專利名稱：生物活性基元的酶促共軛的制作方法
生物活性基元的酶促共軛本發(fā)明涉及生物活性基元與聚合物或可聚合化合物選擇性共軛的方法。與生物活性基元共軛的聚合物或可聚合化合物(如單體、大分子單體或預(yù)聚物) 在生物藥物應(yīng)用中具有廣泛用途。例如，生物活性基元可以通過官能團(tuán)(例如羧酸)共軛， 所述官能團(tuán)是聚合物或可聚合化合物的一部分。然而，在共軛產(chǎn)物制備的一些階段中期望 或甚至需要保護(hù)羧酸基團(tuán)，從而允許特定的加工步驟有效地發(fā)生和/或避免游離(即未受 保護(hù)的)羧酸基團(tuán)的存在引起的不想要的副反應(yīng)。通常，羧酸通過用烴酯化來保護(hù)。在能夠使生物活性基元與受保護(hù)的羧酸化學(xué)共軛之前，需要去保護(hù)步驟。然而，這 類去保護(hù)可能是麻煩的，尤其是當(dāng)聚合物或可聚合化合物在除受保護(hù)的羧酸基團(tuán)以外還包 含一種或多種其它可水解基團(tuán)如其它酯基或硫酯基時。可水解基團(tuán)如酯或硫酯基通常由水性環(huán)境中的酸或堿水解。然而，已知這類水解 不是選擇性的。在一些情況下需要選擇性水解，尤其是例如當(dāng)聚合物或可聚合化合物包含 一種或多種其它可水解基團(tuán)(例如多酯基)時。已知例如可以在無水有機(jī)溶劑中，在使用例 如三氟乙酸(TFA)的化學(xué)方法中優(yōu)先實現(xiàn)叔丁基酯相對于其它酯或硫酯基的選擇性水解。 然而，該方法具有若干缺點。對于酯的有效去保護(hù)而言，通常需要使用大幅過量的TFA( > 10當(dāng)量)。高度酸性的條件使得這種去保護(hù)形式不適用于在強酸性條件下不穩(wěn)定的化合 物。所述反應(yīng)在無水溶劑中進(jìn)行，因為在TFA-介導(dǎo)的去保護(hù)期間，痕量水通常會足以引起 分子中其它可水解基團(tuán)、尤其是其它酯或硫酯功能的廣泛水解。TFA的完全去除或幾乎完全 去除是費力(和昂貴)的，但是極其重要，尤其是在官能團(tuán)(例如為生物活性基元一部分的 官能團(tuán))要與羧酸偶合時，因為偶合步驟中TFA的存在對于偶合反應(yīng)可以是有害的。在生物活性基元與聚合物或可聚合化合物的化學(xué)共軛的情況下，生物活性基元的 反應(yīng)性基團(tuán)應(yīng)當(dāng)至少部分被保護(hù)，從而避免與化學(xué)共軛劑的副反應(yīng)。此外，化學(xué)共軛劑是昂貴、不可循環(huán)和環(huán)境不友好的。此外，受保護(hù)的生物活性基元的使用還在共軛反應(yīng)后需要一個或多個其它的去保 護(hù)步驟，這可能是一種挑戰(zhàn)。本發(fā)明的一個目的是克服上述一種或多種缺點。本發(fā)明的另一個目的是提供使生物活性基元與聚合物或可聚合化合物有效共軛 的方法。本發(fā)明的又一個目的是提供一種上述方法，其中不需要對存在于聚合物或可聚合 化合物中的羧酸基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)的步驟。本發(fā)明的又一個目的是提供一種上述方法，所述方法在共軛過程中不需要昂貴的 偶合試劑或多個步驟。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述方法，其中生物活性基元在共軛之前在其反 應(yīng)性官能團(tuán)上需要更少保護(hù)基或不需要保護(hù)基。目前發(fā)現(xiàn)可使生物活性基元與聚合物或可聚合化合物選擇性地共軛。因此，本發(fā)明涉及使生物活性基元與懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基選擇性共軛的 方法，其中所述懸掛式基團(tuán)是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使聚合物或可聚合化合物與水解酶接觸，以催化生物活性基元和懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基之 間的共軛。驚訝地發(fā)現(xiàn)，可能以相對于聚合物或可聚合化合物主鏈中可能存在的一種或多種 其它基團(tuán)(例如其它酯基、硫酯基、氨基甲酸酯基或脲基)而言高度的選擇性，使生物活性 基元與聚合物或可聚合化合物中存在的懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基共軛。本發(fā)明方法的一個優(yōu)點是根據(jù)本發(fā)明的酶促方法與化學(xué)共軛方法相比是環(huán)境友 好的。另一個優(yōu)點是可以通過催化量的廉價和可再循環(huán)的酶，使生物活性基元與立體大 聚合物或可聚合化合物選擇性地共軛。又一個優(yōu)點是在共軛之前生物活性基元的反應(yīng)性官能團(tuán)僅需被部分保護(hù)或不需 保護(hù)。又一個優(yōu)點是可以使生物活性基元選擇性地共軛，使羧酸基團(tuán)保護(hù)以及去保護(hù)， 其中在保護(hù)的情況下不需要去保護(hù)步驟，例如在酯或硫酯基的情況下。在聚合物或可聚合化合物具有任選的與生物活性基元結(jié)合的活性中心時，在共軛 反應(yīng)期間聚合物或可聚合化合物不發(fā)生外消旋化或發(fā)生更少外消旋化是又一優(yōu)點。在本文中使用時，術(shù)語“聚合物”表示基本包含下述單元的多個重復(fù)的結(jié)構(gòu)，所述 單元事實上或概念上衍生自低相對分子量的分子。這類聚合物可包括交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)、樹狀聚 體和超分枝聚合物以及線性聚合物。低聚物被認(rèn)為是聚合物的一類，即具有相對低數(shù)量下 述單元重復(fù)的聚合物，所述單元事實上或概念上衍生自低相對分子量的分子。聚合物可具有200Da或更高、400Da或更高、800Da或更高、IOOODa或更高、2000Da 或更高、4000Da或更高、8000Da或更高、10 OOODa或更高、100 OOODa或更高或1 000 OOODa 或更高的分子量。具有相對低質(zhì)量(8000Da或更低，尤其是4000Da或更低，更尤其是IOOODa 或更低)的聚合物可以被稱作低聚物。懸掛式羧酸、酯或硫酯表示不位于聚合物主鏈中或者在隨后的聚合步驟中不會位 于得到的聚合物主鏈中的羧酸、酯或硫酯。尤其令人驚訝的是本發(fā)明允許生物活性基元與下述化合物中懸掛式空間難以接 近的羧酸基、酯基或硫酯基團(tuán)的選擇性共軛，所述化合物例如為聚合物或低聚物或大的可 聚合化合物，例如為包含多于一個可聚合基元的化合物。本發(fā)明尤其涉及下述方法，其中懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合 化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少兩個可聚合基元，和(b)至少一
個氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的方法尤其適用于使生物活性基元與下述聚合物或可聚合化合物的 懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基選擇性共軛，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少兩個 可聚合基元，和(b)包含至少兩個氨基的氨基酸的至少一個氨基酸殘基，所述至少兩個氨 基已形成脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基或硫代氨基甲酸酯基。因此本發(fā)明允許下述聚合物或可聚合化合物中懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基的選 擇性共軛，所述聚合物或可聚合化合物可得自商業(yè)上容易獲得或容易合成的初始化合物。 例如，可以從下述二氨基酸制備氨基甲酸酯，所述二氨基酸的羧酸功能被伯烷基酯如甲酯 (例如L-賴氨酸甲酯)保護(hù)。
另外，能夠?qū)崿F(xiàn)與生物活性基元的高度選擇性共軛而不需要化學(xué)計量的昂貴并且 環(huán)境不友好的偶合劑是有利的。聚合物或可聚合化合物除了懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基以外，還可包含選自脲 基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、其它酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或 碳水化合物基的基元。根據(jù)本發(fā)明的方法更尤其適用于使生物活性基元與式I表示的聚合物或可聚合 化合物選擇性地共軛，其中
權(quán)利要求
1.將生物活性基元與懸掛式(pendant)羧酸基、酯基或硫酯基選擇性共軛的方法，其 中所述懸掛式基團(tuán)是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或 可聚合化合物與水解酶接觸，以催化所述生物活性基元和所述懸掛式羧酸基、酯基或硫酯 基之間的共軛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合 化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少兩個可聚合基元和(b)至少一個氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物除了所述懸 掛式羧酸基、酯基或硫酯基以外，還包含選自脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯 基、酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或碳水化合物基的基元。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述可聚合化合物由式I表示
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中 -G 是 X ；-每個Y = 0，且每個X表示包含羥基亞烷基、羥乙基丙烯酸酯或羥乙基異丁烯酸酯的 基元； -每個R表示氫；-L表示氨基酸；-η = 1 ；-W 是 0 ；-Q 是 0 ；-Z是H或具有1-6個C原子的烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述氨基酸基元選自賴氨酸基元、二氨基丙酸基元、羥 基賴氨酸基元、N-α -甲基化的賴氨酸基元或二氨基丁酸基元。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述氨基酸殘基具有L-構(gòu)型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述聚合物是由根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一 項的化合物組成的聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物含有一個或多 個賴氨酸-甲基酯基元。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述水解酶選自羧酸酯水解酶、硫酯水解 酶或肽酶的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述水解酶是選自絲氨酸型羧肽酶、金 屬羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、絲氨酸內(nèi)肽酶、半胱氨酸內(nèi)肽酶、天冬氨酸內(nèi)肽酶和金屬內(nèi) 肽酶的組的肽酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述酶是絲氨酸內(nèi)肽酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述酶是枯草桿菌蛋白酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述酶是枯草桿菌蛋白酶Carlsberg。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述酶是半胱氨酸內(nèi)肽酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述酶是木瓜蛋白酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述酶是選自Candidaantarctica脂肪酶B (CALB)、 lypozyme RM、Piccantase A 、Rhizomucor miehei 月旨肪醇、熱穩(wěn)定酉旨醇或 Iilipase 的幾 基酯水解酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述生物活性基元的共軛可在所述可聚 合化合物的聚合作用之前、期間或之后發(fā)生。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中所述生物活性基元的共軛發(fā)生在所述聚 合物成形之后。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中所述生物活性基元選自氨基酸、肽或蛋 白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物活性基元與聚合物或可聚合化合物的選擇性共軛的方法。所述方法更明確地涉及生物活性基元與懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基的選擇性共軛，其中所述懸掛式基團(tuán)是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或可聚合化合物與水解酶接觸，以催化生物活性基元和懸掛式羧酸基、酯基或硫酯基之間的共軛。生物活性基元的共軛可在可聚合化合物的聚合作用之前、期間或之后發(fā)生。生物活性基元的共軛也可以在聚合物成形之后發(fā)生。
文檔編號A61K47/48GK102007217SQ200980113041
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月13日
發(fā)明者克勞迪婭·卡森, 凱瑟琳娜·赫伯蒂娜·瑪麗亞·斯徹伯斯, 埃爾文·戴耶斯, 巴斯·瑞特澤, 巴索路米阿斯·約翰尼斯·瑪格瑞薩·普盧姆, 彼得·珍·倫納德·馬里奧·奎德弗利格 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司