專利名稱：：一種抗腦缺血玄參的有效成分提取及滴丸制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗腦缺血玄參的有效成分提取方法，以及利用該方法獲得的玄參有效成分制備抗腦缺血滴丸的方法。(二)
背景技術(shù)：
：隨著人類社會的發(fā)展，人類疾病譜發(fā)生變化，腦血管疾病逐漸增多，成為威脅人類生命和影響生活質(zhì)量的主要疾病?；瘜W(xué)藥物的研制由于投資大、時間長、風(fēng)險高，變得越來越困難。中藥以其扎實(shí)的臨床基礎(chǔ)、完整的理論體系和較好的功效引起了國際制藥界的普遍重視，近年來，國內(nèi)、國際市場對天然藥物的需求量日益增加，呈現(xiàn)出無可估量的巨大市場空間。玄參(RadixScrophulariae)為玄參禾斗植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，別名元參、黑參、浙玄參等，為著名"浙八味"之一。玄參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品其味甘、苦、咸，性微寒；歸肺、胃、腎經(jīng)；有涼血滋陰，瀉火解毒的作用。其主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜苷類和苯丙素苷類，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，其在抑制血小板聚集、促纖溶、擴(kuò)張血管、抗氧化、抗腦缺血損傷、改善神經(jīng)功能等方面發(fā)揮了顯著的作用。玄參藥材分布廣泛，市場流通量每年高達(dá)4000噸以上，其中浙江省磐安地區(qū)玄參資源豐富，常年種植面積達(dá)1.0萬畝，但絕大多數(shù)玄參都以原藥材外銷，急需對玄參進(jìn)行深加工開發(fā)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，玄參主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜苷類和苯丙素苷等化合物，其已在預(yù)防和治療腦血管疾病發(fā)生方面呈現(xiàn)突出的藥理功效，采用先進(jìn)分離富集技術(shù)，提高浙玄參有效部位得率，并將其開發(fā)成防治腦血管新藥和保健品將具有廣闊的市場前景。目前國內(nèi)普遍采用傳統(tǒng)溶劑提取法提取玄參有效部位，這類提取方法有效成分利用率低下、周期長、工序多，規(guī)?；a(chǎn)受到極大制約，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的需求。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一批新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如超聲波萃取(SE)、超臨界流體萃取(SFE)等。SE目前仍較多用于實(shí)驗(yàn)室，SFE由于設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高，提取范圍有限等問題應(yīng)用受到限制。大孔吸附樹脂為一種選擇性有機(jī)高聚吸附劑，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點(diǎn)。在我國，采用大孔吸附樹脂分離純化中藥提取液已越來越受到人們的重視，其在分離、純化中藥提取液方面已日益顯示其獨(dú)特的效果，它有著廣闊的應(yīng)用前途，不僅為中藥制劑質(zhì)量控制和中藥現(xiàn)代化研究提供更有效、可靠的純化手段，更重要的是能改善傳統(tǒng)中藥制劑"粗、大、黑"的外觀和服用量過大等缺點(diǎn)，對中藥制劑的革新起積極的推動作用。大孔吸附樹脂現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離和富集，但在玄參有效成分提取分離方面的研究報道甚少。滴丸是指固體或液體藥物與基質(zhì)混勻加熱熔化后，滴入不相混溶的冷卻劑中，收縮冷凝成丸的一種速效劑型，主要供口服應(yīng)用。這種滴法制丸過程，實(shí)際上是將固體分散體制成滴丸的形式。滴丸劑中藥物呈分子、膠體或晶體狀態(tài)分散于滴丸基質(zhì)中，不僅增大了總表面積，而且因其基質(zhì)為水溶性，有利于藥物在人體內(nèi)的溶解和吸收，具有溶解快、吸收好、生物利用度高等特點(diǎn)，因此得以廣泛應(yīng)用于臨床治療。將玄參有效成分制備成滴丸，與其他劑型相比，又可使易水解、易氧化的藥物和易揮發(fā)的藥物包埋而增加其穩(wěn)定性，又可提高生物利用度，起效迅速，用于臨床治療缺血性腦卒中，可預(yù)見重要應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種抗腦缺血玄參的有效成分提取方法，以及利用該方法獲得的玄參有效成分制備抗腦缺血滴丸的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種抗腦缺血玄參的有效成分提取方法，所述方法包括(1)上樣液制備取玄參干燥粉末，加入610倍質(zhì)量的水回流提取13次，每次24h，過濾，合并濾液濃縮至濃度為0.5lg/mL作為上樣液；(2)樹脂前處理大孔吸附樹脂用7095%乙醇浸泡1224h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；(3)有效成分提取步驟(1)上樣液上步驟(2)所述樹脂柱，以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附23次，先以37倍柱體積的水洗脫，然后用3070%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、干燥，得抗腦缺血的玄參提取物。所述大孔吸附樹脂可選用本領(lǐng)域常規(guī)大孔吸附樹脂，優(yōu)選為DM130大孔樹脂、D101大孔樹脂或D201大孔樹脂。所述大孔吸附樹脂(裝柱量，干重)與上樣液中的玄參(生藥量)質(zhì)量比為i:i4?！N利用所述方法獲得的抗腦缺血的玄參提取液制備抗腦缺血玄參滴丸的方法，所述方法包括(1)上樣液制備取玄參干燥粉末，加入610倍質(zhì)量的水回流提取13次，每次24h，過濾，合并濾液濃縮至濃度為0.5lg/mL作為上樣液；(2)樹脂前處理大孔吸附樹脂用7095%乙醇浸泡1224h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；(3)有效成分提取步驟(1)上樣液上步驟(2)所述樹脂柱，以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附23次，先以37倍柱體積的水洗脫，然后用3070%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、干燥，得抗腦缺血的玄參提取物；(4)按照玄參提取物干燥粉末與聚乙二醇質(zhì)量比1:16，將玄參提取物干燥粉末加入熔融的聚乙二醇中，攪拌至融合均勻，得混合物；(5)以滴速2050滴/min、滴距46cm，將熔融的混合物滴入冷凝液中，所述冷凝液為二甲基硅油和液體石蠟體積比57:13的混合液，O3t:冷凝成丸，收集滴丸，干燥，即得所述抗腦缺血玄參滴丸。所述聚乙二醇優(yōu)選為PEG4000和PEG6000質(zhì)量比14:16的混合物。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在1.經(jīng)大孔樹脂富集后，玄參有效成分含量提高約9倍，改善傳統(tǒng)中藥制劑"粗、大、黑"的外觀和服用量過大等缺點(diǎn)；2.以PEG4000作基質(zhì)，滴丸的流動性和耐熱性均較差；以PEG6000作基質(zhì)，與藥物混合后粘度較大，滴制相對比較困難，因此采用PEG4000與PEG6000混合滴制效果較好。3.以滴丸的重量差異變異系數(shù)為指標(biāo)，在最佳成型工藝條件下對滴距、滴速及冷凝液溫度用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，對玄參滴丸的滴制工藝進(jìn)行篩選，制成的滴丸圓整、具光澤、無拖尾粘連。4.按最佳制備工藝重復(fù)試驗(yàn)6次，進(jìn)行質(zhì)量檢查，滴丸重量、溶散時限及外觀無明顯差異，設(shè)計與優(yōu)化結(jié)果可靠。5.采用本發(fā)明方法制備的滴丸符合2005年版《中國藥典》要求。(四)圖1為玄參滴丸的TLC鑒別；1為陰性對照品，2為有效成分對照品，35為實(shí)施例57滴丸樣品。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:玄參有效成分的提取上樣液制備取玄參干燥粉末100g，第一次加入1000g水、加熱回流提取2h，過濾，濾渣再加入800g水、加熱回流提取4h，過濾，合并濾液，濃縮至濃度為0.8g/mL作為上樣液；樹脂前處理DM130大孔吸附樹脂用80%乙醇浸泡24h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；有效成分提取取6g處理后的DM130大孔吸附樹脂裝柱，10mL上樣液以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附2次，先以5倍柱體積的水洗脫，然后用70%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液，濃縮成浸膏后干燥制成粉末，得抗腦缺血的玄參提取物干燥粉末。實(shí)施例2:玄參有效成分的提取上樣液制備取玄參干燥粉末100g，第一次加入800g水、加熱回流提取3h，過濾，濾渣再加入600g水、加熱回流提取4h，過濾，合并濾液，濃縮至濃度為0.8g/mL作為上樣液；樹脂前處理D101大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡18h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；有效成分提取取7g處理后的D101大孔吸附樹脂裝柱，10mL上樣液以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附2次，先以6倍柱體積的水洗脫，然后用60%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液，濃縮成浸膏后干燥制成粉末，得抗腦缺血的玄參提取物。實(shí)施例3:玄參有效成分的提取上樣液制備取玄參干燥粉末100g，第一次加入800g水、加熱回流提取3h，過濾，濾渣再加入800g水、加熱回流提取3h，過濾，合并濾液，濃縮至濃度為0.8g/mL作為上樣液；樹脂前處理D102大孔吸附樹脂用90%乙醇浸泡20h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；有效成分提取取7g處理后的D102大孔吸附樹脂裝柱，10mL上樣液以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附2次，先以7倍柱體積的水洗脫，然后用50%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液，濃縮成浸膏后干燥制成粉末，得抗腦缺血的玄參提取物。實(shí)施例4:玄參有效成分含量測定1、對照品溶液的制備精密稱取有效成分對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號111730-200604)l.OOmg，用40%甲醇溶解定容至10mL，備用。2、供試品溶液的制備稱取適量的玄參粗粉用610倍質(zhì)量水加熱回流提取24h兩次，過濾，合并濾液后濃縮至濃度為0.5g/mL作上樣液，按照實(shí)施例1方法，對DM130大孔吸附樹脂進(jìn)行預(yù)處理，并將上樣液按最佳純化工藝過大孔樹脂柱，將上樣液和洗脫液濃縮、揮去溶劑，用40%甲醇定容后作供試液。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取上述對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于25mL量瓶中，定容，得到不同濃度的對照品溶液，在278nm波長處測定吸光度。以對照品的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=0.037C+0.0144，r=0.9991，結(jié)果表明哈巴俄苷在8.016.Omg/L時，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。4、富集程度的考察測定上樣液和上樣后大孔樹脂的洗脫液中的總環(huán)烯醚萜苷含量及浸膏量，測定結(jié)果見表l。表1:大孔樹脂富玄參有效成分的程度考察<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可知提取液經(jīng)上柱，上樣前后固型物中的有效成分含量由5.17%提高至46.3%，含量提高將近9倍。實(shí)施例5:玄參滴丸的制備冷凝液的制備選擇二甲基硅油和液體石蠟混合液為冷凝液，二甲基硅油和液體石蠟體積比5:2，冷凝管長度16cm。精密稱取基質(zhì)PEG4000-PEG6000(質(zhì)量比2:1)共7g，水浴上加熱熔融，混合均勻，按照提取物基質(zhì)質(zhì)量比為l:5精密稱取實(shí)施例1中藥提取物，加入熔融的基質(zhì)中，攪拌至融合均勻；保持溫度，調(diào)節(jié)滴速為20±2滴/min，滴距46cm，將混合物滴入冷凝液中，03t:冷凝成丸，收集滴丸，放入干燥機(jī)中干燥24h，即得所述抗腦缺血玄參滴丸。滴制工藝的選擇滴丸丸重受滴制過程中滴距、滴速、溫度等因素的影B向。故以滴丸的重量差異變異系數(shù)為指標(biāo)，參照前述滴丸制備工藝，對滴距、滴速及冷凝液溫度用L9(34)正交表對玄參滴丸的滴制工藝進(jìn)行篩選。因素水平見表2，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3、4。表2:正交試驗(yàn)中的因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>R2001.562025.262039.891993.24表4:重量差異變異系數(shù)方差分析方差來源離差平方和自由度均方F值P值A(chǔ)3.26721.6346.63B11.16525.58222.65P<0.05C16.04128扁32.55P<0.05誤差0.49320.246由表2、表3可知，影響滴丸重量的主次因素為C>B>A，B、C因素對其有顯著性影響。實(shí)施例6:玄參滴丸的制備冷凝液的制備選擇二甲基硅油和液體石蠟混合液為冷凝液，比例2:l，冷凝管長度18cm。精密稱取基質(zhì)PEG4000-PEG6000(質(zhì)量比3:2)共6g，水浴上加熱熔融，混合均勻，按照提取物基質(zhì)質(zhì)量比為l:4精密稱取實(shí)施例2中藥提取物，加入熔融的基質(zhì)中，攪拌至融合均勻；保持溫度，調(diào)節(jié)滴速為20±2滴/min，滴距46cm，將混合物滴入冷凝液中，03t:冷凝成丸，收集滴丸，放入干燥機(jī)中干燥24h，即得所述抗腦缺血玄參滴丸。實(shí)施例7:玄參滴丸的制備冷凝液的制備選擇二甲基硅油和液體石蠟混合液為冷凝液，比例7:3，冷凝管長度14cm。精密稱取基質(zhì)PEG4000-PEG6000(質(zhì)量比4:1)共5g，水浴上加熱熔融，混合均勻，按照提取物基質(zhì)質(zhì)量比為l:3精密稱取實(shí)施例3中藥提取物，加入熔融的基質(zhì)中，攪拌至融合均勻；保持溫度，調(diào)節(jié)滴速為30±2滴/min，滴距46cm，將混合物滴入冷凝液中，03t:冷凝成丸，收集滴丸，放入干燥機(jī)中干燥24h，即得所述抗腦缺血玄參滴丸。實(shí)施例8:抗腦缺血玄參滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)抗腦缺血玄參滴丸TLC測定分別稱取實(shí)施例57滴丸各約2g，于研缽中研細(xì)，放入具塞錐形瓶中，加40%甲醇10mL，超聲處理20分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。取空白基質(zhì)所制備滴丸同法制成滴丸陰性對照液。精密稱取哈巴俄苷對照品5.0mg，用40%甲醇定容到10ml，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5ii1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水(8:2:3)為展開劑，用展開劑預(yù)飽和20分鐘，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。(2)抗腦缺血玄參滴丸性狀8圓整、具光澤的滴丸，氣微香，味微苦。每丸重量36mg，每丸含生藥量0.44g(3)抗腦缺血玄參滴丸檢查1、溶散時限照崩解時限檢查法(中國藥典2005版一部附錄XIIA)檢查，選擇篩孔內(nèi)徑為0.42mm的崩解儀，3批樣品(實(shí)施例57)中每批取供試品6丸，不加擋板進(jìn)行檢查。結(jié)果3批樣品均在30min內(nèi)全部溶散，符合藥典規(guī)定。2、重量差異照滴丸劑(中國藥典2005版一部附錄IK)項(xiàng)下〔重量差異〕的檢查法，3批樣品(實(shí)施例57)每批取供試品20丸，精密稱定總重量，求得平均丸重后，再分別精密稱定每丸的重量，每丸重量與平均丸重相比較，計算重量差異，超出重量差異限度(±12%)的不得多于2丸，并不得有1丸超出限度1倍。結(jié)果3批樣品重量差異檢查均符合藥典規(guī)定。3、微生物限度照微生物限度檢查法(中國藥典2005版一部附錄XIIIC)檢查，3批樣品(實(shí)施例57)均符合藥典規(guī)定。權(quán)利要求一種抗腦缺血玄參的有效成分提取方法，所述方法包括(1)上樣液制備取玄參干燥粉末，加入6～10倍質(zhì)量的水回流提取1～3次，每次2～4h，過濾，合并濾液濃縮至濃度為0.5～1g/mL作為上樣液；(2)樹脂前處理大孔吸附樹脂用70～95％乙醇浸泡12～24h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；(3)有效成分提取步驟(1)上樣液上步驟(2)所述樹脂柱，以2～4mL/min吸附速度動態(tài)吸附2～3次，先以3～7倍柱體積的水洗脫，然后用30～70％乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、干燥，得抗腦缺血的玄參提取物。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂為下列之一DM130大孔樹脂、D101大孔樹脂或D201大孔樹脂。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂與玄參質(zhì)量比為1:l4。4.一種利用權(quán)利要求1所述方法獲得的抗腦缺血的玄參提取液制備抗腦缺血玄參滴丸的方法，所述方法包括(1)上樣液制備取玄參干燥粉末，加入610倍質(zhì)量的水回流提取13次，每次24h，過濾，合并濾液濃縮至濃度為0.5lg/mL作為上樣液；(2)樹脂前處理大孔吸附樹脂用7095%乙醇浸泡1224h，去除上層漂浮的雜質(zhì)及小顆粒，抽干乙醇后，濕法上柱并測定柱體積，再用乙醇洗脫至流出液加水不變渾濁為止，再用水洗脫至無醇味，得樹脂柱備用；(3)有效成分提取步驟(1)上樣液上步驟(2)所述樹脂柱，以24mL/min吸附速度動態(tài)吸附23次，先以37倍柱體積的水洗脫，然后用3070%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、干燥，得抗腦缺血的玄參提取物；(4)按照玄參提取物干燥粉末與聚乙二醇質(zhì)量比l:16，將玄參提取物干燥粉末加入熔融的聚乙二醇中，攪拌至融合均勻，得混合物；(5)以滴速2050滴/min、滴距46cm，將熔融的混合物滴入冷凝液中，所述冷凝液為二甲基硅油和液體石蠟體積比57:13的混合液，O3t:冷凝成丸，收集滴丸，干燥，即得所述抗腦缺血玄參滴丸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述聚乙二醇為PEG4000和PEG6000質(zhì)量比14:16的混合物。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗腦缺血玄參的有效成分提取方法，以及利用該方法獲得的玄參有效成分制備抗腦缺血滴丸的方法。本發(fā)明采用將中藥材經(jīng)水提后上樹脂柱富集有效成分的方法，最終獲得提取物中有效成分含量提高約9倍，改善傳統(tǒng)中藥制劑“粗、大、黑”的外觀和服用量過大等缺點(diǎn)。采用本發(fā)明方法制備抗腦缺血玄參滴丸，使易水解、易氧化的藥物和易揮發(fā)的藥物包埋而增加其穩(wěn)定性，又可提高生物利用度，起效迅速，用于臨床治療缺血性腦卒中，可預(yù)見重要應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。文檔編號A61P9/00GK101744937SQ200910155688公開日2010年6月23日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者李兆翌,梁澤華,毛慶秋,胡瑛瑛,鐘曉明,黃真申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)