一種羔羊痢疾b型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法；是將B型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境條件下38℃14h培養(yǎng)增菌;將上述培養(yǎng)物加入到由緩沖液溶解的胰蛋白胨、糊精、酵母浸膏、L-精氨酸培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境下振蕩培5h，然后4℃15min3800g離心，蔡氏濾器中過濾除菌;將滅活好的類毒素按1:1比例加入滅菌的白油佐劑，并加入0.01%硫柳汞，即得類毒素疫苗。該疫苗無毒副作用，效價高，免疫力強，能有效預(yù)防、控制由B型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羔羊痢疾、綿羊、山羊、駒及犢牛的腸毒血癥或壞死性腸炎。
【專利說明】一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。
[0002](二)發(fā)明背景
[0003]B型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羔羊痢疾、綿羊、山羊、駒及犢牛的腸毒血癥或壞死性腸炎，主要致病毒素為α、β、ε毒素。由β_毒素引起的壞死性腸炎，一般認為是由于食物中的胰蛋白酶阻止了腸道中該毒素的分解，從而導(dǎo)致該病的發(fā)生。此外，該毒素可能還是一種神經(jīng)毒素。而B型毒素的分泌量少，它則可促使動物的主動脈和其它動脈收縮而導(dǎo)致血壓升高；此外，還具有與血腦屏障內(nèi)血管上皮受體結(jié)合的能力，從而引起血管通透性增高,最終導(dǎo)致致死性水腫,但ε -毒素不耐熱(Mcdonel, 1986)。
·[0004]多年來，我國生產(chǎn)中使用的是滅活菌苗，早在1989年，陳錫全等已經(jīng)開展了 “兔病毒性出血癥和A型魏氏梭菌聯(lián)苗”的研究并且取得成功；恪承剛等(1991)研制兔的魏氏梭菌單苗，對實驗動物可以產(chǎn)生82.01%的保護率；魯承(1997)等對兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二聯(lián)苗進行了研究；楊瑛(1997)對A型魏氏梭菌氫氧化鋁滅活苗進行研究，疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保護小鼠、兔和豬抵抗標(biāo)準(zhǔn)A型IMLD毒素的攻擊；姚湘燕等(1998)采用三個不同來源的牛源魏氏梭菌分離株研制牛魏氏梭菌濃縮AL(OH)3滅活苗；王克領(lǐng)(1998)等對兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏桿菌病三聯(lián)苗進行了研究；譚詩文等(2000)進行了羔羊痢疾、羊腸毒血癥、大腸桿菌病、羊猝狙四聯(lián)油佐劑滅活苗的研制。這些菌苗對該病的預(yù)防有一定的效果，同時也存在一些不足:最關(guān)鍵地是疫苗中的有效成分主要為菌體抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體只能夠中和菌體抗原，卻難以中和毒素抗原，與家畜“猝死癥”致病機理不全相符。因此，滅活菌苗的有效性還存在一些質(zhì)疑。
[0005]柴同杰(2001)對家畜“猝死癥”致病機理的研究發(fā)現(xiàn):在某種應(yīng)激狀態(tài)下，動物腸道中微生態(tài)平衡破壞，使魏氏梭菌呈‘爆炸性’的繁殖，瞬間產(chǎn)生大量的外毒素，腸粘膜通透性的升高使得毒素或細菌+毒素進入血液循環(huán)引起毒血癥(有時伴有菌血癥)，從而導(dǎo)致重要器官的衰竭，造成動物死亡；由此，進一步提出，“魏氏梭菌感染致病以及動物快速死亡的主要原因是腸源性毒血癥，預(yù)防的關(guān)鍵在于針對毒素引起的毒血癥，疫苗的抗原成分應(yīng)是相應(yīng)的類毒素”的學(xué)說。
[0006]B型產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā)的羔羊痢疾等疾病發(fā)病急，死亡快，有時癥狀不太明顯并且根本來不及治療。要從根本上控制本病的傳播，減少或避免經(jīng)濟損失，必須采取切實有效的預(yù)防措施。產(chǎn)氣莢膜梭菌形成的主要外毒素的化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，具有較好的免疫原性。因此，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病機理，制備產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素，將其滅活后做成類毒素疫苗，用于畜禽預(yù)防。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明發(fā)明提供了一種效價全、免疫力強、針對性好、無毒副作用的羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，用于動物的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌病特別是羔羊痢疾的預(yù)防，控制羔羊痢疾等B型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行。[0008]羔羊痢疾等B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0009]IB型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上在厭氧環(huán)境(氣體的組成為85%氮氣9%氫氣6% 二氧化碳)下37 °C 46h復(fù)蘇。
[0010]2B型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境(氣體的組成為85%氮氣9%氫氣6%二氧化碳)下38°C 14h培養(yǎng)增菌。
[0011]3將8ml上述培養(yǎng)物加入到產(chǎn)毒培養(yǎng)基海IOOmlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2rL-精氨酸)中，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，221擺/min，38°C培養(yǎng)5h，然后在4°C 3800g離心15min，再用孔徑0.22 μ m的蔡氏濾器中過濾除菌，即得外毒素溶液。
[0012]4在外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比為0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，置370C 48h滅活，間隔5-6h振搖一次，得到滅活好的類毒素溶液。
[0013]5在類毒素溶液中按1:1體積比加入滅菌的白油佐劑乳化，每100毫升乳化液中加Λ 0.01克硫柳汞制得B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗；
[0014]所述白油佐劑 構(gòu)成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液體積比2%的Tween-20和質(zhì)量比1%的硬脂酸鋁；
[0015]所述的血平板培養(yǎng)基成分為:100毫升蒸餾水、3.7g豆粉瓊脂、Ig葡萄糖和5%體積比綿羊血；
[0016]所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為:每IOOmlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2rL-精氨酸；
[0017]所述的PBS緩沖液成分為:IL去離子水、8g NaCU0.2g KC1、3.58gNa2HPO4.12Η20、0.27g ΚΗ2Ρ04。
[0018]使用時，肌肉注射，一次5毫升。
[0019]有益效果
[0020]該疫苗無毒副作用，效價高，免疫力強，能有效預(yù)防、控制由B型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羔羊痢疾、綿羊、山羊、駒及犢牛的腸毒血癥或壞死性腸炎，能為養(yǎng)殖業(yè)減少損失，帶來可視性利益。
(四)【具體實施方式】
[0021]實施例1疫苗制備的詳細過程
[0022]首先，制備菌液。B型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種NCTC6121 (National Collection of TypeCultures-英國微生物菌種保藏中心保藏保藏號:NCTC6121)挑取一環(huán)(約3 μ I)接種于血平板培養(yǎng)基(100ml蒸餾水、3.7g豆粉瓊脂、Ig葡萄糖、5毫升綿羊血)厭氧環(huán)境(各氣體濃度為85% N2、9% H2、6% CO2) 37°C 46h復(fù)蘇。挑取一個B型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基FT (青島日水生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))中，在氣體濃度為85% N2,9% H2,6% CO2的厭氧環(huán)境條件下38°C 14h培養(yǎng)增菌。
[0023]將上述培養(yǎng)物加入到自制的產(chǎn)毒培養(yǎng)基(每IOOmlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸)中，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，221擺/min，38°C 5h，4°C 15min3800g離心，再用孔徑0.22μπι的蔡氏濾器中過濾除菌，即得外毒素，將所制備的外毒素加入甲醛使甲醛終濃度達到0.3%，充分振蕩混勻，置37°C 48h滅活，間隔5-6h振
搖一次。[0024]在滅活好的類毒素溶液中按1:1體積比加入滅菌的白油佐劑，加入硫柳汞(每100毫升類毒素溶液中和白油佐劑疫苗混合液中加入0.01克硫柳汞)，即得類毒素疫苗。使用時，肌肉注射，一次5毫升。
[0025]實施例2疫苗安全性及效果的驗證
[0026]最小致死量的確定用體重30kg的健康綿羊12只，隨機分成四組,分別注射5ml、7ml、9ml、I Iml制備的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素，一天后，注射5ml和7ml外毒素的綿羊發(fā)生腹瀉但不死亡，注射9ml和Ilml毒素的綿羊嚴(yán)重腹瀉后死亡，因而確定9ml為綿羊最小致死量。
[0027]安全性檢驗取1.5kg健康兔4只，分別肌肉接種5ml所制備的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗，連續(xù)觀察10·天。局部無肉芽腫等不良反應(yīng)，全身亦無異常反應(yīng)。(參照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》)
[0028]使用劑量的確定用體重為30kg的健康綿羊12只，隨機分為四組，分別注射4、5、6、7ml所制備的疫苗，18d后四組均注射9ml的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素，觀察3d，注射5、
6、7ml疫苗的綿羊均不死亡，并且無羔羊痢疾的癥狀，因而，免疫劑量定為5ml。
[0029]免疫效力檢驗用體重30kg的健康綿羊6只,其中4只肌肉注射5ml制備的類毒素疫苗，另外兩只不注射類毒素疫苗作為對照組。18d后，6只綿羊均注射9ml的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素。24h后，對照組的2只綿羊嚴(yán)重腹瀉并死亡，而免疫過的綿羊均不死亡，并且繼續(xù)觀察3d，無羔羊痢疾等發(fā)病癥狀。說明該疫苗對綿羊的保護力達到了 100%。
【權(quán)利要求】
1.一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)B型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上在厭氧環(huán)境下37°C46h復(fù)蘇； 2)復(fù)蘇后的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境下38 0C 14h培養(yǎng)增菌； 3)將步驟2)增菌培養(yǎng)物按照接種量8%體積比接種產(chǎn)毒培養(yǎng)基，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，38°C培養(yǎng)5h，然后在4°C 3800g離心15min，蔡氏濾器過濾除菌，得到外毒素溶液； 4)在外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比為0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，置37°C 48h滅活，間隔5-6h振搖一次，得到滅活好的類毒素溶液； 5)在類毒素溶液中按1:1體積比加入滅菌的白油佐劑乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗； 所述白油佐劑構(gòu)成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液體積比2%的Tween-20和質(zhì)量比1%的硬脂酸鋁； 所述的血平板培養(yǎng)基成分為:100毫升蒸餾水、3.7g豆粉瓊脂、Ig葡萄糖和5%體積比綿羊血； 所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為:每IOOmlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸； 所述的 PBS 緩沖液成分為:1L 去離子水、8g NaCU0.2g KCl,3.58g Na2HPO4.12H20、0.27g KH2PO4。
【文檔編號】A61P31/04GK103432579SQ201310416012
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】柴同杰, 劉雪慧, 王海榮 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)