專利名稱：防治糖尿病并發(fā)癥及衰老的植物提取物組合物及制備方法
防治糖尿病并發(fā)癥及衰老的植物提取物組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域。具體涉及一種抑制晚期糖基化終產(chǎn)物形成的天然植物提取物 組合物藥物，以及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，其死亡率已居腫瘤，心血管病之后的第3 位。2007年，全世界估計(jì)有2. 46億糖尿病患者，到2025年，全球糖尿病患者將增至3. 8億。 而我國是糖尿病患病率增長最快的國家之一，目前患病率為3%，患病人數(shù)有3，800萬，具 世界糖尿病患病人數(shù)的第二位。盡管胰島素和其它降血糖藥物的使用極大的提高了糖尿病患者的生活質(zhì)量，延長 糖尿病患者的生存時(shí)間(life expectancy)，但隨之而來的糖尿病晚期并發(fā)癥，如加速性 心，腦血管動(dòng)脈粥樣硬化，腎病，視網(wǎng)膜，外周神經(jīng)末稍喪失及非創(chuàng)傷性截肢等，已成為影響 患者的生活質(zhì)量，早期死亡的主要原因。據(jù)聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年全世界大約有 四百萬人死于糖尿病晚期心血管并發(fā)癥。除此，在全球范圍內(nèi)，超過60%的非外傷性下肢截 肢，50%以上的失明患者是由長期糖尿病導(dǎo)致的下肢及視網(wǎng)膜病所致微微循環(huán)異常所致。 在有10年以上糖尿病病史的病人中，40%的患者患有不同成度的糖尿病腎病，高達(dá)70%的 糖尿病患者至少具有輕度神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀， 約30%的患者下肢及足部的感覺受損，微循 環(huán)異常。這些糖尿病微血管并發(fā)癥不但極大影響患者本人的生活質(zhì)量，同時(shí)對糖尿病晚期 并發(fā)癥患者的長期的醫(yī)療護(hù)理也給各國醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了碩大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在大多 數(shù)地區(qū)和國家，糖尿病患者的最大單項(xiàng)醫(yī)療費(fèi)用開支是住院治療糖尿病晚期并發(fā)癥。因此， 預(yù)防和治療糖尿病微血管并發(fā)癥是一個(gè)重要的，急待解決的臨床課題。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究證明長期糖尿病高血糖引起的蛋白質(zhì)非酶糖基化， 導(dǎo)致晚期糖化終產(chǎn)物(advanced glycation end product, AGE)在組織內(nèi)形成和積累是引 起糖尿病血管并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制。晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)是還原糖的醛基與蛋白、脂 質(zhì)、氨基酸的自由氨基之間的非酶性糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物。反應(yīng)首先由糖的羰基基團(tuán)和蛋白 質(zhì)的氨基共價(jià)結(jié)合形成不穩(wěn)定的希夫堿(Schiff base)開始，然后這種不穩(wěn)定的希夫堿迅 速重排得到穩(wěn)定的阿馬杜(Amadori)產(chǎn)物，阿馬杜產(chǎn)物再經(jīng)過一系列緩慢的重排和脫水氧 化等不可逆反應(yīng)形成晚期糖化終產(chǎn)物AGEs。AGEs結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，具有其獨(dú)特的生化特性 棕褐色、大多數(shù)具有熒光，不可逆、不易被蛋白降解酶所降解、有很強(qiáng)的交聯(lián)性，即可經(jīng)過側(cè) 鏈交聯(lián)與其他AGEs形成更大分子量的物質(zhì)，并在組織中大量沉積。這些化學(xué)反應(yīng)性很強(qiáng)的 晚期糖化終產(chǎn)物與微血管膠原，纖維連接蛋白，微管蛋白交聯(lián)，形成糖化交聯(lián)蛋白。隨著時(shí) 間的推移，這些交聯(lián)蛋白變硬結(jié)締組織，導(dǎo)致腎臟，視網(wǎng)膜，血管壁及神經(jīng)損傷，引起糖尿病 并發(fā)癥。目前研究證實(shí)AGEs主要通過兩個(gè)途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)一方面通過對蛋白質(zhì)、脂 質(zhì)、核酸等的直接修飾改變其結(jié)構(gòu)功能；二是通過與特異受體結(jié)合導(dǎo)致機(jī)體的病理改變。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AGEs受體包括RAGE、I型和II型SR_A、CD36、SR_B1、寡糖轉(zhuǎn)移酶48 (0ST48)、80KH 磷酸蛋白(AGER2)、半乳糖結(jié)合蛋白3(AGER3)。其中通過RAGE (—種膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族的多配體成員，存在于多種細(xì)胞上)介導(dǎo)的損傷在糖尿病血管系統(tǒng)損傷中占主導(dǎo)地 位。此外，晚期糖化終產(chǎn)物在胰腺β細(xì)胞(產(chǎn)生和分泌胰島素的細(xì)胞)內(nèi)積累，引起β細(xì) 胞氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress)增力Π,產(chǎn)生過量的氧化自由基(reactive oxidative species, R0S)和炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素_1，組織壞死因子-α，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞功能 喪失，細(xì)胞凋亡。β細(xì)胞功能喪失和凋亡反過來又加劇了糖尿病的惡化，行成惡性循環(huán)。因 此，抑制高血糖導(dǎo)致的晚期糖化終產(chǎn)物的產(chǎn)生是防止糖尿病并發(fā)癥的有效治療措施。在過去的十多年中，已發(fā)現(xiàn)數(shù)種化學(xué)合成化合物能夠抑制的形成(AGEinhibitor) 或能夠打破AGE與蛋白質(zhì)之間形成的交聯(lián)(Cross-link breaker)，如氨基胍 (Aminoguanidine)，PTB，和ALT-711。其中最有希望能夠成為預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥的合 成藥物是氨基胍。它是一種小分子親核性化合物，能夠和阿馬杜(Amadori)產(chǎn)物中的還原 性羰基發(fā)生加成反應(yīng)，與活性α “ 二羰基中間體發(fā)生反應(yīng)，通過消除羰基和生成三嗪類化 合物，阻止其阿馬杜產(chǎn)物進(jìn)一步重排生成形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)的AGEs。動(dòng)物研究和臨床第二期和 臨床第三期階段臨床試驗(yàn)證實(shí)氨基胍能減低多種在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生。但是，常期 服用氨基胍產(chǎn)生的各種毒副作用如流感樣綜合癥、誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生、髓過氧化物酶抗中 性粒細(xì)胞胞漿抗體、引起急進(jìn)性腎炎限制了它在人體的應(yīng)用。同樣，其它幾種抑制AGEs形 成的化合物由于在臨床前期動(dòng)物研究中出現(xiàn)的毒副作用而使它們能否在人體內(nèi)應(yīng)用受到 爭議。迄今，在國內(nèi)外市場上尚無被批準(zhǔn)的抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的藥物。因此，發(fā)展安 全，有效的抗糖基化的藥物是目前臨床上的迫切需要和挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成且無毒副作用，防治晚 期糖化終產(chǎn)物對機(jī)體的危害的組合藥物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況 的天然植物提取物組合藥物的制備方法。為達(dá)成前述目的，本發(fā)明一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況的天 然植物提取物組合藥物，其是由車前草、葛根、山茱萸、姜黃四種天然植物中分離提取的能 夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物組合物組成。進(jìn)一步地，所述四種天然植物中活性成分提取物組合物中，各種天然植物的活性 成分提取物重量百分比分別為車前草5 85% ；葛根5 85% ；山茱萸5 85% ；姜黃 5 85%。進(jìn)一步地，其可用于預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況。 進(jìn)一步地，所述的糖尿病并發(fā)癥包括加速性心，腦血管動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病性腎 病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，糖尿病性白內(nèi)障，糖尿病性神經(jīng)病變，糖尿病下肢及足部難愈潰瘍。進(jìn)一步地，其為口服液、丸齊IJ、膠囊齊IJ、片齊U、沖劑，乳劑，水懸浮劑，膠體液，丸劑， 顆粒劑，粉劑、注射劑，霜?jiǎng)?，膏劑，貼劑及噴霧劑。為達(dá)成前述另一目的，本發(fā)明一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況 的天然植物提取物組合藥物的制備方法，其包括如下步驟分別自車前草，葛根，山茱萸，姜黃中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活 性成分提取物；將前述植物中分離提取的能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物
5按一定比例混合制成活性成分提取物組合物；將所述活性成分提取物組合物與藥物載體相 結(jié)合形成藥物組合物。本發(fā)明包含車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性提取物組合物可以與藥物載體結(jié)合制 成藥物組合物，或者添加到其他輔料中形成各種膠囊、片劑或者飲料等各種保健品，根據(jù)本 發(fā)明的方法從車前草，山茱萸，葛根，姜黃中分離提取的活性成分組合物治療能夠減低晚期 糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病大鼠胰腺，眼晶狀體，胸降主動(dòng)脈及腎臟組織的產(chǎn)生和累 積；降低血糖，減少糖尿病大鼠24小時(shí)尿蛋白排出量，提高腎臟組織超氧化物歧化酶活性， 減少脂質(zhì)過氧化等功效。這些臨床前動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明包含該活性成分的組合藥物能夠預(yù) 防和治療糖尿病并發(fā)癥以及抗衰老。能夠有效防治糖尿病并發(fā)癥和衰老。

圖1為本發(fā)明的活性成分提取物混合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖濃度的影響。圖2為實(shí)驗(yàn)大鼠胰腺胰島素免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明的活性成分提取物混合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)熒光性 晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量的影響。圖4為為本發(fā)明的活性成分提取物混合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠24小時(shí)尿白蛋白 排出量的影響。
具體實(shí)施方式在該說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”可能并非指的是同一個(gè)實(shí)施例， 也不是與其它實(shí)施例相互排斥的相互獨(dú)立或選擇性的實(shí)施例。天然植物活性提取物在預(yù)防和治療多病因，多病理機(jī)制的慢性疾病如糖尿病及其 各種并發(fā)癥中具有多作用靶點(diǎn)，毒副作用小的優(yōu)勢。本發(fā)明首先分別自車前草，葛根，山茱 萸，姜黃中分離提取有不同程度的能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物。下面對四種天然植物進(jìn)行簡單介紹車前草(Plantago astiatice)為車前科多年生草本。全草含有多種化學(xué)物質(zhì)如 車前甙、桃葉珊瑚甙、烏蘇酸，B-谷甾醇、正三十一烷、棕櫚酸B-谷甾酸酯、棕酸豆甾醇酯、 維生素B、維生素C、以及蛋白質(zhì)、琥珀酸、腺嘌呤、膽鹼、梓醇、硬質(zhì)酸、花生酸、亞麻酸、亞沒 酸等脂肪酸。有利水通淋、清熱解毒、清肝明目、祛痰、止瀉的功效，用于治療慢性支氣管炎 百日咳，腮腺炎，急性黃疸型肝炎，高血壓，青光眼等疾病。葛根(Pueraria Lobata)為多年生豆科藤本植物。葛根富含蛋白質(zhì)、氨基酸、葛根 素(Puerarin)和人體所需的鐵、鈣、硒等微量元素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，葛粉具有降低高血脂、 降低高血壓、降低血糖等作用，并能增加腦及冠狀動(dòng)脈血流量。對冠心病、心絞痛、以及高血 壓導(dǎo)致的疾病均有顯著的輔助治療效果。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus Officinalis)的果肉。含莫羅忍冬甙、 7-甲基莫羅忍冬甙、獐牙菜甙、番木鱉甙、山茱萸鞣質(zhì)等化學(xué)成分。具有增強(qiáng)機(jī)體的抗應(yīng)激 能力抗應(yīng)激、抗氧化、降血脂等藥理作用。姜黃為姜科植物姜黃(Curcuma longa L)的根莖。主要成分含姜黃素(Curcumin) 和揮發(fā)油。揮發(fā)油中含姜黃酮(Turmerone)、姜油烯(Zingerene)、水芹烯(Phellandrene)、去氫姜黃酮。具有降血脂，抗氧化，抗腫瘤作用。下面對從每一種植物中分別分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分 提取物的方法逐一說明。從車前草中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方 法包括以下步驟(1)將干燥的車前草IOOg粉碎成粗粉；(2)加5倍量水煮沸2次，每次1小 時(shí)；(3)合并水提液，過濾，減壓濃縮；(4)加4 6倍無水乙醇于濃縮液，靜置于低溫(4°C) 沉淀過夜；過濾后的沉淀物經(jīng)無水乙醇洗脫，減壓干燥得粗提物；(5)取diaion HP-20吸附 樹脂，以生藥重量比1 2的比例裝柱，將干燥的粗提物溶于適量的水，以15 20ml/min 的流速通過此吸附樹脂柱，完全通過后，再分別依次用去離子水和甲醇洗脫。收集甲醇洗脫 液，干燥后得車前草活性成分提取物。從山茱萸中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方 法包括以下步驟(1)將干燥的山茱萸原料IOOg粉碎成粗粉，加6 10倍量100%甲醇，加 熱回流(65-70°C )提取2次，每次2 3小時(shí)；合并醇提液，分別經(jīng)濾孔為70和25 μ m的 濾器過濾；濾液減壓回收甲醇，真空干燥，得山茱萸粗提取物；(2)將此粗提取物溶于5 10倍量的去離子水，然后依次用丁烷和乙酸乙酯萃取；(3)收集水相溶液，濃縮后以15 20ml/min的流速通過diaion HP-20吸附樹脂吸附樹脂柱，完全通過后，再分別依次用H20/ MeOH 梯度洗脫(H20/Me0H = 100 0 — 50 50 — 0 100) ； (4)收集 H20/Me0H(50 50) 洗脫液，冷凍干燥后得山茱萸活性成分提取物。從葛根中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方法 包括以下步驟(1)將干燥葛根原料IOOg粉碎成粗粉，加5 10倍量80%乙醇，在37°C溫 度下萃取2 3次，每次48小時(shí)。合并醇提液，濾過。濾液減壓回收乙醇，真空干燥，得葛 根乙醇粗提取物。(2)將葛根乙醇粗提取物溶于5倍量的純水，然后用乙酸乙酯萃?。?3) 收集水相溶液，濃縮后以15 20ml/min的流速通過diaion HP-20SS吸附樹脂吸附樹脂 柱，再分別依次用H20/Me0H梯度洗脫(H20/Me0H = 100 0 - 0 100) ； (4)收集甲醇洗 脫液，冷凍干燥后得葛根活性成分提取物。從姜黃中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方法 包括以下步驟(1)將干燥的姜黃干粉IOOg加入加6 10倍量100%乙醇，加熱回流(60 700C )提取3次，每次2 3小時(shí)；(2)合并醇提液，分別經(jīng)濾孔為70和25 μ m的濾器過濾， 濾液減壓濃縮回收甲醇后，得到姜黃活性成分提取物。分別自車前草，葛根，山茱萸，姜黃中分離提取有不同程度的夠抑制晚期糖化終產(chǎn) 物形成的活性成分之后，依據(jù)在體外對晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)形成的抑制試驗(yàn)結(jié)果，對各 活性成分進(jìn)行優(yōu)化配比組合，形成本發(fā)明具有最大抑制AGEs形成藥理作用組合藥物。其中 各種活性成分提取物混合的重量百分比分別為5 85%。為驗(yàn)證經(jīng)過本發(fā)明方法制成的活性成分提取物或活性成分提取物組合物確實(shí)能 夠抑制晚期糖基化產(chǎn)物，下面通過試驗(yàn)對活性成分提取物或活性成分組合物的藥效進(jìn)行分 析。首先進(jìn)行體外糖基化修飾的蛋白質(zhì)(AGE-BSA)的制備及測定。其中用到的材料 有純化的牛血清白蛋白(BSA)，甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)，磷酸鹽緩沖液，疊氮鈉 (sodium azide)0
具體進(jìn)行體外糖基化修飾的蛋白質(zhì)(AGE-BSA)制備的方法包括將BSA(最終濃 度5mg/ml)溶于含2mmol/L的甲基乙二醛和0. 02%疊氮鈉的0. IM的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)，形成蛋白質(zhì)-糖基化修飾反應(yīng)混合物。將上述白蛋白-甲基乙二醛反應(yīng)混合物分裝 于2. 0毫升試管內(nèi)，通入氮?dú)獬龊髮⒃嚬苊芊?，置?7°C孵育7天形成糖基化修飾的白蛋白 (AGE-BSA)。進(jìn)行體外糖基化修飾的蛋白質(zhì)(AGE-BSA)測定的方法是利用AGEs在激發(fā)波長 370/發(fā)射波長440納米有特征性吸收光譜，采用熒光光譜分析法測定其形成的AGE-BSA含量。為驗(yàn)證從車前草，葛根，山茱萸和姜黃四種植物中提取的能夠抑制晚期糖化終產(chǎn) 物形成的活性成分提取物及這些活性成分提取物組合物能夠在體外抑制晚期糖基化產(chǎn)物 形成，下面對這些活性成分提取物或活性成分提取物組合物的藥效進(jìn)行測定，具體方法 為將根據(jù)本發(fā)明的前述方法得到的活性成分提取物或活性成分提取物組合物溶解 于2%的TweenSO，加入上述BSA-MG混合液中，充分混合后，一式三份，每份500微升，分裝 密封于1. O毫升試管中，置于37°C孵育箱孵育。每次試驗(yàn)均包括三個(gè)對照組空白對照(反 應(yīng)混合液中只含BSA，不含MG及任何測試物)；陽性對照(只含BSA-MG反應(yīng)混合液，不含任 何測試物)；陽性標(biāo)準(zhǔn)藥物對照(BSA-MG反應(yīng)混合液和2mM氨基胍鹽酸鹽)。孵育7天后， 用上述描述的熒光光譜分析法測定其AGE-BSA含量。抑制百分比的計(jì)算活性成分提取物及活性成分提取物組合物在體外抑制晚期糖 基化產(chǎn)物形成的抑制率按下列公式計(jì)算百分抑制率(％ ) = [1_(活性成分提取物測試管 平均熒光強(qiáng)度_空白對照管平均熒光強(qiáng)度)/ (陽性對照管平均熒光強(qiáng)度_空白對照管平均 熒光強(qiáng)度)xl00% ]。藥效測定結(jié)果總結(jié)于表1。表中結(jié)果表明(1)本發(fā)明所列舉的四種天然植物單一 的活性成分提取物均有明顯的抑制晚期糖基化產(chǎn)物形成的藥理作用；(2)四種天然植物活 性成分提取物組合物在12. 5，25，50和lOOmcg/ml每個(gè)濃度的抑制率均大于同濃度的單一 提取物，提示在抑制晚期糖基化產(chǎn)物形成上具有協(xié)同作用；(3)四種天然植物活性提取物 的組合物在12. 5，25，50和lOOmcg/ml每個(gè)濃度的抑制率均大于同濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照藥 物氨基胍。表1 姜黃、車前草、山茱萸、葛根活性成分提取物、活性成分提取物組合物和陽性 對照藥氨基胍在體外抑制晚期糖基化產(chǎn)物形成的藥效測定 下面通過實(shí)驗(yàn)對車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物抑制糖尿病大 鼠體內(nèi)晚期糖化終產(chǎn)物形成和積累，防治糖尿病并發(fā)癥的治療效果進(jìn)行觀察。其中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8周令，體重200 250克的雄性SD大鼠。受試藥物為根據(jù)本發(fā)明的方法制備的車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取 物組合物，以100mg/ml的濃度溶于2%吐溫-80/0. 5%甲基纖維素溶媒中。陽性對照藥氨 基胍鹽酸鹽，粉劑，以10mg/ml的濃度濃度溶于2%吐溫-80/0. 5%甲基纖維素溶媒中。糖尿病模型的建立及分組所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12小時(shí)，一次性腹腔 注射鏈脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型，STZ劑量為55mg/kg體重。注射72小時(shí)后由尾精脈 取血，用微量血糖儀測定血葡萄糖水平。凡血糖濃度> 300m/dl者作為糖尿病模型鼠，按血 糖水平隨機(jī)平行分為(1)提取物組合物治療組(η = 8)，劑量為500mg/kg，每日一次，灌胃 給藥；(2)氨基胍治療組(η = 8)，劑量為50mg/kg，每日一次，灌胃給藥；(3)模型對照組(η =8)，每日灌胃一次給予相同容量2 %吐溫-80/0. 5 %甲基纖維素溶媒。并另取健康雄性 大鼠8只，作正常對照，每日灌胃一次給予相同容量溶媒液。糖尿病模型穩(wěn)定1周后開始治 療，連續(xù)給藥共12周。觀察指標(biāo)及測定方法實(shí)驗(yàn)期間，每2周測定一次大鼠體重，血糖。血糖測定采用 尾精脈取血，Contour微量血糖儀檢測。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3天代謝籠收集24小時(shí)尿液，計(jì)24小時(shí)尿量，保存尿標(biāo)本，用酶聯(lián)免 疫吸附測試大鼠尿微量白蛋白試劑盒測定24小時(shí)尿白蛋白排出量。組織標(biāo)本收集在療程結(jié)束，腹腔注射巴比妥處死動(dòng)物后，迅速取出胰腺，眼晶狀 體，胸降主動(dòng)脈及腎臟組織標(biāo)本，經(jīng)液氮冷凍后，-80°C冷藏。胰腺，眼晶狀體，胸降主動(dòng)脈及腎皮質(zhì)熒光性AGEs含量測定組織樣本制備參 照Nakayama等人報(bào)導(dǎo)的堿溶性蛋白法進(jìn)行，將組織破碎后，加氯仿-甲醇(2 1)，4°C搖 振過夜脫脂，經(jīng)水化沖洗后，加0. IN NaOH溶液，勻漿，離心取上清液，用熒光分光光度法 (λ ex370/ λ em 440nm)測定其熒光性AGEs含量。以Img BSA/ml 0. IN NaOH溶液熒光值為 1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)任意熒光單位(AU)。組織樣本蛋白質(zhì)含量用Bradford法測定。組織樣本中主要 非熒光性晚期糖基化產(chǎn)物N-羧甲基賴氨酸(N ε -carboxymethyl-lysine CML)，用CML特異 性酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定。大鼠腎臟超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)含量按照試劑盒說明書檢測。大鼠胰腺內(nèi)胰島素免疫組織化學(xué)檢測5 μ m胰腺組織石蠟切片梯度脫蠟水化后， 3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液(O.Olmol/L，pH7. 4)洗滌，正常山羊血清 封閉，依次加入兔抗大鼠胰島素抗體、羊抗兔-Evision 二抗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染，樹脂封 片。顯微鏡下觀察、拍照，陽性部位呈棕黃色。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為(1)車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物治療顯著地增加了實(shí)驗(yàn)性 糖尿病大鼠體重(P < 0.01)，見表2。表2車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠體重 的影響
組別η治療開始體重(g)治療結(jié)束體重(g)正常對照組8218.6±11.0362.5±9.3糖尿病模型8220.6士 10.7265·2±8.5"對照藥物組8216.9±12.5258.6±8.1**受試藥物組8214.6±11.6294.3±7.2**##注表中數(shù)據(jù)為組間平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。與正常對照組比較，< 0. 01 ；與糖尿 病模型組和氨基胍治療組比較，##P < 0. 01。(2)與糖尿病模型組和氨基胍治療組相比，車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提 取物組合物治療顯著地降低了實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖濃度(P < 0. 01)，見圖1。(3)與糖尿病模型組和氨基胍治療組相比，車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提 取物組合物治療顯著增加實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胰島內(nèi)胰島素的合量。如圖2實(shí)驗(yàn)大鼠胰島胰島素免疫化學(xué)染色所示正常對照大鼠胰島呈規(guī)則橢圓 狀，有著很強(qiáng)的棕色胰島素免疫組化染色；而模型對照組大鼠的胰島呈不規(guī)則增生型，胰島 內(nèi)含有大量纖維性組織，極其微弱的胰島素免疫組化染色；經(jīng)氨基胍治療的大鼠胰島內(nèi)胰 島素免疫組化染色較對模型對照組無明顯差異；但經(jīng)車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物治療大鼠的胰島具有相當(dāng)數(shù)量陽性胰島素免疫組化染色。(4)如圖3所示，與糖尿病模型組相比，車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取 物組合物和氨基胍治療顯著地減低糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量。(5)如表3所示，與糖尿病模型組相比，車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取 物組合物和氨基胍治療顯著地減低糖尿病大鼠眼晶狀體內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量。表3 車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠眼 晶狀體內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量影響 注表中數(shù)據(jù)為組間平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。與正常對照組比較，< 0. 001 ；與糖 尿病模組比較，#P < 0. 05，##P < 0. Olo(6)車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物和氨基胍治療顯著地減低 糖尿病大鼠胸降主動(dòng)脈血管壁內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量(表4)表4車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胸降 主動(dòng)脈血管壁內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量影響 注表中數(shù)據(jù)為組間平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。與正常對照組比較，< 0. 001 ；與糖 尿病模組比較，##P < 0.01。(7)車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物和氨基胍治療顯著地減低 糖尿病大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)含量(表5)表5車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎皮 質(zhì)內(nèi)晚期糖基化產(chǎn)物(ACEs)含量的影響
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注表中數(shù)據(jù)為組間平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。與正常對照組比較，< 0. 001 ；與糖 尿病模組比較，##P < 0.01。(8)與糖尿病模型組相比，車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物和氨 基胍治療顯著地減少了實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠24小時(shí)尿蛋白排出量(分別為-32%和-34%)， 見圖9。(9)車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物顯著地增加糖尿病大鼠腎 臟超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量(表6)。表6車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎皮 質(zhì)內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量的影響 注表中數(shù)據(jù)為組間平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。與正常對照組比較，< 0. 001 ；與糖 尿病模組比較，a:P<0. 01 ；與對照藥物組比較，b :P < 0. 01。結(jié)論上述結(jié)果提示車前草，山茱萸，葛根，姜黃活性成分提取物組合物治療能夠 減低AGE在糖尿病大鼠胰腺，眼晶狀體，胸降主動(dòng)脈及腎臟組織的產(chǎn)生和累積；降低血糖， 減少糖尿病大鼠24小時(shí)尿蛋白排出量，提高腎臟組織超氧化物歧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧 化等功效，是一種潛在的防治糖尿病并發(fā)癥的藥物治療方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明從車前草，山茱萸，葛根，姜黃四種植物中 分離提取出的抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物可以和藥用載體相結(jié)合形成藥 物組合物。這些“藥用載體”包括但不限于藥物添加劑，如稀釋劑，粘合劑，表面活性劑， 蕓滑劑，助流劑，崩解劑，包衣材料，增塑劑，著色劑，調(diào)味劑等混和，并根據(jù)配制方法來制 備。稀釋劑包括但不限于纖微素或纖微素衍生物，如微晶纖微素等；淀粉或淀粉衍生物，如玉米淀粉，小麥淀粉，環(huán)糊精等；糖或糖醇，如乳糖，D-甘露糖醇等；無機(jī)稀釋劑如氫氧化鋁 螢?zāi)z，碳酸鈣，鋁硅酸鎂，磷酸氫鈣等。粘合劑可包括羥丙基纖微素，甲基纖微素，羥丙基甲 基纖微素，聚乙烯吡硌烷酮，糊精，支鏈淀粉，羥丙基淀粉，聚乙烯醇，阿拉伯膠，瓊脂，明膠， 聚乙二醇等。表面活性劑可包括蔗糖酯，硬脂酸聚烴氧基酯，聚氧乙烯氫化的蓖麻油，聚氧 乙烯聚丙二醇，失水山梨糖醇倍半油酸酯，失水山梨糖醇三油酸酯，失水山梨糖醇單硬脂酸 酯，失水山梨糖醇單棕與酸酯，聚山梨糖醇，單硬脂酸甘油酯，十二烷基硫酸鈉，月桂基聚乙 二醇等。蕓滑劑可包括硬脂酸，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，滑石等。助流劑可包括無水氫氧化鋁 螢?zāi)z，硅酸鎂等。崩解劑可包括交聯(lián)羧甲基淀粉鈉，交聯(lián)羧甲基纖微素鈉，低取代羥丙基纖 微素和交聯(lián)PVP。包衣材料可包括羥丙基甲基纖微素2910，氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物 E，聚乙烯醇縮乙醛二乙氨基乙酸酯，聚乙二醇6000，氧化鈦等。增塑劑可包括檸檬酸乙酯， 聚乙二醇6000等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法從車前草，山茱萸，葛根，姜黃植物 中分離提取出的抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物與藥用載體相結(jié)合形成的藥 物組合物可通過腸道或者非腸道途徑給藥。腸道給藥制劑包括但不限于膠囊，片劑，乳劑， 水懸浮劑，膠體液，丸劑，顆粒劑，粉劑。非腸道給藥制劑包括但不限于注射劑，霜?jiǎng)?，膏劑?貼劑及噴霧劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法從車前草，山茱萸，葛根，姜黃植物 中分離提取出的抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物也可以配以常規(guī)輔料制成口 服液，丸劑，膠囊劑，片劑及沖劑等劑型形成保健品，或者也可以添加到其他食品中，例如添 加到奶類產(chǎn)品，肉類，香腸，面包，巧克力，糖果，點(diǎn)心，糖果，比薩餅，面條，炒面，牙齦和冰淇 淋，各種湯類，飲料，茶，傳統(tǒng)飲料，果肉果汁，果汁飲料，蔬菜汁，酒類飲品及復(fù)合維生素等 食品中。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以將根據(jù)前述方法形成的活性成分與晶體纖 維素以及玉米淀粉按每300mg膠囊成分中包含250mg前述活性成分、40mg晶體纖維素、IOmg 玉米淀粉的配比形成膠囊。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以將根據(jù)前述方法形成的活性成分與其他成 分相混合形成片劑，以一片500mg的片劑為例，其各種成分的配比如下表表7 車前草，山茱萸，葛根，姜黃抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物藥 用500mg片劑 上述說明已經(jīng)充分揭露了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。需要指出的是，熟悉該領(lǐng)域的 技術(shù)人員對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
所做的任何改動(dòng)均不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求書的范圍。 相應(yīng)地，本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍也并不僅僅局限于前述具體實(shí)施方式
。
權(quán)利要求
一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況的天然植物提取物組合物，其特征在于，其是由車前草、葛根、山茱萸、姜黃四種天然植物中分離提取的，能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的天然植物活性成分提取物經(jīng)優(yōu)化配比組合組成。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述四種天然植物活性成分提取物組合 物，其中各種天然植物的活性成分提取物重量百分比分別為車前草5 85% ；葛根5 85% ；山茱萸5 85% ；姜黃5 85%。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其可用于預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn) 物引起病理狀況。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于所述的糖尿病并發(fā)癥包括加速性心，腦血 管動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病性腎病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，糖尿病性白內(nèi)障，糖尿病性神經(jīng)病變， 糖尿病下肢及足部難愈潰瘍。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其為口服液、丸劑、膠囊劑、片劑、沖劑，乳 劑，水懸浮劑，膠體液，丸劑，顆粒劑，粉劑、注射劑，霜?jiǎng)?，膏劑，貼劑及噴霧劑。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述天然植物提取物組合物可以與藥物 載體相結(jié)合形成藥物組合物。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述天然植物提取物組合物可以添加到 固體或液體食品中形成保健食品或飲料。
8.一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況的天然植物提取物組合藥物的 制備方法，其包括如下步驟分別自車前草，葛根，山茱萸，姜黃中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成 分提取物；將前述植物中分離提取的能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物按一定比 例進(jìn)行經(jīng)優(yōu)化配比組合形成活性成分提取物組合物；將所述活性成分提取物組合物與藥物載體相結(jié)合形成藥物組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于在將所述四種天然植物中的活性成分提取 物進(jìn)行經(jīng)優(yōu)化配比組合形成活性成分提取物組合物時(shí)，各種天然植物的活性成分提取物重 量百分比分別為車前草5 85% ；葛根5 85% ；山茱萸5 85% ；姜黃5 85%。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于從車前草中分離提取能夠抑制晚期糖化終 產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方法包括以下步驟(1)將干燥的車前草粉碎成粗粉； (2)加水煮沸；(3)合并水提液，過濾，減壓濃縮；(4)加無水乙醇于濃縮液，靜置于低溫沉淀 過夜；過濾后的沉淀物經(jīng)無水乙醇洗脫，減壓干燥得粗提物；(5)將干燥的粗提物溶于適量 的水，通過diaion HP-20吸附樹脂柱；分別依次用去離子水和甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液， 干燥后得車前草活性成分提取物。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于從山茱萸中分離提取能夠抑制晚期糖化終 產(chǎn)物形成的活性成分提取物的制備方法包括以下步驟(1)將干燥的山茱萸原料粉碎成粗 粉，加甲醇，加熱回流提??；合并醇提液，經(jīng)濾器過濾；濾液減壓回收甲醇，真空干燥，得山 茱萸粗提取物；(2)將此粗提取物溶于去離子水，然后依次用丁烷和乙酸乙酯萃??；(3)收 集水相溶液，濃縮后通過diaionHP-20附樹脂柱，再分別依次用H20/Me0H梯度洗脫；(4)收 集H20/Me0H洗脫液，冷凍干燥后得山茱萸活性成分提取物。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于從葛根中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn) 物形成的活性成分提取物的制備方法包括以下步驟(1)將干燥葛根原料粉碎成粗粉，加 乙醇進(jìn)行萃?。缓喜⒋继嵋?，濾過，減壓回收乙醇，真空干燥，得葛根乙醇粗提取物；(2)將 葛根乙醇粗提取物溶于純水，然后用乙酸乙酯萃??；(3)收集水相溶液，濃縮后通過diaion HP-20SS吸附樹脂柱，再分別依次用H20/Me0H梯度洗脫；(4)收集甲醇洗脫液，冷凍干燥后 得葛根活性成分提取物。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于從姜黃中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn) 物形成的活性成分提取物的制備方法包括以下步驟(1)將干燥的姜黃干粉加乙醇，加熱 回流提??；(2)合并醇提液，經(jīng)濾器過濾，減壓濃縮回收甲醇后，得到姜黃活性成分提取物。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述藥物組合物為口服液、丸劑、膠囊劑、 片劑、沖劑，乳劑，水懸浮劑，膠體液，丸劑，顆粒劑，粉劑、注射劑，霜?jiǎng)?，膏劑，貼劑及噴霧 劑。
15.一種預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起病理狀況的天然植物提取物組合物的制 備方法，其包括如下步驟分別自車前草，葛根，山茱萸，姜黃中分離提取能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成 分提取物；將前述植物中分離提取的能夠抑制晚期糖化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物按一定比 例進(jìn)行優(yōu)化配比組合形成活性成分提取物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制晚期糖基化終產(chǎn)物形成的天然藥物提取物組合物及其應(yīng)用。具體地說，該組合物以車前草，葛根，山茱萸，姜黃四種天然植物中具有抑制晚期糖基化終產(chǎn)物形成的活性成分提取物為原料經(jīng)優(yōu)化配比組合制備而成。該提取物藥物組合能夠有效的預(yù)防和抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物引起的糖尿病微血管并發(fā)癥和心，腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
文檔編號A61P25/00GK101884767SQ20101019071
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者黃鑫, 黃欽恒 申請人:湖北萬博特生物科技有限公司