專利名稱：去甲二氫愈創(chuàng)木酸在制備抗腫瘤干細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新應(yīng)用，特別涉及去甲二氫愈創(chuàng)木酸(簡(jiǎn)稱NDGA)在制備抗 腫瘤干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱CSC)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展取決于一小部分具有自我更新和多向分化 能力的腫瘤細(xì)胞群體，即CSC亞群，其它絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均由這一小群細(xì)胞分化而來(lái)并 導(dǎo)致了腫瘤組織在形態(tài)和功能上的異質(zhì)性，CSC才是腫瘤發(fā)生的根源和始動(dòng)細(xì)胞。這一研 究發(fā)現(xiàn)對(duì)于開發(fā)更有效的抗腫瘤治療新方案具有重要意義。缺乏CSC靶向性的抗腫瘤治療 方案雖然能夠短期內(nèi)殺死大量分化型腫瘤細(xì)胞(簡(jiǎn)稱non-CSC)，使得腫瘤體積消退，卻無(wú) 法避免治療停止后腫瘤復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處播散。因此，惡性腫瘤的治療效果主要取決于所采用的 治療方案對(duì)CSC的根除效率。目前已成功從胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤中分離得到了 CSC。研究 顯示，與non-CSC相比，CSC對(duì)放療和化療具有更強(qiáng)的抵抗能力，這一生存優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致CSC在 惡性腫瘤治療抵抗和復(fù)發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)也使得探索針對(duì)CSC、抑制其增殖或者誘導(dǎo) 其分化的藥物具有極大的臨床價(jià)值。NDGA是一種從植物中提取出的天然藥物成分。既往研究表明，NDGA具有抗腫瘤作 用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。但迄今為止，NDGA是否具有抗CSC的作用尚 未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于確認(rèn)NDGA是否具有抗CSC的作用，在制備抗CSC的 藥物方面有無(wú)應(yīng)用可能性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明進(jìn)行了以下研究①通過(guò)干細(xì)胞培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞Hu-7、肺癌細(xì)胞A549、 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的CSC，使用CCK-8試劑盒檢測(cè) NDGA處理對(duì)CSC增殖的影響。結(jié)果顯示NDGA能夠顯著抑制胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺 癌和膠質(zhì)瘤CSC的增殖。②通過(guò)干細(xì)胞培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U87皮下移植瘤細(xì)胞中的CSC，采用免疫熒 光染色觀察移植瘤組織中花生四烯酸-5-脂氧化酶(簡(jiǎn)稱AL0X-5)和干細(xì)胞標(biāo)志物nestin 的共表達(dá)情況；采用Western-blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤CSC和non-CSC的AL0X-5蛋白表達(dá)水平； 采用定量RT-PCR法檢測(cè)膠質(zhì)瘤CSC和non-CSC的AL0X-5 mRNA表達(dá)水平；使用脂氧化酶 抑制劑篩選試劑盒檢測(cè)NDGA對(duì)AL0X-5活性的抑制效率；使用CCK-8試劑盒檢測(cè)NDGA和 AL0X-5的產(chǎn)物白三烯B4 (簡(jiǎn)稱LTB4)處理對(duì)膠質(zhì)瘤CSC增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)NDGA處理對(duì)移植瘤⑶133+細(xì)胞比例的影響；采用梯度稀釋法檢測(cè)NDGA處理對(duì)移植瘤 細(xì)胞成球能力的影響；采用免疫熒光染色觀察NDGA處理對(duì)膠質(zhì)瘤CSC表達(dá)星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的影響；采用半定量RT-PCR法檢測(cè)NDGA處理導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤CSC目的基因mRNA表 達(dá)變化；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NDGA處理對(duì)膠質(zhì)瘤CSC細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤 CSC較non-CSC表達(dá)更高水平的AL0X-5，NDGA能夠明顯抑制AL0X-5的活性，且此效應(yīng)介導(dǎo) 了 NDGA對(duì)CSC增殖的抑制作用；NDGA處理能夠選擇性去除體外培養(yǎng)的U87移植瘤細(xì)胞中 的CSC ；NDGA處理呈時(shí)間和劑量依賴性的促進(jìn)膠質(zhì)瘤CSC表達(dá)GFAP，降低其自我更新相關(guān) 基因轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致其細(xì)胞周期發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，誘導(dǎo)CSC向星形細(xì)胞表型分化。③從膠質(zhì)瘤U87皮下移植瘤細(xì)胞中篩選CSC并注射至裸鼠皮下，構(gòu)建膠質(zhì)瘤CSC 始動(dòng)的移植瘤模型，采用NDGA體外預(yù)處理CSC和CSC成瘤后NDGA體內(nèi)治療兩種方案，通過(guò) 檢測(cè)移植瘤體積，流式細(xì)胞術(shù)分析移植瘤CD133+細(xì)胞比例，梯度稀釋法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞成 球能力，免疫熒光染色法觀察移植瘤干細(xì)胞標(biāo)記物、增殖指數(shù)和分化細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)比 例，綜合評(píng)價(jià)NDGA對(duì)CSC始動(dòng)的膠質(zhì)瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的干預(yù)作用。結(jié)果顯示NDGA體外預(yù)處 理CSC能顯著抑制其在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力；CSC成瘤后NDGA體內(nèi)治療能明顯抑制移植瘤 的生長(zhǎng)，與經(jīng)典膠質(zhì)瘤化療藥物卡莫司汀(簡(jiǎn)稱BCNU)相比，NDGA抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)持 續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)；NDGA治療呈劑量依賴性降低移植瘤CD133+細(xì)胞比例，而BCNU治療則顯著地富 集了⑶133+細(xì)胞；NDGA治療組移植瘤細(xì)胞成球能力顯著低于對(duì)照，而BCNU治療組使移植瘤 中具有成球生長(zhǎng)能力的細(xì)胞大幅增加；NDGA治療組的移植瘤干細(xì)胞標(biāo)記物和增殖指數(shù)明 顯低于對(duì)照，分化細(xì)胞標(biāo)記物上調(diào)，而BCNU治療組導(dǎo)致移植瘤干細(xì)胞標(biāo)記物富集，分化指 數(shù)和分化標(biāo)記物均降低；上述結(jié)果說(shuō)明NDGA可以靶向去除膠質(zhì)瘤中的CSC，其機(jī)制可能與 誘導(dǎo)CSC分化有關(guān)。根據(jù)上述研究結(jié)果，本發(fā)明確認(rèn)了 NDGA具有抗CSC的作用，可以用于制備抗CSC 的藥物。進(jìn)一步，所述抗CSC的藥物為抗胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤CSC的 藥物；進(jìn)一步，所述抗CSC的藥物為抗膠質(zhì)瘤CSC的藥物；進(jìn)一步，所述抗膠質(zhì)瘤CSC的藥物為誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤CSC分化的藥物；進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤CSC分化的藥物是通過(guò)抑制AL0X-5的活性誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤 CSC分化；進(jìn)一步，所述NDGA為外消旋NDGA (簡(jiǎn)稱Nordy)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 NDGA在制備抗CSC的藥物中的應(yīng)用，為靶 向CSC的腫瘤治療提供了新的方案和藥物，對(duì)提高腫瘤治療效果，改善患者生存質(zhì)量具有
重要意義。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為常規(guī)培養(yǎng)條件下貼壁生長(zhǎng)的non-CSC和懸浮生長(zhǎng)的CSC(100倍放大)A和 B分別為胃癌細(xì)胞SGC7901的non-CSC和CSC ；C和D分別為乳腺癌細(xì)胞MCF-7的non-CSC和 CSC ；E和F分別為肝癌細(xì)胞Hu-7的non-CSC和CSC ；G和H分別為肺癌細(xì)胞A549的non-CSC 和CSC ；I和J分別為結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的non-CSC和CSC ；K和L分別為膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的 non-CSC 和 CSC。圖2為Nordy抑制多種腫瘤CSC的增殖:A為SGC7901胃癌CSC ；B為乳腺癌 MCF-7CSC ；C為Hu-7肝癌CSC ；D為A549肺癌CSC ；E為HCT116結(jié)腸癌CSC ；F為U87膠質(zhì)瘤 CSC ;#、*表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖3為免疫熒光染色觀察移植瘤組織中AL0X-5和干細(xì)胞標(biāo)志物nestin的共表達(dá) 情況；圖4為Western-blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤CSC和non-CSC的AL0X-5蛋白表達(dá)水平。圖5為定量RT-PCR法檢測(cè)膠質(zhì)瘤CSC和non_CSC的AL0X_5mRNA表達(dá)水平，#表 示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖6為NDGA、內(nèi)消旋NDGA (meso-NDGA)和Nordy對(duì)AL0X-5活性的抑制效率，#表 示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖7為不同濃度Nordy和LTB4處理對(duì)膠質(zhì)瘤CSC增殖的影響，#、*表示組間差異 顯著(p < 0. 05)。圖8為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的U87移植瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度Nordy和LTB4處 理后的⑶133+細(xì)胞比例，#、*表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖9為單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度Nordy和LTB4預(yù)處理2天再用干細(xì)胞培 養(yǎng)基培養(yǎng)14天后在干細(xì)胞培養(yǎng)基中的成球能力(A)及單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度 Nordy和LTB4持續(xù)處理14后在干細(xì)胞培養(yǎng)基中的成球能力(B)，#、*表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖10為免疫熒光染色觀察膠質(zhì)瘤CSC經(jīng)不同濃度Nordy分別處理不同時(shí)間后 GFAP的表達(dá)比例，#表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖11為半定量RT-PCR法檢測(cè)Nordy 10 u M處理膠質(zhì)瘤CSC 2天和4天時(shí)目的基 因mRNA表達(dá)變化。圖12為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nordy 10 u M處理膠質(zhì)瘤CSC 2天和4天時(shí)細(xì)胞周期變 化情況，#、*表示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖13為膠質(zhì)瘤CSC分別經(jīng)Nordy 50 y M和100 u M預(yù)處理后裸鼠皮下移植第5周 的腫瘤體積，#表示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖14為免疫熒光染色觀察膠質(zhì)瘤CSC分別經(jīng)Nordy 50 y M和100 u M預(yù)處理后裸 鼠皮下移植第5周的⑶133和GFAP的表達(dá)情況，#、*表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖15為BCNU和Nordy治療荷瘤鼠對(duì)膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤生長(zhǎng)速度的影響 (A)及各組治療結(jié)束時(shí)(第26天)和延長(zhǎng)觀察結(jié)束時(shí)(第34天)移植瘤典型圖片(B)，#、 *表示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖16為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BCNU和Nordy治療荷瘤鼠結(jié)束時(shí)(第26天)移植瘤 ⑶133+細(xì)胞比例，#、*表示組間差異顯著(p < 0. 05)。圖17為BCNU和Nordy治療荷瘤鼠結(jié)束時(shí)(第26天)單個(gè)移植瘤細(xì)胞在干細(xì)胞 培養(yǎng)基中的成球生長(zhǎng)能力，#、*表示組間差異顯著(P < 0. 05)。圖18為免疫熒光染色觀察BCNU和Nordy治療結(jié)束時(shí)(第26天)干細(xì)胞標(biāo)記物、 增殖指數(shù)和分化細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況，#，*，※，★表示組間差異顯著(P < 0. 05)
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)NDGA抗CSC的作用進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)驗(yàn)材料和儀器Nordy制備方法參見文獻(xiàn)(Bian Xff, et al. Proteomics，2008， 8(3) 484-494)和申請(qǐng)?zhí)枮?2133700. 4的中國(guó)專利申請(qǐng)；胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞 Hu-7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肺癌細(xì)胞A549和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87均購(gòu)自美 國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)；兔抗人AL0X-5多克隆抗體購(gòu)自Santa cruz公司，兔抗人GFAP 多克隆抗體購(gòu)自Zymed公司，小鼠抗人nestin多克隆抗體購(gòu)自Chemicon公司，小鼠抗人 CD133多克隆抗體購(gòu)自Abcom公司，PE標(biāo)記的鼠抗人CD133抗體購(gòu)自Miltenyi Biotec 公司，小鼠抗人Ki-67多克隆抗體購(gòu)自北京中杉公司；脂氧化酶抑制劑篩選試劑盒購(gòu)自 Cayman Chemical公司(貨號(hào)760700)，半定量RT-PCR試劑盒和定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自 TAKARA公司；體重16 20g的4 6周齡雌性BALB/c_nu/nu小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心；Leica TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡；Rotor-Gene6000型熒光定量PCR儀。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件
進(jìn)行分析，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩個(gè)組之間的差異，單因素方差分析比較多個(gè)組之間 的差異。一、NDGA抑制多種腫瘤CSC的增殖1、CSC的條件篩選和培養(yǎng)將胃癌細(xì)胞SGC7901、肝癌細(xì)胞Hu-7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肺癌 細(xì)胞A549和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87按照ATCC提供的培養(yǎng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)傳代，可見上述各株 細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中呈單層貼壁生長(zhǎng)，其中SGC7901、Hu-7和MCF-7細(xì)胞在光鏡下為扁平 上皮型形態(tài)，HCT116、A549和U87細(xì)胞為長(zhǎng)或短梭形成纖維型形態(tài)，與ATCC提供圖片相似 (圖1)。取指數(shù)生長(zhǎng)期的上述各株細(xì)胞，參照文獻(xiàn)方法(Yu SC,et al. Cancer Lett, 2008, 265(1) 124-134 ；Galli R, etal. Cancer Res, 2004,64 (19) :7011_7021)篩選培養(yǎng) CSC 用 干細(xì)胞培養(yǎng)基(由1XB27、濃度為20ng/ml的EGF、濃度為20ng/ml的bFGF和DEME/F12培 養(yǎng)基組成)稀釋至細(xì)胞密度為4X 104/ml，接種24孔板，500ul/孔，在溫度為37°C、C02氣 體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每3天換液，第7天獲得大量懸浮生長(zhǎng)的CSC細(xì)胞球(圖 1)。2、NDGA抑制多種腫瘤CSC的增殖收集上述各種CSC，以巴氏吸管反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并 調(diào)整細(xì)胞密度至2X 104/ml，接種96孔板，0. 2ml/孔，再加入DMS0 lul (vehicle)或Nordy 50 u M，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)6天，每天用CCK-8試劑盒檢 測(cè)細(xì)胞增殖，以波長(zhǎng)450nm處的吸光度值表示。結(jié)果顯示(圖2)，Nordy組較vehicle組能 夠顯著抑制多種腫瘤CSC的增殖，這一現(xiàn)象在第5天和第6天具有顯著差異，提示Nordy有 可能通過(guò)靶向CSC而對(duì)上述各種腫瘤具有治療作用。二、NDGA抑制膠質(zhì)瘤U87皮下移植瘤細(xì)胞中CSC的增殖并誘導(dǎo)其分化1、膠質(zhì)瘤U87皮下移植瘤模型的建立及其CSC的培養(yǎng)收集按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1 X 106/ ml，接種于BALB/c-nu/nu裸小鼠左前胸部皮下，按標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)。接種后第8周，將實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物麻醉后取皮下移植瘤，將移植瘤均勻剪碎成約1mm3大小組織塊，一部分重新移植到裸小鼠體內(nèi)以連續(xù)傳代，另一部分置混合消化液(由質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0. 1 %的I型和IV型膠原酶組 成)中消化15分鐘，獲取單細(xì)胞懸液后，以細(xì)胞密度為10/yl接種于干細(xì)胞培養(yǎng)基中，每 2天半量換液，第7天獲得膠質(zhì)瘤CSC細(xì)胞球。2、AL0X-5介導(dǎo)NDGA對(duì)膠質(zhì)瘤CSC增殖的抑制作用(1)膠質(zhì)瘤CSC高表達(dá)AL0X-5取人膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本冰凍切片，冷丙酮固定，正常山羊血清封閉，加入兔抗人 AL0X-5多克隆抗體和小鼠抗人Nestin多克隆抗體，4°C孵育過(guò)夜，再加入Cy3標(biāo)記的羊 抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，用碘化丙啶(PI)復(fù)染胞核，緩沖甘油封片，激光 掃描共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示(圖3)，人膠質(zhì)瘤組織中AL0X-5與干細(xì)胞標(biāo)志物 Nestin存在共分布現(xiàn)象，其中較多Nestin陽(yáng)性的細(xì)胞也表達(dá)AL0X-5，提示人膠質(zhì)瘤CSC 表達(dá)AL0X-5。進(jìn)一步Western-blot結(jié)果顯示(圖4)，人膠質(zhì)瘤CSC比non-CSC表達(dá)更多 的 AL0X-5 蛋白。定量 PCR(AL0X_5 基因擴(kuò)增引物 F :5，-gaagacctgatgtttggctacc-3，，R 5，-aatgttcccttgctggacctc-3，；產(chǎn)物長(zhǎng)度162bp，退火溫度60°C )結(jié)果顯示(圖5)，人膠 質(zhì)瘤CSC中的AL0X-5mRNA表達(dá)水平是non_CSC的4. 1 士 1. 9倍(p < 0. 05)。這些結(jié)果證實(shí) 人膠質(zhì)瘤CSC高表達(dá)AL0X-5。(2) NDGA 抑制 AL0X-5 活性 由于NDGA是一種脂氧化酶抑制劑，本發(fā)明分別檢測(cè)了 NDGA、meso-NDGA和 Nordy對(duì)AL0X-5活性的抑制效率。采用脂氧化酶抑制劑篩選試劑盒并按照試劑盒說(shuō)明 書設(shè)計(jì)對(duì)照和實(shí)施實(shí)驗(yàn)，讀取波長(zhǎng)500nm處的吸光度值，按以下公式計(jì)算AL0X-5活性 的抑制效率:A500/min = (A500 樣本-A500 對(duì)照)/5min ；初始 AL0X-5 活性=(A500/ min)/9. 47mM-l X (0. 21/0. 09)；繪制藥物濃度-初始AL0X-5活性曲線圖，根據(jù)曲線圖得到 半數(shù)抑制濃度(IC5Q)。結(jié)果顯示(圖6)，冊(cè)64、!^80-冊(cè)64和吣『(^均可以顯著抑制411 -5 活性，其初始AL0X-5活性與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，NDGA, meso-NDGA, Nordy的IC5(1分別為 19 士 1. 5iiM、25 士 2. liiM、36±2.5iiM。(3) NDGA抑制膠質(zhì)瘤CSC增殖結(jié)合(1) (2)兩項(xiàng)結(jié)果和AL0X-5激活后具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步研究 Nordy是否可以抑制膠質(zhì)瘤CSC增殖，且這一效應(yīng)是否與其對(duì)AL0X-5活性的抑制效應(yīng)有關(guān)。 以干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸膠質(zhì)瘤CSC制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2X 104/ml，接種96孔 板,0. 2ml/孑L，再力口入 DMS0 lul (vehicle control)、Nordy 10 u M> Nordy 50 ii M 或 Nordy 10 u M+LTB4 0.4iiM，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5 %的條件下培養(yǎng)5天，每天用 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，以波長(zhǎng)450nm處的吸光度值表示。結(jié)果顯示(圖7)，第5天 時(shí)Nordy 10 iiM組和Nordy 50 y M組對(duì)膠質(zhì)瘤CSC增殖的抑制率分別為53%和67%，與 vehicle control 相比均具有顯著性差異(p < 0. 05)；而 Nordy 10 u M+LTB4 0. 4 ii M 組較 Nordy 10 uM組使膠質(zhì)瘤CSC增殖恢復(fù)了 60% (p < 0. 05)，說(shuō)明AL0X-5的產(chǎn)物L(fēng)TB4可以 逆轉(zhuǎn)Nordy對(duì)膠質(zhì)瘤CSC增殖的抑制作用。3、NDGA選擇性去除體外培養(yǎng)的U87移植瘤細(xì)胞中的CSC(l)NDGA降低U87移植瘤細(xì)胞中⑶133+細(xì)胞比例以干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)U87移植瘤細(xì)胞，并加入Nordy 10 u M、Nordy 50 u M、Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 y M 或 Nordy 50 u M+LTB4 0. 4 y M，培養(yǎng) 5 天后收集細(xì)胞，以鼠抗人 IgG2b為同型對(duì)照，與PE標(biāo)記的鼠抗人⑶133抗體于4°C孵育30分鐘，洗滌重懸后，用流式細(xì)胞儀 檢測(cè)⑶133+細(xì)胞比例。結(jié)果顯示(圖8)，體外培養(yǎng)的U87移植瘤細(xì)胞中⑶133+細(xì)胞比例為
6.2士0.7% (Medium Control) ；Nordy處理呈劑量依賴性地降低體外培養(yǎng)的U87移植瘤細(xì) 胞中CD133+細(xì)胞比例，NordylO u M組和Nordy 50 u M組的CD133+比例分別為2. 9 士0. 3%禾口 1. 0士0. 1%，與Medium Control 相比 CD133+細(xì)胞比例分別降低了 54%和 84% (P < 0. 05)； 而LTB4處理可以減輕Nordy對(duì)CD133+細(xì)胞的抑制程度，Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 u M組和 Nordy 50 u M+LTB4 組的 CD133+ 細(xì)胞比例分別為 1. 8士0. 3%禾口 7. 4士0. 6%，與 Nordy50 u M 組相比CD133+細(xì)胞比例分別升高了 86%和679% (P < 0. 05)。(2) NDGA降低單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞成球能力采用梯度稀釋法以干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋U87移植瘤細(xì)胞至細(xì)胞密度為100/ml，接 種96孔板，0. lml/孔，倒置相差顯微鏡下觀察并標(biāo)記單細(xì)胞孔，在單細(xì)胞孔中加入Nordy 10 iiM、Nordy 50 u M, Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 ii M 或 Nordy 50 ii M+LTB40. 4 ii M，在溫度為 37°C、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每3天換液，培養(yǎng)14天后鏡下計(jì)數(shù)含細(xì)胞數(shù) 大于50的細(xì)胞球數(shù)，按以下公式計(jì)算成球率成球率=細(xì)胞球數(shù)/單細(xì)胞孔數(shù)X 100%。 結(jié)果顯示，Nordy處理可以降低單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中的成球能力(圖 9A)，單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后具有成球生長(zhǎng)特性的細(xì)胞比例為
7.3 士 1. 0% (MediumControl)，分別以Nordy 10 ii M和50 ii M預(yù)處理2天導(dǎo)致這一比例下 降至4. 8 士0. 84%和0. 8 士0. 2% (P < 0. 05)，而在Nordy 50 y M預(yù)處理體系中分別添加 LTB4 0. liiM和0. 4iiM同時(shí)作用，則可以使成球比例上升至1. 5士0. 3%和8. 7士0. 8% (P < 0. 05)；同時(shí)，Nordy持續(xù)作用于干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的單個(gè)U87移植瘤細(xì)胞也導(dǎo)致其成 球能力顯著下降(圖9B)，分別以Nordy 10 y M和50 y M持續(xù)作用14天導(dǎo)致成球比例下降 至 3. 4 士 0. 6% 和 0. 8 士 0. 2% (P < 0. 05)，而 Nordy 50yM 分別與 LTB4 0. 1 ii M 禾口 0. 4 ii M 同時(shí)作用則使成球比例上升至3. 7 士0. 6%和9. 0 士 1. 6% (P < 0. 05)。4、NDGA促進(jìn)膠質(zhì)瘤CSC向成熟的星形細(xì)胞表型分化(1) NDGA促進(jìn)膠質(zhì)瘤CSC表達(dá)GFAP 以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸膠質(zhì)瘤CSC，將細(xì)胞懸液滴 于多聚賴氨酸包被的載玻片上，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下貼壁培養(yǎng) 4小時(shí)，以PBS洗凈含血清培養(yǎng)基，換用干細(xì)胞培養(yǎng)基并加入Nordy 10 y M或Nordy 50 u M 培養(yǎng)3天，結(jié)束后以PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定，正常山羊血清封閉，加 入兔抗人GFAP多克隆抗體，正常小鼠IgG代替一抗作為陰性對(duì)照，4°C孵育過(guò)夜，再加入異 硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗，用碘化丙啶(PI)復(fù)染胞核，緩沖甘油封片，激光掃描共 聚焦顯微鏡下觀察，在400倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。結(jié)果顯示 (圖10)，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤CSC保持低分化的狀態(tài)，僅有3 % 4%的細(xì)胞表 達(dá)成熟的星形細(xì)胞標(biāo)志物GFAP (Medium Control)；在相同的培養(yǎng)條件下，Nordy可以促進(jìn) 膠質(zhì)瘤CSC表達(dá)GFAP，且此效應(yīng)與Nordy濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)，分別以Nordy 10 u M 和50 ii M處理膠質(zhì)瘤CSC 3天，GFAP細(xì)胞陽(yáng)性比例達(dá)到56. 3士2. 1 %和84. 7士3. 5%，與 Medium Control 相比差異顯著(P < 0. 05)。(2) NDGA導(dǎo)致膠質(zhì)瘤CSC目的基因mRNA表達(dá)變化提取膠質(zhì)瘤CSC以及經(jīng)Nordy 10 u M分別處理2天和4天的膠質(zhì)瘤CSC的總RNA，使用半定量RT-PCR試劑盒并按照試劑盒說(shuō)明書的反應(yīng)條件，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再 以其為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR，目的基因引物序列見表1，PCR循環(huán)29次， 產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用Quantity One軟件進(jìn)行分析，計(jì)算 目的基因與GAPDH的灰度比值。結(jié)果顯示(圖11)，自我更新狀態(tài)的膠質(zhì)瘤CSC表達(dá)若干 與干細(xì)胞相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子如CD133、Melk、OCT-4、SOX-2、Nanog、Nestin等(Medium Control), Nordy在誘導(dǎo)GFAP表達(dá)的同時(shí)降低了這些基因的mRNA表達(dá)水平，說(shuō)明其可能使 這些基因表達(dá)水平降低。表1引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度 (3) NDGA誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤CSC細(xì)胞周期動(dòng)態(tài)改變以Nordy 10 y M分別處理膠質(zhì)瘤CSC 2天和4天，收集細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為70%的 乙醇溶液固定，PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示(圖12)，Nordy在調(diào)節(jié)膠 質(zhì)瘤CSC基因表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)了 CSC細(xì)胞周期的動(dòng)態(tài)改變，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膠質(zhì) 瘤CSC超過(guò)60%處于細(xì)胞靜止期(G0/G1期)(MediumControl)，而Nordy 10 u M處理2天 導(dǎo)致了約8%的靜止期細(xì)胞進(jìn)入增殖期(G2/M+S期)(P < 0. 05)，延長(zhǎng)處理時(shí)間至4天，反 而有約10%的增殖期細(xì)胞重新進(jìn)入靜止期(P < 0. 05)。三、NDGA抑制膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)1、NDGA體外預(yù)處理膠質(zhì)瘤CSC抑制膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤的發(fā)生(1)藥物預(yù)處理方案及膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤模型的構(gòu)建分別以Nordy 50 y M和100 u M處理來(lái)源于前述U87移植瘤的CSC 48小時(shí)，以未 處理CSC為對(duì)照(Medium Control)，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞比例，再將2 X 104個(gè)膠質(zhì)瘤CSC
9接種入BALB/c nu/nu裸小鼠左腋下，按標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，建立膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤模型。(2)NDGA體外預(yù)處理使膠質(zhì)瘤CSC體內(nèi)成瘤能力顯著降低，所形成的移植瘤呈分 化成熟的免疫表型第5周取小鼠移植瘤組織，測(cè)量移植瘤體積，并用免疫熒光染色法觀察移植瘤 細(xì)胞CSC標(biāo)記物⑶133和星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的表達(dá)情況。移植瘤體積分析結(jié)果顯示 (圖13)，Nordy 50yM組和100 y M組的移植瘤在第5周時(shí)體積分別為940 士 150mm3和 90士20mm3，與 Medium Control 組移植瘤(2250士460mm3)相比差異顯著(P < 0. 05)；實(shí)驗(yàn) 還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Nordy預(yù)處理的膠質(zhì)瘤CSC形成移植瘤的潛伏期較對(duì)照組長(zhǎng)，Nordy 50 u M組和 100 PM組分別在第14天和第19天出現(xiàn)可觸及的皮下結(jié)節(jié)，而Medium Control組移植瘤第 10天肉眼可見。上述結(jié)果說(shuō)明使用Nordy處理體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤CSC可以降低其在裸鼠體 內(nèi)的成瘤能力和移植瘤的生長(zhǎng)速度。免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖14)，不同組移植瘤細(xì)胞 CSC標(biāo)記物⑶133和星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的表達(dá)強(qiáng)度不同，Nordy 100 y M組⑶133和GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為1. 4士0. 5%和38. 2士2. 4%，而Medium Control組CD133和GFAP陽(yáng) 性細(xì)胞比例分別為6. 2 士 1. 3 %和21. 2 士 1. 9 %，二者差異顯著(P < 0. 05)，說(shuō)明Nordy處理 組移植瘤中CSC比例低而分化細(xì)胞比例高。2、NDGA體內(nèi)治療抑制膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤的生長(zhǎng)(1)膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤模型的構(gòu)建及藥物治療方案將2 X 104個(gè)來(lái)源于前述U87移植瘤的CSC接種入BALB/cnu/nu裸小鼠左腋下，按 標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，建立膠質(zhì)瘤CSC始動(dòng)的移植瘤模型，再將其分為Nordyl3. 5mg/kg組、Nordy 27mg/kg組、BCNU 20mg/kg組和PBS (vehicle control)組，從第10天開始分別給予4個(gè)周 期的藥物治療，每個(gè)周期為4天，腹腔注射給藥，Nordy 13. 5mg/kg組和27mg/kg組每2天 給藥1次，BCNU 20mg/kg組每4天給藥1次，PBS對(duì)照組每4天給藥1次。(2) NDGA對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)比BCNU具有更好的持續(xù)性在每個(gè)治療周期的第4天以游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤最長(zhǎng)徑(L)和最寬徑(W)，按如下 公式計(jì)算移植瘤體積(V) :V = LXW2/2，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示(圖15) vehicle control組的移植瘤在前2周內(nèi)生長(zhǎng)速度緩慢，第10天出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤結(jié)節(jié)，第14天 腫瘤結(jié)節(jié)體積為120士30mm3，隨后腫瘤生長(zhǎng)迅速，至第26天腫瘤結(jié)節(jié)體積達(dá)650士70mm3， 第 34 天達(dá) 2140士 170mm3 ；Nordy 13. 5mg/kg 組、27mg/kg 組及 BCNU 20mg/kg 組均可抑制 膠質(zhì)瘤CSC移植瘤的生長(zhǎng)，第26天治療結(jié)束時(shí)，Nordy 13. 5mg/kg組、27mg/kg組及BCNU 20mg/kg組的移植瘤體積分別為380士80mm3、290士50mm3和50士 10mm3，顯著低于vehicle control組(P < 0. 05)，且BCNU 20mg/kg組的移植瘤體積明顯低于Nordy 13. 5mg/kg組 (P < 0. 05)，說(shuō)明給藥期間BCNU抑制移植瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)優(yōu)于Nordy ；延長(zhǎng)觀察時(shí)間發(fā)現(xiàn)， 停藥后BCNU 20mg/kg組移植瘤迅速長(zhǎng)大，而Nordy組移植瘤增速相對(duì)較緩。至第34天監(jiān) 測(cè)截止，BCNU 20mg/kg組移植瘤體積已達(dá)1500 士 110mm3，顯著大于Nordy 13. 5mg/kg組(P < 0. 05)，說(shuō)明Nordy治療CSC移植瘤比BCNU具有更好的停藥后持續(xù)效應(yīng)。(3) NDGA選擇性降低而BCNU富集移植瘤細(xì)胞中CSC比例移植瘤細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比例檢測(cè)為分析BCNU停藥后移植瘤生長(zhǎng)異常迅速 的機(jī)制，在第4個(gè)治療周期末即皮下接種膠質(zhì)瘤CSC第26天，每組各取4只裸鼠麻醉 處死，取皮下移植瘤，剪碎消化獲得單細(xì)胞懸液，用干細(xì)胞培養(yǎng)基短暫培養(yǎng)6小時(shí)，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)停藥時(shí)移植瘤細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比例。結(jié)果顯示(圖16)， vehicle control 組 CD133+細(xì)胞比例為 6. 4士0. 5% ；BCNU 20mg/kg 組 CD133+細(xì)胞比例為 32. 9士3. 3%，顯著高于 vehicle control 組(P < 0. 05) ；Nordy 13. 5mg/kg 組禾口 27mg/kg 組CD133+細(xì)胞比例分別為1. 6士0. 5%和0. 9士0. 1%，均顯著低于vehicle control組(P < 0. 05)。移植瘤細(xì)胞成球能力檢測(cè)取“移植瘤細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比例檢測(cè)”中所述單細(xì) 胞懸液，采用梯度稀釋法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞成球能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖17)，vehiclecontrol組 有5. 4士0.9%的移植瘤細(xì)胞具有成球能力；BCNU 2011^/1^組有26.4士4.2%的移植瘤細(xì)胞 具有成球能力，顯著高于 vehicle control 組(P < 0. 01) ；Nordy 13. 5mg/kg 組和 27mg/kg 組成球生長(zhǎng)的細(xì)胞比例分別為3. 1 士0.6%和1. 3士0.6%，均顯著低于vehicle control組 (P < 0. 01)。(4)NDGA導(dǎo)致移植瘤增殖指數(shù)下降，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化治療結(jié)束后取小鼠移植瘤組織，立即用冰凍包埋劑包埋，于-20°C冰凍切6 y m組 織片，貼附于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，4°C丙酮固定20分鐘，室溫晾干，正常山羊血清 封閉，加入一抗(小鼠抗人CD133多克隆抗體、小鼠抗人nestin多克隆抗體、小鼠抗人 Ki-67多克隆抗體或兔抗人GFAP多克隆抗體)，正常小鼠IgG作為陰性對(duì)照，4°C孵育過(guò)夜， 再加入FITC或四乙基羅達(dá)明異硫氰酸鹽(TRITC)標(biāo)記的二抗，PI復(fù)染胞核，緩沖甘油封 片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，在400倍鏡下隨機(jī)選取測(cè)定10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞 所占比例。結(jié)果顯示(圖18)，vehicle control組CD133、Nestin、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例 分別為 6. 3士0. 9%、25. 6士2. 3%、35. 8士3. 4% ；Nordy 27mg/kg 組 CD133、Nestin、Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為1. 5士 1. 3 %、7士3. 2 %、4. 8士 1. 9 %，均顯著低于vehicle control 組(P < 0. 05) ；BCNU 20mg/kg 組 CD133、Nestin 陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為 32. 3士4. 5
36. 6士4. 7%，較 vehicle control 組增高(P < 0. 05)，而 Ki-67 比例降低為 6. 8士2. 2% (P < 0. 05)；同時(shí)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比例在Nordy 27mg/kg組升高至66. 6士7. 7%，在BCNU 20mg/kg 組降低至 14. 8士2. 8%，與 vehicle control 組 24士2%差異顯著(P < 0. 05)。上 述結(jié)果說(shuō)明Nordy和BCNU治療分別導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物和增殖指數(shù)發(fā)生不同變化。傳統(tǒng)抗癌藥物篩選主要是通過(guò)檢查腫瘤病灶的消退程度，這種辦法能夠獲得對(duì)絕 大部分腫瘤細(xì)胞具有殺傷力的藥物，但這些藥物不一定能夠靶向CSC。因此，本發(fā)明采用的 評(píng)價(jià)方法是檢測(cè)藥物對(duì)CSC標(biāo)記物和成球能力的影響。CD133是目前較為公認(rèn)的CSC標(biāo)志 物之一。由于有證據(jù)表明部分⑶133_細(xì)胞也具有CSC特性，因此本發(fā)明同時(shí)引入了另一個(gè) 評(píng)價(jià)指標(biāo)，即干細(xì)胞培養(yǎng)基中自我更新式的成球生長(zhǎng)能力。成球生長(zhǎng)是CSC的重要細(xì)胞生 物學(xué)特性，同時(shí)也可以作為腫瘤患者臨床預(yù)后的判斷指標(biāo)之一。綜合上述兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，本 發(fā)明認(rèn)為靶向CSC的藥物不一定會(huì)在短期內(nèi)使得腫瘤體積迅速減小，但是會(huì)有較好的遠(yuǎn)期 治療效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BCNU雖然能夠在短期內(nèi)迅速抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是停藥后卻導(dǎo)致移植瘤 異常的迅速?gòu)?fù)發(fā)，這一現(xiàn)象與BCNU治療顯著富集了 CSC有關(guān)，而Nordy雖然在治療期間抑 瘤效果不如BCNU明顯，但是停藥后抑瘤效應(yīng)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，腫瘤增殖緩慢，這可能與Nordy 治療降低了 CSC比例有關(guān)。因此，綜合評(píng)價(jià)二者抗癌效果，本發(fā)明認(rèn)為Nordy治療膠質(zhì)瘤優(yōu) 于 BCNU。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
去甲二氫愈創(chuàng)木酸在制備抗腫瘤干細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤干細(xì)胞的 藥物為抗胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌或膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤干細(xì)胞的 藥物為抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸的應(yīng)用，其特征在于所述抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 的藥物為誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì) 胞分化的藥物是通過(guò)抑制花生四烯酸-5-脂氧化酶的活性誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸的應(yīng)用，其特征在于所述去甲 二氫愈創(chuàng)木酸為外消旋去甲二氫愈創(chuàng)木酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物的新應(yīng)用，特別涉及去甲二氫愈創(chuàng)木酸在制備抗腫瘤干細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，去甲二氫愈創(chuàng)木酸通過(guò)抑制花生四烯酸-5-脂氧化酶的活性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向星形細(xì)胞表型分化，對(duì)膠質(zhì)瘤的體內(nèi)治療效果好于經(jīng)典的膠質(zhì)瘤化療藥物卡莫司??；同時(shí)，去甲二氫愈創(chuàng)木酸還能夠顯著抑制胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等腫瘤干細(xì)胞的增殖。
文檔編號(hào)A61K31/05GK101869557SQ20101019074
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者余時(shí)滄, 卞修武, 平軼芳, 王斌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院