專利名稱：：一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的天然激活劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-Y的天然激活劑。
背景技術(shù)：
：在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用的ox-LDL能夠激活PPAR-Y轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1的表達(dá)(PPARY-LXR-ABCA1途徑)[Houetal.，CellBiochemFunct，2007，25:33-44]，從而促進(jìn)膽固醇的流出。ox-LDL部分脂類成分及衍生物，如9-HODE禾P13-HODE[Itohetal.，NatStructMolBiol，2008，15:924-931]，已證實(shí)是PPAR-Y的天然配體，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，下式A為各種PPAR天然配體的結(jié)構(gòu)式AP5"~l,OxLig-l是ox-LDL的活性成分，OxLig-l在動(dòng)脈粥樣硬化中對(duì)PPAR-Y的影響仍未見報(bào)道。PCT/JP02/00723專利公開了利用氫譜和碳譜分析法對(duì)OxLig-l進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。丄H-顧R(500固z，CDC13)結(jié)果顯示S=5.708(s，'H，H-6)，4.732-4.712(m，丄H，H-3);13C-NMR(500MHz，CDC13)結(jié)果顯示S=202.03，179.03，173.01，164.05，126.89，72.04，54.88，50.04，49.89，45.47，43.18，39.52，38.74，36.23，36.06，328.84，28.54，28.01，24.89，24.61，23.87，22.80，18.91，17.29。"C-顧R表明壬二酸與7-KC發(fā)生了酯化反應(yīng)。^-NMR中，7-KC上與羥基相連的碳上氫原子的化學(xué)位移發(fā)生變化(8=4.732-4.712)，也說(shuō)明發(fā)生了酯化反應(yīng)。雖然氫譜和碳譜分析法確定了OxLig-l氫和碳的具體位置，但該方法很難確定PPAR激活劑OxLig-l羧基(-COOH)的羥基。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要證實(shí)OxLig-l具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)，并且通過(guò)化學(xué)及生物學(xué)方法闡明OxLig-l激活PPAR-Y的作用機(jī)制。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-Y的天然激活劑，OxLig-l具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)，是PPAR-Y的天然配體，下式B為OxLig-l的結(jié)構(gòu)式B從B中可以看出OxLig-l具有PPAR天然配體共有的羧基。OxLig-l激活PPAR-Y的作用機(jī)制如下—、OxLig-l具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)進(jìn)行7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，OxLig-l)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的紅外色譜法。由紅外光譜圖看出，在3449cm-工處，有一羧基的羥基峰，證明OxLig-l具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)。二、OxLig-l是PPAR-Y的天然配體利用AutoDock3.0軟件包對(duì)受體PPAR-a/y禾POxLig-l分子進(jìn)行半柔性對(duì)接。分子對(duì)接中PPAR-a/Y與OxLig-l分子按1:1比例結(jié)合。在進(jìn)行半柔性對(duì)接模擬前，使用AUTOGRID計(jì)算網(wǎng)格，每一次對(duì)接所用的網(wǎng)格長(zhǎng)、寬和高均為100個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，網(wǎng)格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸殘基，距離設(shè)定為0.0375nm。模擬對(duì)接過(guò)程中PPAR-a/y結(jié)構(gòu)視為剛性，OxLig-l分子為柔性，OxLig-l分子內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵由AUTOTORS程序識(shí)別并可以在搜索過(guò)程中任意旋轉(zhuǎn)，分子對(duì)接在AutoDock軟件包中進(jìn)行，對(duì)接使用Lamarchian遺傳算法與局部能量搜索相結(jié)合(GALS)對(duì)PPAR-a/y-OxLig-l復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行搜索。每一次均進(jìn)行了IOO次對(duì)接計(jì)算，最終的計(jì)算結(jié)果從軟件生成的輸出文件中抽提出來(lái)。結(jié)果的選擇向時(shí)考慮聚類分析(ClusteringAnalysis)的結(jié)果和AUTODOCK軟件自帶的AMBER評(píng)分函數(shù)打分的高低。根據(jù)對(duì)接作用能大小和幾何匹配情況，對(duì)100個(gè)對(duì)接參考結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OxLig-l進(jìn)入PPAR-Y配體結(jié)合腔后，是橫貫于左右兩個(gè)腔中，其羧4基端接近極性氨基酸位點(diǎn)，能與已知的極性氨基酸位點(diǎn)中的His449及Lys367位點(diǎn)形成氫鍵；OxLig-1另一側(cè)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)位于右側(cè)腔中，與Met364非極性氨基酸形成疏水作用。OxLig-1與PPAR-Y的對(duì)接能量為-10.41Kcal/mol，其結(jié)構(gòu)和能量值均表明OxLig-1能夠在配體結(jié)合腔中穩(wěn)定存在，輔助說(shuō)明OxLig-l是PPAR-Y的天然配體。三、OxLig-1激活PPAR-Y的作用機(jī)制(l)OxLig-l促進(jìn)PPAR-Y細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位研究表明，PPAR-Y主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)與其配體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核中，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。為了檢測(cè)OxLig-1是否能夠活化PPAR-Y，利用20iig/mLOxLig-1作用J774A.1細(xì)胞，檢測(cè)PPAR-Y表達(dá)量的變化情況。20yg/mLOxLig-1剌激細(xì)胞降低了細(xì)胞質(zhì)中PPAR-Y表達(dá)量。同時(shí)，OxLig-1剌激使細(xì)胞核中PPAR-Y蛋白的表達(dá)量明顯增加。當(dāng)OxLig-1加入細(xì)胞lOmin時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)PPAR-Y的表達(dá)量增加的最為明顯，說(shuō)明PPAR-Y受OxLig-1活化發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。(2)0xLig-l促進(jìn)對(duì)PPAR-Y下游的膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)巨噬細(xì)胞不能降解細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的脂質(zhì)。PPAR-Y的部分天然配體和合成配體能夠調(diào)控三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al(ATPbindingcassettetransporterA1andGl，ABCAl)和載脂蛋白AI(apoAl)，促進(jìn)膽固醇的流出，使細(xì)胞中的脂質(zhì)保持動(dòng)態(tài)平衡。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片結(jié)果顯示，OxLig-1作用J774A.1細(xì)胞2h后ABCAlmRNA水平增加了2.73倍。另夕卜，OxLig-1也使apoAl的變化量增加34.62倍，說(shuō)明OxLig-1對(duì)膽固醇流出有促進(jìn)作用。本發(fā)明的有益效果是利用化學(xué)及生物學(xué)方法證實(shí)了OxLig-1是PPAR-Y的天然激活劑，并提供了OxLig-1是治療動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)的可能性。圖1為實(shí)施例1揭示OxLig-1羧基的羥基峰的紅外光譜分析圖。圖2為實(shí)施例2分子對(duì)接分析顯示OxLig-1能夠在PPAR-Y配體結(jié)合腔中穩(wěn)定存在構(gòu)象圖。圖3A為實(shí)施例30xLig-l使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PPAR-Y表達(dá)減少。圖3B為實(shí)施例30xLig-l使細(xì)胞核內(nèi)PPAR-Y表達(dá)增加。具體實(shí)施方式實(shí)施例1紅外光譜分析圖揭示OxLig-1羧基的羥基峰。進(jìn)行7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，OxLig-1)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的紅外色譜法。羥基(OH)官能團(tuán)的吸收出現(xiàn)在3600-2500cm—、由圖1可以看出，OxLig-1具有一個(gè)吸收頻率為3449cm-1羧基的羥基峰。因此，可以得出OxLig-1具有PPAR的天然激活劑共有的羧基峰的結(jié)論。實(shí)施例2通過(guò)化學(xué)方法闡明OxLig-1是PPAR-Y的天然配體。(l)模型的準(zhǔn)備5從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(ProteinDataBank)中獲得含配體GW735與PPAR-aLBD和配體N-sulfonyl-2-indolecarboxamide與PPAR-YLBD復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)分別為2P54和2HFP)。首先將配體GW735/N-sulfonyl-2-indolecarboxamide從復(fù)合物中剝離抽出，將受體導(dǎo)入到AUTODOCK3.0軟件包中進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)修改，包括去除水分子、加入氫原子以及加入Gasteiger-Marsili電荷等。配體OxLig-1分子的結(jié)構(gòu)參數(shù)是利用Gaussian03程序在HF/6-31G*水平上優(yōu)化獲得的。其部分電荷是利用RESP方法對(duì)從頭算Milliken電荷擬合得到的。最后分別將PPAR-a/Y和OxLig-1分子保存為PDBQT格式(包含原子類型和電荷)的文件，為對(duì)接過(guò)程做好準(zhǔn)備。(2)分子對(duì)接利用AutoDock3.0軟件包對(duì)受體PPAR-a/y禾POxLig-1分子進(jìn)行半柔性對(duì)接。分子對(duì)接中PPAR-a/Y與OxLig-1分子按1:1比例結(jié)合。在進(jìn)行半柔性對(duì)接模擬前，使用AUTOGRID計(jì)算網(wǎng)格，每一次對(duì)接所用的網(wǎng)格長(zhǎng)、寬和高均為100個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，網(wǎng)格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸殘基，距離設(shè)定為0.0375nm。模擬對(duì)接過(guò)程中PPAR-a/y結(jié)構(gòu)視為剛性，OxLig-1分子為柔性，OxLig-l分子內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵由AUTOTORS程序識(shí)別并可以在搜索過(guò)程中任意旋轉(zhuǎn)，分子對(duì)接在AutoDock軟件包中進(jìn)行，對(duì)接使用Lamarchian遺傳算法與局部能量搜索相結(jié)合(GALS)對(duì)PPAR-a/y-OxLig-1復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行搜索。每一次均進(jìn)行了100次對(duì)接計(jì)算，最終的計(jì)算結(jié)果從軟件生成的輸出文件中抽提出來(lái)。結(jié)果的選擇同時(shí)考慮聚類分析(ClusteringAnalysis)的結(jié)果和AUTODOCK軟件自帶的AMBER評(píng)分函數(shù)打分的高低。根據(jù)對(duì)接作用能大小和幾何匹配情況，對(duì)100個(gè)對(duì)接參考結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象。結(jié)果如圖2所示，OxLig-l進(jìn)入PPAR-Y配體結(jié)合腔后，是橫貫于左右兩個(gè)腔中，其羧基端接近極性氨基酸位點(diǎn)，能與已知的極性氨基酸位點(diǎn)中的His449及Lys367位點(diǎn)形成氫鍵；OxLig-l另一側(cè)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)位于右側(cè)腔中，與Met364非極性氨基酸形成疏水作用，OxLig-1與PPAR-Y的對(duì)接能量為-10.41Kcal/mol，其結(jié)構(gòu)和能量值均表明OxLig-1能夠在配體結(jié)合腔中穩(wěn)定存在，輔助說(shuō)明OxLig-1是PPAR-Y的天然配體。實(shí)施例3通過(guò)生物學(xué)方法闡明OxLig-1激活PPAR-Y的作用機(jī)制。(1)細(xì)胞培養(yǎng)J774A.1細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium,DMEM，Gibco，InvitrogenCorporation)。另外加入1.5g/L的碳酸氫鈉，ImM丙酮酸鈉，10%(V/V)的經(jīng)熱滅活的胎牛血清(Gibco)，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL。每三天傳代，接種量為1X1()6個(gè)細(xì)胞，20mL(75cm2)，于37。C，5X(V/V)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加藥前，無(wú)血清培養(yǎng)基作用6h。然后加入不同濃度OxLig-l(O、5、10、20和40iig/mL)，作用細(xì)胞10，30，60min。細(xì)胞加藥時(shí)，OxLig-l用DMSO溶解，再按照加藥濃度用培養(yǎng)基稀釋。(2)蛋白質(zhì)提取l)胞漿蛋白提?、侔幢?.1配制蛋白裂解液②取出藥物作用后的ce11，倒掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶置于冰上。1XPBS(預(yù)冷，5-10mL/次)，洗cell3次(終止藥物剌激，去除培養(yǎng)基)。③吸干PBS，加入lmL細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。于4。C搖晃離心管15min。4°C，10000rpm離心10min，收集上清。⑤BCA法測(cè)蛋白濃度，分裝成小份，-20°〇保存。2)核蛋白提取(采用碧云天核蛋白提取試劑盒)①向細(xì)胞沉淀中加入50iiL添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑；②最高速劇烈vortex1530s，將細(xì)胞沉淀完全懸浮于試劑中；冰浴30min，每隔12min居lj烈vortex1530min。③4。C，12000rpm離心10min，收集上清，即為核蛋白。不同濃度的OxLig-l(O、5、10、20禾P40iig/mL)，作用不同時(shí)間(10，30，60min)后，提取J774A.1細(xì)胞的胞漿蛋白和核蛋白。(3)蛋白質(zhì)印跡(Westernblot):l)樣品處理將12iiL蛋白(所提Pr+PBS)禾口3yL5XSDS-PAGEloadingbuffer混勻，100°C煮沸5min。上樣maker4uL，樣品15uL。2)電泳恒壓80V，23h。3)安裝轉(zhuǎn)印裝置4)轉(zhuǎn)膜IOOV恒壓轉(zhuǎn)移lh(冰浴)。5)5%(W/V)blockingbuffer封閉lh。6)primaryantibody室溫孵育2h(或4。C過(guò)夜)，TBSTBuffer洗膜6次，10min/次。7)secondaryantibody室溫孵育lh，TBSTBuffer洗膜6次，10min/次。8)ECL發(fā)光顯色，暗室曝光，顯影，定影。加入不同濃度OxLig-l(O、5、10、20禾P40iig/mL)，作用細(xì)胞10，30，60min后，Westernblot檢測(cè)PPAR-Y蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OxLig-l最適合作用濃度為20iig/mL。20iig/mLOxLig-l剌激細(xì)胞降低了細(xì)胞質(zhì)中PPAR-Y表達(dá)量，如圖3A所示。同時(shí)，OxLig-l剌激使細(xì)胞核中PPAR-Y蛋白的表達(dá)量明顯增加，如圖3B所示。(4)小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片(購(gòu)買自上?？党缮锕?實(shí)驗(yàn)1)按照5X105/mL，5mL接種J774A.1細(xì)胞到25cm2培養(yǎng)瓶中，37"培養(yǎng)12h;2)無(wú)血清培養(yǎng)基處理6h;3)加入20iig/mLOxLig-l作用細(xì)胞2小時(shí)；4)利用TRIzol法(Invirogen，Carlsbad，CA)抽提對(duì)照和20yg/mLOxLig-l作用的細(xì)胞的總RNA，2%(W/V)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的純度和完整性；5)使用SuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(Invirogen，Carlsbad,CA)對(duì)所提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。并使用RneasyMinEluteCleanup試劑盒(QiagenGmbH，Hilden，Germany)去除基因組DNA污染。6)對(duì)基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR操作95。C預(yù)變性10min后，設(shè)定40個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)95°C15s、40°Clmin。77)運(yùn)用AACt對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出OxLig-l作用組與空白對(duì)照組之間的差異水平。正值代表基因的mRNA水平上調(diào)，負(fù)值代表下調(diào)。結(jié)果如表1所示，OxLig-l促進(jìn)對(duì)PPAR-Y下游的膽固醇流出相關(guān)基因ABCAl和apoAI表達(dá)，小鼠的RT2ProfilerPCR生物芯片結(jié)果顯示，OxLig-1作用細(xì)胞2h后ABCAlmRNA水平增加了2.73倍。另外，OxLig-l也是膽固醇流出相關(guān)的載脂蛋白AI(apoAI)的變化量增加34.62倍，說(shuō)明OxLig-1對(duì)膽固醇流出有促進(jìn)作用。表10xLig-l促進(jìn)對(duì)PPAR-Y下游的膽固醇流出相關(guān)基因ABCAl和apoAI表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的天然激活劑，其特征在于，OxLig-1具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)，是PPAR-γ的天然配體，下式為OxLig-1的結(jié)構(gòu)式2.權(quán)利要求1所述的一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-Y的天然激活劑，其特征在于，該天然激活劑激活PPAR-Y的作用機(jī)制如下一、OxLig-l是PPAR-Y的天然配體利用AutoDock3.0軟件包對(duì)受體PPAR-a/y禾POxLig-1分子進(jìn)行半柔性對(duì)接，分子對(duì)接中PPAR-a/Y與OxLig-l分子按1:1比例結(jié)合，在進(jìn)行半柔性對(duì)接模擬前，使用AUTOGRID計(jì)算網(wǎng)格，每一次對(duì)接所用的網(wǎng)格長(zhǎng)、寬和高均為100個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，網(wǎng)格包含OxLig-l分子可能作用的所有活性氨基酸殘基，距離設(shè)定為0.0375nm，模擬對(duì)接過(guò)程中PPAR-a/Y結(jié)構(gòu)視為剛性，OxLig-l分子為柔性，OxLig-l分子內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵由AUTOTORS程序識(shí)別并可以在搜索過(guò)程中任意旋轉(zhuǎn)，分子對(duì)接在AutoDock軟件包中進(jìn)行，對(duì)接使用Lamarchian遺傳算法與局部能量搜索相結(jié)合對(duì)PPAR-a/Y-OxLig-1復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行搜索，每一次均進(jìn)行了IOO次對(duì)接計(jì)算，最終的計(jì)算結(jié)果從軟件生成的輸出文件中抽提出來(lái)，結(jié)果的選擇同時(shí)考慮聚類分析的結(jié)果和AUTODOCK軟件自帶的AMBER評(píng)分函數(shù)打分的高低，根據(jù)對(duì)接作用能大小和幾何匹配情況，對(duì)IOO個(gè)對(duì)接參考結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象；OxLig-l進(jìn)入PPAR-Y配體結(jié)合腔后，是橫貫于左右兩個(gè)腔中，其羧基端接近極性氨基酸位點(diǎn)，能與已知的極性氨基酸位點(diǎn)中的His449及Lys367位點(diǎn)形成氫鍵；OxLig-l另一側(cè)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)位于右側(cè)腔中，與Met364非極性氨基酸形成疏水作用，OxLig-1與PPAR-Y的對(duì)接能量為-10.41Kcal/mol，其結(jié)構(gòu)和能量值均表明OxLig-1能夠在配體結(jié)合腔中穩(wěn)定存在；二、OxLig-1激活PPAR-Y的作用機(jī)制(1)OxLig-l促進(jìn)PPAR-Y細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位當(dāng)OxLig-1加入細(xì)胞lOmin時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)PPAR-Y的表達(dá)量增加的最為明顯，說(shuō)明PPAR-Y受OxLig-1活化發(fā)生了核轉(zhuǎn)位；(2)0xLig-l促進(jìn)對(duì)PPAR-Y下游的膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)OxLig-1作用J774A.1細(xì)胞后，ABCA1和apoAlmRNA水平顯著增加，說(shuō)明OxLig-1對(duì)膽固醇流出有促進(jìn)作用。全文摘要本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的天然激活劑。該過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的天然激活劑OxLig-1具有PPAR天然配體共有的羧基結(jié)構(gòu)，是PPAR-γ的天然配體，下式為OxLig-1的結(jié)構(gòu)式OxLig-1激活PPAR-γ的作用機(jī)制如下一、OxLig-1是PPAR-γ的天然配體利用AutoDock3.0軟件包對(duì)受體PPAR-α/γ和OxLig-1分子進(jìn)行半柔性對(duì)接，OxLig-1的結(jié)構(gòu)和能量值均表明OxLig-1能夠在配體結(jié)合腔中穩(wěn)定存在，輔助說(shuō)明OxLig-1是PPAR-γ的天然配體。二、OxLig-1激活PPAR-γ的作用機(jī)制OxLig-1促進(jìn)PPAR-γ細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位；OxLig-1促進(jìn)對(duì)PPAR-γ下游的膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)。本發(fā)明利用化學(xué)及生物學(xué)方法證實(shí)了OxLig-1是PPAR-γ的天然激活劑，并提供了OxLig-1是治療動(dòng)脈粥樣硬化潛在靶點(diǎn)的可能性。文檔編號(hào)A61K31/575GK101690726SQ20091018781公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年9月30日優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日發(fā)明者劉媛媛,劉慶平,李文哲申請(qǐng)人:大連大學(xué)