專利名稱：一種多肽、蛋白類藥物口腔粘膜吸收劑型的組方及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經(jīng)口腔粘膜遞藥的藥劑組方及制備方 法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著基因工程藥物研究的進展，蛋白和多肽藥物作為很有潛力的一類藥物，在臨 床治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。然而，由于胃腸道蛋白酶對蛋白和多肽藥物的水解作 用，這些藥物基本口服無效。臨床上蛋白和和多肽類藥物最常用的給藥方式是注射給藥。當(dāng) 蛋白和多肽藥物用于治療慢性疾病時，如用胰島素治療糖尿病，長期注射給藥很不方便，給 患者帶來極大的不便和痛苦。因此，研發(fā)蛋白和多肽類藥物的各種非注射給藥劑型是藥物 研發(fā)領(lǐng)域的的熱點，受到高度重視。蛋白和多肽藥物的非注射給藥途徑大都屬于透粘膜吸 收，主要包括肺吸入劑、口服制劑、粘膜給藥制劑。其中口腔頰粘膜給藥制劑以其突出的優(yōu) 勢，受到研究者的關(guān)注。頰粘膜吸收表面積大，通透性良好，蛋白酶活性較低，血管豐富，是 多肽、蛋白類藥物較適合的給藥途徑；頰粘膜給藥可避免多肽、蛋白類藥物在胃腸道的降解 和在肝臟的首過效應(yīng)；口腔粘膜遞藥系統(tǒng)方便給藥，且病人易于接受，具有較高的順應(yīng)性。 然而，由于多肽、蛋白類藥物分子量較大，如胰島素分子量接近6000，親水性強，正常生理條 件下很難透過口腔粘膜吸收入血，因此如何提高該類藥物在頰粘膜處的通透性，提高藥物 的生物利用度，是研發(fā)多肽、蛋白類藥物口腔頰黏膜制劑首先需要解決的關(guān)鍵問題。影響藥物經(jīng)口腔粘膜滲透吸收的口腔粘膜滲透障礙主要包括口腔粘膜膜包裹顆 粒、蛋白酶、唾液三方面的因素?？谇活a粘膜上皮的滲透障礙主要源自上皮的上三分之一到四分之一。有報道稱藥 物(包括大分子如辣根過氧化酶和小分子如鑭鹽)通過口腔粘膜滲透吸收的主要阻礙，是 從膜包裹顆粒排出的物質(zhì)，這些物質(zhì)主要包括極性脂質(zhì)(磷脂、膽固醇脂和糖基神經(jīng)酰胺)寸。對于酶不穩(wěn)定的藥物(蛋白質(zhì)及肽類)，口腔內(nèi)存在的酶對藥物滲透吸收也有一 定的影響。與鼻腔給藥、陰道給藥和直腸給藥相比，藥物對口腔粘膜內(nèi)的蛋白水解酶敏感性 低很多。但是，有文獻報道，口腔粘膜中的酶確實限制了蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)的吸收，比如在 正常狀態(tài)下，倉鼠口腔內(nèi)胰島素的降解顯著大于糖尿病狀態(tài)時的降解，且廣譜酶抑制劑桿 菌肽可以抑制各種蛋白水解酶活性。到目前為止，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的存在于動物口腔粘膜的酶主 要有氨基肽酶、二肽基肽酶和二肽基羧肽酶、羧肽酶、酰胺酶、肽鏈內(nèi)切酶、亮氨酸氨肽酶和 一些特異性的酯酶。有報道指出氨基肽酶是口腔粘膜里唯一具有活性的肽酶，而肽鏈內(nèi)切 酶和羧肽酶沒有活性。正常口腔內(nèi)唾液由99. 5%的水和少量蛋白質(zhì)、糖蛋白和電解質(zhì)組成，其中鉀離子 濃度為血漿的7倍，碳酸氫鹽、鈣、磷濃度為血漿的3倍，鈉離子濃度為血漿的十分之一。正 常唾液的PH是5. 6-7，分泌速率約為l-2mL/min。唾液中含有a_淀粉酶(可裂解1_4糖苷
3鍵)、溶解酵素(溶解細菌細胞壁)和舌脂肪酶(分解脂肪)?？谇徽衬?0%表面與唾液相 接觸，其厚度大約為70 ym，是口腔粘膜表面的不流動層。由于唾液的清除吞咽作用，使藥物 在口腔內(nèi)的滯留時間太短，限制了藥物的滲透吸收量。因此，唾液對藥物的清除作用也不容 忽視。藥物的理化性質(zhì)也是影響藥物經(jīng)口腔粘膜滲透吸收的另一主要因素?？谇徽衬の?收遵循PH分配學(xué)說，而大部分藥物屬于弱電解質(zhì)。藥物的相對分子質(zhì)量、解離度及脂溶性 大小都會影響藥物的滲透吸收。細胞間隙的非薄層狀液相脂質(zhì)和細胞膜的脂溶性，使脂溶 性較高的藥物幾乎可以暢通無阻的滲透，但是對于肽、蛋白類等親水性藥物，其吸收速度與 分子量大小有關(guān)，分子量小于100D的物質(zhì)可以快速滲透吸收，滲透性隨藥物分子量增大而 急劇下降。因此，由于口腔內(nèi)環(huán)境的滲透障礙和多肽、蛋白類藥物本身的影響，該類藥物通過 口腔粘膜滲透吸收非常有限。如何提高大分子親水性藥物的滲透吸收程度是口腔粘膜遞藥 系統(tǒng)研究領(lǐng)域面臨的重大困難，目前最常用的方法是加入促吸收劑。一個理想的促滲透吸收劑應(yīng)該具備以下特點有效、安全、化學(xué)惰性、無生物活性、 作用可逆性等。傳統(tǒng)的促滲透吸收劑可分為表面活性劑、非離子型表面活性劑、膽汁酸鹽、 螯合劑等等，詳見表1。新型促吸收劑也層出不窮，包括殼聚糖衍生物、各種小分子肽、氨基 酸等。促吸收劑的作用大小受很多因素的影響，如藥物的理化性質(zhì)、遞藥載體的組成、黏膜 組織是否用促吸收劑預(yù)處理過等?，F(xiàn)在的研究認(rèn)為，促滲透吸收劑發(fā)揮促吸收作用的機制 有以下幾點(1)減少粘液層的粘滯性，有助于藥物經(jīng)旁細胞轉(zhuǎn)運，增加藥物進入組織的比例。 如月桂氮卓酮(Azone)。(2)提取但不破壞細胞間隙的脂質(zhì)，與上皮的蛋白質(zhì)區(qū)域相互作 用，提高膜流動性有助于藥物的跨細胞轉(zhuǎn)運。如十二烷基硫酸鈉(SDS)。(3)增加藥物在口 腔黏膜的滯留時間。如殼聚糖是一種生物相容性好，可降解的高分子聚合物，具有良好的生 物粘附性，可增加藥物在口腔黏膜表面的滯留時間，并可干擾細胞間隙脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)排列，進 而減少唾液對藥物的清除，增加藥物滲透吸收的能力。(4)干擾細胞間脂質(zhì)的排列，瞬間增 加細胞間隙。乙醇具有吸取口腔黏膜脂質(zhì)的功能，油酸可增加細胞間隙脂質(zhì)的流動性，促進 藥物在皮膚的滲透吸收。然而到現(xiàn)在，仍沒有任何一個含有促滲透吸收劑的口腔黏膜藥物 上市。這主要是因為促滲透吸收劑刺激性問題，還缺乏令人滿意的研究結(jié)果。促滲透吸收 劑的長期安全性實驗，包括作用是否可逆性，有無毒性，作用靶點的選擇性等等，都需要研 究者們做進一步的研究。對于多肽、蛋白類藥物，一方面需要提高其在口腔黏膜的滲透吸收能力，另一方 面，不能忽視藥物對口腔內(nèi)蛋白水解酶的敏感性?？谇粌?nèi)蛋白水解酶的活性大小與回腸中 的差不多。有研究指出，在白兔的口腔黏膜組織勻漿中，0.01%抑酞酶可減少70%-80%胰 島素和胰島素前體藥的降解。目前，研究中使用的酶抑制劑主要有抑酞酶(屈來塞多)、 抑氨肽酶素、嘌呤霉素、牛膽酸鈉鹽和芐澤35等。另外口腔粘膜給藥劑型的研究也日趨白熱化，包括片劑、貼劑、粉劑、噴霧劑、水凝 膠、脂質(zhì)體、溶液劑、微球和咀嚼膠等。硝酸甘油舌下片需要在口腔內(nèi)溶解后才能被吸收， 這使得藥物在口腔內(nèi)停留時間較短，易被唾液清除，且因為味覺而影響病人的順應(yīng)性。噴 霧劑、咀嚼膠作用時間短暫，若不加入理想的促滲透吸收劑則多肽、蛋白類藥物很難發(fā)揮療效。傳統(tǒng)的片劑采用壓片法制備，結(jié)構(gòu)致密，不利于藥物的釋放，限制了藥物的吸收。貼劑 載藥量受限，應(yīng)用不廣?；谏鲜隼碚摵蛯嵺`，我們通過TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運模型，篩選了 一系列安全有效的促滲透吸收劑，可顯著促進多肽、蛋白類藥物經(jīng)口腔粘膜的滲透吸收，有 望提高該類藥物經(jīng)口腔粘膜吸收的生物利用度。凍干法制備口腔粘附雙層片，其海綿樣多 孔狀結(jié)構(gòu)有利于藥物的釋放，粘附片防水層和粘附層的雙層設(shè)計，避免了藥物的損失，且該 法制備的肽、蛋白類藥物口腔粘附片方便保存，穩(wěn)定性好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的多肽、蛋白類藥物口腔粘附雙層片，粘附層由多 肽及蛋白類藥物、促滲透吸收劑、蛋白酶抑制劑、生物粘附劑、添加劑組成，防水層由乙基纖 維素組成，使得該粘附片可避免藥物在口腔環(huán)境內(nèi)的損失，提高肽類、蛋白類藥物經(jīng)口腔粘 膜遞藥的生物利用度。該口腔粘附雙層片通過凍干法制備，不損失該類藥物的生物活性，且 其海綿樣多孔狀結(jié)構(gòu)有利于藥物的釋放，使得該口腔粘附片的穩(wěn)定性增加。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案。粘附層的組方為多肽及蛋白類藥物、促滲透吸收劑、蛋白酶抑制劑、生物粘附劑、 添加劑。防水層的組方組成乙基纖維素。所述的多肽及蛋白類藥物為天然提取的、人工合成的、基因重組的多肽及蛋白類 藥物。所述的促滲透吸收劑為以下幾類(1)藥物及食物成分類，包括N-乙酰-L-半胱 氨酸(NAC)、滅特復(fù)星、18-0-甘草次酸(GA)、刺嫩芽中的皂苷類成分、辣椒素、啤酒花提 取物、毛果槭及高良姜；(2)小分子短肽類，包括蜂毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)、酪蛋 白磷酸肽(CPPs)、霍亂孤菌編碼的第二毒素Zot毒素、還原型谷胱甘肽(GSH)、跨膜蛋白 occludin的兩個胞外泮多肽及脂肽類衍生物如C14-0P90-103 ； (3)殼聚糖及其衍生物類； (4) 一氧化氮供體，包括硝普鈉(SNP)、L-精氨酸(L-Arg)、N0C5和N0C12 ； (5)膽酸鹽類，包 括脫氧膽酸鈉(SDC)、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉；(6)脂肪酸及其衍生物，包括肉豆蔻酸 酯，月桂酸酯、軟脂基肉毒堿；(7)螯合劑，包括水楊酸鈉、EDTA ； (8)表面活性劑，包括合成 表面活性劑如月桂基硫酸鈉、各種烷基糖苷，非離子型表面活性劑如月桂氮酮(Azone)、月 桂醇聚醚_9、月桂醇聚醚-4、吐溫80、吐溫20、PEG-8月桂酸酯、PEG-4月桂酸酯、甘油單月 桂酸酯、4-椰纖維烷基嗎啉衍生物；(9)其他，包括大豆卵磷脂(SPC)、糖酯、月桂醯胺丙基 甜菜堿、磷脂酰肌醇、磷酸卵磷酯、氨基已酸、聚丙烯酸、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、卵清酸、環(huán) 糊精。所述的蛋白酶抑制劑為抑酞酶(屈來塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤霉素、牛膽酸鈉鹽和芐澤35。所述的生物粘附劑為天然高分子材料明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、殼聚糖及 其衍生物等，合成高分子材料有丙烯酸聚合物卡波姆、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維 素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。所述的添加劑為矯味劑、抗氧劑、抑菌劑、著色劑。所述的矯味劑為薄荷醇、木糖醇、山梨醇。
所述的抗氧劑為生育酚、2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚。所述的抑菌劑為尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。所述的著色劑為天然著色劑辣椒紅、甜菜紅、紅曲紅、胭脂蟲紅、高粱紅、葉綠素銅 鈉、姜黃、桅子黃、胡蘿卜素、藻藍素、可可色素、焦糖色素；合成色素胭脂紅、莧菜紅、日落 黃、赤蘚紅、檸檬黃、新紅、靛藍、亮藍、二氧化鈦(白色素)。所述的防水層乙基纖維素為用乙醇或丙酮溶解的適當(dāng)濃度的乙基纖維素溶液。本發(fā)明所設(shè)計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片組方成分比例為藥物_5%，促 滲透吸收劑_5%，蛋白酶抑制劑_5%，矯味劑0. 1% _2%，抗氧劑0. 1% -2%、著色 劑0. _2%，生物粘附劑80% -96%。本發(fā)明所設(shè)計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，每片80-100mg，厚度3_5mm，主藥 2mg。藥物及輔料粉末平均顆粒在0. 2-150um時較好，0. 5-100um更好，l_20um之間最好。生產(chǎn)過程稱取并且過篩材料，將各種輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放 入_20°C冰箱預(yù)凍24h，然后用冷凍干燥機凍干24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到口腔粘 附片粘附層。接著，在其上面涂抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇或者 制備)，室溫下放置至無水乙醇完全蒸發(fā)，即得到口腔粘附雙層片，置于干燥器皿中4°C冰 箱保存。本發(fā)明優(yōu)選的促滲透吸收劑為N-乙酰-L-半胱氨酸、水溶性殼聚糖及其衍生物、 一氧化氮供體、小分子肽還原型谷胱甘肽、月桂氮酮、大豆卵磷脂及上述任意兩種的混合 物。N-乙酰-L-半胱氨酸使用量為1. 25 % -8 %，最優(yōu)為5 %，不能少于1 %，不能超過10 %。 水溶性殼聚糖及其衍生物使用量為0. 5 % -5 %，最優(yōu)為3 %，不能少于0. 1 %，不能超過5 %。 一氧化氮供體使用量為1 % _6 %，最優(yōu)為3 %，不能少于1 %，不能超過10 %。還原型谷胱甘 肽和月桂氮酮使用量均為_5%，最優(yōu)為5%，不能少于1%，不能超過6%。大豆卵磷脂 使用量為3% -8%，最優(yōu)為5%，不能少于3%，不能超過10%。本發(fā)明優(yōu)選的粘附層生物粘附材料為殼聚糖及其衍生物、果膠、海藻酸鈉、卡 波姆934P及其不同比例的混合物。殼聚糖及其衍生物、果膠可單用，也可混合，比例為 1:4-4: 1，最佳為1 4。海藻酸鈉與殼聚糖的比例為1 4-4 1，最佳為4 1?？?波姆934P可單用，也可與海藻酸鈉混合，最優(yōu)為與海藻酸鈉混合，最佳比例為1 3。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白酶抑制劑為抑酞酶，使用量為_5%，最優(yōu)為2.5%。本發(fā)明優(yōu)選的矯味劑為薄荷醇，使用量為0. 1% _2%，最優(yōu)為1%。本發(fā)明優(yōu)選的抗氧劑為生育酚，使用量為0. 1% _2%，最優(yōu)為0. 5%。本發(fā)明優(yōu)選的著色劑為二氧化鈦，使用量為0. 1% _2%，最優(yōu)為1%。本發(fā)明優(yōu)選的抑菌劑為尼泊金乙酯，使用量為0. 1% -0. 3%，最優(yōu)為0. 2%。本發(fā)明設(shè)計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的制備中，對藥物混合溶液的pH值有 一定規(guī)定，應(yīng)根據(jù)藥物的穩(wěn)定性來確定，最佳PH為6. 5，最好不要超過8，不要低于5。本發(fā)明所設(shè)計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，可用于多種疾病的治療，長期用 藥，安全可靠。本發(fā)明的特點是所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，適應(yīng)于多種藥物，新穎的 處方設(shè)計及備工藝，提高了該類藥物經(jīng)口腔粘膜吸收的生物利用度和該類藥物制劑的穩(wěn)定 性。其優(yōu)點是(1)本發(fā)明選擇的促滲透吸收劑安全有效，可顯著促進該類藥物經(jīng)口腔粘膜的吸收；(2)該口腔粘附片處方組成簡單，原料易得，成本低廉，凍干法制備工藝簡單；(3) 雙層設(shè)計及多孔結(jié)構(gòu)避免了藥物損失，利于藥物的釋放。由此可見，本發(fā)明所述的多肽、蛋 白類藥物口腔粘附片既保留了該類藥物的生物活性，又解決了該類藥物穩(wěn)定性差、生物利 用度低的問題，并首次采用凍干法制備口腔粘附片，為該類藥物非注射制劑的研究奠定了 ■石出。因此，本發(fā)明所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，是一種新型的口腔粘膜遞藥系 統(tǒng)，可用于各種多肽及蛋白類藥物，為該類藥物非注射制劑的研究提供了新的思路，具有廣 闊的市場開發(fā)前景和臨床應(yīng)用前景。


下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明做進一步說明。圖1為不同濃度N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮 細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。圖2為不同濃度一氧化氮供體硝普鈉(SNP)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞 滲透轉(zhuǎn)運的影響。圖3為不同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透 轉(zhuǎn)運的影響。圖4為不同濃度L-精氨酸(Arg)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運 的影響。圖5為不同濃度殼聚糖(CS)、殼聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物對胰島素經(jīng) TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。圖6為不同濃度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵 磷脂(SPC)/殼聚糖(CS)混合物對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。圖7為胰島素口腔粘附雙層片的制備方法示意圖。圖8為胰島素口腔粘附雙層片的掃描電鏡照片。圖9為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外釋放度。表1為各促滲透吸收劑對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。表2為不同濃度的各促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響。表3為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外粘附力。表4為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外溶脹率。
具體實施例方式下列實施例用以幫助描述如何實施本發(fā)明的各種實施方案。這些實施例是為了舉 例說明，而不是以任何方式限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明提供了篩選促滲透吸收劑的方法。本發(fā)明還提供了制備多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的方法。本發(fā)明還提供了評價多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的方法。以下實施例均是以胰島素作為實驗藥物，其他多肽、蛋白類藥物口腔粘附片同樣 按照以下方法進行實驗。
7
第1步，通過146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運模型和豬口腔粘膜滲透轉(zhuǎn)運模型篩 選可促進胰島素經(jīng)口腔粘膜滲透的促滲透吸收劑。第2步，通過MTT實驗和MTS/PMS實驗，檢測各種所篩選的促滲透吸收劑對TR146 細胞的毒作用，以評價各種促滲透吸收劑的安全性。第3步，按照設(shè)計的處方比例，制備胰島素的混合溶液，控制溶液的pH值。第4步，凍干法制備胰島素口腔粘附片。將胰島素混合溶液倒入模具中，-20°C冰 箱預(yù)凍24h，然后凍干24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到胰島素口腔粘附片粘附層。接 著，在其上面涂抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇或者制備)，室溫下 放置至無水乙醇完全蒸發(fā)，即得到口腔粘附雙層片，置于干燥器皿中4°C冰箱保存。第5步，測定胰島素口腔粘附片的粘附力和體外釋放度。第6步，胰島素口腔粘附片藥效學(xué)檢測實施例1篩選促滲透吸收劑采用TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運模型進行促吸收研究。吸去插入式培養(yǎng) 皿上下各室的DMEM培養(yǎng)液，用HBSS緩沖液清洗TR146細胞。然后在上、下腔室分別加入 HBSS溶液，平衡lh后，吸出上室HBSS溶液，加入2mL供試液(含有不同濃度的促滲透吸 收劑)。按設(shè)定時間從下室取樣100 yL，并立即補充等量HBSS溶液。采用色譜方法，進樣 分析，記錄得到的峰面積(A)，計算各時間點胰島素的累積滲透量。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)計算 以下指標(biāo)①胰島素表觀滲透系數(shù)Papp = dQ/dtXl/(AXC0)；②胰島素通過插入式培養(yǎng)皿 (無細胞時)的滲透系數(shù)Pins = dQ/dtXl/(AXCQ)；③胰島素回收率Recovery)= (XKeceiver+XD。n。r+XFilter) X 100/X0 ；④細胞滲透系數(shù)1/Papp= 1/P。+1/Pins ；⑤促吸收增強比率 ER = Pc(enhancer)/Pc(control)。其中dQ/dt表示穩(wěn)態(tài)的滲透速率，A是指滲透面積(cm2)，C0是指 上腔室胰島素的起始濃度，XEeceiver指實驗結(jié)束時下腔室累計的胰島素量，XDonor指實驗結(jié)束 時上腔室剩余的胰島素量，XFiltCT指實驗結(jié)束后插入式培養(yǎng)皿上殘余的胰島素量，Pc指胰島 素通過細胞的滲透系數(shù)，Pins指無細胞時插入式培養(yǎng)皿的滲透系數(shù)，Pc(enhancer)和P。(。。ntraU分 別指NAC存在和不存在時，胰島素跨越細胞TR146的細胞滲透系數(shù)。結(jié)果見圖1、圖2、圖3、 圖4、圖5、圖6、表1。圖1為不同濃度N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細 胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。從圖中可以看出，10%、5% NAC均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜上皮 細胞的滲透轉(zhuǎn)運，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，且其促吸收作用具有明顯的濃度依賴性。圖2為不同濃度一氧化氮供體硝普鈉(SNP)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞 滲透轉(zhuǎn)運的影響。從圖中可看出，5%、1% SNP均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜上皮細胞的 滲透轉(zhuǎn)運，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。圖3為不同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透 轉(zhuǎn)運的影響。從圖中可看出，5% GSH均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜上皮細胞的滲透轉(zhuǎn) 運，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。圖4為不同濃度L-精氨酸(Arg)對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運 的影響。從圖中可看出，5% Arg均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜上皮細胞的滲透轉(zhuǎn)運，與 對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。圖5為不同濃度殼聚糖(CS)、殼聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。從圖中可看出，5% CS,5% CS/1 % Azone,5% CS/5% Azone均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜上皮細胞的滲透轉(zhuǎn)運，與對照組相比具有統(tǒng) 計學(xué)差異。圖6為不同濃度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵 磷脂(SPC)/殼聚糖(CS)混合物對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。從 圖中可看出，5% SPC,5% SPC/1% Azone,5% SPC/1% CS均可顯著促進胰島素經(jīng)口腔粘膜 上皮細胞的滲透轉(zhuǎn)運，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。表1為各促滲透吸收劑對胰島素經(jīng)TR146 口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運的影響。實施例2促滲透吸收劑的細胞毒作用用指數(shù)增長期的TR146細胞，制備2 X 104cells/mL單細胞懸液，每孔100 u L接種 于96孔板。48h后補充培養(yǎng)液80 u L，然后給予20 y L不含胰島素的供試液，供試液制備方 法同2. 2。孵育48h后，進行MTT檢測，檢測波長490nm。以未被處理的細胞酶活性為100%， 計算供試液處理過的細胞酶活性。計算公式相對酶活性(％) = (ODrOD^/^-OD^^D! 是指用供試液處理過的細胞0D值，0D2是指沒有細胞僅有供試液的0D值，0D3指未處理過 的細胞0D值，0D4是指無細胞無供試液時空白孔的0D值。本實驗每組重復(fù)6孔。結(jié)果見表 2。表2為不同濃度的各促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響。從表中可以 看出，SDC、Arg 組、5% Gin、Azone、SDC、SNP、Arg 組禾口 5% CS/5% Azone 混合組均顯著 降低TR146細胞的相對酶活性，與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異。其余各組細胞相對酶活性 變化不大，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，表明對TR146細胞的毒性較小，可作為安全有效地 促滲透吸收劑用于藥物制劑的研發(fā)。實施例3胰島素口腔粘附片的制備胰島素口腔粘附片的處方組成(mg/片) 按照表中處方設(shè)計，將各種輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放入-20°C冰 箱預(yù)凍24h，然后用冷凍干燥機凍干24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到胰島素口腔粘附 片粘附層。接著，在其上面涂抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇制備)， 室溫下放置至無水乙醇完全蒸發(fā)，即得到胰島素口腔粘附雙層片，置于干燥器皿中4°C冰箱 保存。制備流程見圖7。圖7為胰島素口腔粘附雙層片的制備方法示意圖。圖8為胰島素口腔粘附雙層片的掃描電鏡照片。如圖8C所示，胰島素口腔粘附雙 層片具有多孔狀結(jié)構(gòu)，這與傳統(tǒng)藥片的致密非孔狀結(jié)構(gòu)相比，有顯著的差異。粘附層表面孔 徑直徑在30iim-120iim之間(見圖8A)，內(nèi)部孔徑直徑較為均一，約150 y m。防水層乙基
9纖維素和粘附層緊密結(jié)合，有效封閉了粘附層表面的孔狀結(jié)構(gòu)，使胰島素單向釋放成為可 能(如圖8B所示)。實施例4胰島素口腔粘附片體外粘附力、體外溶脹率、體外釋放度的測定采用自制裝置測定粘附力，選用雞蛋殼膜作為生物膜材，取新鮮生雞蛋傾出內(nèi)容 物后小心剝?nèi)ネ饷娴挠矚?，所得的新鮮雞蛋殼膜即可作為供試膜材。所測粘附力結(jié)果見表 3。取各處方粘附片6片，放入溶出度儀的轉(zhuǎn)籃中，稱定各初始重量^。然后，把轉(zhuǎn)籃 放入900mL人工唾液的溶出杯中，用水浴保持恒溫37士0. 1°C，轉(zhuǎn)速lOOr/min。于開始實驗 后0. 5、1、2、3、4、6、8h時取出，用濾紙吸干網(wǎng)籃周圍的水分，稱量重量W，計算不同時間各粘 附片的溶脹百分率。溶脹百分率Ep的計算公式為Ep= [(W-WJ/WJXIOO^。以溶脹百分 率Ep對時間t進行線性回歸計算溶脹速率。所測體外溶脹率見表4。將待測處方片劑按中國藥典(2005年版II部附錄XC)規(guī)定的槳法進行實驗。溫 度為(37士0. 5) °C，溶出介質(zhì)為lOOmL人工唾液，轉(zhuǎn)速100r/min，于0. 5、1、2、4、6、8、10h定 時取樣lmL，濾過同時立即補加等量同溫溶出介質(zhì)。取出的樣品液于214nm處測定吸收度， 用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算累積釋放度。所測體外釋放度見圖9。表3為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外粘附力。表4為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外溶脹率。圖9為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外釋放度。 表1.各促滲透吸收劑對胰島素滲透吸收的影響(x士s，n = 3)
與對照組相比*P < 0. 05
表2.促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響(x士s，n = 6)
與對照組相比*P < 0. 05
表3.胰島素口腔黏附片體外黏附力(x士s，n = 3)
表4.胰島素口腔黏附片的體外溶脹百分率和溶脹速率(x士s，n = 3)
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經(jīng)口腔粘膜遞藥的藥劑組方及制備方法和應(yīng)用。此種藥劑由下列組分組成多肽、蛋白類藥物、促滲透吸收劑、生物黏附劑、蛋白酶抑制劑、添加劑。此種藥劑是具有粘附層、防水層的口腔粘附雙層片，制備工藝為冷凍干燥法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所述的多肽和蛋白類藥物，可為天然提 取、人工合成、基因重組的各種分子量的多肽和蛋白類藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促滲透吸收劑，其特征在于所述的促滲透吸收劑為①藥物 及食物成分類，包括N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、滅特復(fù)星、18- 0 -甘草次酸(GA)、刺嫩芽 中的皂苷類成分、辣椒素、啤酒花提取物、毛果槭及高良姜；②小分子肽類，包括蜂毒素、產(chǎn) 氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)、酪蛋白磷酸肽(CPPs)、霍亂孤菌編碼的第二毒素Zot毒素、還原 型谷胱甘肽(GSH)、跨膜蛋白occludin的兩個胞外泮多肽及脂肽類衍生物如C14-0P9(l_1(l3及 人工合成的短肽；③殼聚糖及其衍生物類；④一氧化氮供體，包括硝普鈉(SNP)、L-精氨酸 (L-Arg)、N0C5和N0C12 ；⑤膽酸鹽類，包括脫氧膽酸鈉(SDC)、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉； ⑥脂肪酸及其衍生物，包括肉豆蔻酸酯，月桂酸酯、軟脂基肉毒堿；⑦螯合劑，包括水楊酸 鈉、EDTA ；⑧表面活性劑，包括合成表面活性劑如月桂基硫酸鈉、各種烷基糖苷，非離子型表 面活性劑如月桂氮酮(Azone)、月桂醇聚醚_9、月桂醇聚醚-4、吐溫80、吐溫20、PEG_8月桂 酸酯、PEG-4月桂酸酯、甘油單月桂酸酯、4-椰纖維烷基嗎啉衍生物；⑨其他，包括大豆卵磷 脂(SPC)、糖酯、月桂醯胺丙基甜菜堿、磷脂酰肌醇、磷酸卵磷酯、氨基己酸、聚丙烯酸、透明 質(zhì)酸酶、軟骨素酶、卵清酸、環(huán)糊精等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物粘附劑，其特征在于所述的生物粘附劑分為天然高分 子材料明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物等，合成高分子材料丙烯酸聚合 物卡波姆、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶抑制劑為抑酞酶(屈來塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤霉 素、牛膽酸鈉鹽和芐澤35。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加劑為矯味劑、著色劑、抗氧劑、抑菌劑。所述的矯味劑為 薄荷醇、木糖醇、山梨醇。所述的著色劑分為天然著色劑辣椒紅、甜菜紅、紅曲紅、胭脂蟲紅、 高粱紅、葉綠素銅鈉、姜黃、桅子黃、胡蘿卜素、藻藍素、可可色素、焦糖色素；合成色素胭脂 紅、莧菜紅、日落黃、赤蘚紅、檸檬黃、新紅、靛藍、亮藍、二氧化鈦(白色素)。所述的抗氧劑 為生育酚，2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚。所述的抑菌劑為尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的制備方法，其特征在于所述 的粘附片為雙層結(jié)構(gòu)，所述的制備方法為冷凍干燥法。生產(chǎn)過程稱取并且過篩材料，將各種 輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放入-20°C冰箱預(yù)凍24h，然后凍干24h，去除溶液 中的溶劑成分，即得到口腔粘附片粘附層。接著，在其上面涂抹防水層，防水層為10%乙基 纖維素溶液(用無水乙醇或者制備)，室溫下放置至無水乙醇完全蒸發(fā)，即得到口腔粘附雙 層片，置于干燥器皿中4°C冰箱保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)所制 備藥物的不同，可用于多種疾病的治療，長期用藥，安全可靠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經(jīng)口腔粘膜遞藥的藥劑組方及制備方法和應(yīng)用。此種藥劑由下列組分組成多肽、蛋白類藥物、促滲透吸收劑、生物黏附劑、蛋白酶抑制劑、添加劑。此種藥劑是具有粘附層、防水層的口腔粘附雙層片，制備工藝為冷凍干燥法。此種藥劑適于各種蛋白、多肽類藥物。其要解決的關(guān)鍵問題是提高多肽、蛋白類藥物經(jīng)口腔粘膜吸收的生物利用度，增加多肽、蛋白類藥物制劑的穩(wěn)定性，為開發(fā)新型多肽、蛋白類藥物非注射給藥制劑奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A61K38/02GK101843595SQ200910023349
公開日2010年9月29日 申請日期2009年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者侯征, 周穎, 孟靜茹, 羅曉星, 薛小燕, 陳瑛瑛 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)