅速，因此破傷風(fēng)的有效預(yù)防和治療往往需要及時(shí)注射破傷風(fēng)抗毒素(Tetanus antitoxin, TAT)或破傷風(fēng)人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglulin, HTIG)。破傷風(fēng)抗毒素是用破傷風(fēng)梭狀桿菌或類毒素免疫動(dòng)物獲取而制備的免疫血清，該血清具有中和的破傷風(fēng)毒素的能力。目前我國用于臨床的破傷風(fēng)抗毒素主要為馬血清。抗毒素和毒素的中和反應(yīng)只能在毒素處于游離的狀態(tài)下才能發(fā)生，而且用抗毒素預(yù)防或治療破傷風(fēng)其成敗的關(guān)鍵在于時(shí)間。若抗毒素能趕在毒素與易感細(xì)胞或組織結(jié)合之前中和毒素，其治療效果是肯定的。然而，另一方面，破傷風(fēng)毒素抗作為異種蛋白的抗原性畢竟還未完全改變，血清過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性仍未徹底根除。尤其是我國有大量人群已使用過破傷風(fēng)抗毒素，再次使用的可能性較大，因此產(chǎn)生血清過敏的風(fēng)險(xiǎn)也更大，臨床應(yīng)用受到一定的限制。關(guān)鍵的是，抗毒素的臨床應(yīng)用效果不確實(shí)，馬血清抗毒素在體內(nèi)的半衰期短，不利于預(yù)防作用。破傷風(fēng)人血免疫球蛋白是采集經(jīng)破傷風(fēng)類毒素免疫的健康獻(xiàn)血者抗體滴度較高的抗毒素血漿制備而成的抗體，屬人源性同種蛋白，較為安全，幾乎不會(huì)發(fā)生血清病與過敏反應(yīng)。而且，該免疫球蛋白半衰期長，可達(dá)3 4周，大大提升了破傷風(fēng)的防治水平。但由于人血來源困難，價(jià)格昂貴，工業(yè)化生產(chǎn)復(fù)雜，易受病毒污染，使破傷風(fēng)人血免疫球蛋白的應(yīng)用受到了極大地限制。因此，目前主要還是由馬血清破傷風(fēng)抗毒素占領(lǐng)著市場(chǎng)。由此，利用先進(jìn)的技術(shù)，尋找更加高效的、安全的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體在本領(lǐng)域中具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種高效的、安全的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體并揭示其可變區(qū)序列，更具體為其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。本發(fā)明的另一目的在于提供一種特異性的、抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，該單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID N0:6所示的⑶R1、SEQ ID NO 8所示的⑶R2、SEQ ID NO 10所示的⑶R3 ；其輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 12 所示的 CDRl、SEQ ID NO 14 所示的 CDR2、SEQ ID NO 16 所示的⑶R3。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述單克隆抗體的⑶R序列如SEQ ID N0:6、8、10、 12、14和16所示。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO 2 所示的氨基酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的框架區(qū)內(nèi)存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為鼠源抗體、人-鼠嵌合抗體或人源化抗體，優(yōu)選人-鼠嵌合抗體，更優(yōu)選所述人-鼠嵌合抗體包含人的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū) (如人IgGl恒定區(qū))。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的可變區(qū)序列中包括前述序列的同系物或修飾物；同系物為抗體可變區(qū)的蛋白序列，其同系性達(dá)到上述序列的60%或以上、70%或以上、80%或以上；修飾物為對(duì)所述抗體的氨基酸或其核酸序列通過取代、增加或截短進(jìn)行改變的產(chǎn)物，上述單克隆抗體具有中和破傷風(fēng)類毒素的活性。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種DNA分子，其編碼包含SEQ ID NO :6、8和10 的氨基酸序列，或編碼包含SEQ ID NO :12,14或16的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述DNA分子編碼SEQ ID NO :2所示的重鏈可變區(qū)，或編碼SEQ ID NO 4所示的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述DNA分子含有SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種表達(dá)載體，它含有本發(fā)明的DNA分子序列以及與所述序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體是ρ⑶NA3. 1 (+/")。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明的DNA分子或被本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人、鼠、羊、馬、狗或貓的細(xì)胞，更優(yōu)選CHO細(xì)胞。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種疫苗組合物，其包含免疫有效量的本發(fā)明的單克隆抗體，以及免疫學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種診斷試劑盒，其包含診斷有效量的本發(fā)明的單克隆抗體或其免疫偶聯(lián)物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述免疫偶聯(lián)物具有選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素或酶。在本發(fā)明的第七方面中，提供了一種制備本發(fā)明的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的方法，所述方法包括a)提供表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有本發(fā)明的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面中，提供了本發(fā)明的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體在制備預(yù)防破傷風(fēng)感染的疫苗中的用途。在本發(fā)明的又一方面中，提供了本發(fā)明的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體在制備破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷試劑中的用途。在本發(fā)明的其它方面中，提供了一種抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，其中所述抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列同系物或修飾物；同系物為抗體可變區(qū)的蛋白序列，其同系性達(dá)到上述序列的60%或以上、70%或以上、 80%或以上；修飾物為對(duì)所述抗體的氨基酸或其核酸序列通過取代、增加或截短進(jìn)行改變的產(chǎn)物仍舊保留中和破傷風(fēng)毒素的能力。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。本發(fā)明其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了鼠源抗破傷風(fēng)類毒素單抗的純化SDS-PAGE電泳圖。圖2顯示了鼠源抗破傷風(fēng)類毒素單抗的親和力測(cè)定結(jié)果。圖3顯示了采用RT-PCR制備抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗cDNA的反應(yīng)體系和步驟。圖4顯示了抗破傷風(fēng)類毒素單抗可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，1 20 依次為實(shí)施例2中所示抗體輕鏈及重鏈上游可變區(qū)兼并引物。圖5顯示了抗破傷風(fēng)類毒素單抗6D12的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列，其中下劃線部分為CDR序列。圖6顯示了本發(fā)明表達(dá)載體pcDNA3. 1(+/_)并標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)。其中VH為抗破傷風(fēng)類毒素單抗6D12重鏈可變區(qū)基因；CH為人IgGl抗體重鏈恒定區(qū)基因；VL 為抗破傷風(fēng)類毒素單抗6D12輕鏈可變區(qū)基因；CL為人IgGl抗體輕鏈恒定區(qū)基因。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，以破傷風(fēng)類毒素為免疫原，以Balb/c小鼠為免疫對(duì)象，通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液并使之與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得可表達(dá)抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。發(fā)明人進(jìn)一步從眾多細(xì)胞株中篩選出可表達(dá)高特異性的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體。并且，本發(fā)明人還利用基因重組技術(shù)，保留鼠源抗體可變區(qū)部分，將其與人源抗體恒定區(qū)拼接，構(gòu)建抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種新的抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體，包括該抗體的基因和蛋白序列和生物功能。本發(fā)明的抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體是通過下述幾個(gè)主要步驟實(shí)現(xiàn)的1、抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單克隆抗體的制備；2、單克隆抗體可變區(qū)編碼序列的克隆與鑒定；3、人-鼠嵌合抗體表達(dá)真核載體的構(gòu)建；4、人-鼠嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)；近年來，利用基因抗體工程技術(shù)對(duì)鼠源單克隆抗體進(jìn)行改造制備的基因工程抗體不僅降低甚至消除了一種血清蛋白引起的過敏反應(yīng)，又克服了人源免疫球蛋白生產(chǎn)過程中的障礙，具有較好的發(fā)展前景。采用基因重組技術(shù)，在基因水平上對(duì)抗體分子進(jìn)行改造，形成嵌合抗體，即將鼠抗可變區(qū)基因與人IgG恒定區(qū)鏈接；人源化抗體，即將鼠抗可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)移植入人IgG的骨架區(qū)中，進(jìn)一步降低了鼠抗引起的免疫反應(yīng)；完全人源抗體，該類抗體不含任何外來基因，不會(huì)造成過敏反應(yīng)，是目前基因工程抗體研究的熱點(diǎn)之一。本發(fā)明建立一種既具有高特異性、高效價(jià)、能中和破傷風(fēng)毒素，又能降低或基本消除異種蛋白引起的過敏反應(yīng)的單抗，以用于治療。以破傷風(fēng)類毒素作為免疫原，采用雜交瘤技術(shù)制備抗破傷風(fēng)類毒素單克隆雜交瘤細(xì)胞株，并制備其抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗。由于鼠源單抗作為異種蛋白的抗原性仍異常強(qiáng)烈，可能會(huì)引起強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)而限制其臨床應(yīng)用。采用基因工程抗體技術(shù)對(duì)鼠抗進(jìn)行改造構(gòu)建嵌合抗體，該抗體不僅具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，且極大降低了其異種蛋白的抗原性。利用基因過程抗體生產(chǎn)嵌合抗體、人源化抗體的技術(shù)已趨于成熟，且大量產(chǎn)品以市場(chǎng)化。這為抗破傷風(fēng)基因工程抗體的制備提供了有力的前提條件。
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如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成” 屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體(單克隆抗體)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外， 單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。 修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。 每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。本文所用的術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中。可變區(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè) FR區(qū)，它們大致上呈β -折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R—起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等，NIH Publ. No. 91-3242，卷I，647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。本發(fā)明還提供了抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的氨基酸序列及其可變區(qū)鏈，以及具有這些鏈的其它蛋白質(zhì)或融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)， CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合
7表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述，稱為超變區(qū)域(CDR)，將該段間隔成4個(gè)框架區(qū)域(FR)，4個(gè)FR的氨基酸序列相對(duì)比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應(yīng)輕鏈上的⑶R構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了 FR或CDR區(qū)域。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab’ )2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature, 256 :495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No. 4，816，567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature, 352 624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離獲得。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明單克隆抗體中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該DNA分子含有SEQ ID NO=I所示的編碼所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :3所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。在獲得上述編碼本發(fā)明的單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列后， 通?？赏ㄟ^以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也能預(yù)計(jì)到，將編碼本發(fā)明單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別插入不同的表達(dá)載體中進(jìn)行共表達(dá)也能獲得本發(fā)明的單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列，，通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。 例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點(diǎn)將這些核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，使它們分別在表達(dá)載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們?cè)谕蛔x框內(nèi)。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購自Qiagen和!Iomega公司的表達(dá)載體，以及其它可獲得的表達(dá)載體，如PMG18(《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)的工具開 M)) "Development of Tools for Environmental Monitoring Based on INCP-9Plasmids Sequences" . A. Greated, R. Krasowiak, M. Titok, C. M. Thomas, 1992 年出版，具體載體圖見該書第143頁)。隨后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞?！八拗骷?xì)胞”一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系來作為表達(dá)真核細(xì)胞衍生多肽的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)物中的繁殖是本領(lǐng)域熟知的。見《組織培養(yǎng)》，Academic Press, Kruse and Patterson編輯(1973)，該文納入本文作為參考。較佳的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是許多可購得的無限增殖細(xì)胞系。這些無限增殖細(xì)胞系包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK) 細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如H印G2)和其它許多細(xì)胞系。它們?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后修飾，包括正確的折疊、正確的二硫鍵形成以及正確位點(diǎn)的糖基化。盡管在下文實(shí)施例中，本發(fā)明僅列舉了以CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的例子，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例可以知道，本發(fā)明也能采用上述這些細(xì)胞系。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1，5- 二氮i^一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。例如可采用^vitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染諸如CHO細(xì)胞等宿主細(xì)胞。然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-kpharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的人源抗EGFR單克隆抗體。所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)(如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來測(cè)定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal. Biochem.，107 =220(1980)的katchard分析來測(cè)定。另一方面，本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療破傷風(fēng)的疫苗組合物，該組合物含有免疫有效量的本發(fā)明單克隆抗體以及免疫學(xué)上可接受的載體。在較佳的實(shí)施方案中，該組合物中還可含有與本發(fā)明的單克隆抗體偶聯(lián)的其它標(biāo)記或治療部分。本文所用的術(shù)語“免疫學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、 過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的單克隆抗體相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低單克隆抗體或疫苗組合物的藥效。作為免疫學(xué)上可接受的載體的具體例子包括但不限于糖類，如葡萄糖和蔗糖； 淀粉，如玉米淀粉；纖維素及其衍生物，如乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽； 明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ；調(diào)味劑；穩(wěn)定劑； 抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。使用疫苗組合物時(shí)，其安全有效量可為常規(guī)用量。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。本發(fā)明的單克隆抗體還可用于制備破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷試劑盒，從而用于有效診斷破傷風(fēng)細(xì)菌的感染。例如所述診斷試劑盒中可包括檢測(cè)條，其含有本發(fā)明的單克隆抗體或其偶聯(lián)物、或它們與可檢測(cè)標(biāo)記物的結(jié)合物。所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自膠體金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記，優(yōu)選所述酶標(biāo)記為HRP酶標(biāo)。本發(fā)明的診斷試劑盒所針對(duì)的生物樣品可以是獲自患者的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織、體液、血液、或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液等適于檢測(cè)的各種形式存在，例如在結(jié)合免疫組織化學(xué)的檢測(cè)中，優(yōu)選采用石蠟切片標(biāo)本?？筛鶕?jù)多種檢測(cè)原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測(cè)所需的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，“試劑組”是指包含了檢測(cè)所需的多種試劑的試劑組合。此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對(duì)照物(包括陽性或陰性對(duì)照)、使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體情況對(duì)其進(jìn)行選擇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明中制備了高特異性抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，并利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體，其基因和蛋白質(zhì)序列與現(xiàn)有報(bào)道不同，該抗體具有較高的中和破傷風(fēng)毒素的能力。通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明，該抗體可保護(hù)動(dòng)物抵御破傷風(fēng)毒素的攻擊。此外，該抗體作為藥物與國內(nèi)現(xiàn)有抗體比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、極大降低過敏反應(yīng)目前國內(nèi)使用的馬血清抗體，容易誘發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。而此抗體是經(jīng)基因重組技術(shù)改造構(gòu)建的抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合單克隆抗體，極大降低了過敏反應(yīng)。2、較高的效價(jià)該抗體具有較高的中和毒素的能力。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的抗體可完全保護(hù)小鼠抵御致死劑量的破傷風(fēng)毒素的攻擊。本發(fā)明經(jīng)基因重組技術(shù)大大降低了異種蛋白的抗原性，但由于嵌合抗體仍保留部分鼠源抗體可變區(qū)的異源性，可對(duì)嵌合抗體進(jìn)一步人源化。本發(fā)明克服了現(xiàn)有產(chǎn)品存在的缺點(diǎn)，提供了一種嵌合抗破傷風(fēng)類毒素單抗的制備和應(yīng)用，不僅克服了目前臨床使用的抗破傷風(fēng)毒素(主要為馬抗破傷風(fēng)毒素抗血清)引起的人體過敏反應(yīng)，而且利用基因重組技術(shù)所制備的單抗克服了動(dòng)物病毒感染病人的危險(xiǎn)性。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(例如可參考通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(同上)中所述的條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單克隆抗體的制備
一、抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備1、免疫原購自上海生物制品研究所生產(chǎn)部的破傷風(fēng)類毒素。2、免疫 BalbA^JnIlBalb/c小鼠購自上海斯萊克公司，所有免疫用Balb/c小鼠均為3周齡、雌性、標(biāo)準(zhǔn)化無病、健康的純種小鼠，符合美國FDA標(biāo)準(zhǔn)。3、Balb/c小鼠免疫方法第一次免疫將50μ gO50l·! 1)抗原與250 μ 1鋁佐劑混勻，配置成500 μ 1溶液， 注射于Balb/c小鼠皮下多點(diǎn)及足掌。第二次免疫距第一次免疫間隔三周后，同法同劑量進(jìn)行第二次免疫。第三、四次免疫距第二次免疫間隔二周后，同法同劑量進(jìn)行第三、四次免疫。四次免疫后小鼠尾靜脈采血，采用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)測(cè)定血清抗體滴度，待血清滴度> IO5以上時(shí)(為3. 3X IO6)，準(zhǔn)備做細(xì)胞融合。細(xì)胞融合前三天進(jìn)行加強(qiáng)免疫小鼠尾靜脈注射抗原20 μ g(100 μ 1)。4、細(xì)胞融合Sp2/0-Agl4小鼠骨髓瘤細(xì)胞購自美國ATCC公司。(1)融合前一天換液，使Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞保持良好生長狀態(tài)。(2)脾細(xì)胞取免疫小鼠，放血，斷頸猝死，于75%酒精浸泡3-^iin。無菌條件下取出小鼠脾臟，放入15ml離心管中，加入少許無血清RPM 1640培養(yǎng)液，用移液管輕輕吹打， 碾碎，直至沒有組織結(jié)塊、細(xì)胞均勻?yàn)橹埂Ｈ缓?，用無血清RPM 1640培養(yǎng)液洗滌小鼠脾臟細(xì)胞三次，計(jì)數(shù)備用。(3)取對(duì)數(shù)生長期的Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞，無血清RPM 1640培養(yǎng)液洗滌三次， 計(jì)數(shù)備用。(4)將小鼠脾臟細(xì)胞和Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞以10 1的比例混合，1500rpm離心 7min。洗去上清液，準(zhǔn)備融合。(5) 一分鐘內(nèi)緩緩加入Iml PEG(1450)，輕搖90sec ；再在2. 5min中內(nèi)加入5ml無血清RPM 1640培養(yǎng)液，最后再加入5ml無血清培液終止反應(yīng)，靜置5min后，1280rpm離心 8min，棄去上清，加入常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，制備成細(xì)胞懸液。(6)將上述細(xì)胞懸液以每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度種入96孔板，每孔200 μ 1，置于 37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24h后，更換含有HAT(25X)的常規(guī)RPM1640培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。培養(yǎng)14d后用ELISA法檢測(cè)各個(gè)克隆細(xì)胞的上清液篩選抗破傷風(fēng)類毒素抗體的陽性克隆。5、細(xì)胞篩選與亞克隆首先使用含有HAT的常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)篩選，培養(yǎng)7d后，改用HT的常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液培，進(jìn)行再次培養(yǎng)篩選。培養(yǎng)14d后，用ELISA方法以各個(gè)克隆細(xì)胞的上清液篩選抗破傷風(fēng)類毒素抗體的陽性克隆。采用有限稀釋法，將細(xì)胞懸液稀釋至60個(gè) /ml，于96孔板中每孔加100 μ 1 (約6個(gè)細(xì)胞/孔)。接種2排，剩余細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排。重復(fù)一次。置37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每隔2 3天，更換1/2培養(yǎng)液。培養(yǎng)約IOd后，選擇單個(gè)克隆生長的陽性孔進(jìn)行第二次篩選和亞克隆。連續(xù)三次亞克隆后，經(jīng)ELISA法檢測(cè)抗體陽性率為100%時(shí)確定為穩(wěn)定表達(dá)目的抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保種建庫。6、單克隆抗體的類型鑒定經(jīng)篩選，獲得一株抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，命名為6D12。采用Sigma 抗體亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)該抗體的類型進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定(結(jié)果如表1所示)，抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體6D12的類型為=IgGl亞型，Kappa(K)。
“抗體亞型 IgGl IgG2a IgG2b IgG3 IgAIgM
6D121.854 0.295 0:397 0.331 0.418 0.464鼠源抗破傷風(fēng)類毒素單抗6D12的純化SDS-PAGE電泳圖如圖1所示。采用常規(guī)ELISA法測(cè)定抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體6D12的親和力，其親和常數(shù)為 3. 9X IO8M-1 (如圖 2 所示)。實(shí)施例2、抗破傷風(fēng)類毒素單抗可變區(qū)編碼序列的克隆和鑒定以實(shí)施例1中篩選所得抗破傷風(fēng)類毒素雜交瘤細(xì)胞株(6D12)cDNA為模板，利用 PCR技術(shù)，克隆抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗可變區(qū)基因；經(jīng)測(cè)序，選取無突變無終止密碼子的序列，采用5’ RACE技術(shù)克隆出功能性\和Vh基因。一、抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗可變區(qū)編碼序列的克隆(一 )從雜交瘤細(xì)胞株中提取抗破傷風(fēng)類毒素單抗的總RNA用上海飛捷生物公司FAST1000試劑盒提取。(1)取4X IO5雜交瘤細(xì)胞，IOOOrpmX 3min，棄上清。用PBS洗滌一次。將細(xì)胞重懸于100 μ IPBS中，放入離心管內(nèi)。(2)加入RBl液1ml，充分顛倒混勻直至完全溶解，室溫放置5min。(3)加入RB2液500 μ 1，充分顛倒混勻Imin。將混勻后的液體吸入或直接倒入內(nèi)套管中離心lmin。(4)棄去外套管中液體，內(nèi)套管中加入500 μ 1洗液，離心lmin，再重復(fù)一次。(5)取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，離心lmin。(6)將內(nèi)套管移入新的離心管中，在膜中央加入洗脫液40μ1，室溫靜置lmin，獲得總RNA。(以上槍頭、離心管和無菌水均用DEPC處理，經(jīng)121°C滅菌20min。)(二)RT-PCR制備抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗cDNA以總RNA為模板，Oligo (dT) 18為引物，RT-PCR擴(kuò)增抗破傷風(fēng)類毒素單抗cDNA。反應(yīng)體系和步驟如圖3所示。(三)抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗可變區(qū)基因的克隆A、兼并引物的合成根據(jù)抗體信號(hào)肽及骨架區(qū)基因的保守性，設(shè)計(jì)并合成以下兼并引物(以下引物中 W = A/T, K = G/T, R = A/G, Y = C/T, M = A/C, S = C/G, N = C/G/T, V = A/C/G)(1)輕鏈上游可變區(qū)兼并引物(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的1-6)根據(jù)信號(hào)肽序列設(shè)計(jì) (5， -3，)1、VLFWDl (SEQ ID No. 17)GAATTCCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT
2、VLFWD2(SEQ ID No. :18)GAATTCCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3、VLFWD3(SEQ ID No. :19)GAATTCCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA4、VLFWD 4 (SEQ ID No. 20)GAATTCCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT5、VLFWD 5 (SEQ ID No. 21)GAATTCCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG根據(jù)FRl保守序列設(shè)計(jì)(5’ -3’ )6、MKac-Fwd (SEQ ID No. 22) GAYATTGTGMTSACMCARffCTMCA(2)輕鏈下游兼并引物(5’ -3’ )MKac-Rev(SEQ ID No. 23) :GGATACAGTTGGTGCAGCATC(3)重鏈上游兼并引物根據(jù)信號(hào)肽序列設(shè)計(jì)(5’ -3’)(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的 7-13)7、MuIgVHDl(SEQ ID No. 24) :ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT8、MuIgVHD2(SEQ ID No. 25) =ATGGRCAGRCTTACffTYYTCATTCCT9、MuIgVHD3(SEQ ID No. :26) :ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACC10、MuIgVHFl(SEQ ID No. :27) :ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTTll、MuIgVHF2(SEQ ID No. :28) :ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT12、MuIgVHF3(SEQ ID No. :29) :ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG13、MuIgVHF4(SEQ ID No. :30)ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(4)重鏈上游兼并引物根據(jù)FRl保守序列設(shè)計(jì)(5’ _3’ )(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的 14-20)14、MHFR-Fwd-I (SEQ ID No. 31) SARGTNMAGCTGSAGSAGTC15、MHFR-Fwd-2(SEQ ID No. 32) SARGTNMAGCTGSAGSAGTCffGG16、MHFR-Fwd-3(SEQ ID No. 33) CAGGTTACTCTGAAAGffGTST17、MHFR-Fwd-4(SEQ ID No. :34) GAGGTCCARCTGCAACARTC18、MHFR-Fwd-5(SEQ ID No. 35) GAGGTCCAACTVCAGCARCC19、MHFR-Fwd-6(SEQ ID No. :36) :AGAGTGAASSTGGTGGAATC20、MHFR-Fwd-7(SEQ ID No. :37) GATGTGAACTTGGAAGTGTC(5)重鏈下游兼并引物MHCC-Rev(SEQ ID No. 38) :ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGCB、可變區(qū)基因的克隆以上述兼并引物和已制備抗破傷風(fēng)類毒素單抗cDNA為模板，PCR擴(kuò)增抗破傷風(fēng)類毒素鼠源單抗可變區(qū)基因。(I)PCR體系和參數(shù)設(shè)置如下_試劑體積(μ )
13
_IOX 緩沖液5Mg2+(25mmol/l) 2IOmM dNTP Mix 1P-Fwd1P-Rev1模板 cDNA1Tag DNA 聚合酶 1ddH2038總量50/樣品_PCR參數(shù)設(shè)置95°C，預(yù)變性，5min ；30輪如下循環(huán)95°C變性，0. 5min，65°C復(fù)性， 0. 5min，72°C延伸，0. 5min ；72°C延伸，IOmin0(2)用的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，并與DNA分子量標(biāo)記LD2000判斷擴(kuò)增片段的大小(如圖4所示)。結(jié)果顯示分別有5條兼并引物(分別為1、2、3、5、6兼并引物)擴(kuò)增出輕鏈可變區(qū)基因，有4條兼并引物(分別為12、15、17、19兼并引物)擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)基因，其大小約為330bp左右，條帶單一，與輕/重鏈可變區(qū)基因片段的理論大小基本一致。采用博大泰克公司的膠回收試劑盒回收330bp處的單抗可變區(qū)PCR擴(kuò)增片段，并連接于PMD 18T克隆載體(購自Takara公司)上，轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中， 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送hvitrogen公司測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)NCBI IgBLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)免疫球蛋白基因比對(duì)分析結(jié)果，篩選出功能性抗體可變區(qū)基因，設(shè)計(jì)抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)下游引物TT6D12-L-Rev(SEQ ID NO :39) :TCTAGACTAGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGAT TTCCAGTTTTT6D 1 2-H-Re V (SEQ ID NO 40) T C T AG A C T A GGG G A AG A C CG A T G GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT采用5’RACE擴(kuò)增出可變區(qū)5’端的序列。最終獲得抗破傷風(fēng)類毒素單抗的功能性可變區(qū)基因。在6D12雜交瘤細(xì)胞株中，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3分別是抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列；SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4分別是上述DNA編碼序列相應(yīng)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID N0s:5、7和9分別為重鏈的CDRl、CDR2和CDR3編碼序列。SEQ ID NOs 11、13和15分別為輕鏈的CDRl、 ⑶R2和⑶R3編碼序列。圖5顯示了 6D12單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)核苷酸及氨基酸序列， 其中下劃線部分顯示了⑶R部分。^mm 3、抗破傷風(fēng)類毒素人-uM^^MM^ma^mmmw利用重疊PCR技術(shù)將輕鏈\基因與人Ig的Q基因進(jìn)行拼接，構(gòu)成輕鏈嵌合基因；輕鏈5’端引入BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，輕鏈3’端引入EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。同理，構(gòu)建重鏈嵌合基因。分別將上述輕鏈/重鏈基因插入PCDNA3. 1(+/_)表達(dá)載體(購自hvitrogen公司)的單克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合抗體的表達(dá)載體。(1)按常規(guī)方法設(shè)計(jì)上下游物，利用PCR技術(shù)分別于重鏈/輕鏈可變區(qū)基因5’端引入BamHI單酶切位點(diǎn)，在重鏈/輕鏈恒定區(qū)基因3’端引入EcoR I單酶切位點(diǎn)。BamHI和 EcoRI雙酶切重鏈/輕鏈嵌合基因，切膠回收目的片段。(2)pcDNA3. 1 (+/-)真核表達(dá)載體的處理BamHI 和 EcoRI 雙酶切 pcDNA3. 1 (+/-) 載體，切膠回收目的片段( 5400bp)。(3)將⑴中抗體重鏈/輕鏈基因分別克隆到(2)中pcDNA3. 1 (+/-)載體的BamHI 和EcoRI位點(diǎn)。(4)用上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，小量抽提重組質(zhì)粒DNA。挑選插入目的片段的陽性克隆送上海hvitrogen公司測(cè)序鑒定。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，驗(yàn)證本發(fā)明構(gòu)建的抗破傷風(fēng)類毒素單抗重鏈/輕鏈的重組表達(dá)載體其序列正確。該表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)如圖6所示。棚列4、_· *λ - ■純碰CHO 采用脂質(zhì)體法將抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合抗體重鏈/輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO/ dhfr—細(xì)胞(購自ATCC)，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空細(xì)胞對(duì)照。培養(yǎng)48Κ7 !后，采用常規(guī)ELISA 法，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體檢測(cè)抗破傷風(fēng)類毒素人-鼠嵌合抗體的表達(dá)及嵌合抗體對(duì)破傷風(fēng)類毒素抗原的特異性識(shí)別。鑒定結(jié)果如表1所示
權(quán)利要求
1.一種抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 6 所示的 CDRl ；SEQ ID NO 8 所示的 CDR2 ；SEQ ID NO 10 所示的 CDR3,所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 12 所示的 CDRl ；SEQ ID NO 14 所示的 CDR2 ；SEQ ID NO 16 所示的 CDR3。
2.如權(quán)利要求1所述的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的 CDR 序列如 SEQ ID NO :6、8、10、12、14 和 16 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
4.一種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子編碼包含SEQ ID NO :6、8和10的氨基酸序列，或編碼包含SEQ ID NO 12,14或16的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子含有SEQIDNO 1或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的DNA分子序列以及與所述序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的DNA分子或被權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
8.一種疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包含免疫有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，以及免疫學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。
9.一種診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含診斷有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其免疫偶聯(lián)物。
10.一種制備權(quán)利要求1所述的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體的方法，所述方法包括a)提供表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求4所述的DNA分子序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合所述單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體、其制備方法及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有SEQ ID NO6所示的CDR1；SEQ ID NO8所示的CDR2；和/或SEQ ID NO10所示的CDR3，其輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有SEQ ID NO12所示的CDR1；SEQID NO14所示的CDR2；SEQ ID NO16所示的CDR3。本發(fā)明還提供了編碼所述序列的DNA分子、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102453091SQ20101051241
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者于漢卿, 張燕燕, 梁紅遠(yuǎn), 瞿愛東, 祝婧燁 申請(qǐng)人:上海生物制品研究所有限責(zé)任公司