專利名稱：：一種吲唑化合物的用途及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種吲唑化合物在制備藥物方面的用途。特別涉及3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽用于制備血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷引起的相關(guān)腦血管疾病預(yù)防和治療藥物的用途，以及3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽的制備方法。
背景技術(shù)：
：腦血管病是危害人類生命與健康的常見病、多發(fā)病。具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點。腦血管病的發(fā)病率與年齡成正相關(guān)，隨著我國人口老齡化程度加重。其發(fā)病呈上升趨勢。以腦卒中為例，我國每年發(fā)病率為150/10萬人，死亡率為120/10萬人，存活中約有75%致殘，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)41%，由此造成了社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日趨加重。據(jù)統(tǒng)計資料顯示，腦血管病以缺血性為多見。缺血性腦損傷以后，首先發(fā)生明顯的腦微血管系統(tǒng)缺血性改變，病灶區(qū)出現(xiàn)血液循環(huán)障礙，血腦屏障通透性增加及腦水腫，最后導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元細(xì)胞死亡等重要的病理生理變化。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)微循環(huán)局部與整體全過程的聯(lián)系，提出血管內(nèi)皮細(xì)胞是腦缺血損傷致病因素的重要靶細(xì)胞(ZlokovicBV.Theblood-brainbarrierinhealthandchronicneurodegenerativedisorders.Neuron.2008,24:178-201;高梅等，缺血性中風(fēng)治療新策略--耙向神經(jīng)血管單元?！吨袊R床藥理學(xué)與治療學(xué)》2008，13:813-821)。以血管內(nèi)皮作為切入點，是進(jìn)一步研究腦血管疾病治療方法的突破口所在(ZlokovicBV.Theblood-brainbarrierinhealthandchronicneurodegenerativedisorders.Neuron.2008，24:178-201.)。氧化應(yīng)激(oxidativestress)是缺血性腦血管疾病重要病理反應(yīng)過程。其中過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite，0N00-)是心腦血管損害時氧化應(yīng)激的重要信號途徑，0N00-因為其強(qiáng)大氧化活性使含硫基團(tuán)氧化、羥基化和蛋白質(zhì)酪氨酸殘基硝化，可改變細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(XuJ，HeL，AhmedSHetal.Oxygen-glucosedeprivationinducesinduciblenitricoxidesynthaseandnitrotyrosineexpressionincerebralendothelialcells.Stroke.2000，31:1744-1751)。應(yīng)用藥物阻止0N00-，逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是改善腦血管內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對防治以血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為病理基礎(chǔ)的腦血管疾病有重大實際意義。3-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基_1H_噴唑鹽酸鹽(JP09-301955)的化學(xué)式如下33-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基_1H_噴唑鹽酸鹽的制備僅見上述專利報道由吲唑基乙酸出發(fā)先制成其乙酯，再還原成吲唑基乙醇，醇羥基鹵代后與哌嗪側(cè)鏈偶聯(lián)后，經(jīng)鹽酸化、重結(jié)晶制得。合成過程長且收率較低。近年來的文獻(xiàn)中已介紹過3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽可以調(diào)控心肌肥厚病理過程中的f丐調(diào)素依賴激酶和磷酸化酶的穩(wěn)態(tài)平衡(LuYM，ShiodaN，HanF，MoriguchiS，KasaharaJ，ShirasakiY，QinZH，F(xiàn)ukunagaK.ImbalancebetweenCaMkinaseIIandcalcineurinactivitiesimpairscaffeine—inducedcalciumreleaseinhypertrophiccardiomyocytes.BiochemPharmacol.200715;74(12):1727-37)。但目前尚未見該物質(zhì)用于逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，腦血管損傷保護(hù)作用的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種吲唑化合物3-{2-[4N_(2-甲基_3_氯苯基)_1N_哌嗪基]乙基卜5，6-二甲氧基-lH-吲唑鹽酸鹽在制備治療腦血管疾病藥物中的用途。所述的吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽能夠減少或阻斷ONOO-產(chǎn)生及繼發(fā)，逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，可用于制備以血管氧化應(yīng)激損傷為病理基礎(chǔ)的腦血管疾病的防治的藥物。本發(fā)明的另一個目的是提供3-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)_1N_哌嗪基]乙基卜5，6-二甲氧基-lH-噴唑鹽酸鹽的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯(I)出發(fā)，經(jīng)重氮化合環(huán)反應(yīng)制得吲唑乙酸(II)，經(jīng)酰氯化后與哌嗪側(cè)鏈結(jié)合后得吲唑乙酰胺(III)，再經(jīng)四氫鋰鋁(LiAIH4)或四氫硼鈉(NaBH4)還原成吲唑胺(IV)，再鹽酸化、重結(jié)晶制得目的化合物(V)。反應(yīng)式基于氧化應(yīng)激損傷條件下的血管內(nèi)皮細(xì)胞在多種腦病病理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)地位，本發(fā)明采用永生化人臍靜脈來源的EA.hy926細(xì)胞系制作了血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧低糖氧化應(yīng)激損傷模型(Oxygen-GlucoseD印rivation，OGD)，模擬了體外的血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)。采用該模型觀察3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽的抗過氧亞硝基陰離子產(chǎn)生作用及對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。本發(fā)明建立了大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型對3-{2-[4^(2_甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽的神經(jīng)血管單元保護(hù)作用進(jìn)行了體內(nèi)外的藥效學(xué)評價。通過本發(fā)明提供的制備方法可以很容易得到3-{2-[4^(2_甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基卜5，6-二甲氧基-lH-噴唑鹽酸鹽。血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧低糖氧化應(yīng)激損傷實驗結(jié)果表明，3-{2-[4^(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽可以減少或消除0N00—，并能有效減少血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡率。大腦中動脈腦缺血動物實驗結(jié)果也證實該吲唑鹽腹腔內(nèi)給藥可以顯著減少血腦屏障破壞和腦梗塞，并可改善神經(jīng)功能障礙。兩組實驗數(shù)據(jù)就共同證實3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽能夠逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腦血管。使用本發(fā)明提供的方法可以從簡單廉價的咖啡酸衍生物(I)出發(fā)，高收率地合成中間體(n、ni、iv)，以較高得率、更廉價地制得目標(biāo)化合物(V)。圖1是不同濃度的3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對0GD條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡率的影響情況圖。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之內(nèi)。實施例一化學(xué)合成法合成3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽步驟1:噴唑基乙酸合成將669mg的2_氨基_3，4_二甲氧基桂皮酸乙酯(I)在冰冷條件下投入3ml2mo1/L鹽酸中，攪拌均勻。向其中滴加1.5ml140g/L亞硝酸鈉水溶液，半小時后加入4.5ml3.Ommol/L的亞硫酸鈉水溶液，充分混合。然后向其中加入乙醇6mL，攪拌后濾取結(jié)晶，用乙醇洗滌，50度4小時減壓干燥后，將其懸濁于2mol/L1.OmL鹽酸中，60度下攪拌半小時。醋酸鈉調(diào)pH至中性，濾取結(jié)晶，水洗，50度下4小時減壓干燥得吲唑基乙酸(n)248mg。步驟2:吲唑基乙酰胺的合成取上述產(chǎn)物4.724g加入50mL二氯亞砜中，回流1小時后，將其殘渣溶于100mL四氫呋喃中，向該溶液中滴加含4.21gl-lN-(2-甲基-3-氯苯基)哌嗪的10mL四氫呋喃溶液，室溫下攪拌3小時，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液淬活，每次100mL乙酸乙酯提取4次，無水硫酸鈉干燥，過濾后濾液減壓濃縮得吲唑基乙酰胺(III)粗產(chǎn)物8.2g，收率96X。步驟3:3-{2-[4N-(2-甲基_3_氯苯基)_1N_哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-lH-噴唑鹽酸鹽(IV)粗品的合成將上述步驟得到(IV)的粗品溶于60mL四氫呋喃中，并將該溶液滴加至含0.91g四氫鋰鋁的100mL四氫呋喃中，室溫下反應(yīng)3小時，向混合液中滴加水O.25mL，過濾，濃縮濾液，柱層析分離得產(chǎn)物2.49g。將該化合物溶于35mL丙酮，向該溶液中加入濃鹽酸5mL，回流攪拌1小時，冷卻結(jié)晶，洗滌，自然干燥后得(V)粗產(chǎn)物2.77g。步驟4:粗品的精制將上述步驟3得到的化合物(V)的粗品溶于10mL純水中。加熱至完全溶解后加入活性炭l.O克并保溫半小時，過濾，濾液冷卻至O度。濾取結(jié)晶，減壓干燥得3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽(V)2.55g。收率28%。'HNMR(400MHz，DMSO):7.21(s，1H)，6.98(s，1H)，3.94(s，2H)，3.89(s，3H)，3.83(s，3H)。實施例二化學(xué)合成法合成3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽(V)步驟1:吲唑基乙酰胺(III)的合成取實施例一中步驟1得到的產(chǎn)物吲唑酸(11)4.724g，向其中加入50mL二氯亞砜中，回流1小時后，將其殘渣溶于100mL四氫呋喃中，向該溶液中滴加含4.21gl-lN-(2-甲基-3-氯苯基)哌嗪的10mL四氫呋喃溶液，室溫下攪拌3小時，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液淬活，每次100mL乙酸乙酯提取4次，無水硫酸鈉干燥，過濾后濾液減壓濃縮得吲唑基乙酰胺(III)粗產(chǎn)物8.2g，收率96X。步驟2:3-{2-[4N-(2-甲基_3_氯苯基)_1N_哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-lH-吲唑(IV)粗品的合成將步驟1得到的粗品溶于60mL四氫呋喃中，并將該溶液滴加至含1.15g四氫硼鈉的lOOmL四氫呋喃中，室溫下反應(yīng)3小時，向混合液中滴加水0.25mL，過濾，濃縮濾液，柱層析分離得產(chǎn)物(IV)2.49g。步驟3:3-{2-[4N_(2-甲基_3_氯苯基)_1N_哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-lH-噴唑鹽酸鹽(IV)粗品的合成將上述步驟2得到的產(chǎn)物(IV)溶于35mL丙酮，向該溶液中加入濃鹽酸5mL，回流攪拌1小時，冷卻結(jié)晶，洗滌，自然干燥后得粗產(chǎn)物2.70g。步驟4:粗品的精制按實施例一中步驟4的精制方法精制后得目標(biāo)化合物2.04克，收率22%。^NMR(400MHz，DMSO):7.21(s，1H)，6.98(s，1H)，3.94(s，2H)，3.89(s，3H)，3.83(s，3H)。實施例三3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對缺氧低糖氧化應(yīng)激損傷條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用藥品與試劑高糖DMEM、高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBIC0公司，胎牛血清、新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所，I型膠原酶和四氮唑藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純試劑。試驗所使用的細(xì)胞培養(yǎng)用人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞系為永生化細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%滅活國產(chǎn)胎牛血清)在37t:、飽和空氣濕度、含5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈單層貼壁生長。細(xì)胞長至融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗23次，O.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。體外低糖缺氧模型(Oxygen-GlucoseD印rivation，0GD)構(gòu)建將單細(xì)胞懸液移入96孔板，3X103cells/Vell、37。C、5XC02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞完全融合時加入不同處理空白對照組在正常條件下培養(yǎng)；實驗組每孔用預(yù)熱至37t:的HBSS(NaCl8.00，KC10.20，CaCl20.14，MgS04.7H200.20，Na2HP04.H200.06，KH2P040.06，NaHC030.35)清洗三次，并換入相同培養(yǎng)基，以上每組每種劑量設(shè)平行3孔，先放入缺氧密閉箱(美國Billups-Rothenberg公司產(chǎn)品，MIC-lOl)通入混合氣體(含95%N2，5%C02)約5min，然后將密閉箱放入孵箱處理6h，最后換入正常高糖DMEM培養(yǎng)基，并加入20iiL0.5%MTT，輕輕搖勻，培養(yǎng)箱中孵育4h，吸干培養(yǎng)液，然后加入150iiLDMSO，酶標(biāo)儀上以570nm波長測定吸光度，測內(nèi)皮細(xì)胞在不同濃度的存活率，并觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。實驗結(jié)果受試藥品在OGD模型制作前l(fā)h加入培養(yǎng)基直至實驗結(jié)束。實驗結(jié)果可見3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽可以有效降低人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞死亡率，且呈劑量依賴性，參見圖1，3-{2_[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽10—5iig/ii1-10—3iig/P1可以有效減少血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡率。實施例四3-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對缺氧低糖氧化條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧亞硝基陰離子產(chǎn)生的影響藥品與試劑高糖DMEM、高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBIC0公司，胎牛血清、新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所。nitrotyrosine鼠抗一抗(UpstateBiotechnology)，鼠二抗(AmershamBioscience)，其它試劑均為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純試劑。試驗所使用的細(xì)胞培養(yǎng)用人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞系為永生化細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%滅活國產(chǎn)胎牛血清)在37t:、飽和空氣濕度、含5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈單層貼壁生長。細(xì)胞長至融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗23次，O.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。體外低糖缺氧模型構(gòu)建將單細(xì)胞懸液移入96孔板，3X103cells/well、37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞完全融合時加入不同處理空白對照組在正常條件下培養(yǎng)；0GD組和OGD合并3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽用藥組(10—5iiM-10—3iiM)，每孔用預(yù)熱至37。C的HBSS(NaCl8.00g，KC10.20g，CaCl20.14g，MgS04.7H200.20g，Na2HP04.H200.06g，KH2P040.06g，NaHC030.35g)清洗三次，并換入相同培養(yǎng)基，以上每組每種劑量設(shè)平行3孔，先放入缺氧密閉箱通入混合氣體(含95%N2，5%C02)約5min，然后將密閉箱放入孵箱處理6h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量。免疫印跡法定量檢測3-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對血管內(nèi)皮OGD損傷后過氧亞硝基陰離子表達(dá)的影響血管內(nèi)皮OGD損傷后nitrotyrosine蛋白(特異性識別過氧亞硝基陰離子水平)表達(dá)變化定量檢測，蛋白標(biāo)本電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉45分鐘。滴加nitrotyrosine鼠抗一抗(1:500)，4。C過夜。10mMPBS洗3次各5分鐘。滴加鼠抗二抗(1:2000)室溫120分鐘。10mMPBS洗3次各5分鐘，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。對免疫印跡的條帶進(jìn)行定量分析。實驗結(jié)果3-{2-[4N_(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基_1H_噴唑鹽酸鹽(10—^g/iU-lO—、g/iU)在OGD模型制作前l(fā)h加入培養(yǎng)基直至實驗結(jié)束。實驗結(jié)果顯示3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-IN-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基_1H_吲唑鹽酸鹽相比0GD模型組可以更有效降低0GDe小時后人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞過氧亞硝基陰離子產(chǎn)生量，呈明顯劑量依賴性(*P<0.05或林P<O.Ol)，參見表1。表l是不同濃度的3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-lH-噴唑鹽酸鹽對OGD6小時條件后過氧亞硝基陰離子產(chǎn)生的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n二6)。表中噴唑鹽酸鹽即3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽表1與0GD模型組比較8組別Nitrotyrosine相對表達(dá)量(％)正常對照組100.0±0.0OGD模型組273.8±32.2吲唑鹽酸鹽(10—5Kg^l)198.2±31.4*吲唑鹽酸鹽(KTVig/pl)190.8±29.7*吲唑鹽酸鹽(1(rVg4d)134.5±19.4***P<0.05;**P<0.01實施例五3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對腦微血管損傷后血腦屏障的保護(hù)作用操作方法Wistar大鼠，體重220270g，雄性。Dextran-40:Sigma公司產(chǎn)品。特制碳素微栓，NewEnglandNuclear公司產(chǎn)品。大鼠采用水合氯醛(10%)麻醉，固定，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)、頸外動脈、翼突腭動脈，動脈夾臨時夾閉頸外動脈和翼突腭動脈。頸總動脈近心端結(jié)扎，在距頸內(nèi)、頸外動脈分叉之前插入導(dǎo)管，將直徑為50ym的碳素微栓在不中斷動脈血流的情況下緩慢注入頸內(nèi)動脈，去動脈夾，外科用手術(shù)封口膠修補(bǔ)動脈，皮膚縫合。實驗分組如下假手術(shù)組、腦微血管損傷模型組，腦微血管損傷+藥物(低劑量)治療組，腦微血管損傷組+藥物(高劑量)治療組，每組動物6只。藥物采用腹腔注射，分別于腦微血管損傷前60分和損傷后1小時時間點兩次給藥。24小時后測定實驗動物血腦屏障通透性腦微血管損傷損傷后22小時大鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)，2h后實驗動物斷頭取腦，觀察血腦屏障對伊文思藍(lán)的通透性；按(王超云，蔣王林，智紅英等，黃芩苷對腦損傷的保護(hù)作用。中草藥，2004;35(2)，188-190)中的操作方法稱取大腦濕重，105。C烘烤至恒重，精確稱量干重，計算含水量。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用Du皿ett-t檢驗。實驗結(jié)果實驗結(jié)果顯示3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-lH-吲唑鹽酸鹽可以有效減少了伊文思藍(lán)的漏出。同時，也觀察到微血管損傷+藥物(低劑量)治療組，腦微血管損傷組+藥物(高劑量)治療組比腦微血管損傷模型組有更低的腦含水量。證明3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽具有減輕腦水腫的作用(P<0.01)，見表2。表2是不同濃度的吲唑鹽對腦微血管損傷后血腦屏障破壞的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n二6)。表中噴唑鹽酸鹽即3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽表2與腦微血管損傷模型組比較9組別腦含水量(％)76.33±1.37~~"82.33±1.9780.00±1.55*78.83±1.17**P<0.05實施例六3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對大腦中動脈缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用操作方法雄性Wistar大鼠，體重220270g。大鼠采用水合氯醛(10%)麻醉，固定，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)、頸外動脈。頸外動脈、頸總動脈近心端結(jié)扎，在距頸內(nèi)、頸外動脈分叉之前剪口，插入直徑統(tǒng)一的3-0尼龍線栓(造成腦缺血現(xiàn)象)，2小時后尼龍線栓退出(造成腦血再灌注現(xiàn)象)，皮膚縫合。實驗分組如下假手術(shù)組、腦血管損傷模型組，腦血管損傷+藥物治療組(低劑量)，腦血管損傷+藥物治療組(高劑量)，每組動物7只。藥物采用腹腔注射，腦缺血損傷前60分和再灌注后兩次給藥。24小時后實驗動物評價觀察動物行為變化、通常動物會出現(xiàn)眼球震顫，共濟(jì)失調(diào)，運(yùn)動障礙等一系列神經(jīng)功能損害的表現(xiàn)，按照Longa法對腦血管損傷SD大鼠行為學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下0分無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。梗塞面積測定實驗動物大腦標(biāo)本，去掉嗅球、小腦和低位腦干，用大鼠腦模冠狀切4刀分為5片，每片厚2mm。腦片用紅四氮唑(TTC)染色，染色液成分為1.5ml4%TTC、0.lmllmol/LKH2P04，3.4ml生理鹽水，37"C避光染色30min。用NIH1.63圖像分析軟件計算梗塞體積。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用Du皿ett-t檢驗。實驗結(jié)果實驗結(jié)果顯示腦血管損傷+藥物治療組(低劑量)，腦血管損傷+藥物治療組(高劑量)兩組都得到比腦血管損傷模型組有較低的神經(jīng)功能障礙評分，梗塞面積也較小。證明3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6-二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽可以有效改善神經(jīng)功能障礙，同時有效減少了腦梗塞體積(P<0.01)，見表3。表3是不同濃度的3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽對大腦中動脈缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能障礙及梗塞體積的影響(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n二7)。表3與腦血管損傷模型組比較(**P<0.01)10假手術(shù)組腦微血管損傷模型組吲唑鹽酸鹽(低劑量)剛唑鹽酸鹽(高劑量)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽在制備治療腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，所述腦血管疾病是因血管氧化應(yīng)激損傷所致。2.—種噴唑化合物3-(2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-lN-哌嗪基]乙基}_5，6_二甲氧基-1H-噴唑鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯(I)出發(fā)，經(jīng)重氮化合環(huán)反應(yīng)制得吲唑乙酸(11)，經(jīng)酰氯化后與哌嗪側(cè)鏈結(jié)合后得吲唑乙酰胺(III)，再經(jīng)四氫鋰鋁(LiAIH4)或四氫硼鈉(NaBH4)還原成吲唑胺(IV)，再鹽酸化、重結(jié)晶制得目的化合物(V)，反應(yīng)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明提供一種吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑鹽酸鹽在制備治療腦血管疾病藥物中的用途。由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯出發(fā)，經(jīng)重氮化合環(huán)反應(yīng)制得吲唑乙酸，經(jīng)酰氯化后與哌嗪側(cè)鏈結(jié)合后得吲唑乙酰胺，再經(jīng)四氫鋰鋁或四氫硼鈉還原成吲唑胺，再鹽酸化、重結(jié)晶制得目的化合物。本發(fā)明的吲唑化合物能夠減少或阻斷ONOO-產(chǎn)生及繼發(fā)，逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，能夠逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腦血管。制備方法簡便，原材料廉價，收率高。文檔編號A61K31/496GK101747277SQ200910155888公開日2010年6月23日申請日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者盧應(yīng)梅,張辰,樓宜嘉,福永浩司,韓峰申請人:浙江大學(xué)