預防和治療原發(fā)和轉移性癌癥的light-抗腫瘤抗原抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段相連的腫瘤特異性抗體、含有該抗體的組合物、預防和治療癌癥的方法和用途。本發(fā)明的LIGHT－抗體和組合物可以用于預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，降低、抑制、減少原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移。
【專利說明】預防和治療原發(fā)和轉移性癌癥的LIGHT-抗腫瘤抗原抗體
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00910136143. 4、申請日為2009年5月4日、發(fā)明名稱為"預 防和治療原發(fā)和轉移性癌癥的LIGHT-抗腫瘤抗原抗體"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于癌癥預防和治療領域。本發(fā)明涉及與LIGHT蛋白或其片段相連的腫瘤 特異性抗體、含有該抗體的組合物、預防和治療癌癥的方法和用途。

【背景技術】
[0003] LIGHT(homologous to lymphotoxin, exhibits inducible expression, and competes with HSV glycoprotein D for herpes virus entry mediator, a receptor expressed by T lymphocytes (與淋巴毒素同源，表現(xiàn)為誘導型表達，并與HSV糖蛋白D競 爭皰疹病毒進入介體--T淋巴細胞表達的一種受體））是最近鑒定的TNF配體超家族II 型跨膜糖蛋白。LIGHT (TNFSF 14)是腫瘤壞死因子（TNF)家族成員，其與分別主要表達在基 質細胞和T細胞上的淋巴毒素 β受體（ΧΤβ R, LymphotoxinP receptor)和皰疫病毒進入 介體（HVEM, herpes virus entry mediator)相互作用。LTPR信號傳導是形成有組織的 淋巴結構所必需的，這可能至少部分歸因于LTi3R能夠誘導趨化因子和粘著分子表達，而 后兩者可以吸引淋巴器官中的幼稚T細胞和樹突細胞（DC)。體內(nèi)LIGHT對基質細胞上的 LT β R的刺激導致CCL21表達，在缺乏LT α β (LT β R的另一配體）的情況下CCL21吸引脾 臟Τ細胞區(qū)域中的幼稚Τ細胞。這些結果證實LIGHT能夠與LT β R相互作用以調節(jié)CCL21 趨化因子的表達。此外，LIGHT也表現(xiàn)出有力的、CD28非依賴性的、Τ細胞致敏和擴增共刺 激活性，導致增強的抗腫瘤T細胞免疫和/或增強的自身免疫。通過LT β R的信號傳導是 有組織的淋巴組織形成所必需的。淋巴毒素 β受體（LTi3R)在淋巴結構的形成中起重要 作用。LTi3R被TNF家族的兩個成員，即，淋巴毒素 α β和LIGHT，激活。LTi3R在二級淋巴 器官中Τ、B區(qū)的不同組織和LN的形成上起關鍵作用。通過LTi3 R的信號傳導調節(jié)二級淋 巴器官中趨化因子和粘著分子的表達。趨化因子和粘著分子控制脾臟中DC和淋巴細胞的 遷移和定位?？扇苄訪T或TNF在非淋巴組織中的過表達足以促進功能性淋巴新生。
[0004] LIGHT在T細胞激活和淋巴組織形成中具有獨特作用。LIGHT是LT β R及皰疹病 毒進入介體（HVEM)的配體。LIGHT主要表達在淋巴組織上。LIGHT與LTPR的相互作用可 以在LT α +小鼠脾臟中重建淋巴結構。此外，LIGHT的上調可以導致T細胞激活和遷移入 非淋巴組織中并形成淋巴樣結構。相反地，LIGHT+小鼠表現(xiàn)出受損的T細胞激活和延遲的 心臟排斥。因此，LIGHT是有力的共刺激分子，其也可以促進淋巴組織形成以增強局部免疫 應答。引流淋巴組織中有效的幼稚T細胞致敏的缺乏和腫瘤中腫瘤特異性T細胞的無法擴 增會妨礙癌癥的根除。
[0005] 微轉移瘤（顯微鏡下可見的癌細胞小聚積體）可以在異質性原發(fā)腫瘤發(fā)育的非常 早階段確立并在其被臨床檢測到前播種于遠處組織。例如，乳腺癌中當原發(fā)性腫瘤體積很 小時能夠觀察到可檢測的轉移。因此，診斷時，許多癌癥患者已經(jīng)發(fā)生顯微轉移，該觀察結 果已經(jīng)導致針對實體瘤患者開發(fā)術后輔助治療。盡管有這些進展，但是成功仍是有限的，而 且轉移性疾病的最佳治療一直是癌癥治療中的一個顯著挑戰(zhàn)。
[0006] 轉移性疾病是癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因。盡管手術、化療或放療常常能夠 控制原發(fā)性腫瘤生長，但是很少成功地根除已經(jīng)散布的轉移瘤。一個尚未解答的問題是這 種應答是否允許對到來的CTL實行教導然后使之離開腫瘤部位。另一個尚未解答的問題是 是否這些CTL然后能夠在外圍進行巡邏并有效地去除自發(fā)轉移的腫瘤細胞。用LIGHT局部 治療腫瘤可以產(chǎn)生大量的腫瘤特異性CTL，這些CTL離開原發(fā)性腫瘤并浸潤遠端腫瘤以完 全根除已經(jīng)存在的自發(fā)轉移瘤。
[0007] 人體中天然發(fā)生的抗惡性腫瘤T細胞應答常常不足以造成腫瘤（原發(fā)性或轉移 性）消退。免疫治療潛在地引起可以尋找并破壞已經(jīng)散布的腫瘤抗原陽性癌細胞的腫瘤反 應性T細胞，但是對攜帶腫瘤的宿主的自動免疫接種僅僅表現(xiàn)出有限的益處。在大多數(shù)腫 瘤中由于缺乏充分確立的抗原從而限制了自動免疫接種或過繼轉移治療。甚至在未確定特 異腫瘤抗原的情況下仍然有效的免疫療法將更為適用和更具有治療可行性。免疫治療常常 在常規(guī)手術、放療和化療之后使用。手術可以減小腫瘤負擔但也除去了腫瘤抗原的主要來 源，這可能產(chǎn)生信號以導致免疫應答撤回，而放療和化療將進一步損害已有的免疫應答。仍 不清楚何時及以何種方式來加強抗腫瘤自動免疫應答。
[0008] 抗Her2/neu抗體可抑制和延遲Her2/neu+腫瘤的生長。適當?shù)穆?lián)合治療可能誘 導傳統(tǒng)癌癥治療和LIGHT之間的協(xié)同作用，以根除已經(jīng)建立的腫瘤。關鍵的選擇是使用可 以選擇性地殺死腫瘤但不殺死免疫細胞的藥劑。HER_2/neu(也稱為HER2or c-erb-B2) 是185-kDa的蛋白質受體，具有酪氨酸激酶活性，并與表皮生長因子（EGF)受體具有廣泛 的類似性。HER-2/neu在許多上皮腫瘤中表達，并且已知在全部卵巢癌和乳腺癌的大約 20-25 %、全部胰腺腺癌的35-45 %和直腸結腸癌的高達90 %中過量表達。HER-2/neu過 表達是不良預后和癌癥轉移的標志?？?Her2/neu抗體能夠以依賴FcR的方式抑制腫瘤 的生長（Clynes et al.，2000)。HER-2/neu陽性腫瘤細胞潛在地是已用于免疫治療試驗 的腫瘤反應性細胞毒性T淋巴細胞的好靶標。重要的是抗Her2/neu(Here印tin)抗體 已在若干臨床試驗中進行過測試，被證明是HER-2/neu陽性乳腺癌有效的輔助治療方法 (Piccart-Gebhart et al.，2005 ;Romond et al.，2005)。但是，長期（52 周）使用伴隨 paclitaxel免疫接種常常導致心臟副作用。在患有HER-2/neu陽性腫瘤的患者中觀察到 T細胞和B細胞水平的天然免疫，確認了 HER-2/neu的免疫原性（Ercolini et al.，2005 ; Kiessling et al.，2002)。對Here印tin有應答的患者的頻率是有限的，大多數(shù)最初對 Here印tin有應當?shù)幕颊咴谥委熀笠荒陜?nèi)產(chǎn)生抗性（Kiessling et al.，2002)。因此，迫切 需要開發(fā)新的策略來根除neu+腫瘤和neu-腫瘤。在本發(fā)明中，我們將LIGHT和抗neu治 療聯(lián)合，以實現(xiàn)不僅對于neu而且對于其它腫瘤抗原產(chǎn)生長期免疫，以此可能有效根除原 發(fā)性和/或遠端腫瘤。用Herceptin處理的人neu+腫瘤細胞系顯示更高比率被HER-2-特 異性CTLs裂解（Kono et al.，2004)。因此，重要的是確定LIGHT和抗Her2抗體治療之間 是否存在協(xié)同作用以根除局部或遠端癌癥。
[0009] 本發(fā)明提供了用抗體-LIGHT預防和治療癌癥（包括原發(fā)性腫瘤和轉移瘤）的新 的方法。抗腫瘤表面抗原的抗體將會把LIGHT帶到腫瘤部位，以吸引更多的免疫細胞和殺 死腫瘤。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 第一方面，本發(fā)明涉及與LIGHT蛋白或其片段相連的腫瘤特異性抗體。腫瘤特異 性抗體與LIGHT蛋白或其片段相連構成復合物。該復合物至少包括兩個成分，一個成分是 腫瘤特異性抗體，另一個成分是LIGHT蛋白或其片段。
[0011] 在本發(fā)明的復合物中，所述抗體和所述LIGHT蛋白或其片段可以通過形成融合蛋 白、化學綴合、和形成免疫脂質體等方法中的一種或者多種方法相連。在一個優(yōu)選實施方案 中，所述抗體和所述LIGHT蛋白或其片段通過形成融合蛋白而相連。
[0012] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及包含腫瘤特異性抗體與LIGHT蛋白或其片段 的融合蛋白。
[0013] 本發(fā)明的復合物和融合蛋白可以是分離的，例如可以是重組產(chǎn)生的，或者可以是 經(jīng)過至少部分純化的。
[0014] 當形成融合蛋白時，所述抗體和所述LIGHT蛋白或其片段之間可以包含（也可以 不包含）連接接頭。連接接頭是由一個或多個（例如1 一 50個，1 一 20個，1 一 15個或者 1 一 10個）氨基酸殘基組成的氨基酸序列。例如，連接接頭可以是圖1A中所示的接頭。
[0015] 融合蛋白可以包含信號肽（導向肽）或者便于純化的標簽。
[0016] 當形成融合蛋白時，所述抗體優(yōu)選是單鏈抗體，優(yōu)選是scFv。
[0017] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明融合蛋白由信號肽（導向肽）和/或者便于純化 的標簽、腫瘤特異性抗體（單鏈抗體）、接頭和LIGHT蛋白或其片段構成。在一個具體實施 方案中，本發(fā)明融合蛋白由腫瘤特異性抗體（單鏈抗體）和LIGHT蛋白或其片段構成。在 一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明融合蛋白由腫瘤特異性抗體（單鏈抗體）、接頭和LIGHT蛋白 或其片段構成。
[0018] 在本發(fā)明的融合蛋白中，LIGHT蛋白或其片段可以在腫瘤特異性抗體（單鏈抗體） 的上游（N端一側）或者下游（C端一側）。
[0019] 所述抗體可以是人源化單克隆抗體、嵌合抗體、heterominibody、或單鏈抗體。本 發(fā)明的抗體優(yōu)選是腫瘤抗原特異性的抗體。在一個實施方案中，腫瘤抗原是腫瘤表面抗原。 在一個實施方案中，所述抗體能特異識別和結合腫瘤表面抗原。
[0020] 本發(fā)明的抗體可以是抗體片段。能夠特異結合抗原的抗體片段是本領域知曉的。 優(yōu)選地，所述抗體是足以識別腫瘤抗原的抗體片段。
[0021] 本發(fā)明復合物中的所述抗體包括但不限于對以下腫瘤抗原特異的抗體：HER2、 HER4、HER8和/或EGFR，例如抗neu抗體和/或抗Her2抗體，或237和抗-pUA。本發(fā)明復 合物中所用抗體還包括對腫瘤上過表達的蛋白質或者突變的跨膜蛋白特異的抗體。本發(fā)明 復合物中所用抗體還包括對STEAP (前列腺的六次跨膜上皮抗原）、CD55特異的抗體。
[0022] 一種抗一人 Her2/neu scFv 例子是 7. 16. 4。另一種抗一人 Her2/neu scFv 例子是 SEQ ID N0:5。
[0023] 所述LIGHT蛋白和其片段優(yōu)選是人的。野生型人類LIGHT DNA序列見SEQ ID NO: 1。天然人LIGHT氨基酸序列見SEQ ID NO: 2。
[0024] 優(yōu)選地，所述LIGHT蛋白片段足以刺激細胞毒性T淋巴細胞。
[0025] 優(yōu)選地，所述LIGHT蛋白片段包含或者是LIGHT蛋白胞外域的片段。
[0026] 所述LIGHT蛋白的片段優(yōu)選是包含LIGHT蛋白胞外域的片段。在一個具體實施方 案中，LIGHT蛋白的片段可以是LIGHT蛋白胞外域。在一個實施方案中，LIGHT蛋白胞外域 具有如下氨基酸序列：
[0027] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSY HDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGG VVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO ：4)
[0028] (也參見 gi 113124597 I sp I 043557 I TNF14_HUMAN[13124597]。
[0029] LIGHT蛋白的片段優(yōu)選包含LIGHT的大約100-150個氨基酸。在一個優(yōu)選實施方 案中，所述LIGHT蛋白片段包含：LIGHT蛋白約第85 - 239位的氨基酸序列。
[0030] 在一個優(yōu)選實施方案中，LIGHT蛋白的片段包含：LIGHT蛋白約第85 - 239位的氨 基酸序列、或LIGHT蛋白約第90 - 239位的氨基酸序列、或LIGHT蛋白約第90 - 235位的 氨基酸序列。氨基酸的編號是指SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的位置，或者與該氨基酸序 列最佳比對后對應的氨基酸序列位置。
[0031] 在另一個實施方案中，所述LIGHT蛋白片段包含LIGHT蛋白的保守結構域。
[0032] 在另一個優(yōu)選實施方案中，所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段是蛋白酶抗性LIGHT 蛋白或LIGHT蛋白片段。
[0033] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段是人的LIGHT蛋白或 LIGHT蛋白片段，在蛋白酶識別序列EQLI中包含突變，導致具有蛋白酶抗性。
[0034] 作為舉例說明，一種突變的人LIGHT氨基酸序列缺乏EQLI，其序列見SEQ ID N0:3。
[0035] 在一個具體實施方案中，所述復合物包含或者具有如下序列或者由如下序列構 成：抗體（例如抗_Her2抗體或者抗-237抗體）+LIGHT。
[0036] 另一方面，本發(fā)明還涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的復合物，其中所述復合 物是包含所述抗體和所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段的融合蛋白。
[0037] 本發(fā)明還涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的包含腫瘤特異性抗體與LIGHT蛋 白或其片段的融合蛋白。
[0038] 本發(fā)明還涉及包含上述核酸分子的載體。該載體優(yōu)選是表達載體，其能夠在宿主 細胞中表達所述核酸分子。
[0039] 本發(fā)明還涉及包含上述載體的宿主細胞。宿主細胞包括動物細胞、植物細胞、微生 物細胞，例如大腸桿菌細胞，動物細胞系，非生殖動物細胞系等。
[0040] 本發(fā)明的復合物可以用于預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低、 抑制、或減少原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移，或者刺激產(chǎn)生使幼稚T細胞致敏的趨化因 子、粘著分子和共刺激性分子中的至少一種，或者刺激對抗所述腫瘤的腫瘤特異性T細胞。
[0041] 另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明復合物或者本發(fā)明核酸分子或者載體的組合 物。
[0042] 另一方面，本發(fā)明涉及用于預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低、 抑制、或減少原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移的藥物組合物，包含本發(fā)明復合物或者本發(fā) 明核酸分子或者載體和可藥用載體。
[0043] 在一個實施方案中，本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選是適用于靜脈內(nèi)給藥的形式，例如注 射液。
[0044] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明藥物組合物通過刺激產(chǎn)生使幼稚T細胞致敏的趨化因 子、粘著分子和共刺激性分子中的至少一種來降低癌癥轉移。
[0045] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明藥物組合物通過刺激對抗所述腫瘤的腫瘤特異性Τ細 胞來降低原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移。
[0046] 在另一個實施方案中，所述藥物組合物用于和化療劑和/或放射療法聯(lián)合給藥。
[0047] 另一方面，本發(fā)明涉及聯(lián)合制劑，包含本發(fā)明與LIGHT蛋白或其片段相連的腫瘤 特異性抗體和編碼LIGHT蛋白或其片段的核酸分子.
[0048] 另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明復合物或者本發(fā)明核酸分子或者載體在制備藥物中 的用途，所述藥物用于預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低、抑制、或減少 原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移，或者刺激產(chǎn)生使幼稚T細胞致敏的趨化因子、粘著分子和 共刺激性分子中的至少一種，或者刺激對抗所述腫瘤的腫瘤特異性T細胞。
[0049] 本發(fā)明待預防和治療的癌癥/腫瘤包括但不限于乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸 癌，或皮膚癌。
[0050] 另一方面，本發(fā)明涉及預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低、抑 制、或減少原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移的方法，所述方法包括：
[0051] 給藥本發(fā)明復合物或者本發(fā)明核酸分子或者載體的藥物組合物；和
[0052] 通過激活腫瘤特異性的抗腫瘤T細胞以降低所述原發(fā)性腫瘤的生長和/或癌癥轉 移。
[0053] 在上述方法的一個實施方案中，所述藥物組合物是通過靜脈內(nèi)給藥的。
[0054] 在上述方法的一個實施方案中，藥物組合物通過刺激產(chǎn)生使幼稚T細胞致敏的趨 化因子、粘著分子和共刺激性分子中的至少一種來降低癌癥轉移
[0055] 另一方面，本發(fā)明涉及預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低、抑 制、或減少原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移的方法，所述方法包括：
[0056] (A)給個體給藥包含本發(fā)明復合物或者本發(fā)明核酸分子或者載體的藥物組合物；
[0057] (B)通過刺激對抗所述腫瘤的腫瘤特異性T細胞來降低原發(fā)性腫瘤生長和/或癌 癥轉移。
[0058] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子被遞送至預先存在的腫瘤部位。
[0059] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子被遞送至預先存在的腫瘤部位的遠端部 位。
[0060] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括給藥化療劑。
[0061] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括采用放射療法。
[0062] 在一個實施方案中，所述與LIGHT蛋白或其片段相連的腫瘤特異性抗體如上文所 定義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1顯示抗體-LIGHT融合蛋白的構建。
[0064] 圖1A顯示抗體-LIGHT融合蛋白的分子設計。上圖是融合蛋白的總體策略。下圖 是LIGHT與抗her2抗體在基因水平上融合的具體實例。scFvOieu)是抗Her2單鏈Fv抗 體，圖中給出的該抗體的例子是7. 16. 4,在本發(fā)明中也可以利用其它抗Her2抗體，或者抗 其它抗原的抗體。scFV(neu)的C端通過接頭L2與LIGHT片段的N端相連。L2的非限制 性例子有兩個，其中L2short是長接頭（CS)，L21ong是短接頭（CL)，E⑶是LIGHT的胞外 域，p3是載體的一部分。
[0065] 圖1B顯示LIGHT-anti-Her2和它們的接頭：抗Her2抗體和短接頭（CS)或者長 接頭（CL)的序列，以及小鼠 LIGHT的EOT。
[0066] 圖1C顯示了一個抗人Her2/neu scfv，它可以用于本發(fā)明中，通過接頭（或者不通 過接頭）和LIGHT或其片段融合，構成融合蛋白。
[0067] 圖2說明向neu+腫瘤中遞送LIGHT能夠增強抗neu免疫。Adv-mmlit (表達鼠突 變LIGHT的腺病毒）可抑制neu+N202腫瘤生長。詳見實施例2。
[0068] 圖3顯示237-LIGHT結合Agl04Ld腫瘤細胞以及LT β R和HVEM。這些數(shù)據(jù)顯示， 237-LIGHT既可以結合Agl04腫瘤細胞，也可以結合LT β R和HVEM，提示237-LIGHT可以結 合兩個目標部位。使用各圖上方所示試劑對大約4Χ105個Agl04Ld腫瘤細胞進行染色。通 過峰標記FL2的平均熒光。最后三圖是圖上方所示兩種染色的重疊圖。
[0069] 圖4說明237-LIGHT可以對抗-⑶3刺激的T細胞增殖產(chǎn)生共刺激作用。將大約 3X 105個混合的淋巴結細胞和脾細胞置于已經(jīng)使用抗⑶3和所示試劑包被的96孔板的 每個孔中。刺激后48小時加入 3H并在3H加入后18小時收獲板子。很清楚，使用lug/ml 237-LIGHT獲得好得多的T細胞應答，與迄今為止最有效的抗共刺激分子--抗⑶-28相 當。因此，這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明融合蛋白仍然保持LIGHT的功能。
[0070] 圖5顯示全身性使用低劑量的237-LIGHT融合蛋白能夠限制已經(jīng)建立的原發(fā)性腫 瘤的生長。以大約1〇 5個Agl04Ld腫瘤細胞于第0天皮下接種C3B6F1小鼠。給小鼠過繼 轉移3xl06活化的2C T細胞（體外以SH肽活化）并靜脈內(nèi)注射10 μ g小鼠免疫球蛋白 (mlg，作為對照）或237-LIGHT抗體。在第15天重復mlg或237-LIGHT給藥。結果顯示在 圖中。
[0071] 圖6是顯示在除去原發(fā)性腫瘤后根除繼發(fā)性腫瘤的結果圖。在第一個部位給 B6C3F1小鼠接種Agl04Ald腫瘤細胞作為原發(fā)性腫瘤。15天后在遠端部位接種第二個腫瘤。 然后在第15、29和36天用融合蛋白237-LIGHT按圖中所示處理小鼠。
[0072] 圖7顯示當以抗-Her2抗體或同種型IgG(Isotype IgG)給藥時，移植的 Her2+Tubo腫瘤的生長情況，其中發(fā)現(xiàn)，在最初抗Her2抗體處理后一些Tubo腫瘤生長消失， 但是在處理停止后重新生長。經(jīng)s. c.途徑給BABL/c小鼠接種106Tubo腫瘤細胞。在腫瘤 接種后第10天和第17天經(jīng)i. p.途徑注射100ug抗-Her2抗體（7. 16. 4)或者同種型IgG。 在圖中指明的時間點檢測腫瘤生長。結果顯示，在用抗Her2抗體處理的5只小鼠中有3只 出現(xiàn)腫瘤重新生長。
[0073] 圖8顯示當以Ad-LIGHT單獨給藥、抗-Her2單獨給藥以及以Ad-LIGHT和抗-Her2 聯(lián)合給藥時，腫瘤的生長情況。給BABL/c小鼠 s. c接種106Tubo腫瘤細胞。在腫瘤接種后 第18天向腫瘤內(nèi)注射lelOAd-LIGHT或Ad-LacZ病毒顆粒（VP)。在腫瘤接種后第18和25 天i.p.注射50ug抗-Her2抗體或者同種型IgG。在圖中指明的時間點檢測腫瘤生長。在 第21天后，所有治療組均和同種型IgG組有顯著差別。在第25天后，Ad-LIGHT和抗Her2 聯(lián)合治療組與單Ad-LIGHT組或者單抗-Her2抗體組有顯著差別。統(tǒng)計學分析是采用雙尾 student's t檢驗進行的。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM。p〈0. 05被認為有顯著差別。結果顯 示，抗-Her2抗體能夠減緩腫瘤生長但不能根除腫瘤，只有在給予抗Her2抗體和ad-LIGHT 兩者時才會導致根除腫瘤。
[0074] 圖9顯示通過聯(lián)合治療可在Her2/neu Tg小鼠中控制自發(fā)性腫瘤生長。在首次檢 測到腫瘤之后不久按圖中所示處理小鼠。參見實施例6。在第0、1、2周以抗體（100ug)或 腺病毒（VP:10 1(I)處理帶有自發(fā)性腫瘤的小鼠三次。在聯(lián)合治療組中，給予抗_her2單克隆 抗體（mab)和表達鼠突變LIGHT的腺病毒（adv-mmlight)。
[0075] 圖10顯示的是實施例7不同處理組的腫瘤體積。表明用抗體和融合蛋白抗HER 抗體一 LIGHT短期處理可消除原發(fā)性neu+TUBO腫瘤。"Ctrl"表示對照組。"Her2"表示抗 HER抗體組。"Her2+Fab-LIGHT"表示抗HER抗體一 LIGHT融合蛋白組。詳見實施例7。
[0076] 圖11顯示的是實施例8不同處理組的肺轉移腫瘤計數(shù)。表明融合蛋白抗HER2抗 體-LIGHT能夠降低肺部轉移腫瘤。未處理組是用PBS處理的對照組。7. 16. 4組是用抗neu 抗體7. 16. 4單克隆抗體處理的組。Fab-LIGHT組是用抗HER2抗體-LIGHT融合蛋白處理的 組。詳見實施例8。
[0077] 發(fā)明詳述
[0078] 在本發(fā)明中用LIGHT-抗體融合產(chǎn)物靶向腫瘤可以產(chǎn)生對抗原發(fā)性腫瘤和轉移瘤 的強免疫性。
[0079] 腫瘤環(huán)境常常形成免疫屏障阻止足夠水平的抗原或抗原呈遞細胞進入引流淋巴 結由此導致無效的T細胞致敏。為了開發(fā)新的實用性方法以產(chǎn)生抗腫瘤強免疫，本發(fā)明人 直接用TNF超家族成員14 (TNFSF14)，LIGHT，靶向腫瘤組織，LIGHT可以直接向腫瘤部位 募集更多免疫細胞并增強抗腫瘤免疫（Yu等，2004, Wang等，2006, Fan等，2006)。為了 排除大的已經(jīng)建立的腫瘤，開發(fā)了標準療法和LIGHT相聯(lián)合的療法。用抗Her2靶向腫瘤 可以有效地降低腫瘤負擔但是不能完全地根除腫瘤，尤其是轉移瘤。目前，本發(fā)明人證實， LIGHT-抗腫瘤抗原抗體可以減緩大塊腫瘤（massive tumor)的生長。本發(fā)明人還證實， LIGHT和抗-Her/neu之間的協(xié)同作用比單種療法可以更好地控制原發(fā)性腫瘤。重要的是， 用LIGHT-抗her2/neu可根除轉移性neu+腫瘤。本研究可以延伸到與抗其它腫瘤抗原的 抗體連接的LIGHT，尤其是在微轉移瘤治療方面。同等重要的是，也可以將其它細胞因子與 抗腫瘤抗原抗體連接，并使用其對抗微轉移瘤。
[0080] 早期轉移可能是不活躍的或是生長緩慢的，這可能不能有效刺激免疫應答。如何 根除這些微轉移瘤成為了一個難題。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)證實，對腫瘤特異的抗體可以更為有 效地將LIGHT帶入腫瘤部位從而抑制腫瘤生長。例如，使用可以將LIGHT帶入遠端腫瘤部 位的抗neu的SvFc與LIGHT的融合物（Sv-Fc-neu-LIGHT)，在術后治療neu+腫瘤患者是可 行的。以此方式，本發(fā)明人可以促進免疫細胞靶向微轉移瘤。
[0081] 通過LIGHT-抗體融合物或綴合物（conjugate)在腫瘤組織中誘導免疫應答可以 產(chǎn)生足夠的抗原特異性致敏效應T細胞，以離開腫瘤并在甚至除去腫瘤后根除轉移瘤。將 手術切除與使用TNFSF14(LIGHT)靶向原發(fā)性腫瘤相聯(lián)合，是一種引發(fā)更好的免疫應答以 根除自發(fā)性轉移的新策略。抗體-LIGHT治療減緩侵襲性腫瘤的生長。
[0082] 治療腫瘤（尤其是微轉移瘤（micrometastasis)，此時的腫瘤通過成像方式是無 法看見的）的一個新方法是：通過使用突變LIGHT分子，創(chuàng)建淋巴樣微環(huán)境，該淋巴樣微環(huán) 境可以表達導致幼稚T細胞致敏和導致活化的T細胞擴增所需的趨化因子、粘著分子及共 刺激分子?？僧a(chǎn)生更寬的抗腫瘤Τ細胞。直接遞送將LIGHT(或其它免疫刺激劑）與抗腫 瘤抗原抗體連接在一起的融合蛋白或者兩者的綴合物可以有效地抗腫瘤和腫瘤轉移。本發(fā) 明人的數(shù)據(jù)清楚地顯示，與對照處理的腫瘤相比，當以LIGHT-抗體綴合物或融合產(chǎn)物靶向 腫瘤時，體內(nèi)腫瘤體積減小。在全身性治療原發(fā)腫瘤后，可減少遠端腫瘤或者轉移瘤。
[0083] 本發(fā)明以下具體公開的核酸分子編碼包括了細胞外域的重組人LIGHT :
[0084] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLT
[0085] GSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVG
[0086] CPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSF
[0087] LGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO:4).
[0088] 轉移性疾病是導致癌癥患者死亡的主要原因。轉移瘤或小的原發(fā)性腫瘤的最初隱 匿可以歸因于可用于致敏CD8+T細胞的抗原的水平不足。利用與LIGHT偶聯(lián)的識別腫瘤細 胞表達的抗原的抗體（抗體-LIGHT)進行治療的方法可以在通過靜脈內(nèi)（i.v.)注射全身 性地引入該抗體-LIGHT后特異地并有效地靶向遷移的腫瘤細胞。
[0089] 作為舉例說明，在小鼠模型中，"237"（參見文獻A Mutant Chaperone Converts a Wild-Type Protein into a Tumor-Specific Antigen. Andrea Schietinger 等，SCIENCE, 13 OCTOBER 2006,VOL 314,Pages 304-308 ；P. L. Ward, H. Koeppen,T.Hurteau, H. Schreiber, J Exp Med 170,217(1989))是一種抗Agl04腫瘤細胞的高親和性單克隆抗體，其在靜脈注 射后以高濃度在體內(nèi)聚積在腫瘤內(nèi)。Het er〇minib〇dy237-LIGHT (通過綴合或遺傳連接方 式連接）允許LIGHT在其系統(tǒng)性引入后被特異地遞送入位于各種遠端位置的腫瘤組織中。 LIGHT-抗體偶聯(lián)物（例如，LIGHT-抗體融合蛋白）選擇性地聚積在腫瘤組織內(nèi)并在體外特 異地結合Agl04腫瘤。
[0090] 利用與LIGHT偶聯(lián)的、識別腫瘤細胞表達的抗原的抗體（抗體-LIGHT)的治療方 法被設計成在通過靜脈內(nèi)注射而全身引入該抗體-LIGHT后特異和有效地靶向遷移的腫瘤 細胞（策略見圖1)。識別任何腫瘤抗原的任何腫瘤特異性抗體都適于與LIGHT或其功能性 片段偶聯(lián)。
[0091] LIGHT在腫瘤細胞上的表達可以促進腫瘤排斥。腫瘤Agl04A及其衍生物被用作我 們的腫瘤模型之一。Agl04A最初來源于C3H(H-2 k)小鼠的自發(fā)性骨肉瘤，甚至非常低劑量 的 Agl04A(104)也能夠在 C3H 或 B6C3F1 小鼠 （Jackson laboratory, Maine USA)中侵襲性 生長并伴隨非常小的浸潤。當將強抗原Ld(allogeniC antigen)引入腫瘤中后，腫瘤仍保持 對免疫識別具有抵抗性，提示可能存在強的腫瘤屏障。局部表達的突變LIGHT可以成為一 種強共刺激分子，其可以增強腫瘤抗原向抗原特異性T細胞的直接呈遞并防止腫瘤微環(huán)境 中浸潤的T細胞的無免疫反應性?？磥鞮IGHT在介導腫瘤免疫方面具有多種功能。LIGHT 也可以增強體內(nèi)腫瘤凋亡。
[0092] 通過目前現(xiàn)有的癌癥治療方法很少成功根除轉移瘤。在手術切除前于原發(fā)性腫瘤 組織中引起免疫應答可以產(chǎn)生足以根除遠端轉移瘤的腫瘤特異性效應T細胞。通過例如在 原發(fā)性腫瘤中遞送LIGHT-抗體來致敏腫瘤特異性CD8+T細胞，可以促進細胞毒性T淋巴細 胞（CTL)的隨后離開，該CTL可向遠端腫瘤歸巢。在手術切除前靶向原發(fā)性腫瘤可以通過 免疫介導方式根除自發(fā)性轉移瘤。
[0093] 已經(jīng)散布的轉移的腫瘤細胞能夠在手術切除原發(fā)性腫瘤后數(shù)月或甚至數(shù)年保持 隱匿并在臨床上無法檢測到，這導致隨后的臨床疾病復發(fā)。免疫治療策略適于消除此微轉 移疾?。╩icrometastatic disease)。例如，將LIGHT-抗體遞送入原發(fā)性腫瘤中可以防止 轉移形成并對外周組織中已經(jīng)建立的轉移瘤產(chǎn)生排斥作用。例如，將LIGHT以抗體-LIGHT 融合蛋白形式直接遞送至腫瘤（例如，原發(fā)性腫瘤）可以從腫瘤組織中產(chǎn)生足夠數(shù)量的可 移動至遠端位置的效應/記憶T細胞，導致免疫應答強度的整體增加、炎性細胞因子的產(chǎn)生 增加、以及自發(fā)性轉移瘤的根除。
[0094] 在存在位于腫瘤表面的LIGHT時，CTL可以有效地被致敏并隨后通過循環(huán)浸潤 LIGHT陰性的遠端腫瘤。沒有原發(fā)性腫瘤中存在LIGHT時帶來的好處，預期在繼發(fā)性腫瘤位 置將幾乎沒有活化T細胞。可能的是，在LIGHT存在時在局部腫瘤位置產(chǎn)生的這些效應/ 記憶T細胞能夠離開腫瘤并在外周巡查和鑒別轉移的腫瘤細胞。近來已經(jīng)證實，趨化因子 受體（CCR7)是T細胞離開外周組織，包括炎癥部位，并前往引流LN的關鍵分子。
[0095] 本文中，單克隆抗體包括"嵌合"抗體，其中該抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分與 來源于特定物種或屬于特定抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述鏈的 剩余部分則與來源于另一物種或屬于另一抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同 源；該術語也包括"嵌合"抗體的片段，只要所述片段表現(xiàn)出期望的生物學活性即可（見美 國專利 4, 816, 567 ;和 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本 文中有意義的嵌合抗體包括含有來源于非人靈長類動物的可變區(qū)抗原結合序列和人恒定 區(qū)序列的"靈長類化"抗體（〃primatized〃antibodies)。
[0096] "抗體片段"包括完整抗體的一部分，例如完整抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？?體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'）2、單鏈Fv和Fv片段；diabody ;線性抗體（linear antibodies)(見美國專利 5, 641，870 ;Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) :1057-1062(1995)); 單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0097] 已經(jīng)開發(fā)了多種技術用于生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)地，通過蛋白酶水解消化完整抗體 來獲得這些片段。然而，這些片段也可以通過重組宿主細胞直接生產(chǎn)。Fab、Fv和ScFv抗 體片段均能夠在大腸桿菌（E.coli)中表達和分泌，由此使得可以容易地生產(chǎn)大量的這些 片段?？梢詮目贵w噬菌體文庫分離抗體片段?？贵w片段也可以是"線性"抗體，例如，美國 專利5, 641，870中描述的。此線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
[0098] 抗體與共刺激分子如LIGHT的綴合物（Conjugates)可以使用各種雙官能蛋白質 偶聯(lián)劑來制備，所述偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（STOP)、琥 拍酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己燒-1-羧酸酯、iminothiolane (IT)、亞氨酸酯 的雙官能衍生物（如己二酰亞氨酸二甲基酯HCL)、活性酯（例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯）、 醛類化合物（例如戊二醛）、二疊氮基化合物（如，二（對疊氮基苯甲?；┘憾罚㈦p重 氮衍生物（如，雙-(對重氮化苯甲?；?乙二胺））、二異氰酸酯（如甲苯2, 6-二異氰酸 酯）、和雙活性氟化合物（如1，5-二氟-2, 4-二硝基苯）。LIGHT的細胞外域或其片段與特 異于腫瘤抗原（優(yōu)選表面腫瘤抗原）的抗體或抗體片段綴合。
[0099] 或者，可以例如通過重組技術或肽合成法，制備包含抗腫瘤抗原抗體和LIGHT的 融合蛋白。此DNA的長度可以包括編碼該綴合物的這兩個部分的相應區(qū)域，其中所述的這 兩個部分可以彼此相鄰或者被編碼不會破壞該綴合物的期望性質的接頭肽的區(qū)域分開。
[0100] 圖1說明融合蛋白或者綴合物的可能結構。我們還給出了一個融合蛋白序列作為 通用策略的例子，用于指導抗體一 LIGHT的構建。
[0101] 本文公開的LIGHT-抗體復合物也可以配制成免疫脂質體（immunoliposomes)的 形式。"脂質體"是由各種脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小泡，其對于將藥物遞送給 哺乳動物是有用的。脂質體的成分通常排列為雙層形式，類似于生物膜的脂質排列方式。 含有抗體的脂質體可以通過本領域已知的方法，例如美國專利4, 485, 045和4, 544, 545和 W097/38731 (1997年10月23日公布）描述的方法制備。美國專利5, 013, 556中公開了具 有增加的循環(huán)時間的脂質體。
[0102] 對于疾病的預防或治療，施用的劑量和方式可以由臨床醫(yī)師根據(jù)已知標準選擇。 LIGHT-抗體綴合物或融合產(chǎn)物的適宜劑量可以取決于待治療的癌癥類型、疾病的嚴重性和 病程、腫瘤大小、轉移程度、施用抗體的目的是預防性的還是治療性的、先前的治療、患者的 臨床病史及對抗體的應答、以及主治醫(yī)師的判斷。LIGHT-抗體組合物適于一次性或通過一 系列治療的方式施用給患者。優(yōu)選地，通過靜脈內(nèi)灌注或皮下注射施用該組合物。根據(jù)疾病 的類型和嚴重性，可以將大約1 μ g/kg至大約50ug/kg體重（例如，大約0· l-15mg/kg/劑） 的抗體作為最初候選劑量，通過例如一次施用或多次分開施用或者持續(xù)灌注施用給患者。 本發(fā)明融合蛋白的一個優(yōu)點是使用的劑量比單給予抗體的劑量低得多。給藥方案可以包括 施用大約〇· 〇lmg/kg的初始承載劑量（loading dose)、之后大約0· 22mg/kg抗Her2-LIHGT fusion的每周維持劑量。然而，其它劑量方案也可能是有用的。典型的每日劑量可以從大 約1 μ g/kg至0. lmg/kg或更多，這取決于上述因素。對于持續(xù)幾天或更長時間的重復施 用，根據(jù)情況，可以維持該治療直到疾病癥狀獲得期望的抑制，例如腫瘤大小/體積的減小 和轉移的減小?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法和分析試驗，基于醫(yī)師或本領域其它技術人員已知的標 準，監(jiān)測該治療的過程。
[0103] 可以使用LIGHT-抗體融合物或綴合物靶向的適宜腫瘤表面抗原包括表皮生長因 子受體家族（EGFR)，包括 HER1、HER2、HER4 和 HER8 (Nam, Ν· H.，& Parang, K. (2003)，Current targets for anti-cancer drug discovery. Current Drug Targets, 4(2)，159-179)、 STEAP(前列腺的六次跨膜上皮抗原；Hubert等，STEAP:a prostate-specific cell-surface antigen highly expressed in human prostate tumors. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999 ;96 (25): 14523-8. )、CD55 (Hsu 等，Generation and characterization of monoclonal antibodies directed against the surface antigens of cervical cancer cells. , Hybrid Hybridomics. 2004:23(2):121-5)〇
[0104] 本發(fā)明的抗體可以采用本領域已知的方法制備。例如，抗neu/Her2抗體的制備 可參見如下文獻：Α Β7· 1-antibody fusion protein retains antibody specificity and ability to activate via the T cell costimulatory pathway. Challita-Eid PM 等，J Immunol. 1998Apr 1,160(7) :3419-26 ;以及 HER-2/neu-specific monoclonal antibodies collaborate with HER-2/neu-targeted granulocyte macrophage colony-stimulating factor secreting whole cell vaccination to augment CD8+T cell effector function and tumor-free survival in Her-2/neu-transgenic mice, ffolpoe ME 等，J Immunol. 2003Aug 15, 171(4):2161-9。 實施例
[0105] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的詳細內(nèi)容及其有關效果，但是應該明白，這 些實施例僅是為舉例說明本發(fā)明，而不在任何方面構成對本發(fā)明范圍的限制。
[0106] 材料和方法
[0107] 抗體-LIGHT融合蛋白的制各
[0108] 使用標準方案，構建了融合蛋白237-LIGHT構建體，該構建體允許抗體237特異地 靶向Agl04A，同時攜帶LIGHT到腫瘤區(qū)。LIGHT采用胞外域（其序列見圖1B中的ECD)。
[0109] 類似地，構建了融合蛋白7. 16. 4-LIGHT構建體。7. 16. 4是抗-her2單克隆抗體 (Anti-her2)。LIGHT采用胞外域（E⑶）。融合蛋白7. 16. 4-LIGHT的構建和序列見圖1。
[0110] 圖1提供了詳細策略和相關序列。
[0111] scFv-LIGHT融合蛋白的制各和測試（請參見圖1)
[0112] ?所用表達系統(tǒng)
[0113] 真核表達載體：pFLAG-CMV_l (sigma)或者 pSecTag(invitrogen)
[0114] 細胞系：CH0或293細胞
[0115] 純化方法：抗一 FLAG系統(tǒng)或者Ni-NTA系統(tǒng)
[0116] 其中，Diabody系統(tǒng)在IRES系統(tǒng)中構建。
[0117] ?完整策略
[0118] 1、N -端或C 一端LIGHT構建體的抗原結合試驗
[0119] (1) scFv-LIGHT基因構建體的重疊 PCR
[0120] (2)在 pComb3X 載體中克隆 LIGHT-scFv
[0121] (3)在 Ε· coli ToplOF' 中表達
[0122] (4)用Ni-NTA系統(tǒng)純化
[0123] (5)抗-uPA活性試驗：用HT1080細胞進行FACS
[0124] 2、N -端或C -端LIGHT構建體的T細胞結合試驗
[0125] (1)將scFv-LIGHT融合構建體轉移到真核載體中
[0126] (2)瞬時轉染到CH0或者293細胞
[0127] (3)用抗FLAG或者Ni-NTA系統(tǒng)純化
[0128] (4) LIGHT 功能測試以及抗 uPA :FACS
[0129] 小鼠、細朐系和試劑
[0130] 雌性 C3HXC57BL/6F1(C3B6F1)小鼠，4_ 8 周齡，購自 National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, (Frederick, MD) 〇 C57BL/6-RAG-1 缺陷 (RAG-1+)小鼠購自 Jackson 實驗室（Bar Harbor, ME)。具有 RAG-2 缺陷 /B6 背景的 H-Y TCR 轉基因小鼠（H_Y小鼠）購自Taconic Farms (Germantown, NY)。具有經(jīng)10代育種至B6中的 RAG-1 缺陷背景的 2C TCR 轉基因小鼠（2C 小鼠）由 J. Chen (Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA)提供。0T-1TCR轉基因小鼠（0T-1 小鼠）由 A. Ma(The University of Chicago)提供。RAG-rtH-YdGOT-l小鼠在芝加哥大學的特殊無病原體設施中繁殖 和維持。根據(jù)機構的制度護理和使用動物。
[0131] AG104A纖維肉瘤自發(fā)地在衰老的C3H小鼠中長出，按已有描述的方法（Ward 1989JEM)適應性培養(yǎng)。先前已經(jīng)描述過表達鼠 H-2Ld的AG104A(AG104-Ld)，AG104A細 胞的轉染子。這些腫瘤細胞系維持在補充了 10%FCS(Sigma-Aldrich)、100U/ml青霉素 和 100yg/ml 鏈霉素（BioWhittaker)的 DMEM(Mediatech)中。產(chǎn)生抗1^(克隆 30-5-7) 和抗2C TCR(1B2)抗體的雜交瘤細胞系分別獲自D.Sachs(National Institute of Health, Bethesda, MD)和 T. Gajweski (The University of Chicago)〇
[0132] 使用蛋白G柱通過標準方案從培養(yǎng)物上清液中純化雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。通 過芝加哥大學的單克隆抗體機構（the Monoclonal Antibody Facility),將1B2抗體與 FITC或生物素綴合。偶聯(lián)PE的抗⑶8抗體、偶聯(lián)Cy-Chrome (CyC)的鏈霉親和素、偶聯(lián)CyC 的抗CD44抗體、偶聯(lián)PE的抗CD62L抗體和偶聯(lián)PE的Thl.2抗體購自BD Biosciences。綴 合了 FITC的山羊抗小鼠 IgG購自Caltag。偶聯(lián)PE的鏈霉親和素購自Immunotech。偶聯(lián) PE 的驢抗人 IgG 購自 Jackson Immunological Research Lab (West grove, PA)。生物素化 的山羊抗SLC抗體購自R&D system Inc. (Minneapolis, MN)。綴合了 AP的兔抗山羊Ig抗 體購自 Vector Laboratories Inc. (Burlingame,CA)。經(jīng)純化的山羊抗 SLC抗體購自 Pepro Tech (Rock hill, NJ)。膠原酶（4 型）購自 Sigma-Aldrich。CFSE 購自 Molecular Probes。 用于本研究的HVEM-Ig和LTi3 R-Ig融合蛋白先前已經(jīng)描述過。
[0133] 體內(nèi)腫瘤牛長
[0134] 將腫瘤細胞皮下注射至小鼠背的下部，S卩，尾根部以上0. 5-lcm處。每3至4天利 用游標卡尺測量腫瘤生長。通過公式V= JiabC/6(其中，a，b和c是三個正交的直徑），計 算大?。▎挝唬毫⒎嚼迕祝?。
[0135] 鉬織學
[0136] 在所述時間收集用于組織學檢查的腫瘤組織，并在10%中性緩沖的福爾馬林中 固定、經(jīng)石蠟包埋處理、并用蘇木精和伊紅染色。對于SLC的免疫組織化學染色，收獲腫瘤 組織、包埋在0CT化合物（Miles-Yeda, Rehovot, Israel)中，-70°c冰凍。在PBS中的冷的 2%福爾馬林內(nèi)固定冰凍切片（5-10 μ m厚），用0. 1%皂苷/PBS透化處理。濕室中在0. 1% 皂苷/PBS中用5%山羊血清室溫預封閉切片半小時。為了對SLC進行染色，首先在封閉 緩沖液中與1/25稀釋的生物素化山羊抗SLC抗體（R&D systems Inc. Minneapolis, MN) 孵育。2小時后加入堿性磷酸酶綴合的兔抗山羊Ig抗體（Vector Laboratories Inc. Burlingame，CA)。為了進行免疫熒光染色，用PBS中的2%正常小鼠血清、兔血清和山 羊血清在濕室中室溫封閉切片半小時。將封閉液更換為50μ 1以1/100稀釋在封閉液 中的一抗，ΡΕ 綴合的抗 Thl. 2 (BD PharMingen)或 ΡΕ 綴合的抗⑶8 (BD PharMingen)， 濕室中室溫孵育切片1小時。在含有10% 1，4-二氮雜二環(huán)[2. 2. 2]辛烷的Mowiol 4-88 (BD Biosciences, La Jolla, CA)中封固樣本。48 小時內(nèi)用 Zeiss Axioplan 顯微鏡 (Zeiss, Oberkochen，德國）和 Photometries PXL CCD 相機（Photometries, Tucson, AZ) 分析樣品。使用Openlab v2.0.6(Improvision, Lexington, MA)進行非鄰反卷積計算 (No-Neighbor deconvolution)〇
[0137] CCL21 的 ELISA
[0138] 預備腫瘤勻漿物并分析CCL21。從腫瘤攜帶小鼠收集相似量的腫瘤組織， 并稱重，在含有蛋白酶抑制劑的PBS中勻漿，離心收集上清液。用PBS中2 μ g/ ml的山羊抗小鼠 CCL21包被聚苯乙烯96孔微量滴定板（Immulon 4, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA)，然后用PBS中0· 1%牛血清白蛋白（BSA)室溫封閉30分鐘。 洗滌后，加入已知濃度的標準物（重組CCL21, 50ng/ml, R&D)的系列稀釋物和樣品，室溫溫 育2小時。3次洗滌后，向孔中加入生物素化的兔抗SLC Ab。2小時溫育和洗滌后，加入 50μ 11/1000稀釋的堿性磷酸酶綴合的親和素（Dako)溫育1小時，然后顯色。在自動的板 讀數(shù)器（Spectra-Max 340，Molecular Devices, Sunnyvale, CA)上 405nm 測量顯色的顏色， 通過ELISA從標準曲線確定CCL21的量并根據(jù)組織重量進行標化。數(shù)據(jù)為平均值土s.d.
[0139] T細朐共刺激試駘
[0140] 按照廠商說明書（Miltenyi Biotec, Auburn, California)在磁場中通過負選擇法 純化T細胞。使用抗CD3單克隆抗體通過流式細胞計數(shù)評價分離的T細胞的純度為大于 95%。用0. 2g/ml抗⑶3單克隆抗體包被的板子進一步用突變的LIGHT-flag于37°C包被4 小時。洗滌后，在孔中培養(yǎng)純化的T細胞（IX 106個細胞/ml)。使用可溶性形式的抗CD28 單克隆抗體（1 μ g/ml)。在所有試驗中，在3天培養(yǎng)期的最后15小時通過添加 ICi/孔3H-胸 苷評價T細胞增殖。在TopCount微量板閃爍計數(shù)器（Packard instrument, Meriden, CT) 中測量3H-胸苷的摻入。
[0141] 從腫瘤纟目織分離細朐
[0142] 首先對小鼠進行放血以減少腫瘤組織的血液污染。收集腫瘤組織，在PBS中洗滌， 切成塊，重懸浮在補充了 2% FCS和1. 25mg/ml膠原酶D (膠原酶D溶液）的DMEM中于37°C 振蕩培養(yǎng)箱中溫育40分鐘。40分鐘后收集單細胞懸浮液，在膠原酶D溶液中再消化細胞團 塊40分鐘直到所有腫瘤組織均分解為單細胞懸浮液。
[0143] 藥物纟目合物
[0144] 本文所用的治療組合物可以配制成含有適于期望的遞送方法的載體的藥物組合 物。適宜的載體包括當與所述治療組合物聯(lián)合時保留該治療組合物的抗腫瘤功能的物質。 實例包括，但不限于，各種標準的藥物載體，例如無菌磷酸緩沖鹽水、抑菌水等?？梢匀芙?治療性制劑，并通過適于將該治療組合物遞送至腫瘤部位的任何途徑施用該制劑。潛在的 有效施用途徑包括，但不限于，靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮內(nèi)、器官內(nèi)、同位 (orthotopic)等途徑。用于靜脈內(nèi)注射的制劑包含處于防腐的抑菌水溶液、無菌的非防腐 水中的、和/或稀釋在含有用于注射的無菌氯化鈉的聚乙烯氯化物或聚乙烯袋中的治療組 合物。對于治療性蛋白質制品，可以進行凍干并以無菌粉末形式，優(yōu)選地在真空下保存，之 后在注射前于抑菌水（含有例如芐基醇防腐劑）或無菌水中重配。使用本文公開的方法進 行癌癥治療時的劑量和給藥方案可以隨著所述方法和目標癌癥而改變，而且一般取決于本 領域已知和明了的各種因素。
[0145] 脾和腫瘤中細朐閔子的測定
[0146] 按所述（Yu等，2003)制備腫瘤和脾勻漿物。簡而言之，收集相似量的腫瘤或 脾組織，稱重并在含有蛋白酶抑制劑的PBS中勻漿，離心收集上清液。使用Cytometric bead array 試劑盒（CBA) (BD Biosciences)在配備有 CellQuestPro 和 CBA 軟件（Becton Dickinson)的FACS Caliber細胞計數(shù)器上根據(jù)廠商說明書，定量上清液中的細胞因子量。
[0147] 腫瘤牛長差異的統(tǒng)計學分析
[0148] 由于對相同小鼠持續(xù)一段時間重復觀察腫瘤生長，故使用縱向數(shù)據(jù)隨機效應模型 分析該數(shù)據(jù)。對于每一實驗，均假定腫瘤的生長取決于處理方法并在一段時間遵循線性生 長速率。該模型針對每一組的線性生長的截距和斜率給出了總體估計。截距和斜率被允許 在小鼠個體之間發(fā)生變化。比較斜率，即，生長速率，其在不同處理組中是不同的。實際的 腫瘤生長可能不在整個隨訪期均遵循線性生長趨勢。一些實驗中腫瘤的生長在早期增加緩 慢，在后期變快。在以上隨機效應模型中在隨訪時間上添加了二次項。
[0149] 野生型人類LIGHT DNA序列（加下劃線顯示編碼蛋白酶位點EQLI的序列）：
[0150] 5, -ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGG
[0151] ACAGACCGACATCCCATTCACGAGGCTGGGACGAAGCCACCGGAG
[0152] ACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTG
[0153] CTGATGGGGGCTGGGCTGGCCGTCCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAG
[0154] CTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACGGA
[0155] CCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCAC
[0156] GAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGGGCCAACTCCAGCTTGA
[0157] CCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGG
[0158] CCTTCCTGAGGGGCCTCAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCAC
[0159] CAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGT
[0160] GTGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTC
[0161] TACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTGGAGCTGTTGGTCA
[0162] GCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCT
[0163] GGTGGGACAGCAGCTTCCTGGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTG
[0164] GGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGAC
[0165] TGCGTGATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA-3' （SEQ ID N0:1)
[0166] 天然人LIGHT氨基酸序列（加下劃線顯示蛋白酶消化位點）：
[0167] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMG
[0168] AGLAVQGffFLLQLHWRLGEMVTRLPDGPAGSffEQLIQERRSHEVNP
[0169] AAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYY
[0170] YIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRA
[0171] TSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGA
[0172] FMV(SEQ ID NO :2)
[0173] 一種突變的人LIGHT氨基酸序列（缺乏EQLI，以點表示）：
[0174] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMG
[0175] AGLAVQGWFLLQLHWRLGEMVTRLPDGPAGSW…· QERRSHEVNPAA
[0176] HLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYI
[0177] YSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRAT
[0178] SSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAF
[0179] MV(SEQ ID NO :3)
[0180] 一種抗一人 Her2/neu scFv 的序列
[0181] CATATGCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAGTTGAAAAAAC
[0182] CCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTT
[0183] TACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGG
[0184] CCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAA
[0185] TACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGT
[0186] CCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGA
[0187] CAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCAGT
[0188] AGTTCCAACTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCC
[0189] AGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCG
[0190] GAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGC
[0191] CGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTG
[0192] CTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTAC
[0193] CAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACA
[0194] CCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTC
[0195] TGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGAT
[0196] GAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTT
[0197] GGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTAGCGGCC
[0198] GC(SEQ ID NO :5)
[0199] 實施例1 :LIGHT表達與腫瘤祀向劑（tumor targeting agent)的偶聯(lián)或綴合
[0200] 一方面，為了能夠遞送突變LIGHT表達遞送系統(tǒng)或等價的遞送系統(tǒng)，可以將突變 LIGHT與腫瘤靶向劑例如腫瘤特異性抗體偶聯(lián)或綴合。例如，可以將腫瘤特異性抗體與 LIGHT綴合，由此選擇性地將該融合蛋白遞送至腫瘤部位。此外，可以設計腫瘤特異性抗體 使之在病毒遞送系統(tǒng)的表面表達，或者可以用腫瘤特異性抗體包被脂質體小泡。表達突變 LIGHT并包含腫瘤靶向劑的遞送運載體將首先靶向特異的腫瘤細胞，然后轉化腫瘤細胞以 在腫瘤細胞表面表達突變的LIGHT。突變LIGHT的這種靶向地在腫瘤表面的表達將在圍繞 腫瘤的基質細胞上誘導趨化因子以吸引T細胞并導致T細胞的初始致敏。這種治療適用于 所有的腫瘤，尤其是實體瘤。使用ad-LIGHT已經(jīng)治療了 4T1、MC38、B16和肥大細胞瘤，結 果顯示出原發(fā)性和/或繼發(fā)性腫瘤的減小。因此，可以使用LIGHT-抗體靶向各種腫瘤，尤 其是它們的轉移瘤。例如，通過全身性注射，抗her2/neu抗體-LIGHT可以將LIGHT帶至 表達her2/neu的轉移性腫瘤部位，然后可以產(chǎn)生局部免疫應答以清除腫瘤。因此，可以通 過任何全身的和局部的途徑遞送該融合蛋白，而且由于抗體或其它藥劑對腫瘤抗原的特異 性，該融合蛋白將更多地定位于腫瘤部位。
[0201] 實施例2 :Adv-LIGHT能夠促進Her2+腫瘤的排斥
[0202] 將表達LIGHT的腺病毒局部遞送給Her2+腫瘤以測試局部給藥LIGHT是否能夠促 進Her2+腫瘤的排斥。
[0203] 圖2說明向neu+腫瘤中遞送LIGHT能夠增強抗neu免疫。Adv-mmlit (表達鼠突 變LIGHT的腺病毒）可抑制neu+N202腫瘤生長，甚至在Her2轉基因小鼠中。
[0204] 表達Her2的轉基因 FBV小鼠在成年后產(chǎn)生乳腺腫瘤，類似于人乳腺癌，并且極難 治療，因為在轉基因小鼠中先前已經(jīng)存在Her2表達，可能已經(jīng)發(fā)生對于Her2的耐受。在第 18和20天向該腫瘤內(nèi)注射大約2 X 101°病毒顆粒的adv-lacz或者adv-mmlit (表達鼠突變 LIGHT的腺病毒，突變LIGHT是抗蛋白酶降解的LIGHT ;adv-lacz和adv-mmlit的構建過程 分別見The Journal of Immunology, 2007, 179:1960 - 1968 中關于ad-lacz 和 ad-mmLIGHT 的構建）。每周監(jiān)測腫瘤生長，測量腫瘤大小。與對照adv-lacz相比，在用adv-mmlit處理 的組中腫瘤生長慢得多。
[0205] 實施例3 :LIGHT -抗體融合蛋白的功能活性
[0206] 通過流式細胞計數(shù)，分別使用LTi3 R-Ig和HVEM-Ig測定了 237_LIGHT(237抗體 和LIGHT的融合蛋白，其構建見材料和方法）與LIGHT的受體（LT β R和HVEM)的結合能力 (圖3)。圖3顯示，這種融合蛋白仍然能夠保持與腫瘤和LIGHT受體的結合能力。融合蛋 白在結合腫瘤（237與Agl04特異結合）后能夠結合LTi3 R和HVEM。為了測試這種融合蛋 白是否仍然保持其激活T細胞的功能，我們首先體外測試237-LIGHT在次最佳劑量的與板 子結合的抗CD3存在時共刺激T細胞的能力，由此確定其功能活性。結果顯示，237-LIGHT 的功能性與抗CD28的功能性相當（見圖4)。因此，表明我們用于產(chǎn)生融合蛋白的策略是可 行的。
[0207] 為了測試237-LIGHT融合蛋白是否能夠體內(nèi)抑制腫瘤生長，給B6C3HF1小鼠持續(xù) 10天皮下（s. c.)注射5X104個Agl04-腫瘤細胞，然后用lOyg融合蛋白進行處理。小劑 量的融合蛋白，即，10 μ g，顯示了對腫瘤生長的抑制（見圖5)。融合蛋白可以導致強的抗腫 瘤免疫。
[0208] 該實施例通過流式細胞計數(shù)分別使用LT β R-Ig和HVEM-Ig證明237-LIGHT能夠 結合LIGHT的受體，LT β R和HVEM，并證明與LIGHT偶聯(lián)的腫瘤特異性抗體可以刺激免疫以 降低腫瘤生長。
[0209] 實施例4用LIGHT-抗體融合蛋白治療手術切除后殘余腫瘤
[0210] 為了測試靶向劑抗體-LIGHT是否可以強有力地清除不能有效地刺激免疫系統(tǒng)的 小數(shù)量轉移腫瘤細胞或殘余癌細胞，我們設計了二腫瘤模型來模擬臨床情形。在兩個位點 接種Agl04Llt瘤細胞，其中一個位點的接種量為10 6個，另一位點的接種量為1X104個。 兩周后，用Ad-LIGHT(見上文adv-mmlight)處理較大的腫瘤（10 6)，處理后10天通過手術 除去該腫瘤。在第15、29和36天用237-LIGHT (見上文）以本文中描述的劑量全身性地處 理小鼠。結果見圖6,該圖顯示，LIGHT-抗體可用于在手術除去原發(fā)性腫瘤之后根除繼發(fā)性 腫瘤（實驗設立的該情形與大多數(shù)癌癥患者的情形類似）。這提示，全身性的抗體一 LIGHT 治療能夠產(chǎn)生強免疫應答，以強有力地清除不能有效地刺激免疫系統(tǒng)的小數(shù)量轉移腫瘤細 胞或殘余癌細胞。
[0211] 實施例5 :抗-Her2抗體與LIGHT的協(xié)同作用
[0212] Tubo是來源于過表達突變型neu基因的Balb/c Tg小鼠的腫瘤系。我們觀察到該 腫瘤系對于體內(nèi)和體外的抗_Her2抗體（7. 16. 4)治療敏感。然而，當腫瘤完全建立時，抗 體和LIGHT的效果都減少。而一旦抗-neu抗體治療被中止，tubo將于3-4星期內(nèi)重新生 長（見圖7)。
[0213] 在另一實驗中，10e6個tubo腫瘤細胞被s. c.接種到BABL/c小鼠。在腫瘤接種 后的第18天，10el0個Ad-LIGHT或Ad-LacZ的VP (病毒顆粒）被注射入腫瘤。在腫瘤接 種后的第18天和第25天，i. p.注射50ug抗-Her2抗體或同種型IgG。在指定的時間點檢 測腫瘤的生長。第21天以后，所有的治療組與同種型IgG相比均具有顯著性差異。第25 天以后，無論與Ad-LIGHT (見上文adv-mmlight)單獨給藥組還是抗-Her單獨給藥組相比， Ad-LIGHT和抗-Her2聯(lián)合給藥組均具有顯著性差異。以雙尾Student氏t檢驗法進行統(tǒng)計 學分析。顯示的數(shù)據(jù)為平均值+SEM.p〈0. 05被認為具有顯著性差異。結果如圖8所示。明 顯的，在聯(lián)合用藥的情況下沒有檢測到腫瘤，相反，當使用單一治療時腫瘤持續(xù)生長（見圖 8)。除聯(lián)合用藥外，其它各組每組全部五只小鼠均有腫瘤，并且所有小鼠都在2 - 3周內(nèi)死 亡。
[0214] 實施例6 :通過聯(lián)合治療在Her2/neu Tg小鼠中控制自發(fā)性腫瘤生長
[0215] Her2. neu Tg小鼠（即在第3 - 4周齡表達Her2/neu的轉基因小鼠，非常類似 于人乳腺癌）（FBV背景）常規(guī)在出生后4 一 5個月生長出乳腺癌（mammary carcinoma)。 在Tg小鼠中的這些腫瘤是極難治療的，因為Tg小鼠中這種腫瘤存在免疫逃避。發(fā)明 人在三組小鼠中處理了這些小鼠：Anti-her2+ad_Laz、Anti-Her2+ad_LIGHT和無處理 組。各組分別在第〇、1、2周給予100ug抗-her2單克隆抗體（Anti-her2,為7. 16. 4) 和101(IVP (病毒顆粒）的表達鼠突變LIGHT的腺病毒（ad-LIGHT，其構建見The Journal of Immunology，2007，179:1960 1968)或者表達 Laz 的腺病毒（ad-Laz，其構建見 The Journal of Immunology, 2007, 179:1960 1968)，或者不給予處理。在聯(lián)合治療組中，給予 抗-her2單克隆抗體（Anti-her2,為7. 16. 4)和表達鼠突變LIGHT的腺病毒（ad-LIGHT，其 構建見上文）。不經(jīng)治療，小鼠會在首次檢測到腫瘤塊之后5 - 6周內(nèi)死亡。重要的是，采 用聯(lián)合治療處理的小鼠的腫瘤在處理過程中沒有生長，在隨后的6 - 7周內(nèi)保持不變。如 圖9所示。
[0216] 以上數(shù)據(jù)顯示，用抗體-LIGHT全身性地靶向腫瘤也可以根除遠端腫瘤。而且， ad-LIGHT和抗體能夠具有協(xié)同作用，抑制自發(fā)性腫瘤生長。因此，抗體-LIGHT可用作治療 轉移癌患者的藥物。
[0217] 實施例7 :融合蛋白抗HER抗體一 LIGHT對原發(fā)性neu+反應性腫瘤的治療作用
[0218] 本實施例證明，融合蛋白能夠用于控制HER2/neu+反應性腫瘤。
[0219] 與人HER_2/neu+腫瘤類似，TUB0能夠在體外對抗neu抗體有反應。TUB0是一種來 自neu Tg (轉基因）小鼠的自發(fā)性腫瘤，TUB0細胞是從BALB-neuTg小鼠自發(fā)產(chǎn)生的乳腺小 葉癌建立的體外克隆細胞系（Journal of Immunology, 165:5133-42, 2000)。在第0天，在 Balb/c小鼠背上接種4xl05TUB0。在抗HER抗體一 LIGHT融合蛋白組（即Her2+Fab-LIGHT 組；η = 5/組），于第15、18和21天給予小劑量（每次50ug)抗neu抗體7. 16. 4,以降低 腫瘤負擔，然后，在第21、24和27天給予小劑量（每次20ug)的融合蛋白抗HER抗體一 LIGHT (即Fab-LIGHT)。檢測腫瘤生長。
[0220] 在抗HER抗體組（即Her2組；N = 5),于第15、18、21天各給予小劑量（50ug)抗 neu 抗體 7. 16. 4。
[0221] 對照組（即Ctrl組；N = 5):未處理。
[0222] Fab-LIGHT是抗neu的scFv抗體和小鼠 LIGHT第85-239位氨基酸的片段通過接 頭融合而成的融合蛋白，該融合蛋白的構建請參考圖1融合蛋白的構建。
[0223] 結果顯示在圖10中。結果顯示，抗neu抗體能夠輕微延遲腫瘤的生長（見圖10 的Her2組），但是，在接種腫瘤后3周再給予融合蛋白抗HER抗體一 LIGHT則消除了腫瘤 (見圖10的Her2+Fab-LIGHT組）。因此，融合蛋白能夠用于縮短抗HER2/neu抗體治療，并 消除剩余的腫瘤。
[0224] 實施例8 :抗HER2抗體-LIGHT融合蛋白對轉移腫瘤的治療效果
[0225] 本實施例證明，融合蛋白能夠用于減少轉移性腫瘤。
[0226] 4Tl-neu 是轉染了 neu 的小鼠乳腺腫瘤 4T1 (Miller，F(xiàn). R.，Β· E. Miller，and G. Η. Heppner. 1983. Invasion Metastasis 3:22 - 31，1983)，該腫瘤在皮下接種后 10-12天 自發(fā)轉移。在第〇天，給Balb/c小鼠（各組n = 5)接種2xl054Tl-neu。在第16、20和23 天i.p.給予三次小劑量的抗neu抗體7. 16. 4單克隆抗體（劑量為每次注射100ug;7. 16.4 組）或融合蛋白抗 HER2 抗體-LIGHT "Fab-LIGHT"（劑量分別為 20, 50, 50ug ;Fab-LIGHT 組），或者TOS (未處理組）。在第23天，在注射融合蛋白前除去原發(fā)性腫瘤。在第33天收 集肺，并對肺部的轉移腫瘤計數(shù)。
[0227] 結果顯示在圖11中。數(shù)據(jù)顯示，融合蛋白抗HER2抗體-LIGHT降低肺腫瘤轉移的 能力顯著強于抗neu抗體（見圖11)。因此，該融合蛋白能夠用于降低或者清除遠端轉移腫 瘤。
[0228] 引用的出版物
[0229] 通過引用將如下出版物并入本文，以這些出版物與本發(fā)明相關為限。
[0230] Ali 等，Gene Therapy 1:367-384 (1994).
[0231] Anderson, Science 256:808-813 (1992).
[0232] Armentano 等，J. Virol. 71:2408-2416 (1997) ·
[0233] Berkner 等，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:39-61 (1992).
[0234] Blank 等，PD-Ll/B7H_linhibits the effector phase of tumor rejection by T cell receptor (TCR)transgenic CD8+T cells. Cancer Res64:1140-1145(2004).
[0235] Boon,T. & van der Bruggen, P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J.
[0236] Exp. Med. 183, 725-29 (1996).
[0237] Boyce，等，PNAS 93:2348-2352 (1996).
[0238] Brandyopadhyay 等，Mol. Cell. Biol. 4:749-754 (1984).
[0239] Cannon, R. E.等 Induction of transgene expression in Tg. AC(v-Ha-ras) transgenic mice concomitant with DNA hypomethylation.Mol Careinog 21, 244-50(1998).
[0240] Carter，"The Growth Cycle of Adeno-Associated Virus，"in Handbook of Parvoviruses, vol. I, pp. 155-168, Ti jssen, ed. , CRC Press (1990).
[0241] Chen, L., Linsley, P. S. & Hellstrom, K. E. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today 14,483-6. (1993).
[0242] Chen 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:1645-1650 (1997) ·
[0243] Cyster, J. G. Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs. Science 286,2098-102. (1999).
[0244] Dougall，W. C.等 RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev 13,2412-24. (1999).
[0245] Engelhardt 等，Hum. Gene Ther. 5:1217-1229 (1994) ·
[0246] Ettinger, R. The role of tumor necrosis factor and lymphotoxin in lymphoid organ development. Curr Top Microbiol Immunol 251，203-10 (2000) ·
[0247] Fu, Y. X. &Chaplin, D. D. Development and maturation of secondary lymphoid tissues. Annu Rev Immunol 17,399-433(1999).
[0248] Glorioso 等，Nature Med. 7:33-40(2001).
[0249] Golasten 等，New Engl. J. Med. 3〇9:288_296 (I983) ·
[0250] Hofmann，等，PNAS 92:10099-10103 (1995).
[0251] Hu and Pathak, Pharmacol Rev. 52:493-512 (2000).
[0252] Ishibashi 等，J. Clin. Invest. 92:883-893 (1993) ·
[0253] Ishibashi 等，J. Clin. Invest. 93:1889-1893 (1994) ·
[0254] Jooss 等，Hum Gene Ther. 7:1555-1566 (1996) ·
[0255] Kang，H. S.等 Signaling via LTbetaR on the lamina propria stromal cells of the gut is required for IgA production. Nat Immunol 3,576-82 (2002) ·
[0256] Kay 等，Pro. Nat. Acad. Sci. USA 94:4686-4691.
[0257] Kim, D.等 Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J Exp Med 192,1467-78. (2000).
[0258] Kong，Y. Y.等Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. Nature402, 304-9. (1999).
[0259] Kuriyama 等，Hum. Gene Ther. 11:2219-2230 (2000) ·
[0260] Leder, A. , Kuo, A. , Cardiff, R. D. , Sinn, E. & Leder, P. v-Ha-ras transgene abrogates the initiation step in mouse skin tumorigenesis: effects of phorbol esters and retinoic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9178-82 (1990).
[0261] Mauri，D. N.等LIGHT，a new member of the TNF superfamily, and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediator. Immunity8, 21-30. (1998).
[0262] Madzak 等，J. Gen. Virol. 73:153336 (1992)
[0263] Melero, I.等 Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3,682-5. (1997).
[0264] Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24(1992).
[0265] Miller 等，Nature 357:455-450(1992)
[0266] Moss 等，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:2538 (1992) ·
[0267] Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:67-93(1992).
[0268] Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-123(1992).
[0269] Ochsenbein，A. R 等Roles of tumour localization, second signals and cross priming in cytotoxic T-cell induction. Nature 411, 1058-64. (2001).
[0270] Ostrand-Rosenberg,S.等 Cell-based vaccines for the stimulation of immunity to metastatic cancers. Immunol Rev 170,101-14. (1999).
[0271] Peace，D. J.等 Lysis of ras oncogene-transformed cells by specific cytotoxic T lymphocytes elicited by primary in vitro immunization with mutated ras peptide. J Exp Med 179,473-9(1994).
[0272] Rooney，I. A.等The lymphotoxin-beta receptor is necessary and sufficient for LIGHT-mediated apoptosis of tumor cells. J Biol Chem 275,14307-15. (2000).
[0273] Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411, 380-4. (2001).
[0274] Ruddle, N. H. Lymphoid ne〇-〇rganogenesis : lymphotoxin' s role in inflammation and development. Immunol Res 19,119-25 (1999).
[0275] Sarma, S.等 Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor rejection antigen PlA:normal development but restrained effector function in vivo. J Exp Med 189,811-20. (1999).
[0276] Schreiber, H. Tumor Immunology, in Fundamental Immunology(ed. Paul, W. E.) 1247-1280 (Lippincott Raven Press, New York, 1999).
[0277] Schieder 等，Nature Genetics 18:180-183 (1998) ·
[0278] Sha, W. C.等 Selective expression of an antigen receptor on CD8_bearing T lymphocytes in transgenic mice. Nature 335,271-4 (1988) ·
[0279] Somia and Verma, Nature Rev. 1:91-99 (2000).
[0280] Tamada,K.等 Modulation of T-cel1-mediated immunity in tumor and graft-versus-host disease models through the LIGHT co-stimulatory pathway. Nat Med 6, 283-9. (2000).
[0281] Tanzawa 等，F(xiàn)EBS Letters 118(1) :81-84 (1980).
[0282] van Beusechem 等，Gene Ther. 7:1940-1946 (2000) ·
[0283] Wang, J.等 The complementation of lymphotoxin deficiency with LIGHT, a newly discovered TNF family member, for the restoration of secondary lymphoid structure and function. Eur J Immunol 32:1969 (2002).
[0284] Wang, J.等 The regulation of T cell homeostasis and autoimmunity by T cell derived LIGHT. J. Clinic. Invest. 108:1771-1780(2001).
[0285] Watanabe, Atherosclerosis 36:261-268 (1986).
[0286] Wick，M.等 Antigenic cancer cells grow progressively in immune hosts without evidence for T cell exhaustion or systemic anergy. J Exp Med 186,229-38. (1997).
[0287] Wilson, Nature 365:691-692(1993).
[0288] Wu, Q.等 The requirement of membrane lymphotoxin for the presence of dendritic cells in lymphoid tissues. J Exp Med 190,629-38(1999).
[0289] Ye，Q.等 Modulation of LIGHT-HVEM costimulation prolongs cardiac allograft survival. J Exp Med 195,795-800. (2002).
[0290] Ye，Z.等Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 8,343-8. (2002).
[0291] Yu,P.等,Complementary role of CD4+T cells and secondary lymphoid tissues for cross-presentation of tumor antigen to CD8+T cells. J Exp Med 197:985-995(2003).
[0292] P.等，Intratumor depletion of CD4+cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors. J Exp Med 201:779-791 (2005).
[0293] Zhai, Y.等 LIGHT, a novel ligand for lymphotoxin beta receptor and TR2/HVEM induces apoptosis and suppresses in vivo tumor formation via gene transfer. Journal of Clinical Investigation 102,1142-51 (1998).
[0294] Zinkernagel, R. M. Immunity against solid tumors ? Int J Cancer 93, 1-5. (2001).
[0295] U. S.專利 No. 6, 048, 551
[0296] U. S.專利 No. 5, 436, 146
[0297] U. S.專利 No. 4, 980, 286
[0298] U. S.專利 No. 5, 994, 523
[0299] U. S.專利 No. 6, 207, 147
[0300] U. S.專利 No. 4, 797, 368
[0301] U. S.專利 No. 5, 399, 346.
【權利要求】
1. 復合物，其包含腫瘤特異性抗體和與該抗體相連的LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段； 其中所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段是人的LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段，其中所述抗 體是對以下腫瘤抗原特異的抗體：表皮生長因子受體家族（EGFR)。
2. 權利要求1的復合物，其中所述抗體和所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段通過形成 融合蛋白、化學綴合、和形成免疫脂質體中的一種或者多種方法相連。
3. 權利要求1的復合物，其中所述抗體和所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段通過形成 融合蛋白而相連，所述抗體和所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段之間有或沒有連接接頭。
4. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是人源化單克隆抗體、嵌合抗體、 heterominibody、或單鏈抗體。
5. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是scFv。
6. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體能識別腫瘤表面抗原。
7. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是足以識別腫瘤抗原的抗體片段。
8. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白片段足以刺激細胞毒性T 淋巴細胞。
9. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白片段包含或者是LIGHT蛋 白胞外域SEQ ID N0:4的片段。
10. 權利要求9的復合物，其中所述片段包含LIGHT的100-150個氨基酸。
11. 權利要求9的復合物，其中所述片段包含：LIGHT蛋白第85 - 239位的氨基酸序列、 或LIGHT蛋白第90 - 239位的氨基酸序列、或LIGHT蛋白第90 - 235位的氨基酸序列。
12. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段是蛋白 酶抗性LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段。
13. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段在蛋白 酶識別序列EQLI中包含突變。
14. 權利要求13所述的復合物，其中所述LIGHT蛋白或LIGHT蛋白片段的序列如SEQ ID NO:3 所示。
15. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白片段包含具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的胞外域。
16. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述LIGHT蛋白片段包含LIGHT蛋白的保 守結構域。
17. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是對以下腫瘤抗原特異的抗 體：HER1、HER2、HER4、HER8、STEAP(前列腺的六次跨膜上皮抗原）或CD55。
18. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是抗neu抗體和/或抗Her2抗 體。
19. 權利要求1 一 3中任一項的復合物，其中所述抗體是7. 16. 4或者SEQ ID NO:5所 示的抗體。
20. 包含權利要求1 一 19任一項的復合物的組合物。
21. 用于預防或治療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低原發(fā)性腫瘤生長和/或癌 癥轉移的藥物組合物，包含權利要求1 一 19任一項的復合物和可藥用載體。
22. 權利要求21的藥物組合物，其是適用于靜脈內(nèi)給藥的形式。
23. 權利要求21的藥物組合物，其中所述藥物通過刺激產(chǎn)生使幼稚T細胞致敏的趨化 因子、粘著分子和共刺激性分子中的至少一種來降低癌癥轉移。
24. 權利要求21的藥物組合物，其中所述藥物組合物通過刺激對抗所述腫瘤的腫瘤特 異性Τ細胞來降低原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移。
25. 權利要求21的藥物組合物，其中所述癌癥是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，或皮 膚癌。
26. 權利要求21的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于和化療劑和/或放射療法聯(lián) 合給藥。
27. 權利要求1 一 19任一項的復合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于：預防或治 療原發(fā)性腫瘤和/或轉移性腫瘤，或者降低原發(fā)性腫瘤生長和/或癌癥轉移，或者刺激產(chǎn)生 使幼稚Τ細胞致敏的趨化因子、粘著分子和共刺激性分子中的至少一種，或者刺激對抗所 述腫瘤的腫瘤特異性Τ細胞。
【文檔編號】A61K38/19GK104151434SQ201410397286
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2009年5月4日 優(yōu)先權日:2008年5月7日
【發(fā)明者】傅陽心 申請人:傅陽心