專利名稱：用于治療和預(yù)防癌癥的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CAPRIN-I抗體或其片段的新藥物用途，例如，用于癌癥的治療劑和 /或預(yù)防劑。
背景技術(shù)：
癌癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。目前，對癌癥進行的治療主要是外科手術(shù)治療，其可與放射治療和化療法聯(lián)合。盡管近年來開發(fā)了新的手術(shù)方法和發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但是除了一些癌癥之外，癌癥治療的結(jié)果仍未得到大的改善。隨著近年來分子生物學(xué)和癌癥免疫學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定了與癌癥特異性反應(yīng)的抗體、細胞毒T細胞所識別的癌抗原、以及編碼癌抗原的基因，并且對靶向抗原的特異性免疫療法的期望已經(jīng)上升(Tsuyoshi AKIY0SHI, "Gan to Kagaku Ryouhou (癌癥和化療法)”，1997，第 M卷，第 551-519 頁(日本)，(Cancer and Chemotherapy Publishers Inc.，El本))。為減輕副作用，在癌癥治療方法中需要被識別為靶抗原的肽、多肽或蛋白質(zhì)不存在于幾乎所有的正常細胞中，但特異性地存在于癌細胞中。在1991年，比利時路德維希研究所Boon等人通過cDNA表達克隆法，使用自身癌細胞系和癌癥反應(yīng)性T細胞，分離了 CD8陽性T細胞識別的人黑素瘤抗原MAGEl (Bruggen P.等人，Science, 254 :1643-1647, 1991)。此后，報道了 SEREX(通過重組表達克隆法對抗原的血清學(xué)鑒定)方法，其中可應(yīng)用基因表達克隆技術(shù)鑒定腫瘤抗原，其中所述的腫瘤抗原可被通過應(yīng)答于癌癥患者身體中的自身癌癥而產(chǎn)生的抗體所識別(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,92 :11810-11813,1995 ； 和美國專利號5，698，396)。通過SEREX方法，分離了一些基本上不在正常細胞中表達但在癌細胞中特異性表達的癌抗原(Int. J. Cancer, 72 =965-971 (1997) ；Cancer Res. ,58 1034-1041(1998) ；Int.J. Cancer,29 :652-658(1998) ；Int. J. Oncol.，14 :703-708(1999)； Cancer Res. ,56 :4766-4772(1996)；和Hum. Mol· Genet 6 :33_39，1997)。此外，已經(jīng)進行了一些應(yīng)用與癌抗原(其為一些分離的癌抗原)特異性反應(yīng)的免疫細胞、以及使用了包含癌抗原的疫苗等的癌特異性免疫療法的臨床試驗。同時，近年來，已開始存在靶向癌細胞上抗原蛋白質(zhì)的用于癌癥治療的各種抗體藥物。此類用作癌特異性治療劑的藥物展示出某些程度的藥效，并且因此它們已得到了關(guān)注。然而，多數(shù)靶抗原蛋白也表達于正常細胞中。施與抗體后，不僅會損傷癌細胞，而且還會損傷已表達了靶抗原的正常細胞，由此會引起副作用(或反作用)，這成為了一個問題。 因此，人們預(yù)期，如果能夠鑒定在癌細胞表面特異性表達的癌抗原，并且將靶向此類抗原的抗體用作藥物，則利用更少副作用的抗體藥物的治療將能實現(xiàn)。胞質(zhì)和增殖相關(guān)蛋白I(CAPRIN-I)是當(dāng)靜止期的正常細胞被活化或發(fā)生細胞分裂時表達的胞內(nèi)蛋白。CAPRIN-I還是已知與細胞中的RNA形成胞內(nèi)應(yīng)激顆粒并與調(diào)節(jié)mRNA 運輸和翻譯有關(guān)的胞內(nèi)蛋白。CAPRIN-I具有不同的名稱，諸如GPI錨定的膜蛋白1和膜組分表面標(biāo)記1蛋白(MllSl)，似乎這一蛋白被認(rèn)為是膜蛋白。這些不同的名稱源自這樣的報告=CAPRIN-I基因序列最初具有GPI結(jié)合區(qū)并且CAPRIN-I是在大腸癌細胞中表達的膜蛋白(J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995) 后來報導(dǎo)了該報告中描述的 CAPRIN-1 基因序列是不正確的，即，單個核苷酸從GenBank等中目前登記的CAPRIN-I基因序列中的缺失造成移碼，因而導(dǎo)致80個氨基酸從羧基末端缺失，并且因而所得的人為產(chǎn)物(74個氨基酸)是前述報告中所提及的GPI結(jié)合區(qū)；并且在該序列的的5’側(cè)也存在錯誤，由此導(dǎo)致53個氨基酸從氨基端缺失(J. Immunol.，172 =2389-2400,2004)。此外，已經(jīng)報道了由 GenBank等中目前所登記CAPRIN-I基因序列編碼的蛋白質(zhì)不是細胞膜蛋白(J. Immunol.， 172 :2389-2400,2004)。此外，基于J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995 對 CAPRIN-I 是細胞膜蛋白的報告，US 2008/0075722和WO 2005/100998公開了名為MllSl的CAPRIN-I作為癌癥治療抗體藥物的靶可用于癌癥治療，并且將其作為一個細胞膜蛋白；然而，實施例中沒有包含應(yīng)用抗該蛋白的抗體治療癌癥的描述。然而，如J. Immunol.，172 =2389-2400,2004中所報道的那樣，從US 2008/0075722申請以來直到現(xiàn)在，一般認(rèn)為CAPRIN-I不表達在細胞表面，并且因此，顯然僅基于不正確信息即CAPRIN-I是細胞膜蛋白的US 2008/0075722和WO 2005/100998的公開內(nèi)容不應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識。發(fā)明概述發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的一個目標(biāo)是鑒定在癌細胞表面特異性表達的癌抗原蛋白，以及提供靶向此類蛋白的抗體作為癌治療劑和/或預(yù)防劑的用途。解決問題的手段通過深入的研究，通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自睪丸組織的cDNA文庫和來自患乳腺癌的狗的血清，本發(fā)明人已經(jīng)獲得了編碼與存在于荷瘤生物血清中的抗體相結(jié)合的蛋白質(zhì)的cDNA。利用獲得的犬基因和與其同源的人、牛、馬、小鼠和雞的基因，現(xiàn)已制備了具有 SEQ ID NO :2-30偶數(shù)編號(S卩，偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30)所示氨基酸序列的CAPRIN-I 蛋白，以及抗CAPRIN-I蛋白的抗體。此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)CAPRIN-I在乳腺癌、腦腫瘤、 白血病、淋巴癌、肺癌、食道癌、大腸癌、胃癌和腎癌細胞中特異性表達，并且CAPRIN-I蛋白的一部分在此類腫瘤細胞表面特異性表達。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)抗表達于癌細胞表面的 CAPRIN-I部分的抗體能夠損傷(損害)表達CAPRIN-I的癌細胞。這些發(fā)現(xiàn)使得完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明具有以下描述的特征。本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與 CAPRIN-I蛋白、或與包含7個或更多個連續(xù)氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30任一項所示的氨基酸序列，或與偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30任一項的氨基酸序列具有80%或更多、優(yōu)選 85 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多、以及更優(yōu)選95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴癌、肺癌、 食道癌、大腸癌、胃癌和腎癌。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述抗體是具有與下述多肽、或與該多肽的片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體，其中所述的多肽具有SEQ ID N0:37或SEQ ID NO :136所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80 %或更多、優(yōu)選85 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多、以及更優(yōu)選95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實施方案中，在包含作為活性成分的抗體的治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物中，上述抗體是下述抗體(a)至(k)任一項、且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體(a)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(b)包含有包含SEQ ID NO 40,41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO :50、51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(c)包含有包含SEQ ID NO 40,41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 60,61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(e)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(f)包含有包含SEQ ID NO :70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(g)包含有包含SEQ ID NO 80,81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(h)包含有包含SEQ ID NO :90,91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(i)包含有包含SEQ ID NO 100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(j)包含有包含SEQ ID NO :110、111和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(k)包含有包含SEQ ID NO :120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO =124,125和1 所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。發(fā)明效果本發(fā)明使用的抗CAPRIN-I抗體損傷(或損壞)癌細胞。因此，此類抗CAPRIN-I 抗體可用于治療或預(yù)防癌癥。附圖簡述

圖1顯示了編碼CAPRIN-I蛋白的基因在正常組織和腫瘤細胞系中的表達模式。 在這一附圖中，參考編號1代表每一編碼CAPRIN-I蛋白的基因的表達模式，并且參考編號 2代表GAPDH基因的表達模式。圖2顯示了抗CAPRIN-I抗體(或抗-CAPRIN-I抗體)對表達CAPRIN-I基因的乳腺癌細胞系(T47D)的細胞毒活性。在這一附圖中，參考編號3顯示了添加抗-CAPRIN-I抗體后的活性，參考編號4顯示了添加對照抗體后的活性，以及參考編號5顯示了不存在任何抗體時的活性。圖3顯示了抗CAPRIN-I抗體(或抗-CAPRIN-I抗體)對表達CAPRIN-I基因的乳腺癌細胞系(MDA-MB-157)的細胞毒活性。在這一附圖中，參考編號6顯示了添加抗-CAPRIN-I 抗體后的活性，參考編號7顯示了添加對照抗體后的活性，以及參考編號8顯示了不存在任何抗體時的活性。圖4顯示了對表達CAPRIN-I基因的乳腺癌MDA_MB_157細胞系的細胞毒性，其中該細胞毒性由與癌細胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I單克隆抗體(即單克隆抗體#1至#11)所顯示。具體地，這一附圖顯示了添加#1抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號9)、#2抗CAPRIN-I 單克隆抗體(參考編號10)、#3抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號11)、#4抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號12)、#5抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號13)、#6抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號14)、#7抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號15)、#8抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號16)、#9抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號17)、#10抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號18)、以及#11抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號19)后的活性水平，添加與CAPRIN-I蛋白本身反應(yīng)但不與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的活性水平(參考編號 20)，以及添加PBS代替每一抗體后的活性水平(參考編號21)。圖fe至5c顯示了與癌細胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I單克隆抗體(即單克隆抗體 #1至#11)對Balb/c小鼠的抗腫瘤活性，其中向該小鼠移植了表達CAPRIN-I的小鼠癌CD6 細胞系。這些附圖顯示了施與#1抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號22)、#2抗CAPRIN-I 單克隆抗體(參考編號23)、#3抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號24)、#4抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號25)、#5抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號26)、#6抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號27)、#7抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號28)、#8抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號29)、#9抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號30)、#10抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號31)、以及#11抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號32)后的小鼠腫瘤大小，施與和CAPRIN-I蛋白本身反應(yīng)但不與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號33)，以及施與PBS代替每一抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號34)。圖6a至6c顯示了與癌細胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I單克隆抗體(即單克隆抗體 #1至#11)對Balb/c小鼠的抗腫瘤活性，其中向該小鼠移植了表達CAPRIN-I的小鼠癌NlE 細胞系。這些附圖顯示了施與#1抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號35)、#2抗CAPRIN-I 單克隆抗體(參考編號36)、#3抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號37)、#4抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號38)、#5抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號39)、#6抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號40)、#7抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號41)、#8抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號42)、#9抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號43)、#10抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號44)、以及#11抗CAPRIN-I單克隆抗體(參考編號45)后的小鼠腫瘤大小，施與和CAPRIN-I蛋白本身反應(yīng)但不與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號46)，以及施與PBS代替每一抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號47)。實施本發(fā)明的實施方案如下所述，可通過體內(nèi)檢查荷瘤動物的腫瘤生長抑制，或通過體外檢查是否展示了對表達下述多肽的腫瘤細胞的免疫細胞介導(dǎo)的或補體介導(dǎo)的細胞毒活性，從而評估本發(fā)明中使用的偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2-30任一項所示多肽的抗體的抗腫瘤活性。
此外，編碼由偶數(shù)編的SEQ ID NO :2至30(即，SEQ ID NO :2、4、6...沘和30)所示氨基酸序列組成的蛋白的多核苷酸序列分別顯示于奇數(shù)編號的SEQ ID而1至四(即， SEQ ID NO :1,3,5...27 和 29)。本發(fā)明公開的序列表中SEQ ID NO :6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是(PRIN-1 蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其是通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自犬睪丸組織的cDNA文庫以及來自患乳腺癌的犬的血清，作為能與特異性地存在于來自荷瘤犬的血清中的抗體結(jié)合的多肽， 從而分離得到的；SEQ ID NO :2和4中顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的人同源物而分離的CPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ ID NO 16顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的牛同源物而分離的CPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ IDNO 18顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的馬同源物而分離的CPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ ID而20至觀(偶數(shù)編號)顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的鼠科動物同源物而分離的CPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列；以及SEQ ID NO :30顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的雞同源物而分離的 CPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列(參見以下描述的實施例1)。已知當(dāng)處于靜止期的正常細胞發(fā)生活化或細胞分裂時表達CAPRIN-I。已知CAPRIN-I不在細胞表面表達。然而，作為與本發(fā)明相關(guān)的檢查的結(jié)果，現(xiàn)已揭示CAPRIN-I的某些部分表達于多種癌細胞表面。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用與CAPRIN-I蛋白中在癌細胞表面表達的那部分結(jié)合的抗體。CAPRIN-I蛋白中在癌細胞表面表達的部分肽的實例包括由序列表中偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2至30 (SEQ ID NO :6和18除外)任一項所示氨基酸序列的氨基酸殘基No.(或氨基酸(aa) )50-98，或氨基酸殘基No. (aa) =233-305 的區(qū)域中7個或更多個連續(xù)氨基酸組成的多肽。其具體的實例包括SEQ ID NO 37或136 所示氨基酸序列(優(yōu)選地，SEQ ID NO 136所示氨基酸序列中SEQ ID NO :137或138所示的氨基酸序列區(qū)域)，或與所述氨基酸序列具有80 %或更多、優(yōu)選85 %或更多、更優(yōu)選90 % 或更多、以及更優(yōu)選95%或更多序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體包括能與上述肽結(jié)合且具有抗腫瘤活性的所有抗體。如上所述的可用于本發(fā)明的抗CAPRIN-I抗體可以是任意類型的抗體，只要它們能夠展示出抗腫瘤活性。其實例包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFV)、及其片段，諸如Fab和F(ab' )2。可通過本領(lǐng)域公知的方法制備這些抗體及其片段。在本發(fā)明中，能夠與CAPRIN-I蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體是所期望的。此類抗體優(yōu)選為單克隆抗體，然而，只要能穩(wěn)定地產(chǎn)生同質(zhì)抗體，也可使用多克隆抗體。此外，如果受試者是人，則人抗體或人源化抗體是所期望的，以避免或抑制免疫排斥。本文所使用的詞語“與CAPRIN-I蛋白特異結(jié)合”是指目的抗體與CAPRIN-I蛋白特異性地結(jié)合并且基本上不與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。如下所述，可通過體內(nèi)檢查荷瘤動物的腫瘤生長抑制，或通過體外檢查是否展示了對表達所述多肽的腫瘤細胞的免疫細胞介導(dǎo)的或補體介導(dǎo)的細胞毒活性，從而評估本發(fā)明所使用的抗體的抗腫瘤活性。此外，需要本發(fā)明的癌癥治療和/或預(yù)防的受試者是哺乳動物，諸如人、寵物、家畜或競技動物。優(yōu)選的受試者是人。以下將解釋本發(fā)明相關(guān)的抗原的制備、抗體以及藥物組合物的制備。
<用于制備抗體的抗原的制備>本發(fā)明中使用的用作敏化抗原以獲得抗CAPRIN-I抗體的蛋白質(zhì)或其片段不限于其來源，諸如動物，例如人、犬、牛、馬、小鼠、大鼠和雞。然而，優(yōu)選根據(jù)與用于細胞融合的親本細胞的相容性選擇此類抗體或其片段。通常優(yōu)選衍生自哺乳動物的蛋白質(zhì)，尤其優(yōu)選衍生自人的蛋白質(zhì)。例如，如果CAPRIN-I是人CAPRIN-I，可使用人CAPRIN-I蛋白，其部分肽， 或能夠表達人CAPRIN-I的細胞。 例如可通過登錄GenBank (NCBI，USA)和應(yīng)用BLAST或FASTA算法(Kar 1 in和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877,1993 ；Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997)獲得人CAPRIN-I和其同源物的核苷酸序列和氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)將人CAPRIN-I的核苷酸序列(SEQ ID NO :1或3)或氨基酸序列 (SEQ ID NO :2或4)用作基礎(chǔ)序列時，靶標(biāo)是每一個由與該基礎(chǔ)核苷酸序列或氨基酸序列的ORF或成熟部分的核苷酸序列或氨基酸序列具有70 % -100 %、優(yōu)選80 % -100 %、更優(yōu)選 90% -100%、以及更優(yōu)選 95% -100% (例如，97% -100%,98% -100%,99% -100%或 99. 5% -100% )序列同一性的序列組成的核酸或蛋白質(zhì)。本文所使用的術(shù)語“％序列同一性”是指，在引入或不引入缺口以比對兩個序列從而達到最大相似度的情況下，同一的氨基酸(或核苷酸)數(shù)對氨基酸(或核苷酸)總數(shù)的百分比(％ )。CAPRIN-I蛋白的片段長度為由抗體識別的抗原最小單位的表位(或抗原決定簇) 氨基酸長度至小于該蛋白質(zhì)的全長。所述表位是指在哺乳動物、優(yōu)選在人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段。該多肽片段的最小單位由約7至12個氨基酸組成，例如8至11個氨基酸。其具體的實例是SEQID NO :37、SEQ ID NO :137或SEQ ID NO :138所示氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有80 %或更多、優(yōu)選85 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多、以及更優(yōu)選95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。包含前述人CAPRIN-I蛋白及其部分肽的多肽可根據(jù)化學(xué)合成方法合成，諸如Fmoc法(芴甲氧羰基法)或tBoc法(叔丁氧羰基法)法(Japanese Biochemical Society (編著)，生物化學(xué)實驗教程(Seikagaku Jikken Kouza) 1，蛋白質(zhì)化學(xué)IV，化學(xué)修飾與肽合成，Kagaku-dojin Publishing Company，he.，日本，1981)。另外，可應(yīng)用多種市售的肽合成儀根據(jù)常規(guī)技術(shù)來合成所述多肽。此外，可通過應(yīng)用已知的基因工禾呈方法(Sambrook 等，Molecular Cloning，第 2 片反，Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press ;Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology,第 3 版，A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995)，John Wiley & Sons，等)制備編碼上述多肽的多核苷酸，將每一多核苷酸整合至表達載體中并將載體導(dǎo)入宿主細胞，由此允許該宿主細胞產(chǎn)生所述多肽，從而獲得目標(biāo)多肽。通過此類方法，可獲得期望的多肽。通過已知的基因工程技術(shù)或使用市售核酸合成儀的常規(guī)技術(shù)，可以容易地制備編碼上述多肽的多核苷酸。例如，可以通過PCR，使用人染色體DNA或cDNA文庫作為模板和所設(shè)計的能夠擴增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的引物對制備包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA。PCR條件可以適當(dāng)?shù)卮_定。例如，此類條件可包括進行30次由以下組成的反應(yīng)步驟(作為每一循環(huán))循環(huán)94°C，30秒(變性)；55°C，30秒至1分鐘(退火)；以及在72°C，2分鐘(延伸)，使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和含Mg2+的PCR緩沖液，隨后在完成30個循環(huán)后在72°C反應(yīng)7分鐘。然而，本發(fā)明不限于上述示范性PCR 條件。PCR 技術(shù)和條件在例如 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology，第 3 版，Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,1995, John Wiley & Sons (特別是第15章)中得以描述。另外，可以基于本文描述的序列表中SEQ ID NO 1至30所示的核苷酸序列和氨基酸序列的信息制備適當(dāng)?shù)奶结樅鸵铮⑶矣么祟愄结樅弦锖Y選人cDNA文庫等，從而可分離目的DNA。此類cDNA文庫優(yōu)選地從表達偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2至30中任一所示蛋白質(zhì)的細胞、器官或組織制備。細胞或組織的實例包括來自睪丸和癌或腫瘤，諸如白血病、乳腺癌、淋巴瘤、腦腫瘤、肺癌和大腸癌的細胞或組織。上文所述的操作，諸如探針或引物的制備、cDNA文庫的構(gòu)建、cDNA文庫的篩選和目的基因的克隆，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且它們例如可以根據(jù) Sambrook 等人，Molecular Cloning，第 2 版，Current Protocols in Molecular Biology, (1989)，Ausubel等人(同上)中所述的方法實施。編碼人CAPRIN-1 蛋白及其部分肽的DNA可從由此獲得的DNA中獲得。上述宿主細胞可以是任意細胞，只要它們可表達上述多肽。原核宿主細胞的實例包括但不限于大腸桿菌。真核宿主細胞的實例包括但不限于哺乳動物細胞，諸如猴腎細胞(COS 1)、中國倉鼠卵巢細胞(CH0)、人胚腎細胞系(HEK293)和胎小鼠皮膚細胞系 (NIH3T3)；酵母細胞，諸如出芽酵母細胞和分裂酵母細胞；家蠶細胞和爪蟾卵細胞。當(dāng)使用原核細胞作為宿主細胞時，可使用具有可在原核細胞中復(fù)制的起點、啟動子、核糖體結(jié)合位點、多克隆位點、終止子、耐藥基因和營養(yǎng)缺陷型互補基因等的表達載體。 大腸桿菌表達載體的實例可以是pUC載體、pBluescriptll、pET表達系統(tǒng)、pGEX表達系統(tǒng)等?？梢詫⒕幋a上述多肽的DNA整合至這種表達載體，用此種載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞，并且然后培養(yǎng)由此得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，因此，可以在原核宿主細胞中表達由該DNA編碼的多肽。在這種情況下，該多肽還可作為與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白表達。當(dāng)使用真核細胞作為宿主細胞時，使用具有啟動子、剪接區(qū)和聚腺苷酸添加位點等的真核細胞表達載體。此類表達載體的實例包括pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、 pBK-CMV、pBK-RSV、EBV載體、pRS、pcDNA3和pYES2。通過與上述方法類似的方法，將編碼上述多肽的DNA整合至這種表達載體，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細胞，并且隨后培養(yǎng)由此獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，由此，可以在真核宿主細胞中表達由所述DNA編碼的多肽。當(dāng)使用pIND/ V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達載體時，可作為與標(biāo)簽的融合蛋白表達上述多肽，所述標(biāo)簽諸如His標(biāo)簽(例如，(His)6至(His)ltl)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或GFP。為將表達載體引入宿主細胞中，可使用公知的方法，諸如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、病毒感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或與細胞膜透過性肽結(jié)合。可通過聯(lián)合使用已知的分離技術(shù)從宿主細胞分離和純化目的多肽。此類已知技術(shù)的實例包括但不限于用變性劑如脲或表面活性劑處理法、超聲破碎法、酶消化法、鹽析、溶劑分級沉淀法、透析法、離心法、超濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGE、等電點聚焦電泳、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法和反相層析法。<抗體結(jié)構(gòu)>一般地，抗體是異多聚糖蛋白，其每一個包含至少兩個重鏈和兩個輕鏈。同時，除IgM之外的抗體均是每一個包含兩個相同輕(L)鏈和兩個相同重(H)鏈的異四聚體糖蛋白 (約150kDa)。一般地，每一輕鏈通過單共價二硫鍵與重鏈相連。然而，重鏈之間的二硫鍵數(shù)在不同的免疫球蛋白同種型之間是不同的。每一個重鏈和輕鏈還具有鏈內(nèi)二硫鍵。每一重鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH區(qū))，一些恒定區(qū)與其順序地相連。每一輕鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL區(qū))，并且在其相反端具有單恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對齊，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)R?？贵w可變結(jié)構(gòu)域的稱為“互補決定區(qū) (CDR)，，的特定區(qū)域展現(xiàn)出特定的變異性，由此賦予抗體的結(jié)合特異性?？勺儏^(qū)中相對保守的部分稱為“構(gòu)架區(qū)(FR) ”。完整的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含4個FR，它們通過3個CDR 彼此相連。此類⑶R以從重鏈N端開始的順序分別稱為“⑶RHl”、“⑶RH2”和“⑶RH3”。類似地，對于輕鏈，它們分別被稱為“⑶RL1”、“⑶RL2”和“⑶RL3”。⑶RH3對抗體-抗原結(jié)合特異性而言起著最重要的作用。此外，每一鏈中的CDR通過FR區(qū)而保持它們彼此接近的狀態(tài)，并且它們與相應(yīng)鏈的CDR —起形成抗體-抗原結(jié)合位點。恒定區(qū)不直接對抗原-抗體結(jié)合起作用。然而，它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子作用，諸如與抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性 (ADCC)、通過結(jié)合Fc γ受體的吞噬作用，通過新生兒Fc受體(Fcfoi)的半壽期/清除速率、 以及通過補體級聯(lián)中的Clq的補體依賴性細胞毒性(⑶C)。<抗體制備>本發(fā)明使用的術(shù)語“抗-CAPRIN-I抗體”是指具有與全長CAPRIN-I蛋白或其片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體。本文所使用的術(shù)語“免疫學(xué)反應(yīng)性，，表示抗體在體內(nèi)結(jié)合CAPRIN-I抗原的性質(zhì)。 損傷腫瘤的功能(例如，死亡、抑制或消退)可通過此類結(jié)合的結(jié)果而發(fā)揮出來。特別地， 任意類型的抗體均可用于本發(fā)明，只要該抗體可與CAPRIN-I蛋白結(jié)合從而損傷腫瘤或癌， 諸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、腦腫瘤、肺癌、食道癌、胃癌、腎癌或大腸癌。此類抗體的實例包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗體、 人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab' )2)。此外，此類抗體任意的免疫球蛋白類型的實例包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，并且任意的免疫球蛋白亞類的實例包括 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。除了糖基化之外，抗體還可通過乙?；?、甲?；?、酰胺化、磷酸化或聚乙二醇化 (PEG)而得以修飾。各種抗體的制備實例如下所述。在目標(biāo)抗體是單克隆抗體的情況下，將表達CAPRIN-I的乳腺癌SK-BR-3細胞系等施與小鼠用于免疫，隨后從該小鼠提取脾臟。從每一脾臟分離細胞，然后將其與小鼠骨髓瘤細胞融合。從所得到的融合細胞(雜交瘤)篩選能夠產(chǎn)生具有癌細胞生長抑制作用的抗體的克隆。分離和培養(yǎng)產(chǎn)生具有癌細胞生長抑制作用的單克隆抗體的雜交瘤。可通過一般的親和純化方法從培養(yǎng)上清液中純化制備目標(biāo)抗體。此外，還可例如通過以下描述的方式制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。首先，通過已知方法用敏化抗原免疫動物。在一般的方法中，通過腹膜內(nèi)或皮下注射敏化抗原至哺乳動物而實施免疫。具體地，將敏化抗原稀釋或懸浮于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、生理鹽水等中至合適的結(jié)果量。如需要的話，在其中混合合適量的常規(guī)佐劑(例如，弗氏完全佐劑)。發(fā)生乳化后，每4至21天地將產(chǎn)物施與哺乳動物數(shù)次。此外，可與敏化抗原一起使用足夠的載體用于免疫。如上所述，免疫哺乳動物并確定升高至期望的血清抗體水平之后，從該哺乳動物收集免疫細胞，并進行融合。免疫細胞的特別優(yōu)選的實例是脾細胞。將哺乳動物骨髓瘤細胞用作相關(guān)的親本細胞，進行與上述免疫細胞的融合。對于此類骨髓瘤細胞，優(yōu)選使用已知細胞系的以下實例P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)、P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81，1-7)、NS-1 (Kohler. G.和 Milstein，C. Eur. J. Immunol. (1976) · 6，511-519)、MPC-Il (Margulies. D. H.等，Cell (1976)8,405-415)、 SP2/0(Shulman，M.等，Nature (1978) 276，269-270)、FO (de St. Groth, S. F.等，J. Immunol. Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)和 R210 (Galfre, G.等，Nature (1979) 277，131-133)?；旧峡筛鶕?jù)已知的方法，諸如Kohler和Milstein等(Kohler，G.和Milstein， C. Methods Enzymo 1. (1981)73,3-46)的方法，進行免疫細胞和上述骨髓瘤細胞的細胞融
口 O更具體地，例如在含有常規(guī)營養(yǎng)物的培養(yǎng)溶液中、在細胞融合促進劑的存在下進行上述細胞融合。可使用的融合促進劑的實例包括聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒(HVJ 日本血凝病毒)。如需要的話，可進一步添加諸如二甲亞砜的佐劑，用于提高融合效率。可任意地確定所使用的免疫細胞和所使用的骨髓瘤細胞之間的比例。例如，免疫細胞對骨髓瘤細胞的比例優(yōu)選為1 1至10 1。可用于上述細胞融合的培養(yǎng)液的實例包括可滿足上述骨髓瘤細胞系生長的RPMI1640培養(yǎng)液和MEM培養(yǎng)液，以及用于這一細胞培養(yǎng)類型的其他常規(guī)培養(yǎng)液。此外，可與其聯(lián)合使用血清替代物，諸如胎牛血清(FCS)。為進行細胞融合，將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞以預(yù)定量在培養(yǎng)液中充分混合。 將之前加熱至約37°C的PEG溶液(例如，平均分子量約1000至6000)以一般地30%至 60% (w/v)的濃度加入其中，隨后混合。這使得形成了目標(biāo)雜交瘤。隨后，重復(fù)地進行相繼地添加合適的培養(yǎng)基和通過離心移除上清液的操作步驟，從而移除不適于雜交瘤生長的細胞融合劑等。在常規(guī)的選擇培養(yǎng)液諸如HAT培養(yǎng)液(包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液) 中培養(yǎng)如此獲得的雜交瘤，用于選擇。持續(xù)地進行在諸如HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)足以使目標(biāo)雜交瘤之外的細胞(非融合細胞)死亡的時間(一般為數(shù)天至數(shù)周)。接下來，應(yīng)用常規(guī)的有限稀釋方法篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤，并得到單克隆。此外，還可能用以下方式獲得產(chǎn)生具期望活性(例如，細胞生長抑制活性)的人抗體的雜交瘤，以及通過用抗原免疫非人動物獲得上述雜交瘤。用蛋白質(zhì)、表達蛋白的細胞或其溶胞產(chǎn)物在體外敏化人淋巴細胞(例如，用EB病毒感染的人淋巴細胞)，并將敏化的淋巴細胞與能永久分裂的人來源的骨髓瘤細胞(例如似66)(登錄號TIB196)融合?？稍诔Ｒ?guī)培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)如上產(chǎn)生的產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤。此外，可將它們保存于液氮中一段時間。特別地，根據(jù)常規(guī)免疫方法使用期望的抗原或表達期望抗原的細胞作為敏化抗原進行免疫。通過常規(guī)細胞融合方法將得到的免疫細胞與公知的親本細胞融合。然后，通過常規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞(雜交瘤)。因此，可進行抗體制備。
可用于本發(fā)明的抗體的其他實例包括多克隆抗體。例如，可應(yīng)用如下描述的方法獲得多克隆抗體。通過用天然存在的CAPRIN-I蛋白、作為與GST等融合的蛋白在諸如大腸桿菌的微生物中表達的重組CAPRIN-I蛋白、或其部分肽免疫諸如小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠、或兔的小動物，從而獲得血清。通過硫酸銨沉淀、蛋白A/蛋白G柱層析、DEAE離子交換層析、親和柱層析(使用偶聯(lián)了 CAPRIN-I蛋白或合成肽的柱子)、或用于制備多克隆抗體的類似技術(shù)，純化血清。在以下描述的實施例中，制備了兔多克隆抗體，并確認(rèn)了其抗腫瘤效果，該抗體針對在癌細胞表面表達的CAPRIN-I蛋白質(zhì)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域的部分肽(具有SEQ ID NO 37所示序列)。本文所使用的已知產(chǎn)人抗體小鼠例如是KM小鼠(Kirin Pharma/Medarex)或 XenoMouse (Amgen)(例如 W002/43478 和 W002/092812)。當(dāng)用 CAPRIN-I 蛋白或其片段免疫此類小鼠時，可從血液中獲得完全的人多克隆抗體。此外，可通過將收集自經(jīng)免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合的方法制備人單克隆抗體?？筛鶕?jù)諸如應(yīng)用動物細胞的方法(日本專利公開，特表2007-530068號)或應(yīng)用桿狀病毒的方法(例如，W098/46777)的方法制備抗原。如果抗原的免疫原性低的話，將抗原與具有免疫原性的大分子(諸如白蛋白)結(jié)合。然后，可將該抗原用于免疫。此外，可使用基因重組抗體，所述重組抗體通過從雜交瘤克隆抗體基因，將該克隆整合至適當(dāng)?shù)妮d體，將該載體引入宿主，并應(yīng)用基因重組技術(shù)制備。(例如，參見， Carl, Α. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,由 MACMILLANPUBLISHERS LTD在英國出版，1990)。具體地，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶從雜交瘤mRNA合成抗體的可變區(qū)(V區(qū))cDNA。獲得編碼目標(biāo)抗體V區(qū)的DNA后，將此類DNA與所期望的編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接。將得到的產(chǎn)物整合至表達載體。備選地，可將編碼抗體V 區(qū)的DNA整合至包含抗體C區(qū)DNA的表達載體中。將此類DNA整合至表達載體中，以使得其在諸如增強子或啟動子的表達控制區(qū)的控制下表達。之后，用此類表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，由此使得抗體表達。本發(fā)明的抗-CAPRIN-I抗體優(yōu)選為單克隆抗體。然而，它們可以是多克隆抗體、基因修飾的抗體(諸如嵌合抗體和人源化抗體)等。單克隆抗體包括人單克隆抗體和非人動物單克隆抗體(例如，小鼠單克隆抗體、 大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體和雞單克隆抗體)?？赏ㄟ^培養(yǎng)雜交瘤獲得單克隆抗體，其中通過骨髓瘤細胞和來自用CAPRIN-I蛋白免疫的非人哺乳動物(例如，小鼠或產(chǎn)生人抗體的小鼠)的脾細胞的融合獲得所述雜交瘤。在以下描述的實施例中，產(chǎn)生了小鼠單克隆抗體并證實了其抗腫瘤作用。此類單克隆抗體包含具有SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 83,SEQ ID NO 93、SEQ ID NO 103,SEQ ID NO :113 或 SEQ ID NO :123 所示氨基酸序列的重鏈可變(VH)區(qū)，和具有 SEQ ID NO 47,SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO :63、 SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 77, SEQ ID N0:87、SEQ ID NO 97, SEQ ID NO :107、SEQID N0: 117或SEQ ID NO :127所示氨基酸序列的輕鏈可變(VL)區(qū)。此處，該VH區(qū)包含由SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :80、SEQID NO :90、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO :110 或 SEQ ID NO 120 的氨基酸序列表示的 CDRl ；由 SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO 81、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:101、SEQ ID NO :111 或 SEQ ID NO :121 的氨基酸序列表示的 CDR2 ；以及由 SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 72, SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO :112或SEQ ID NO : 122的氨基酸序列表示的CDR3。該VL區(qū)包含由SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :74、 SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :94、SEQ ID NO :104、SEQID NO :114 或 SEQ ID NO :124 的氨基酸序列表示的 CDRl ；由 SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :105、SEQID NO :115 或 SEQ ID NO :125 的氨基酸序列表示的 CDR2 ；以及由 SEQID NO 46、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :96、SEQ ID NO :106, SEQ ID NO :116 或 SEQ ID NO 126 的氨基酸序列表示的 CDR3。嵌合抗體是通過組合來自不同動物的序列所產(chǎn)生的抗體。其實例是由小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，以及人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)組成的抗體?？赏ㄟ^公知的方法制備此類嵌合抗體。例如，可通過連接編碼抗體V區(qū)的DNA至編碼人抗體C區(qū)的DNA，將產(chǎn)物整合至表達載體，并將該載體引入用于抗體制備的宿主細胞，從而產(chǎn)生此類嵌合抗體。多克隆抗體包括通過用CAPRIN-I抗體免疫產(chǎn)生人抗體的動物(例如小鼠)而獲得的抗體。人源化抗體是經(jīng)修飾的抗體，其有時也稱為“重構(gòu)人抗體”。公知通過將來自免疫動物的抗體的CDR移植至人抗體互補決定區(qū)從而構(gòu)建人源化抗體。這種一般的基因重組技術(shù)也是公知的。具體地，通過PCR方法合成被設(shè)計以允許小鼠抗體⑶R與人抗體構(gòu)架區(qū)(FR)連接的DNA序列，其中所述的PCR使用了若干個如下方式制備的寡核苷酸，即該寡核苷酸具有在其一端與彼此重疊的部分?？赏ㄟ^將上面得到的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接、將產(chǎn)物整合至表達載體、并將該載體引入用于產(chǎn)生抗體的宿主細胞中，從而獲得人源化抗體 (參見EP-A-239400和W096/02576)。以下述假設(shè)選擇通過CDR彼此相連的人抗體FR，即互補決定區(qū)能夠形成良好的抗原結(jié)合位點。如果需要的話，也可以以下述方式替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸，即，使得重構(gòu)人抗體中的互補決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合位點 (Sato K.等，Cancer Researchl993，53 :851-856)。此外，還可用來自不同人抗體的構(gòu)架區(qū)替換該構(gòu)架區(qū)(參見W099/51743)。以下述假設(shè)選擇通過CDR彼此相連的人抗體構(gòu)架區(qū)，即互補決定區(qū)能夠形成良好的抗原結(jié)合位點。如果需要的話，也可以以下述方式替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸，即，使得重構(gòu)人抗體中的互補決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合位點(Sato K.等，Cancer Research 1993,53:851-856)。產(chǎn)生了嵌合抗體或人源化抗體后，可替換可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)或恒定區(qū)中的氨基酸，例如，用不同的氨基酸替換。本文中，所述的氨基酸替換是，例如，少于15、少于10、不超過8、不超過7、不超過 6、不超過5、不超過4、不超過3或不超過2個氨基酸，優(yōu)選1至5個氨基酸，以及更優(yōu)選1或 2個氨基酸的替換。經(jīng)替換的抗體應(yīng)當(dāng)在功能上與未替換的抗體等價。替換優(yōu)選是保守氨基酸替換，即在電荷、側(cè)鏈、極性、芳香性等方面具有類似性質(zhì)的氨基酸之間的替換。例如， 可將性質(zhì)相似的氨基酸歸類為以下類型堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)；酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；不帶電極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和酪氨酸)；非極性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)；支鏈氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)；以及芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸)?？贵w修飾物的一個實例是與諸如聚乙二醇(PEG)的分子連接的抗體。就本發(fā)明的抗體修飾物而言，與抗體結(jié)合的物質(zhì)不受限制?？赏ㄟ^化學(xué)修飾所獲得的抗體而得到此類抗體修飾物。在本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中已建立起此類修飾的方法。本文所使用的表達“功能上等價的”表示這樣的情況，即其中目標(biāo)抗體具有與本發(fā)明抗體類似的生物學(xué)或生物化學(xué)活性。特別地，此類抗體具有損壞腫瘤的功能，并且當(dāng)施與人類時基本上不會引起排斥反應(yīng)。此類活性的實例是細胞生長抑制活性或結(jié)合活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于制備與給定的多肽功能上等價的多肽的公知方法是包括將突變引入多肽的方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定點誘變方法 (Hashimoto-Gotoh, Τ.等，(1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ.，和 Smith, Μ. (1983) Methods Enzymo1. 100,468-500 ；Kramer,W.等，(1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 ； Kramer, W.禾口 Fritz, HJ.，(1987)Methods Enzymo1. 154,350-367 ；Kunke1, ΤΑ.，(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82，488-492 ；或Kunkel (1988)Methods Enzymo 1. 85，2763-2766) 或類似方法將突變適當(dāng)?shù)匾氡景l(fā)明的抗體。由此可制得與本發(fā)明的抗體功能上等價的抗體。前述能夠識別由抗-CAPRIN-I抗體識別的CAI3RIN-I蛋白表位的抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法獲得。例如，其可通過以下方法獲得包括通過一般的方法(例如， 表位作圖)確定由抗-CAPRIN-I抗體識別的CAPRIN-I蛋白表位，并應(yīng)用具有該表位所含氨基酸序列的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的方法；或包括確定通過一般的方法產(chǎn)生的抗體的表位，以及篩選具有與抗-CAPRIN-I抗體同一的表位的抗體的方法。本文中，“表位”是指在哺乳動物尤其是人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段。其最小的單位由約7至12個氨基酸組成，優(yōu)選由8至11個氨基酸組成。本發(fā)明抗體的親和常數(shù)Ka(k。n/k。ff)優(yōu)選為至少107ΜΓ\至少ΙΟ 1、至少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IOiciIT1、至少 5 X IOiciIT1、至少 IO11ITi、至少 5 X IO11M-1、至少 IO12IT1、或至少 1013ΜΛ本發(fā)明的抗體可與抗腫瘤劑綴合?？赏ㄟ^間隔子實現(xiàn)抗體和抗腫瘤劑之間的結(jié)合，其中所述的間隔子具有與氨基、羧莖、羥基、硫醇基等反應(yīng)的基團(例如，亞胺基琥珀酸酯基團、甲?；?-吡啶基二硫基、馬來酰亞胺基、烷氧羰基或羥基)?？鼓[瘤劑的實例包括以下在參考文獻中公知的抗腫瘤劑等紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、硫替派、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa, 卡波醌、美妥替哌、uredopa、六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)、三輕甲蜜胺(trimethyIoIomelamine)、布拉他辛(bullatacin)、布拉它辛酮(bullatacinone)、喜樹堿、苔蘚抑素、callystatin、 cryptophycin 1、cryptophycin 8、多拉司他汀、duocarmycin、eleutherobin、/K鬼蕉喊 (pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氫氯化氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、膽留醇對苯乙酸氮芥、松龍苯芥、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥、亞硝脲氮芥、吡葡亞硝脲、福替目丁、環(huán)己亞硝脲、嘧啶亞硝脲、雷諾氮芥、calicheamicirudynemicin、氯膦酸鹽、esperamicin、阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、重氮乙酰絲氨酸、爭光霉素、放線菌素C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、放線菌素、detorbicin、6_重氮基_5_氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧正定霉素、麻西羅霉素、絲裂霉素C、 霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、 鏈黑菌素、鏈脲霉素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星、二甲葉酸、蝶羅呤、曲美沙特、氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、2-氨基嘌呤-6-硫醇、環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、5-氟脫氧尿苷、雄激素諸如二甲睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯、氨基苯乙哌啶酮、米托坦、曲洛司坦、 frolinic acid、醋葡內(nèi)酯、醛磷酰胺苷、氨基硐戊酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比山群、依達曲沙、defofamine、脫羰秋水仙堿、亞胺醌氨酯、elfornithine、依利醋銨、環(huán)氧聚微管素、乙環(huán)氧啶、蘑菇多糖、氯尼達明、美登素、安絲菌素(ansamitocine)、丙脒腙、米托蒽醌、mopidanmol, nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰胼、甲基芐胼、丙亞胺、根霉素、裂裥菌素、鍺螺胺、細格孢氮雜酸、三亞胺醌、桿孢菌素A、蛇形菌素(anguidine)、氨基甲酸乙酯、去乙酰長春酰胺、氮烯唑胺、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、 二溴衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷、加環(huán)利定、紫杉萜、苯丁酸氮芥、吉西他濱、6-硫代鳥嘌呤、巰基嘌呤、順氯氨鉬、奧克賽鉬、卡波鉬、長春花堿、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱、諾消靈、替尼泊苷、依達曲沙、道諾霉素、氨基蝶呤、希羅達、伊班膦酸鹽、依立替康、 拓撲異構(gòu)酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMFO)、視黃酸、卡培他濱，及其可藥用鹽或衍生物。備選地，還可將放射性同位素與本發(fā)明的抗體相連接，所述的放射性同位素諸如在參考文獻中已知的 211At、131I、125I、9V、186Re、U53Sm、212Bi、32P、175LU 或 176Lu 等。期望此類放射性同位素對腫瘤治療或診斷有效。本發(fā)明的抗體是具有與CAPRIN-I的免疫反應(yīng)性的抗體，或能夠特異性地識別 CAPRIN-I的抗體。此類抗體應(yīng)當(dāng)是具有這樣的結(jié)構(gòu)的抗體，即允許施與所述抗體的受試動物完全或幾乎完全避免排斥反應(yīng)。如果該受試動物是人，上述抗體的實例包括人抗體、人源化抗體、嵌合抗體(例如，人-小鼠嵌合抗體)、單鏈抗體以及雙特異性抗體。這樣的抗體是具有人抗體來源重鏈和輕鏈可變區(qū)的重組抗體、具有由非人動物抗體來源互補決定區(qū) (⑶R1、⑶R2和⑶R3)和人抗體來源構(gòu)架區(qū)組成的重鏈和輕鏈可變區(qū)(每一個均如此)的重組抗體、或具有非人動物抗體來源重鏈和輕鏈可變區(qū)以及人抗體來源重鏈和輕鏈恒定區(qū)的重組抗體。前兩種抗體是優(yōu)選的?？赏ㄟ^如下描述的方法產(chǎn)生上述重組抗體。從諸如雜交瘤的產(chǎn)抗體細胞中克隆編碼抗人CAPRIN-I單克隆抗體(例如，人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體、或雞單克隆抗體)的DNA。應(yīng)用得到的克隆作為模板通過RT-PCR方法等產(chǎn)生編碼該抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的DNA。然后，通過Kabat EU編碼系統(tǒng)(Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版·Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))確定輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的序列，或CDRl、CDR2以及CDR3的序列。進一步地，通過基因重組技術(shù)(Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))或 DNA 合成儀產(chǎn)生編碼可變區(qū)的DNA或編碼⑶R的DNA。在這里，上述產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤可通過用人CAPRIN-I免疫產(chǎn)生人抗體的動物(例如，小鼠)，并使來自該動物的脾的脾細胞與骨髓瘤細胞融合而產(chǎn)生。除上述之外，需要的話，通過基因重組技術(shù)或DNA合成儀產(chǎn)生編碼人抗體來源輕鏈或重鏈可變區(qū)及恒定區(qū)的DNA。在人源化抗體的情況下，產(chǎn)生了這樣的DNA，即其中編碼人抗體來源輕鏈或重鏈可變區(qū)的DNA中的CDR編碼序列已由非人動物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體中相應(yīng)的 CDR編碼序列替換。將如上述那樣獲得的DNA與編碼人抗體來源輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA 連接。由此，可產(chǎn)生編碼人源化抗體的DNA。在嵌合抗體的情況下，將編碼非人動物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)的DNA與編碼人抗體來源的輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA連接。由此，可產(chǎn)生編碼嵌合抗體的DNA。單鏈抗體是其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過接頭彼此線性連接的抗體?？赏ㄟ^結(jié)合編碼重鏈可變區(qū)的DNA、編碼接頭的DNA和編碼輕鏈可變區(qū)的DNA從而產(chǎn)生編碼單鏈抗體的DNA。在這里，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)是來自人抗體的那些，或來自于人抗體的、 其中僅有CDR已由非人動物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體CDR替換的那些。此外， 該接頭由12至19個氨基酸組成。它的實例是由15個氨基酸組成的(G4S) 3 (G.B.Kim等， Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9) :425-432)。雙特性抗體(diabody)是能特異性地結(jié)合兩種不同表位的抗體，其中，例如，編碼重鏈可變區(qū)A的DNA、編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA、編碼重鏈可變區(qū)B的DNA、以及編碼輕鏈可變區(qū)A的DNA以這樣的順序彼此相連(條件是編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA和編碼重鏈可變區(qū) B的DNA通過編碼上述接頭的DNA彼此連接)。由此可產(chǎn)生編碼雙特異性抗體的DNA。在這里，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者均是來自人抗體的那些，或來自于人抗體、其中僅有CDR 已由非人動物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體CDR替換的那些。將如上產(chǎn)生的重組DNA整合至一個或多個合適的載體中。將每一此種載體引入宿主細胞(例如，哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞)用于(共)表達。由此可產(chǎn)生重組抗體(P. J. Delves.，ANTIBODY PRODUCTIONESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY, P. Shepherd 禾口 C.Dean. ，Monoclonal Antibodies. ,20000XF0RD UNIVERSITY PRESS ;J.W.Goding, Monoclonal Antibodies =Principles and Practice. ，1993ACADEMIC PRE SS)。通過上述方法產(chǎn)生的本發(fā)明抗體的實例包括以下抗體(a)至(k)。(a)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 47的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(b)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 50,51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 53的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(c)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 58的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(d)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ IDNO =60,61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 63的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(e)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 68的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(f)包含有包含SEQ ID NO :70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 73的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 77的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(g)包含有包含SEQ ID NO :80、81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 83的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 87的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(h)包含有包含SEQ ID NO 90,91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO 93的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 97的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(i)包含有包含SEQ ID NO :100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO :103的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 107的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(j)包含有包含SEQ ID NO :110、111和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO :113的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 117的輕鏈可變區(qū)的抗體)。(k)包含有包含SEQ ID NO :120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO =124,125和126所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體(以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO :123的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 127的輕鏈可變區(qū)的抗體)。在這里，SEQ ID NO :40、41禾口 42所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :70、71禾口 72所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :80、81禾口 82所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :90、91禾口 92所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :100,101 ^P 102所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :110、111和112所示的氨基酸序列、或SEQ ID N0:120、121和122所示的氨基酸序列分別相應(yīng)于小鼠抗體重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3。此外，SEQ ID NO :44、45和46所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :50、51和52所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :55、56和57所示的氨基酸序列、SEQ ID NO: 60、61和62所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :65、66和67所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :74、 75和76所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :84、85和86所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :94、95 和96所示的氨基酸序列、SEQ ID NO 104、105和106所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :114、 115和116所示的氨基酸序列、或SEQ ID NO =124,125和126所示的氨基酸序列分別相應(yīng)于小鼠抗體輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3。此外，本發(fā)明的人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體例如是以下抗體 ⑴或(ii)(以下描述了抗體(a)的實例)。(i)包含以下的抗體包含SEQ ID NO :40,41和42的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；以及包含SEQ ID NO :44、45和46的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(以及優(yōu)選是在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列、并且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:47的氨基酸序列的抗體)。(ii)包含以下的抗體包含SEQ ID NO :40,41和42的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；包含人抗體來源氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；包含SEQ ID NO :44,45和46的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；以及包含人抗體來源氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)(以及優(yōu)選是包含如下的抗體包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；包含人抗體來源氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；包含SEQ IDNO 47的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；以及包含人抗體來源氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū))。此外，例如可從NCBI (U. S. A =GenBank, UniGene,等)中獲得人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)和可變區(qū)的序列。例如，以下序列可用作相應(yīng)區(qū)域的參考序列用于人IgGl重鏈恒定區(qū)的具有登錄號J002^的序列；用于人IgG2重鏈恒定區(qū)的具有登錄號J00230的序列；用于人IgG3重鏈恒定區(qū)的具有登錄號X03604的序列；用于人IgG4重鏈恒定區(qū)的具有登錄號 K01316的序列；用于人輕鏈κ恒定區(qū)的具有登錄號V00557、X64135或)(64133的序列；以及用于人輕鏈λ恒定區(qū)的具有登錄號)(64132或)(64134的序列。上述抗體優(yōu)選具有細胞毒活性，由此展現(xiàn)出抗腫瘤活性。此外，上述抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)以及⑶R的特定序列僅僅是例證性地描述。本發(fā)明顯而易見地不限于特定的序列。產(chǎn)生了能夠產(chǎn)生不同的抗人CAPRIN-I的人抗體或非人動物抗體(例如，小鼠抗體)的雜交瘤。收集產(chǎn)自該雜交瘤的單克隆抗體。然后，應(yīng)用就人CAPRIN-I而言的免疫結(jié)合活性及細胞毒活性作為指示，確定獲得的抗體是否為目的抗體。由此鑒定產(chǎn)生單克隆抗體的目的雜交瘤。此后，如上述那樣，從該雜交瘤產(chǎn)生編碼目的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA，用于序列確定。將該DNA用于產(chǎn)生不同的抗體。此外，本發(fā)明的上述抗體可以是具有一個或多個(優(yōu)選1或幻氨基酸替換、缺失或添加(尤其是在構(gòu)架區(qū)序列和/或恒定區(qū)序列中)的上述抗體(i)至(iv)的任一個，只要其具有特異性識別CAPRIN-I的特定性質(zhì)。在這里，術(shù)語“幾個氨基酸”表示2至5個，優(yōu)選2或3個氨基酸。此外，根據(jù)本發(fā)明，還提供了編碼本發(fā)明的上述抗體的DNA、編碼該抗體重鏈或輕鏈的DNA、或編碼該抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的DNA。例如，在抗體(a)的情況下，此類DNA 的實例包括包含編碼SEQ ID NO :40、41和42的氨基酸序列的核苷酸序列的重鏈可變區(qū)編碼DNA ；以及包含編碼SEQ ID NO :44,45和46的氨基酸序列的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)編碼 DNA。由上述序列的DNA編碼的互補決定區(qū)(CDR)是確定抗體特異性的區(qū)域。因此，編碼抗體中其他區(qū)域(即，恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū))的序列可以是來自不同抗體的序列。在這里，不同的抗體包括來自非人生物的抗體。然而，考慮到減少副作用，優(yōu)選為人來源的抗體。也就是說，在上述情況下，編碼重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)及恒定區(qū)的DNA序列優(yōu)選包含編碼來自人抗體的相關(guān)氨基酸序列的核苷酸序列。此外，編碼本發(fā)明抗體(諸如抗體(a))的DNA的不同實例包括包含編碼SEQ ID NO 43的氨基酸序列的核苷酸序列的編碼重鏈可變區(qū)的DNA，以及其中編碼輕鏈可變區(qū)的區(qū)域包含編碼SEQ ID NO :47的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。在這里，編碼SEQ ID NO 43的氨基酸序列的核苷酸序列實例是SEQ ID NO :48的核苷酸序列。此外，編碼SEQ ID NO 47的氨基酸序列的核苷酸序列實例是SEQ ID NO :49的核苷酸序列。此外，上述編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA優(yōu)選包含編碼相應(yīng)的人抗體來源氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的DNA可例如通過前述方法或以下方法獲得。首先，應(yīng)用可商購的RNA提取試劑盒從本發(fā)明抗體的雜交瘤中制備總RNA。然后，應(yīng)用隨機引物等通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。接下來，應(yīng)用具有已知小鼠抗體重鏈和輕鏈基因可變區(qū)中保守序列的寡核苷酸作為引物，通過PCR方法擴增編碼抗體的cDNA?？赏ㄟ^PCR方法擴增已知序列獲得編碼恒定區(qū)的序列。可通過一般的方法確定該DNA的核苷酸序列，其中所述的方法例如包括整合至用于序列確定的質(zhì)?；蚴删w。我們認(rèn)為本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-I抗體對表達CAPRIN-I的癌細胞的抗腫瘤活性是通過如下描述的細胞毒性機制而得以顯示的。該細胞毒性是針對表達CAPRIN-I細胞的、效應(yīng)細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)，以及針對表達CAPRIN-I細胞的、補體依賴性細胞毒性(⑶C)。因此，可通過先體外后體內(nèi)(ex vivo)確定針對表達CAPRIN-I的癌細胞的ADCC 活性或CDC活性評估本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-I抗體的活性，如在以下實施例中具體描述的那樣。本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-I抗體與癌細胞上的CAPRIN-I蛋白結(jié)合，并且基于上述活性展示出抗腫瘤效果。因此，相信此類抗體可用于癌癥治療或預(yù)防。特別地，根據(jù)本發(fā)明， 提供了包含抗-CAPRIN-I抗體作為活性組成的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物。當(dāng)將抗-CAPRIN-I抗體用于施與抗體給人類的目的(抗體治療)時，優(yōu)選以人抗體或人源化抗體的形式使用，以降低免疫原性。此外，抗-CAPRIN-I抗體與癌細胞表面的CAPRIN-I蛋白之間的結(jié)合親和力變得越高，則抗-CAPRIN-I抗體可展示出越強的抗腫瘤活性。因此，如能獲得具有與CAPRIN-I蛋白的高結(jié)合親和力的抗-CAPRIN-I抗體，可以預(yù)期能展示出更強的抗腫瘤活性。因此，應(yīng)用此類抗體作為腫瘤治療和/或預(yù)防的藥物組合物就變得可能。如上所述，對于高結(jié)合親和力，親和常數(shù)Ka(k。n/k。ff)優(yōu)選為至少愈1、至少愈1、至少5X KAf1、至少愈1、至少 5 X IO9IT1、至少 IOkT1、至少 5 X IO10M-1、至少 IO11ITi、至少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、或至少 IO13M-1O<與表達抗原的細胞結(jié)合>可通過應(yīng)用例如實施例中描述的ELISA、蛋白印跡方法、免疫熒光或流式細胞分析的結(jié)合測試法確定抗體與CAPRIN-I結(jié)合的能力。<免疫組織化學(xué)染色>可應(yīng)用用多聚甲醛或丙酮固定的冰凍組織切片或用多聚甲醛固定的石蠟包埋組織切片，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的免疫組織化學(xué)方法，根據(jù)與CAPRIN-I的反應(yīng)性測試識別CAPRIN-I的抗體。此類切片在手術(shù)期間從患者獲得、或從攜帶有異種移植組織的動物中獲得的組織制備，其中所述的動物接種有表達CAPRIN-I的天然細胞或轉(zhuǎn)化細胞系。為了進行免疫組織化學(xué)染色，可通過各種方法染色與CAPRIN-I反應(yīng)的抗體。例如，可通過與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠抗體或山羊抗兔抗體反應(yīng)而顯現(xiàn)該抗體?！此幬锝M合物〉本發(fā)明治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物的靶沒有特別的限制，只要該靶是表達 CAPRIN-I基因的癌(細胞)即可。
本文使用的術(shù)語“腫瘤”和“癌”兩者均指惡性贅生物，并且因此它們可互換使用。在本發(fā)明中可作為靶的癌是表達編碼包含偶數(shù)編號的SEQ ID NO 2至30的任一項的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列的7個或更多個連續(xù)氨基酸組成的部分序列的多肽的基因。其優(yōu)選實例包括乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大細胞瘤、食道癌和大腸癌。這些特定腫瘤的實施例包括，但不限于，乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、肺腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(即，神經(jīng)上皮組織腫瘤)、室管膜瘤、神經(jīng)細胞性腫瘤、胚胎性神經(jīng)外胚層瘤、神經(jīng)鞘瘤、纖維神經(jīng)瘤、腦膜瘤、慢性淋巴細胞性白血病、淋巴瘤、胃腸道淋巴瘤、消化性淋巴瘤、小細胞至中細胞淋巴瘤、盲腸癌、上行結(jié)腸癌、下行結(jié)腸癌、橫結(jié)腸癌、乙狀結(jié)腸癌以及直腸癌。此外，本發(fā)明的受試動物是哺乳動物。其實例包括諸如靈長類、寵物動物、家畜以及競技動物的哺乳動物。特別優(yōu)選的是人、狗和貓。當(dāng)本發(fā)明中使用的抗體作為藥物組合物使用時，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對其進行配制。例如，其可作為腸胃外注射液的形式腸胃外使用包含水或可藥用非水溶液的無菌溶液；或懸浮液。例如，在一種可能情況中，可以通過適當(dāng)?shù)姆椒?lián)合使用可藥用載體或介質(zhì)，具體為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸混劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、賦形劑、載體(vehicle)、防腐劑、結(jié)合劑，通過以通?？山邮艿乃幬锝M合物所需的單位劑型混合從而進行配制。確定制劑中的活性組分量以使得可達到在指示范圍內(nèi)的合適劑
Mo用于注射的無菌組合物可應(yīng)用諸如注射用蒸餾水的載體根據(jù)一般的配制方法配制。注射用水溶液的實例包括生理鹽水以及包含葡萄糖和其它佐劑的等滲溶液，其中所述的其它佐劑諸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化鈉。此類溶液可與合適的溶解助劑一起使用。此類溶解助劑的實例包括醇，諸如乙醇和多元醇、丙二醇、聚乙二醇，以及非離子表面活性劑，諸如聚山梨酸酯80( )和HC0-60。油性流體的實例包括芝麻油和大豆油。此類油性流體可與諸如苯甲酸芐酯或苯甲醇的溶解助劑聯(lián)合使用。此外，其還可與緩沖劑(諸如磷酸鹽緩沖溶液、醋酸鹽緩沖溶液)、 無痛劑(諸如鹽酸普魯卡因)、穩(wěn)定劑(諸如苯甲醇、苯酚)或抗氧化劑混合。一般地，將配制的注射溶液引入適當(dāng)?shù)陌碴持小Ｉ鲜鏊幬锝M合物經(jīng)口或腸胃外施與。優(yōu)選為腸胃外施與。劑型的特定實例包括可注射劑、經(jīng)鼻施與劑、經(jīng)肺施與劑、以及經(jīng)皮施與劑。例如，可注射劑可通過靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射全身性或局部施與。此外，可根據(jù)患者年齡、體重、性別和癥狀適當(dāng)?shù)卮_定施與方法。可在例如 0. OOOlmg至1000mg/kg體重的范圍內(nèi)選擇包含抗體或編碼抗體的多核苷酸的藥物組合物的單劑量。備選地，可在例如每位患者0. 001至IOOOOOmg的范圍內(nèi)選擇劑量，然而，其不必限于此。劑量和施與方法依據(jù)患者年齡、體重、性別和癥狀而改變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇劑量和方法。〈多肽和DNA>根據(jù)本發(fā)明，還提供了上述抗體(a)至(k)的以下多肽和DNA。
(i)包含 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :93、SEQ ID NO :103, SEQ ID NO :113和SEQ ID NO :123的氨基酸序列的多肽，以及編碼該多肽的DNA。(ii)包含 SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 77、SEQ ID N0:87、SEQ ID NO :97、SEQ ID N0:107、SEQ ID NO :117 和 SEQ ID NO 127的氨基酸序列的多肽，以及編碼該多肽的DNA。(iii)包含 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :88、SEQ IDNO :98、SEQ ID NO :108, SEQ ID NO :118 和 SEQ ID NO 128 的核苷酸序列的 DNA。(iv)包含 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :59、SEQ IDNO :64、SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 79、SEQ ID N0:89、SEQ ID NO :99、SEQ ID N0:109、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO 129的核苷酸序列的DNA。(ν)包含選自 SEQ ID NO :40,41 和 42 的氨基酸序列；SEQ ID NO :70、71 和 72 的氨基酸序列；SEQ ID NO 80,81和82的氨基酸序列；SEQ IDNO :90、91和92的氨基酸序列； SEQ ID NO 100、101和102的氨基酸序列；SEQ ID NO 110、111和112的氨基酸序列；以及 SEQ ID NO 120、121和122的氨基酸序列的重鏈⑶R多肽，以及編碼該多肽的DNA。(vi)包含選自 SEQ ID NO 44,45 和 46 的氨基酸序列；SEQ ID NO :50、51 和 52 的氨基酸序列；SEQ ID NO 55,56和57的氨基酸序列；SEQ IDNO :60、61和62的氨基酸序列； SEQ ID NO :65、66和67的氨基酸序列；SEQ ID NO :74、75和76的氨基酸序列；SEQ ID NO 84,85和86的氨基酸序歹Ij ；SEQ ID NO :94、95和96的氨基酸序列；SEQ ID NO 104、105和 106的氨基酸序列；SEQ ID NO :114、115和116的氨基酸序列；SEQ ID N0:124、125和126 的氨基酸序列的輕鏈CDR多肽；以及編碼該多肽的DNA。這些多肽和DNA可通過上述基因重組技術(shù)產(chǎn)生。
實施例下文參考以下實施例來更詳細地描述本發(fā)明，不過本發(fā)明的范圍不限于此。實施例1 通過SEREX方法鑒定新的癌抗原蛋白(l)cDNA文庫的構(gòu)建通過酸胍-酚-氯仿方法從健康犬的睪丸組織提取總RNA,并且使用 01igotex-dT30mRNA純化試劑盒(Takara Shuzo Co. , Ltd.)，根據(jù)其中包括的說明書純化 poIyA RNA。使用如此獲得的mRNA(5 μ g)合成犬睪丸cDNA噬菌體文庫。使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和 ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning試劑盒(STRATAGENE), U 據(jù)各試劑盒中所包含的備份說明書構(gòu)建cDNA噬菌體文庫。由此構(gòu)建的cDNA噬菌體文庫的大小是 7. 73X 105pfu/ml。(2)使用血清篩選cDNA文庫使用上述構(gòu)建的犬睪丸cDNA噬菌體文庫實施免疫篩選。具體地，在NZY瓊脂糖平板(Φ90χ 15mm)上用噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl_BlueMRF’ )，由此獲得2210個克隆。 在42°C培養(yǎng)大腸桿菌細胞3至4小時以形成噬斑。平板以IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纖維素膜(Hybond C Extra =GE Healthcare Bio-Science)在 37°C覆蓋 4小時，從而誘導(dǎo)并表達蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到該膜上。隨后，將該膜回收，浸泡在含有0.5%粉末脫脂乳的TBS (IOmM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7. 5)中并在4°C振搖過夜以抑制非特異性反應(yīng)。使該濾膜與500倍稀釋的患病犬血清在室溫反應(yīng)2至3小時。就上述患病犬的血清而言，使用從患有乳腺癌的犬中收集的血清。這些血清貯藏在-80°C并在即將使用前預(yù)處理。預(yù)處理血清樣品的方法如下。具體而言，宿主大腸桿菌 (XLl-BLue MRF’)用其中未插入外來基因的λ ZAP表達噬菌體感染，并且隨后在NZY平板培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)過夜。隨后，添加含有0. 5M NaCl的緩沖液(0. 2M NaHCO3, pH 8. 3)至該平板，使該平板在4°C靜置15小時，然后收集上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取物。隨后，使由此收集的大腸桿菌/噬菌體提取物流經(jīng)NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，因而將衍生自大腸桿菌/噬菌體的蛋白質(zhì)固定在該柱上。使患病犬的血清流經(jīng)固定有蛋白質(zhì)的柱以與其反應(yīng)，并且從血清中除去已經(jīng)吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經(jīng)流過該柱的血清級分用含有0. 5%粉末脫脂乳的TBS稀釋500倍。將所得物用作免疫篩選材料。膜上已經(jīng)印跡了經(jīng)處理的血清和上述融合蛋白的膜用TBS-T (0. 05 %吐溫20/ TBS)洗滌4次，然后使已經(jīng)用含有0. 5%粉末脫脂乳的TBS稀釋5000倍作為第二抗體的山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的(BETHYL Laboratories))與該膜在室溫反應(yīng) 1小時。檢測通過使用NBT/BCIP反應(yīng)溶液(Roche)的酶顯色反應(yīng)實施。從NZY瓊脂糖平板(Φ90χ15πιπι)收集與顯色反應(yīng)陽性的位點相對應(yīng)的菌落，并將其裂解于500 μ ISM緩沖液 (IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠，pH 7.5)。以與上文所述相似的方法重復(fù)第二和第三篩選，從而篩選30，940個與血清IgG反應(yīng)的噬菌體克隆，直至顯色反應(yīng)陽性菌落單一化。由此分離了 5個陽性克隆。(3)分離的抗原基因的同源性搜索為了對通過上述方法分離的5個陽性克隆進行核苷酸序列分析，實施將噬菌體載體轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒載體的操作。具體地，制備200 μ 1吸光度0D_為1. 0的含宿主大腸桿菌 (XLl-Blue MRF’ )溶液。將其與250 μ 1純化的噬菌體溶液混合，并隨后和1 μ 1 ExAssist 輔助噬菌體(STRATAGENE)混合，隨后在37 °C反應(yīng)15分鐘。添加:3ml LB培養(yǎng)基，在37 °C培養(yǎng) 2. 5至3小時。培養(yǎng)后，立即通過水浴將溶液溫度保持在70°C，持續(xù)20分鐘，4°C和IOOOXg 離心15分鐘，并且然后收集上清液作為噬菌粒溶液。隨后，制備200 μ 1吸光度OD6tltl為1. 0 的含噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)溶液。將該溶液與10 μ 1純化的噬菌體溶液混合，隨后在 37°C反應(yīng)15分鐘。將溶液(50 μ 1)接種于含有氨芐青霉素(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，并且在37°C培養(yǎng)過夜。收集轉(zhuǎn)化的SOLR單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度 50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)。應(yīng)用QIAGEN質(zhì)粒小量制備試劑盒OiIAGEN)純化含有目的插入物的質(zhì)粒DNA。使用SEQ ID NO :31的T3引物和SEQ ID NO :32的T7引物，通過引物步行法，對純化的質(zhì)粒進行插入物全長序列的分析。通過序列分析，獲得SEQ ID N0:5、7、9、ll和13的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID N0:6、8、10、12和 14)來實施同源性搜索程序BLAST搜索(http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。作為這個用已知基因進行的同源性檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得的5個基因均編碼CAraiN-Ι。就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，這五個基因之間的序列同一性為100%的核苷酸序列同一性和99% 的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所述基因與編碼人同源物的基因的序列同一性為94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :1和3，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :2和4。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，由此獲得的犬基因與編碼牛同源物的基因的序列同一性為 94%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: 15，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :16。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言， 編碼人同源物的基因與編碼牛同源物的基因之間的序列同一性為94%的核苷酸序列同一性，以及93%至97%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼馬同源物的基因的序列同一性為93 %的核苷酸序列同一性和97 %的氨基酸序列同一性。馬同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :17，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :18。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼馬同源物的基因之間的序列同一性為93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼小鼠同源物的基因的序列同一性為 87%至89%的核苷酸序列同一性和95%至97%的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列如SEQID NO :19、21、23、25和27所示并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :20,22,24,26 和觀所示。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼小鼠同源物的基因之間的序列同一性為89 %至91 %的核苷酸序列同一性和95 %至96 %的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼雞同源物的基因的序列同一性為82%的核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列同一性。雞同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :29，并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :30。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼雞同源物的基因之間的序列同一性為81% 至82%的核苷酸序列同一性和86%的氨基酸序列同一性。(4)每一組織中的基因表達分析通過RT-PCR方法檢驗通過上述方法在犬和人正常組織及多種細胞系中獲得的基因的表達。逆轉(zhuǎn)錄按照以下方式實施。具體地，使用TRIZOL試劑anvitrogen)，按照其中包含的方案從每一組織(50mg至IOOmg)和各細胞株(5至IOxlO6個細胞)中提取總RNA。 使用用于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用提取的總RNA合成cDNA。使用對所獲得基因特異的引物(SEQ ID NO :33和34)，按照以下方式實施PCR。具體地，使用通過添加諸試劑(0. 25 μ 1通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的樣品，上述引物(每種 2 μ Μ)，dNTP (每種 0. 2mM)和 0. 65UExTaq 聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)) 和附帶的緩沖液以調(diào)節(jié)至25 μ 1總體積的反應(yīng)溶液，以及Thermal Cycler (BIO RAD)，進行以下30個循環(huán)反應(yīng)94°C 30秒，60°C 30秒和72°C 30秒。此外，上述基因特異性引物用來擴增SEQ ID NO 5的核苷酸序列(犬CAPRIN-I基因)第206至632位核苷酸之間的區(qū)域和SEQ ID NO 1的核苷酸序列(人CAPRIN-I基因)第698至IlM位核苷酸的區(qū)域。作為比較對照，同時使用GAPDH特異性引物(SEQ ID NO :35和36)。作為結(jié)果，如圖1中顯示，在健康犬的睪丸組織中觀察到強表達，同時在犬乳腺癌及腺癌組織中觀察到表達。此外，還證實了與所獲得基因同源的人同源物的表達。作為結(jié)果，類似犬CAPRIN-I基因的情況那樣， 在正常組織的情況下，僅在睪丸中證實了其表達。然而，在癌細胞的情況下，在許多類型的癌細胞系諸如乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌和食道癌細胞系中檢測到表達。尤其在許多乳腺癌細胞系中證實了其表達?；谶@些結(jié)果，證實了在除睪丸組織之外的正常組織中觀察不到CAPRIN-I表達，然而，CAPRIN-I在許多癌細胞中并且尤其在乳腺癌細胞系中表達。
此外，在圖1中，縱軸上的參考編號1顯示上文所鑒定的每一基因的表達模式并且相同軸上的參考編號2顯示用于比較對照的GAPDH基因的表達模式。(5)制備抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體為獲得與CAPRIN-I 結(jié)合的抗體，合成了 CAPRIN-1 衍生肽(Arg-Asn-Leu-Glu-Lys -Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln(SEQ IDNO :37))。將作為抗原的所述肽(Img)和與肽等量的不完全弗氏佐劑(IFA)溶液混合。每兩周一次地將該混合物皮下施與兔4次。隨后，收集血液，由此獲得含有多克隆抗體的抗血清。此外，應(yīng)用蛋白G支持物(GEHealthcare Bio-Sciences)純化該抗血清，并且獲得抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體。此外，選定了以上述相同的方式應(yīng)用蛋白G支持物純化沒有施與抗原的兔的血清獲得的抗體，作為對照抗體。(6)抗原蛋白在癌細胞上的表達分析接下來，檢查CAPRIN-I蛋白是否在7種類型的乳腺癌細胞系(MDA_MB_157、T47D、 MRK-nu-1、MDA-MB-231V、BT20、SK-BR-3、和 MDA-MB-231T)的細胞表面表達，其中已強烈確認(rèn)CAPRIN-I基因在這些細胞系中表達。將如上所述那樣已確認(rèn)了基因在其中表達的每種人乳腺癌細胞系(IO6個細胞)在1.5ml微離心管中離心。向其中添加上述(5)中制備的抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體Qyg)(5yl)。使產(chǎn)物再懸浮于含有0.1%胎牛血清 (95 μ 1)的PBS中，然后在冰上靜置1小時。用PBS洗滌后，使產(chǎn)物懸浮于含有FITC-標(biāo)記的山羊抗-兔 IgG 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) (5 μ 1)和 0. 胎牛血清 (FBS) (95 μ 1)的PBS中，并在冰上靜置1小時。用PBS洗滌后，應(yīng)用FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company)測定熒光強度。同時，應(yīng)用(5)中制備的對照抗體替代抗 CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體，進行上述類似的步驟，由此制備對照。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在所有添加了抗人CAPRIN-I抗體的細胞中的熒光強度比對照細胞中的強度強至少30%。具體地，證實了以下熒光強度的增強:MDA-MB-157 =184%, T47D =221%, MRK-nu-1 =115%, MDA-MB-231V :82%、BT20 :32%、SK-BR-3 :279% 以及 MDA-MB-231T :80%?；谏鲜鼋Y(jié)果， 確認(rèn)了 CAPRIN-I蛋白在上述人癌細胞系的細胞表面上表達。此外，熒光強度的增加率由細胞中平均熒光強度(MFI值)的增加率來表示。其通過以下等式計算。平均熒光強度的增加率(熒光強度增加率)(％)=((與抗人CAPRIN-I抗體反應(yīng)的細胞的MFI值)-(對照MFI值))/ (對照MFI值)X 100(7)免疫組織化學(xué)染色(7)-1 正常小鼠和犬組織中的CAPRIN-I表達小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/異氟烷麻醉下放血。剖腹手術(shù)后，將器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、 唾液腺、大腸(結(jié)腸)、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉(zhuǎn)移至盛有PBS的10-cm平皿中。在PBS中切開每一器官并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0. IM磷酸鹽緩沖液(PH 7.4)回流固定過夜。棄去回流液，用PBS漂洗每一器官的組織表面，將含有 10%蔗糖的PBS溶液加入50-ml微離心管。然后將每一組織置于每一管中，然后使用轉(zhuǎn)子在4°C振搖2小時。用含有20%蔗糖的PBS溶液更換每一溶液，然后使其在4°C靜置直至組織沉降。用含有30%蔗糖的PBS溶液更換每一溶液，并使其在4°C靜置直至組織沉降。取出每一組織并使用手術(shù)刀切下所需的區(qū)域。隨后，將OCT化合物(Tissue Tek)施加至每一組織表面并鋪展開，并隨后將組織置于Cryomold上。將Cryomold置于干冰上以迅速冷凍。 使用冷凍切片機(LEICA)將組織切成厚度10 μ m至20 μ m，并且用電吹風(fēng)對載玻片上的組織切片風(fēng)干30分鐘，由此制備其上置有組織切片的載玻片。隨后，將每一載玻片置于充滿 PBS-T (含有0. 05%吐溫20的生理鹽水)的染色瓶，每隔5分鐘更換PBS-T，更換3次。使用Kimwipes紙巾擦掉每一樣品周圍的多余水分，用DAKOPEN(DAKO)圈定切片。將MOM小鼠 Ig封閉試劑(VECTASTAIN)置于小鼠組織上作為封閉液，并將含有10%胎牛血清的PBS-T 溶液置于犬組織上作為封閉液。使這些產(chǎn)物置于保濕室中在室溫靜置1小時。隨后，制備含有抗CAPRIN-I的單克隆抗體(單克隆抗體#6)的溶液，其中所述的抗體是實施例4制備的具有SEQ ID NO :73的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :77的輕鏈可變區(qū)，并與癌細胞表面反應(yīng)， 將該抗體在封閉液中調(diào)節(jié)為10μ g/ml的濃度。將該溶液施加于每一載玻片，并且然后在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向每一載玻片中施加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標(biāo)記的抗IgG抗體(VECTASTAIN)，隨后使之在保濕室中于室溫靜置1小時。用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加抗生物素蛋白-生物素 ABC試劑(VECTASTAIN)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置5分鐘。用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加DAB染色溶液(IOmg DAB+10 μ 1 30% Η202/0· 05Μ Tris-HCl, PH 7. 6，50ml)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置30分鐘。載玻片用蒸餾水淋洗，然后施加蘇木精試劑(DAKO)。使載玻片在保濕室中于室溫靜置1分鐘后，用蒸餾水淋洗。載玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果， 在所有唾液腺、腎、結(jié)腸和胃組織的細胞內(nèi)觀察到微弱程度的CAPRIN-I表達；然而在細胞的表面上沒有觀察到CAPRIN-I表達。此外，在來自其它器官的組織中完全沒有觀察到表達。此外，當(dāng)使用具有SEQ ID NO 103的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :107的輕鏈可變區(qū)的抗 CAPRIN-I單克隆抗體(單克隆抗體#9)時，也得到了類似的結(jié)果。(7)-2 犬乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達使用通過病理診斷法診斷為患有惡性乳腺癌的犬的108份冷凍犬乳腺癌組織樣品，通過與上述類似的方法制備冷凍切片載玻片，并且用實施例4制備的單克隆抗體#6進行免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在108份樣品的100份(92. 5% )中證實了 CAPRIN-I表達。CAPRIN-I在異型度高的癌細胞表面上是特別強烈地表達。此外，當(dāng)使用實施例4產(chǎn)生的單克隆抗體#9時，也獲得了類似的結(jié)果。(7)-3 人乳腺癌組織中的CAPRIN-I表達應(yīng)用石蠟包埋的人乳腺癌組織陣列(BIOMAX)的188份乳腺癌組織樣品實施免疫組織化學(xué)染色。在60°C處理3小時后，將該人乳腺癌組織陣列加入到充滿二甲苯的染色瓶中，然后每5分鐘更換二甲苯，更換3次。隨后，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯重復(fù)相似流程。將人乳腺癌組織陣列加入到充滿含有0. 05%吐溫20的IOmM檸檬酸緩沖液(pH 6. 0) 的染色瓶中，在125°C處理5分鐘，并且在室溫靜置40分鐘或更長時間。使用Kimwipes紙巾擦掉每一樣品周圍的多余水分，用DAK0PEN圈定每一切片，并且向其逐滴添加足夠量的過氧化物酶阻斷劑(DAKO)。使所得物在室溫靜置5分鐘后，然后加入到充滿PBS-T的染色瓶。每5分鐘更換PBS-T，更換3次。將含有10% FBS的PBS-T溶液施加在該陣列上作為封閉液，并且使該陣列置于保濕室中在室溫持續(xù)1小時。隨后，制備含有實施例4制備的、與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體#6的溶液，應(yīng)用含有5% FBS的PBS-T溶液將該抗體調(diào)節(jié)為10μ g/ml的濃度。施與該溶液，并且然后在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3 次，每次 10分鐘后，逐滴添加合適量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO), 并且隨后使載玻片在保濕室中于室溫靜置30分鐘。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后， 施加DAB染色液(DAKO)，并且在室溫靜置約10分鐘。棄去DAB染色液，然后用PBS-T洗滌3 次，每次10分鐘。用蒸餾水淋洗載玻片，然后依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在全部188份乳腺癌組織樣品的138份(73% ) 中觀察到強烈的CAPRIN-I表達。此外，當(dāng)使用實施例4制備的單克隆抗體#9時，也獲得了類似的結(jié)果。(7)-4 人惡性腦腫瘤中的CAPRIN-I表達用實施例4中制備的單克隆抗體#6如上文(7)-3中類似的方式對石蠟包埋的人惡性腦腫瘤組織陣列(BIOMAX)的247份惡性腦腫瘤組織樣品實施免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在全部247份惡性腦腫瘤組織樣品的227份(92% )中觀察到強烈的CAPRIN-I表達。此外，當(dāng)使用實施例4制備的單克隆抗體#9時，也獲得了類似的結(jié)果。(7)-5 人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中的CAPRIN-I表達用實施例4中制備的單克隆抗體#6以如上文(7)-3中類似的方式對石蠟包埋的人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織陣列(BIOMAX)的150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品實施免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在全部150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品的136份 (90%)中觀察到強烈的CAPRIN-I表達。特別地，揭示了 CAPRIN-I在轉(zhuǎn)移自乳腺癌的癌組織中也強烈地表達。此外，當(dāng)使用實施例4制備的單克隆抗體#9時，也獲得了類似的結(jié)果。實施例2 抗CAPRIN-I抗體對癌細胞的抗腫瘤效果(ADCC活性)接下來，我們檢查了抗CAPRIN-I抗體是否能夠損傷表達CAPRIN-I的腫瘤細胞。 應(yīng)用實施例1中制備的抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體實施評估。分別將已證實表達 CAPRIN-I的兩類人乳腺癌細胞系(T47D和MDA-MB-157)(每種細胞IO6個細胞)收集至 50ml離心管中。往其中加入鉻51 (100 μ Ci)，隨后在37°C溫育2小時。之后，用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細胞3次，并將細胞加入到96孔V-底培養(yǎng)板的孔中(每孔IO3個細胞)。往其中加入上述抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體(每孔Iyg)。之后， 往其中加入從兔外周血分離的淋巴細胞(每孔2 X IO5個細胞)，隨后在37°C和5% CO2中培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，確定每一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細胞中釋放的鉻(Cr)51的水平。 然后，計算抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體對癌細胞的ADCC活性。結(jié)果，證實了針對 T47D(15. 4% )和MDA-MB-157(17. 3% )的ADCC活性(參見圖2和3)。同時，當(dāng)應(yīng)用從未用抗原免疫的兔外圍血中制備的對照抗體(實施例1(5))實施上述類似的方法時，或沒有添加抗體時，基本上沒有觀察到活性(參見圖2和3)。因此，這揭示了通過使用抗CAPRIN-I 抗體誘導(dǎo)的ADCC活性可損傷表達CAPRIN-I的腫瘤細胞。此外，對于細胞毒活性，將本發(fā)明使用的抗CAPRIN-I抗體、小鼠淋巴細胞和摻有鉻51的IO3個來自白血病細胞系的細胞混合在一起，并培養(yǎng)4小時。之后，確定釋放至培養(yǎng)基的鉻51水平。然后，通過以下等式*計算對白血病細胞系的細胞毒活性。*等式細胞毒活性(％ )=[(從向其中添加了抗CAPRIN-I抗體和小鼠淋巴瘤的T47D或MDA-MB-157中釋放的鉻51水平)/(從向其中添加了 IN鹽酸的靶細胞中釋放的鉻51水平)]XlOO實施例3 制備新的人癌抗原蛋白(1)重組蛋白的制備基于實施例1中獲得的SEQ ID NO 1的基因通過下述方法制備人同源物基因的重組蛋白。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，以及通過添加試劑及附帶的緩沖液(1 μ 1 cDNA (其來自實施例1制備的衍生自各組織/細胞的cDNA，并通過RT-PCR觀察其表達)、 含有SacI和XhoI限制性酶切位點序列的兩種類型的引物(每種0. 4 μ M，SEQ ID NO :38 和 39)、0. 2mMdNTP 和 1. 25U PrimeSTAR HS 聚合酶(Takara Shuzo))以調(diào)節(jié)至達到總體積 50 μ 1的反應(yīng)溶液進行PCR，所述PCR進行30個98°C /10秒和68°C /2. 5分鐘的循環(huán)。使用上述兩種引物來擴增編碼SEQ ID NO :2的全長氨基酸序列的區(qū)域。在PCR后，將擴增的 DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒OiIAGEN)純化約2. Ikbp 的DNA片段。將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并回收質(zhì)粒?；跍y序證實擴增的基因片段匹配目的序列。用McI和B10I限制性酶處理匹配于目的序列的質(zhì)粒，然后用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物。然后將目的基因序列插入用Mel和BioI限制性酶處理的大腸桿菌pET30b表達載體(Novagen)。使用這種載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 中用于表達，并且然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達，由此在大腸桿菌中表達靶蛋白。(2)重組蛋白的純化在含有30μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)每一種上文所獲得的表達SEQ ID NO :1的重組大腸桿菌，直至在600nm的吸光度達到大約0.7。然后添加異丙基-β-D-I-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，隨后在37°C培養(yǎng)4小時。此后，通過以 4800rpm離心10分鐘收集細胞。將細胞沉淀懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，并以4800rpm 離心10分鐘，以洗滌細胞。將細胞懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，然后在冰上超聲破碎。超聲破碎的大腸桿菌的溶胞產(chǎn)物以6000rpm離心20分鐘。將由此得到的上清液用作可溶級分，并將由此獲得的沉淀用作不溶級分。將可溶級分添加至根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備的鎳螯合柱(載體=Chelateing kpharose (商標(biāo))Fast Flow (GE Health Care)；柱體積5ml ；50mM鹽酸緩沖液(pH 8. 0)作為平衡緩沖液)。用約10倍柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH 8. 0)和含有20mM咪唑的20mM 磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗去未吸附的級分。洗滌之后，立即用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(PH8. 0)洗脫6個床。將含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8. 0)的洗脫級分(已通過考馬斯染色法證實了目的蛋白的洗脫)添加至強陰離子交換柱(載體Q kpharose (商標(biāo))Fast Flow (GE Health Care)；柱體積5ml ；20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0) 作為平衡緩沖液)。用10倍柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和含有200mM氯化鈉的 20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗去未吸附的級分。洗滌后，立即用含有400mM氯化鈉的20mM 磷酸鹽緩沖液(PH 7.0)洗脫5個床。由此，獲得了各個具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的純化級分。
將200 μ 1通過上述方法獲得的每一純化制備物分散到Iml的反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl2,pH 7.4)中，然后添加 2μ1 腸激酶(Novagen)。使制備物在室溫靜置過夜進行反應(yīng)，切除His標(biāo)簽，并且然后使用腸激酶切割捕獲試劑盒(Novagen) 根據(jù)隨附的說明書進行純化。隨后，使用超濾法NANOSEP IOK OMEGA (PALL)，用生理磷酸鹽緩沖液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)置換1. 2ml由上述方法獲得的每一純化制備物。通過0. 22μπι HT Tuffryn Acrodisc(PALL)實施無菌過濾，并且所得物用于以下實驗。實施例4 抗CAPRIN-I單克隆抗體的制備將實施例3中制備的SEQ ID NO :2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1) (100 μ g)與等量的MPL+TDM佐劑(Sigma)混合。將該混合物用作每只小鼠的抗原溶液。將該抗原液腹膜內(nèi)地施用至6周齡的Balb/c小鼠(Japan SLCInc.)，并且以每周為間隔再施用該溶液3次或M次，以完成免疫。最后免疫3日后取出脾臟，然后將其在兩片無菌的載玻片之間研磨。 用PBS(-) (Nissui)洗滌每一所得物，然后以1500rpm離心10分鐘，并因此重復(fù)3次移除上清液的程序。由此，獲得脾臟細胞。將由此獲得的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(購自 ATCC)以10 1的比例混合。添加PEG溶液至細胞，其中所述的PEG溶液通過使在37°C加熱的 200 μ 1 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基與 800 μ 1 PEG1500 (Boehringer)混合而制得。使溶液靜置5分鐘以進行細胞融合。所得物以1700rpm離心5分鐘，以移除上清液。 將細胞懸浮于150ml已經(jīng)添加2%等價HAT溶液(Gibco)的含有15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基)中，并且以每孔100 μ 1鋪種于15塊96孔平板(Nunc)中。在37°C 和5% CO2的條件下培養(yǎng)細胞7天，由此獲得因脾臟細胞與骨髓瘤細胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。使用由這樣制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)， 選擇雜交瘤。將實施例3中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次，以每孔400 μ 1的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma)，并且然后使該平板在室溫靜置3小時。移除該溶液，用400μ1的PBS-T洗滌各孔3次。以每孔100 μ 1的量添加上文獲得的每個雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。用PBS-T洗滌備孔3次，以每孔100 μ 1 的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L)抗體(Invitrogen)，并且在室溫靜置1小時。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)， 并且靜置15至30分鐘，由此進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)。使用吸光度計測定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。結(jié)果，選出了具有高吸光度值的產(chǎn)生抗體的多株雜交瘤。將由此選出的雜交瘤以每孔0.5個雜交瘤細胞的量添加至96孔平板并培養(yǎng)。1周后，觀察到在孔中形成單個集落雜交瘤。進一步培養(yǎng)這些孔中的細胞。使用(從克隆的雜交瘤產(chǎn)生的抗體)對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇雜交瘤。將實施例3中制備的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次，以每孔400 μ 1的量添加0. 5% BSA溶液，并且然后使該平板在室溫靜置3小時。移除該溶液，用400 μ 1的PBS-T洗滌各孔3次。以每孔100 μ 1 的量添加上文獲得的每個雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。用PBS-T 洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L)抗體(Invitrogen)，并且在室溫靜置1小時。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且靜置15至30分鐘，由此進行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后， 以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以終止該反應(yīng)。使用吸光度計測定在450nm的吸光度和在 595nm的吸光度。結(jié)果，獲得了 150個雜交瘤細胞系，這些細胞系產(chǎn)生顯示出與CAPRIN-I蛋白的反應(yīng)性的單克隆抗體。接下來，在這些單克隆抗體當(dāng)中選出顯示了與表達CAPRIN-I的乳腺癌細胞的表面的反應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在1. 5ml微量離心管中離心IO6個MDA-MB-231V人乳腺癌細胞系細胞。添加上文制備的每一雜交瘤上清液(100 μ 1)，并且在冰上靜置1小時。 在用PBS洗滌后，添加用含有0. 1% FBS的PBS稀釋500倍的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體(Invitrogen)，并在冰上靜置1小時。在用PBS洗滌后，使用FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company)測量熒光強度。同時，應(yīng)用用雜交瘤培養(yǎng)基稀釋500倍的未受處理的6周齡Balb/c小鼠血清代替抗體實施類似程序，由此制備對照。結(jié)果，選出了 11個 (#1至#11)具有比對照更強的熒光強度的單克隆抗體；即，選出了與乳腺癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體實施例5 所選擇的抗體的表征(1)抗CAPRIN-I單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆從產(chǎn)生實施例4所選擇的11個單克隆抗體的雜交瘤細胞系中提取mRNA。應(yīng)用對衍生自小鼠FRl的序列和衍生自小鼠FR4的序列特異的引物，通過RT-PCR獲得每一抗 CAPRIN-I單克隆抗體的重鏈可變(VH)區(qū)基因和輕鏈可變(VL)區(qū)基因。為了測序，將這些基因分別克隆至PCR2. 1載體(Invitrogen)。(I)-IRT-PCR應(yīng)用mRNA微量純化試劑盒(GE Healthcare)從每一雜交瘤細胞系(IO6個細胞) 制備mRNA。應(yīng)用Supei^criptII第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)對每一獲得的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，用于cDNA合成。根據(jù)該試劑盒所附方案進行上述程序。 對每一獲得的cDNA通過PCR進行抗體基因擴增。為獲得VH區(qū)基因，應(yīng)用了對小鼠重鏈FRl序列特異的引物(SEQ IDNO :130)和對小鼠重鏈FR4序列特異的引物(SEQ ID N0:131)。此外，為獲得VL區(qū)基因，應(yīng)用了對小鼠輕鏈FRl序列特異的引物(SEQ ID N0:132)和對小鼠輕鏈FR4序列特異的引物(SEQ ID NO :133)。參照 Jones，S. T. ^P Bending, Μ. Μ. Bio/Technology 9，88-89 (1991)設(shè)計這些引物。為了進行 PCR，使用了 Ex-taq (Takara Bio he.)。將每一 cDNA 樣本與 IOxEX Taq 緩沖液(5 μ 1)、dNTP 混合物(2. 5mM) (4 μ 1)、引物(1. 0 μ Μ)(每種 2 μ 1)禾口 ExTaq (5U/μ 1) (0.25 μ D混合。應(yīng)用無菌水將總體積調(diào)節(jié)至50 μ 1。在包括以下條件的條件下進行PCR: 在94°C處理2分鐘后，進行30個以下循環(huán)94°C變性1分鐘、58°C退火30秒、以及在72°C 延伸1分鐘。(1)-2 克隆將上述獲得的每一 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，隨后切取VH區(qū)和VL區(qū)的DNA 帶。應(yīng)用QIAquick凝膠純化試劑盒01IAGEN)根據(jù)該試劑盒所附說明書純化DNA。應(yīng)用TA 克隆試劑盒(Invitrogen)將每一純化的DNA克隆至pCR2. 1載體中。將每一 DNA連接的載體根據(jù)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至Dffia感受態(tài)細胞(Τ0Υ0Β0)中。在37°C在培養(yǎng)基(100 μ g/ml氨芐
30青霉素)中培養(yǎng)每一轉(zhuǎn)化子(10個克隆)過夜。應(yīng)用Qiaspin小量制備試劑盒OiIAGEN) 純化所獲得的質(zhì)粒DNA。(1)-3 測序應(yīng)用熒光測序儀(ABI ；DNA測序儀3130XL)和BigDye終止子Ver. 3. 1循環(huán)測序試劑盒(ABI)，根據(jù)試劑盒所附說明，應(yīng)用M13正向引物(SEQ IDNO 134)和M13反向引物 (SEQ ID NO :135)對上述獲得的每一質(zhì)粒的VH區(qū)和VL區(qū)進行基因序列分析。結(jié)果，確定了每一基因序列(在10個克隆中是同一的)。所得到的單克隆抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO 43、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO 83,SEQ ID NO93,SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO :113和 SEQ ID NO :123 ；所得到的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 58,SEQID NO :63、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :97、SEQ ID NO :107,SEQ ID NO :117 和 SEQ ID N0:127。具體地，單克隆抗體#1包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ IDNO 47的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#2包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :53的輕鏈可變區(qū)。 單克隆抗體#3包含SEQ ID NO 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 58的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#4包含SEQ IDNO :43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :63的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#5 包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :68的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#6包含SEQ ID NO 73的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 77的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#7包含SEQ ID NO 83的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 87的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#8包含SEQ ID NO 93的重鏈可變區(qū)和SEQ IDNO 97的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#9包含SEQ ID NO :103的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :107的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#10包含SEQ ID NO :113的重鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO 117的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#11包含SEQID NO :123的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 127的輕鏈可變區(qū)。(2)應(yīng)用所獲得的單克隆抗體的CAPRIN-I在不同細胞的細胞表面上的表達接下來，我們檢查了 CAPRIN-I蛋白是否在7種已證實在其中表達CAPRIN-I 基因的乳腺癌細胞系(MDA-MB-157、T47D、MRK-nu-l、MDA-MB-231V、BT20、SK-BR-3 和 DA-MB-231T)、3種其他乳腺癌細胞系(MDA-MB-231C、MCF-7和ZR75-1)、6種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(T98G、SNB19、U251和U87G)、3種腎癌細胞系(Caki-1、Caki2和A498)、1種胃癌細胞系(MKN45)、1種大腸癌細胞系(Caco2)、3種肺癌細胞系(A549, QG56和PC8)、以及3種白血病細胞系(Namalwa、BDCM和RPI1788)的細胞表面表達。在1. 5ml微離心管中離心每一細胞系(IO6個細胞)。分別將實施例4中制備的與癌細胞表面反應(yīng)的含有抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#10的雜交瘤上清液(每一種100 μ 1)添加至其中，并在冰上靜置1小時。 在用PBS洗滌后，將每一所得物懸浮于用含有0. 1 % FBS的PBS稀釋500倍的FITC-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen Corporation)中，然后在冰上靜置1小時。在用PBS洗滌后，應(yīng)用FACSCalibur (Becton，Dickinson and Company)測量熒光強度。同時，應(yīng)用上述 (5)中制備的對照抗體作為對照代替含有抗CAPRIN-I的單克隆抗體#1至#11的雜交瘤上清液，實施與上述相同的程序，由此制得對照。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)加入了單克隆抗體#1至#11的所有細胞均比對照細胞的熒光強度強至少30%。具體地，例如當(dāng)使用單克隆抗體#9時，證實了熒光強度的以下增強:MDA-MB-157 :211% ；T47D 145% ；MRK-nu-l :123% ；MDA—MB—231V 251% ；BT20 :168%以及MDA-MB-231T 94% .基于此，證實了 CAPRIN-I蛋白在上述人癌細胞系的細胞表面表達。此外，熒光強度的增強率由細胞中平均熒光強度(MFI值)的增強率來表示。其通過以下等式計算。平均熒光強度的增強率(熒光強度增強率)(％)=((與抗人CAPRIN-I抗體反應(yīng)的細胞的MFI值)-(對照MFI值))/ (對照MFI值)X 100(3)抗CAPRIN-I抗體對癌細胞的抗腫瘤效果(ADCC活性)根據(jù)對癌細胞的細胞毒活性(ADCC活性)評估了上面選擇的抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11。應(yīng)用雜交瘤SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體#1至#11的雜交瘤。應(yīng)用Hitrap蛋白A瓊脂糖FF(GEHealthcare)純化每一獲得的上清液，隨后用PBS(-) 置換，并用0.22-μ m濾器(Millipore)純化。將每一所得物用作活性確定的抗體。將人乳腺癌MDA-MB-157細胞系(IO6個細胞)收集至50ml離心管中。往其中加入鉻51 (100 μ Ci)， 隨后在37°C溫育2小時。之后，用含有10% 83的1 ^11640培養(yǎng)基洗滌細胞3次。將細胞加入到96孔V-底培養(yǎng)板的孔中(每孔103個細胞)。這樣制得靶細胞。往其中加入上述純化的抗體(每孔Iyg)。之后，往其中加入從小鼠脾臟中分離的小鼠淋巴細胞(每孔 2X IO5個細胞)，隨后在37°C和5% CO2中培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，確定每一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細胞中釋放的鉻(Cr)51的水平。然后，計算每一抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗體對癌細胞的ADCC活性。結(jié)果，所有單克隆抗體#1至#11顯示出針對MDA-MB-157的 ADCC活性(20%或更多)。具體地，例如，得到了以下細胞毒活性#1 22. 1% ；#2 :29. 1% ； #6 30. 2% ；和#9 32. 4% (參見圖4)。同時，當(dāng)應(yīng)用實施例4中制備的與CAPRIN-I蛋白質(zhì)本身反應(yīng)但不與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體實施上述類似的方法時，證實了沒有細胞毒活性(參見圖4)。上述結(jié)果顯示了所獲得的抗CAPRIN-I單克隆抗體(#1至#11)通過展示出ADCC活性損傷表達CAPRIN-I的癌細胞。(4)抗CAPRIN-I抗體對癌細胞的抗腫瘤效果(⑶C活性)根據(jù)對癌細胞的細胞毒活性(CDC活性)評估了上面選擇的抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11。將通過血液采樣從兔中收集的血液加入到Eppendorf管中，在室溫下靜置 60分鐘，隨后以3000rpm離心5分鐘。由此，制得用于⑶C活性確定的血清。將人乳腺癌 MDA-MB-231V細胞系(IO5個細胞)收集至50ml離心管中。往其中加入鉻51 (100 μ Ci)，隨后在37°C溫育2小時。之后，用含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基洗滌細胞3次，然后將其懸浮于含有50%上述制備的兔血清的RPMI中。將細胞加入到96孔ν-底培養(yǎng)板的孔中(每孔IO3個細胞)。分別將上面(3)中獲得的抗體#1至#11加入到孔中(每孔1 μ g)，隨后在37°C和5% CO2中培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，確定每一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細胞中釋放的鉻(Cr) 51的水平。然后，計算每一雜交瘤上清液中抗CAPRIN-I單克隆抗體展示出的針對MDA-MB-231V的⑶C活性。結(jié)果，所有單克隆抗體#1至#11展示出⑶C活性(30%或更多)。同時，當(dāng)應(yīng)用實施例4中制備的與CAPRIN-I蛋白質(zhì)本身反應(yīng)但不與癌細胞表面反應(yīng)的單克隆抗體實施上述類似的方法時，證實了沒有細胞毒活性(參見圖4)。因此，揭示了抗 CAPRIN-I單克隆抗體(#1至#11)還可通過展示出⑶C活性損傷表達CAPRIN-I的癌細胞。實施例6 抗CAPRIN-I單克隆抗體對小鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果接下來，評估了所得抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11對帶瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果。通過以上述方法對每一雜交瘤上清液進行柱純化得到這一實施例中使用的抗體。
應(yīng)用帶瘤小鼠檢查抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11的抗腫瘤效果，其中向所述帶瘤小鼠中移植了表達CAPRIN-I的衍生自小鼠的癌細胞系。將CD6細胞(購自ATCC)皮下移植至70只Balb/c小鼠(Japan SLC, Inc.)的背部(每只小鼠IO6個細胞)。使每一腫瘤生長，直至其直徑變?yōu)榧s7mm。對該帶瘤小鼠(70只中的60只)腹膜內(nèi)施與抗CAPRIN-I 單克隆抗體#1至#11，以及實施例4中制備的一類單克隆抗體(與CAPRIN-I蛋白質(zhì)本身反應(yīng)，但不與癌細胞表面反應(yīng))(每種抗體5只小鼠)，劑量為每只小鼠300 μ g (300 μ 1)。之后，在總共2天期間以相同的劑量腹膜內(nèi)施與每一抗體至相關(guān)帶瘤小鼠3次。每天測量腫瘤尺寸，用于觀察抗腫瘤效果。給10只剩余的帶瘤小鼠施與PBS(-)代替抗體。這組小鼠設(shè)計作為對照組。作為抗腫瘤效果的觀察結(jié)果，在施與了抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11 的測試組的情況下，所發(fā)生的腫瘤消退達到了這樣的程度，即開始施與抗體時的腫瘤體積 (100% )在第4天下降至50%，第6天下降至約10%，并且在第8天為百分之幾。在第11 至14天發(fā)生了基本上完全的腫瘤消退(見圖幻。另一方面，在對照組中，在第4、6、8和11 天，腫瘤體積分別增長至原始體積的260 %、350 %、550 %和800 % (參見圖幻。另外在施與了單克隆抗體(與CAPRIN-I蛋白質(zhì)本身反應(yīng)，但不與癌細胞表面反應(yīng))的小鼠組中，沒有展現(xiàn)出抗腫瘤效果，并且如對照組那樣發(fā)生腫瘤生長。該結(jié)果表明所獲得的抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11展示出強烈的針對表達CAPRIN-I的癌細胞的體內(nèi)抗腫瘤效果。此外， 通過以下公式計算腫瘤體積從而獲得腫瘤尺寸長直徑X短直徑X短直徑X0. 5。此外，以上述相同的方式將抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11施與帶瘤小鼠 (Balb/c)，其中向該小鼠移植了小鼠NlE癌細胞(購自ATCC)。這導(dǎo)致在施與抗體后第15 天腫瘤完全消退。另一方面，在對照組中，腫瘤體積升高至高達原始體積的約950% (參見圖6)。實施例7 鑒定CAPRIN-I蛋白中的肽，其中與癌細胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I抗體結(jié)合所述肽應(yīng)用與癌細胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11 (上面獲得)，鑒定了由這些單克隆抗體識別的CAPRIN-I蛋白中的部分序列。首先，通過將重組CAPRIN-I蛋白用PBS溶解為1 μ g/μ 1濃度制備溶液，將 DTT(Fluka)添加到100 μ 1該溶液中至IOmM終濃度，隨后在95 °C反應(yīng)5分鐘，由此使 CAPRIN-I蛋白內(nèi)的二硫鍵還原。接下來，以20mM的終濃度加入碘乙酰胺(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)，然后在遮光條件下在37°C對硫醇基進行烷基化反應(yīng)30分鐘。將50 μ g每一種抗CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11加入到40 μ g如此獲得的還原的烷基化的CAPRIN-I蛋白中，將混合物體積調(diào)節(jié)至ImL 20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)，然后在攪拌混合每一混合物的同時使該混合物在4°C反應(yīng)過夜。然后，添加胰蛋白酶(ftOmega)至0. 2 μ g的終濃度。在37°C反應(yīng)1小時、2小時、4 小時和12小時后，將所得物與在ImM碳酸鈣及NP-40緩沖液QOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)、 5mM EDTA、150mM NaCl和NP-40)中的蛋白A-玻璃珠(GE)混合，然后反應(yīng)30分鐘，其中所述的蛋白A-玻璃珠在此之前用含BSA(Sigma)的PBS進行封閉并然后用PBS洗滌。用25mM碳酸銨緩沖液(pH 8. 0)洗滌每一反應(yīng)混合物，然后用100 μ 10. 1 %甲酸洗脫抗原-抗體復(fù)合物。應(yīng)用Q-TOF Premier(Waters-MicroMass)根據(jù)該儀器所附說明對洗脫物進行LC-MS分析。
結(jié)果，鑒定出了 SEQ ID NO :136的多肽作為CAPRIN-I的部分序列，其被所有抗 CAPRIN-I單克隆抗體#1至#11識別。此外，鑒定了 SEQ ID NO :137的肽，其作為上述SEQ ID NO :136多肽中的部分序列，被單克隆抗體#2至#5、#6至#8和#10識別。還揭示了單克隆抗體#2至#5識別SEQ ID NO :138的肽，其為SEQ ID NO :137肽中的部分序列肽。工業(yè)實用性本發(fā)明的抗體可用于治療和/或預(yù)防癌。本說明書包括日本專利申請?zhí)?009-087285的說明書和/或附圖的全部或部分公開內(nèi)容，其中本申請對所述的日本專利申請?zhí)栆髢?yōu)先權(quán)。此外，本文中引用的全部出版物、專利和專利申請也通過引用的方式完整并入本文中。序列表獨立文本引物SEQ ID NO :31 至 39 及 130 至 13權(quán)利要求
1.用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-I蛋白、或與包含7個或更多個連續(xù)氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30任一項所示的氨基酸序列， 或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-I蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白片段是由除了 SEQ ID N0:6和18 之外的偶數(shù)編號的SEQID NO :2-30任一項所示氨基酸序列中的氨基酸殘基編號50-98或氨基酸殘基編號233-305區(qū)域內(nèi)的7個或更多個連續(xù)氨基酸組成的多肽，或包含所述多肽作為部分序列的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-I的部分多肽、或與包含7個或更多個連續(xù)氨基酸的所述部分多肽的片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-I部分多肽具有SEQ ID NO 37或SEQ ID NO :136所示的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的藥物組合物，其中所述癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、 淋巴癌、肺癌、食道癌或大腸癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的藥物組合物，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的藥物組合物，其中所述抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。
7.具有與下述多肽的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體，其中所述的多肽具有SEQIDN0:37或SEQ ID NO 136所示的氨基酸序列、或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
8.抗體，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
9.抗體，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO :50、51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
10.抗體，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
11.抗體，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 60,61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
12.抗體，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
13.抗體，其包含有包含SEQID NO :70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAI3RIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
14.抗體，其包含有包含SEQID NO :80、81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
15.抗體，其包含有包含SEQID NO :90、91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
16.抗體，其包含有包含SEQID N0:100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。，17.抗體，其包含有包含SEQ ID N0:110、lll和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含 SEQ ID NO: 114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
17.抗體，其包含有包含SEQID N0:120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含 SEQ ID NO :1M、125和1 所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-I蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。
18.根據(jù)權(quán)利要求7至17任一項的抗體，其是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。
19.用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求 7-18任一項的抗體或其片段。
20.用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其應(yīng)用具有與CAPRIN-I蛋白、或與包含7個或更多個連續(xù)氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的 CAPRIN-I蛋白具有偶數(shù)編號的SEQ ID NO :2_30任一項所示的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
21.用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求7-18任一項的抗體或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的抗體或其片段，具有與CAPRIN-1蛋白或包含7個或更多個連續(xù)氨基酸的所述蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性。
文檔編號A61P35/00GK102170907SQ200980138959
公開日2011年8月31日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者井戶隆喜, 岡野文義, 小林真一, 齋藤孝則 申請人:東麗株式會社