專(zhuān)利名稱(chēng)：修飾的il-4突變蛋白受體拮抗劑的制作方法
修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及與非蛋白聚合物如聚乙二醇偶聯(lián)的IL-4突變蛋白受體拮抗劑。另外， 提供了用于治療目的的相關(guān)配制物、其給藥劑量和給藥方法。這些修飾的IL-4突變蛋白受 體拮抗劑以及有關(guān)的組合物和方法用于給患有嚴(yán)重哮喘、慢性阻塞性肺疾病和相關(guān)肺病癥 的個(gè)體提供治療選擇。背景信息哮喘的特征是可變的可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性(airway hyper-responsiveness (AHR))，與活化的T-淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)支氣 管粘膜相關(guān)。這些細(xì)胞和駐留的氣道肥大細(xì)胞一起分泌多種細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)子，它們?cè)诩?病發(fā)病機(jī)理中起到基礎(chǔ)性的作用。據(jù)認(rèn)為，CD4+Th2細(xì)胞通過(guò)釋放特定的細(xì)胞因子(IL-4、 IL-5、IL-9和IL-13)而引起疾病過(guò)程(1，2)。具體而言，Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13被認(rèn) 為對(duì)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)展和維持是至關(guān)重要的。許多體內(nèi)研究也支持IL-4和IL-13在哮喘發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵作用。應(yīng)用任一細(xì)胞 因子缺陷的動(dòng)物，或抑制IL-4或IL-13功能的試劑，觀(guān)察到了這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)初次免 疫應(yīng)答和二次免疫應(yīng)答中的重要作用，所述免疫應(yīng)答導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高_(dá)反應(yīng)性(3， 4)。經(jīng)日積月累，這些數(shù)據(jù)表明，IL-4和IL-13在過(guò)敏性氣道應(yīng)答中起重疊和獨(dú)立的作用， 以及靶向這兩種細(xì)胞因子相對(duì)于單獨(dú)靶向任一細(xì)胞因子具有明顯增加的益處。文獻(xiàn)中曾報(bào)道過(guò)IL-4的拮抗劑。起拮抗劑作用的IL-4突變體包括IL_4拮 ^lJ ^ ^ S S IL-4/Y124D (Kruse, N.，等，Conversion of human interleukin-4into
a highaffinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11 3237-44,1992)和雙突變蛋白 IL-4[R121D/Y124D](Tony, H.，等，Design of Human Interleukin-4Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleu kin-13-dependentresponses in T—cells and B—cells with high efficiency, Eur. J. Biochem. 225 =659-664 (1994)) 單個(gè)突變蛋白是由天冬氨酸在D-螺旋中位置124處替 代酪氨酸。雙突變蛋白是由天冬氨酸分別在D-螺旋中位置121和位置124處替代精氨酸 和酪氨酸。D-螺旋這部分的變異與第二結(jié)合區(qū)相互作用的變化呈正相關(guān)。顯示野生型IL-4激動(dòng)作用或拮抗作用的IL-4突變變體對(duì)于治療與IL_4多效效 應(yīng)之一相關(guān)的病癥是有用的。例如，IL-4的拮抗劑在治療由于IL-4產(chǎn)生而加劇的病癥中 是有用的，所述病癥諸如哮喘、過(guò)敏或其它炎癥反應(yīng)相關(guān)的病癥。IL-4的拮抗劑對(duì)于治療其 中IL-4的存在與疾病的改善或緩解相關(guān)的病癥是有用的，所述疾病例如自身免疫性疾病， 如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病等。這些自身免疫性疾病的特征是在 T輔助細(xì)胞群，1型和2型(Thl，Th2)產(chǎn)生中的極化。幼稚⑶4+T細(xì)胞根據(jù)刺激過(guò)程中所存 在的細(xì)胞因子而分化成Thl或Th2亞群。IL-4激動(dòng)劑理想地轉(zhuǎn)換產(chǎn)生期望的T輔助細(xì)胞， 即，轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生Th2，從而具有治療效果。
PCT/US93/03613公開(kāi)了這樣的IL-4變體，所述IL-4變體在α -螺旋結(jié)構(gòu)域中具 有Phe-Leu或Tyr-Leu序列和緊接著在Phe-Leu或Tyr-Leu序列上游或下游的兩個(gè)氨基酸 中具有帶負(fù)電荷的氨基酸，該變體由于中性氨基酸替代了帶負(fù)電荷的氨基酸而具有對(duì)IL-4 受體增加的親合性。其還公開(kāi)了 IL-4的α-螺旋中Trp-Leu或Phe-Leu在帶負(fù)電荷殘基 的2-殘基中的特定替代導(dǎo)致親合性提高。該變體是IL-4融合蛋白(具有白喉毒素)。在其氨基酸序列的兩個(gè)位置中突變的、來(lái)源于人IL-4的重組突變蛋白(IL-4RA) 先前在美國(guó)專(zhuān)利第6，028，176號(hào)和第6，313，272中進(jìn)行了報(bào)道。IL-4RA以高親合性與人 IL-4受體α鏈一IL-4和IL-13受體復(fù)合物的重要的功能信號(hào)傳導(dǎo)組分——結(jié)合。該突 變蛋白沒(méi)有激動(dòng)劑活性，并且起體外有效的競(jìng)爭(zhēng)性IL-4和IL-13受體拮抗劑的作用(參見(jiàn) 美國(guó)專(zhuān)利第6，028，176號(hào)和第6，313，272號(hào))。應(yīng)用IL-4RA的明顯缺點(diǎn)是其體內(nèi)半衰期相 對(duì)短(大約3-6hrs)。IL-4RA在靈長(zhǎng)類(lèi)哮喘模型中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)/藥物動(dòng)力學(xué)建模表 明，最佳治療效果的有效平均穩(wěn)態(tài)濃度是大約60ng/ml。一種克服半衰期短的方法是頻繁給予患者IL-4RA突變蛋白，然而頻繁給藥(常常 通過(guò)注射或氣管插管)產(chǎn)生臨床上非常明顯的患者接受治療和治療性給藥的障礙。發(fā)明概述本發(fā)明提供半衰期比先前報(bào)道的突變蛋白大的IL-4RA突變蛋白。本發(fā)明還提供 抑制IL-4和IL-13介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的藥劑和方法。本發(fā)明的這一方面和其它方面由下面 列出的一種或更多種實(shí)施方式提供。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的純化制劑，其 包含與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白聚合物偶聯(lián)的IL-4突變蛋白受體拮 抗劑。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，所述純化制劑包含修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑多 肽，該多肽包含SEQ ID NO :32中列出的氨基酸序列。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，所述純化 制劑包含修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑多肽，該多肽包含SEQ ID NO 33中列出的氨基 酸序列。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，所述聚乙二醇(PEG)是線(xiàn)性的或支化的并且具有范 圍從3kD至50kD的分子量。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PEG部分約40kD。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑多肽可以在IL-4的位置 28、36、37、38、104、105或106的氨基酸殘基處與非蛋白聚合物偶聯(lián)。這些位置根據(jù)野生型 IL_4(即人白介素-4)氨基酸序列進(jìn)行編號(hào)。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，在位置28、36、37、 38、104、105或106處的氨基酸殘基是半胱氨酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，在位置121、 124和125處的氨基酸殘基是天冬氨酸。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，在位置13處的氨基 酸殘基是天冬氨酸以及在位置121和124處的氨基酸殘基是天冬氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的修飾的突變蛋白受體拮抗劑以約0. InM至約10 μ M、 約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的Kd與IL-4受體α鏈結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑以約0. InM至約10μΜ、15 約0. 5ηΜ至約1. 0 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC50抑制TF-I細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答。在又一實(shí)施方式中，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑以選自約0. InM至約10 μ Μ、 約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑制TF-I細(xì)胞對(duì)IL-13的增殖應(yīng)答。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑以選自約0. InM至約 10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1. 0 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC50抑制人B細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)
5答。在另一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑以選自約0. InM至約 10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ Μ、約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑制人T細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑具有為未修飾的 IL-4受體拮抗劑血漿半衰期的至少約2-10倍的血漿半衰期。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含(a)與人IL-4受體結(jié)合的修飾的IL_4突變蛋 白受體拮抗劑；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供純化的多核苷酸，其包含(a) SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID N0:31 中列出的 核苷酸序列；或(b)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO 10, SEQ ID NO=IU SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ IDNO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 32或SEQ ID NO 33中列出的氨基酸序列。本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸；和包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿 主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供制備修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的方法，其包括如下步 驟(a)在表達(dá)拮抗劑的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；以及(b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化所述 拮抗劑。在具體的方面，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的拮抗劑可以抑制IL-4和IL-13介導(dǎo)的活性并 且與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白聚合物偶聯(lián)。本發(fā)明還提供治療與IL-4和IL-13活性增強(qiáng)相關(guān)的人類(lèi)病癥的方法，其包括如下 步驟(a)提供患有IL-4和IL-13活性增強(qiáng)的病癥的人；以及(b)給予所述人有效量的本發(fā) 明修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑或本發(fā)明的藥物組合物。在一方面，所述病癥是哮喘、 慢性阻塞性肺疾病(如肺氣腫或慢性支氣管炎)或相關(guān)的肺部病癥。本發(fā)明還提供制備活性形式的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的方法、由所述 方法制備的拮抗劑、包含所述拮抗劑的組合物和包含給予所述拮抗劑和包含所述拮抗劑的 藥物組合物的治療人病癥的方法。所述方法包括如下步驟(a)在表達(dá)拮抗劑的條件下培 養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；(b)使所述拮抗劑在二硫蘇糖醇存在的情況下重折疊；以及(C)從宿主細(xì) 胞培養(yǎng)物中純化所述拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟(d)將所 述拮抗劑與非蛋白聚合物偶聯(lián)；以及(e)純化與非蛋白聚合物偶聯(lián)的拮抗劑。從下面對(duì)某些優(yōu)選實(shí)施方式更加詳細(xì)的描述和權(quán)利要求看，本發(fā)明的具體優(yōu)選實(shí) 施方式將變得明顯。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了 PEG化反應(yīng)化學(xué)的圖示。圖2是顯示IL-4雙突變蛋白(IL-4DM)與在位置38C處具有30kD線(xiàn)性或40kD支 化PEG的相同分子相比與IL-4Rci結(jié)合的BIAcore數(shù)據(jù)的圖表。 圖3是顯示用IL-4刺激抑制TF-1生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)的圖表，其揭示了 PEG化的 IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)比 PEG 化的 IL-4DM 更有效并且等于 IL_4DM(R121D/Y124D)的
有效性。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其包含與非蛋白聚合物、優(yōu)選聚乙二醇分子偶聯(lián)的IL-4突變蛋白受體。除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)以及復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。本文使用的節(jié)段標(biāo)題僅僅是為了組織目的，并不被解釋為限制所描述的主題。本 申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用明確并入本文。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸序列，，或“核酸分子”指DNA或RNA序列。該術(shù)語(yǔ)包括 由DNA和RNA的任意已知堿基類(lèi)似物形成的分子，所述堿基類(lèi)似物諸如但不限于4-乙?；?胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮雜環(huán)丙基_胞嘧啶、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、 5_ (羧基羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧 基-甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基 假尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基-鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌 呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、 5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β -D-甘露糖基辮苷(marmosylqueosine)、5'-甲氧 基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-5N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧 代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2_硫代胞 嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧代 乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸、假尿嘧啶、辮苷、2-硫代胞嘧啶和2，6_氨基嘌呤。術(shù)語(yǔ)“純化的”或“分離的”多核苷酸指這樣的本發(fā)明核酸分子，所述核酸分子(1) 當(dāng)總核酸與來(lái)源細(xì)胞分離時(shí)與至少約50%的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)或與其一起天然發(fā)現(xiàn)的其 它物質(zhì)分離，(2)不與自然界中“分離的核酸分子”連接的全部或部分多核苷酸連接，(3)與 自然界中其不連接的多核苷酸可操作地連接，或(4)不作為較大的多核苷酸序列的一部分 出現(xiàn)在自然界中。優(yōu)選本發(fā)明的分離的核酸分子基本上不含任意其它污染核酸分子(或多 個(gè))或在其自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其它污染物，所述其它污染物將干擾分離的核酸分子在多肽 生產(chǎn)中的應(yīng)用或分離的核酸分子的治療、診斷、預(yù)防或研究應(yīng)用。如本文所用，“野生型IL-4”或“wtIL-4”和其等價(jià)物可互換使用，意即人白細(xì)胞介 素-4——天然的或重組的，具有129個(gè)通常出現(xiàn)的天然人IL-4氨基酸序列，如在美國(guó)專(zhuān)利 第5，017，691號(hào)中所公開(kāi)的，通過(guò)引用并入本文。進(jìn)一步，本文描述的修飾的人IL-4受體 拮抗劑可以具有各種插入和/或刪除和/或與非蛋白質(zhì)聚合物偶聯(lián)，并且按照wtIL-4進(jìn)行 編號(hào)，意即所選擇的具體氨基酸是在wtIL-4中通常存在的相同氨基酸。因此，本領(lǐng)域技術(shù) 人員將會(huì)理解，在位置，例如第13位(蘇氨酸)、第121位(精氨酸)和/或第124位(酪 氨酸)處通常出現(xiàn)的氨基酸，可以在突變蛋白中被轉(zhuǎn)換。因而，半胱氨酸殘基在氨基酸位置 如第38位、第102位和/或第104位處的插入可以在突變蛋白上轉(zhuǎn)換。然而，轉(zhuǎn)換的絲氨 酸(S)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)或插入的半胱氨酸(C)的位置可以通過(guò)檢查和關(guān)聯(lián)這些側(cè) 翼氨基酸與wtIL-4中那些在絲氨酸、精氨酸、酪氨酸或半胱氨酸側(cè)翼的氨基酸確定。進(jìn)一步，編碼人IL-4或突變?nèi)薎L-4蛋白的DNA序列可以包括或不包括編碼信號(hào) 序列的DNA序列。這種信號(hào)序列，如果存在，應(yīng)該是被選擇用于表達(dá)IL-4突變蛋白的細(xì)胞 所識(shí)別的信號(hào)序列。其可以是原核的、真核的或是兩者組合。其也可以是天然IL-4的信號(hào) 序列。信號(hào)序列的包含取決于是否期望從制備IL-4突變蛋白的重組細(xì)胞中分泌出IL-4突 變蛋白。如果所選擇的細(xì)胞是原核的，一般優(yōu)選DNA序列不編碼信號(hào)序列但包括N-末端甲 硫氨酸以指導(dǎo)表達(dá)。如果所選的細(xì)胞是真核的，一般優(yōu)選編碼信號(hào)序列，并且最優(yōu)選被使用
7的是野生型IL-4信號(hào)序列，如在美國(guó)專(zhuān)利第6，028，176號(hào)中所公開(kāi)，其通過(guò)引用而并入本文。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“突變的人IL-4蛋白”、“修飾的人IL-4受體拮抗劑”、“mhIL_4”、 “IL-4突變蛋白”、“IL-4拮抗劑”和其等同物可互換使用，并在發(fā)明的范圍之內(nèi)。這些多肽 和其功能片段是指其中已經(jīng)對(duì)成熟人IL-4蛋白進(jìn)行特定氨基酸置換的多肽。這些多肽包 括本發(fā)明的mIL-4組合物，其被給予需要治療哮喘的對(duì)象。具體而言，本發(fā)明的mhIL-4至 少包括 R121D/Y124D 置換對(duì)(“IL-4RA”)(SEQID NO 31)。如本文所用，“功能片段”是具有IL-4拮抗活性的多肽，包括更小的肽。mhIL-4和 hIL-4修飾的這些和其他方面在美國(guó)專(zhuān)利編號(hào)第6，335，426 ；6, 313，272 ；和6，028，176，號(hào) 中描述，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用而并入本文。通過(guò)“根據(jù)野生型IL-4編號(hào)”我們的用意是，參考在野生型IL-4中氨基酸通常出 現(xiàn)的位置來(lái)鑒定所選的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“載體(vector) ”用來(lái)指用于將編碼信息傳遞到宿主細(xì)胞的任意分子(例如， 核酸、質(zhì)?；虿《?。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指適于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且含有指導(dǎo)和/或控制插入的異源核酸 序列表達(dá)的核酸序列的載體。表達(dá)包括但不限于諸如轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪接——如果內(nèi)含 子存在——的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”在本文中用來(lái)指已經(jīng)用核酸序列轉(zhuǎn)化或能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化，然 后表達(dá)選擇的感興趣的基因的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括母細(xì)胞的子代——只要選擇的基因存在， 不論子代的形態(tài)學(xué)或遺傳組成是否與原母代相同。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”用來(lái)指通常利用噬菌體將基因從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移至另一細(xì)菌。“轉(zhuǎn)導(dǎo)” 還指通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得和轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞序列。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用來(lái)指細(xì)胞對(duì)外來(lái)(foreign)或外源DNA的吸收，以及當(dāng)外源DNA 導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)細(xì)胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)在本領(lǐng)域中是周知的并且公開(kāi)在本文 中。參見(jiàn)，例如 Graham 等 1973，Virology 1052 456 ；Sambrook 等，MolecularCloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories, 1989) ；DavisBasic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986)；以及 Chu 等，1981，Genel3 :197。這些技術(shù)可以 用來(lái)將一個(gè)或更多個(gè)外源DNA部分導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指細(xì)胞遺傳特性的改變，以及當(dāng)細(xì)胞被修飾來(lái)含有新DNA 時(shí)該細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。例如，在從細(xì)胞的天然狀態(tài)遺傳修飾細(xì)胞時(shí)該細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)染 或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化DNA可以通過(guò)物理方法整合入細(xì)胞染色體而與細(xì)胞的DNA重組，可以作為附 加體元件被瞬時(shí)保持而不被復(fù)制，或可以作為質(zhì)粒獨(dú)立復(fù)制。當(dāng)DNA與細(xì)胞的分裂一起被 復(fù)制時(shí)認(rèn)為該細(xì)胞已經(jīng)被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。如本領(lǐng)域中所知，術(shù)語(yǔ)“同一性”指通過(guò)比較序列所測(cè)定的、兩個(gè)或更多個(gè)多肽分 子序列或兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”還意指，根據(jù)具體 情況，通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列或兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的字串(string)之間的 匹配所測(cè)定的、核酸分子或多肽之間序列關(guān)聯(lián)的程度?！巴恍浴庇镁唧w數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī) 程序(即，“算法”)提供的空位比對(duì)(如果有)度量較小的兩個(gè)或更多個(gè)序列之間相同匹 配的百分比。
術(shù)語(yǔ)“相似性”是與“同一性”相關(guān)的概念，但與“同一性”相比，“相似性”指關(guān)聯(lián) 性度量，其包括相同匹配和保守置換匹配。如果兩個(gè)多肽序列具有例如10/20相同的氨基 酸，并且其余全部是非保守置換，那么同一性和相似性百分比都是50%。如果在相同的實(shí)例 中有五個(gè)以上存在保守置換的位置，那么同一性百分比還是50%，但相似性百分比是75% (15/20)。因此，在存在保守置換的情況下，兩個(gè)多肽之間的相似性百分比將高于那兩個(gè)多 肽之間的同一性百分比。相關(guān)核酸和多肽的同一性和相似性可以容易地通過(guò)已知方法進(jìn)行計(jì)算。這些方 法包括但不限于描述在 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk，Α. Μ.，ed.)，1988， Oxford University Press,New York ；BI0C0MPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W.，ed.)，1993，AcademicPress, New York ；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,Part 1, (Griffin,Α. Μ. ,and Griffin,H. G. ,eds.), 1994, Humana Press,New Jersey ； von Heinje， G. ， SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY,1987， Academic Press ； SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J.，eds. )，1991，M. Stockton Press, New York ；Carillo 等，1988，SIAM J. Applied Math. ,48 1073 ；以及 Durbin 等， 1998，BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge UniversityPress 中的那些方法。測(cè)定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計(jì)來(lái)給出測(cè)試序列之間的最大匹配。測(cè)定同一性的方 法描述在可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)程序中。測(cè)定兩個(gè)序列之間同一性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法 包括但不限于GCG程序包，所述GCG程序包包括GAP (Devereux等，1984，Nucl. Acid. Res.， 12 387 ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)、BLASTP> BLASTN 和 FASTA(Altschul 等，1990，J. Mol Biol, 215 :403_410)。BLASTX 程序可從國(guó)家生 物技術(shù)信息中心(NCBI)和其它來(lái)源(BLAST Manual,Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ;Altschul等，1990，supra)公開(kāi)獲得。周知的Smith Waterman算法也可以用來(lái) 測(cè)定同一性。用于比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列的某些比對(duì)方案可以導(dǎo)致僅這兩個(gè)序列的短區(qū)域匹配， 并且該小比對(duì)區(qū)域可以具有非常高的序列同一性——即使在這兩個(gè)全長(zhǎng)序列之間沒(méi)有明 顯的關(guān)系。因此，在某些實(shí)施方式中，選擇的比對(duì)方法(GAP程序)將導(dǎo)致跨越靶多肽的至 少50個(gè)連續(xù)氨基酸的比對(duì)。例如，應(yīng)用計(jì)算機(jī)算法GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)，比對(duì)待測(cè)定序列同一性百分比的兩個(gè)多肽，以對(duì)它們各自的氨基 酸進(jìn)行最優(yōu)匹配(通過(guò)算法所測(cè)定的“匹配跨度(matched span) ”)。在某些實(shí)施方式中，空 位開(kāi)放罰分(其被計(jì)算為三倍的平均對(duì)角線(xiàn)；其中“平均對(duì)角線(xiàn)”是使用的比較矩陣的對(duì)角 線(xiàn)的平均；“對(duì)角線(xiàn)”是具體的比較矩陣賦予每一完美氨基酸匹配的分?jǐn)?shù)或數(shù)字)和空位延 伸罰分(其通常是空位開(kāi)放罰分的十分之一)以及比較矩陣如PAM250或BLOSUM 62結(jié)合算 法一起應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(參見(jiàn)Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure,5 :345_352for thePAM 250comparison matrix ;Henikoff 等， 1992,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 :10915_10919 for the BLOSUM 62comparison matrix) 也被算法所使用。在某些實(shí)施方式中，用于多肽序列比較的參數(shù)包括如下算法Needleman等，1970，J. Mol Biol,48 443-453 ；
比較矩陣=Henikoff 等，1992，supra 中的 BLOSUM 62 ；空位罰分12空位長(zhǎng)度罰分4相似性的閾值0GAP程序可以與上述參數(shù)一起使用。在某些實(shí)施方式中，上述參數(shù)是應(yīng)用GAP算法 的多肽比較的默認(rèn)參數(shù)(以及對(duì)末端空位無(wú)罰分)。如本文所用，20種常規(guī)氨基酸和它們的縮寫(xiě)遵循常規(guī)的應(yīng)用。參見(jiàn)IMMUN0L0GY-A SYNTHESIS,2nd Edition, (Ε. S.Golub and D. R. Gren, Eds.), Sinauer Associates Sunderland, MA，1991，其通過(guò)引用而并入本文，用于任意目的。20種常規(guī)氨基酸的立體異 構(gòu)體(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和 其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的適合組分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4_羥脯氨 酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴(lài)氨酸、ε-N-乙?；?lài)氨酸、0_磷酸絲氨酸、N-乙 ?；z氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、ο -N-甲基精氨酸和其它類(lèi) 似的氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。在本文使用的多肽符號(hào)中，按照標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用 和協(xié)定，左手方向?yàn)榘被┒朔较蛞约坝沂址较驗(yàn)轸然┒朔较?。天然存在的殘基可以基于常?jiàn)的側(cè)鏈性質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)1)疏水性殘基正亮氨酸(Nor)、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；2)中度親水性殘基Cys、Ser, Thr, Asn、Gln ；3)酸性殘基Asp、Glu ；4)堿性殘基His、Lys、Arg ；5)影響側(cè)鏈取向的殘基Gly、Pro ；以及6)芳香殘基1"印、171·、？!^。保守氨基酸置換可以包括這些種類(lèi)中的一個(gè)成員與相同種類(lèi)中的另一成員的 交換。保守氨基酸置換可以包括非天然存在的氨基酸殘基，所述非天然存在的氨基酸 殘基通常是通過(guò)化學(xué)肽合成而不是通過(guò)生物系統(tǒng)中的合成而被參入。這些包括模擬肽 (peptidomimetics)和氨基酸部分的其它翻轉(zhuǎn)或顛倒形式。非保守置換可以包括這些種類(lèi)中的一個(gè)成員與另一種類(lèi)中的成員的交換。這些置 換的殘基可以引入到與非人蛋白同源的人蛋白的區(qū)域或該分子的非同源區(qū)。在進(jìn)行這些改變的過(guò)程中，根據(jù)某些實(shí)施方式，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。每一 氨基酸在其疏水性和電荷特性的基礎(chǔ)上已經(jīng)被賦予親水指數(shù)。它們是異亮氨酸(+4.5)； 纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸 (+1. 9)；丙氨酸(+1. 8)；甘氨酸(-0. 4)；蘇氨酸(-0. 7)；絲氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪 氨酸("1. 3)；脯氨酸(-1. 6)；組氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸 (-3. 5)；天冬酰胺(-3. 5)；賴(lài)氨酸(-3. 9)；以及精氨酸(-4. 5)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白活性生物功能中的重要性在本領(lǐng)域中是知曉的(參 見(jiàn)，例如，Kyte等，1982，J. Mol. Biol. 157 :105_131)。據(jù)了解，某些氨基酸可以置換成具有 類(lèi)似親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)的其它氨基酸并且仍保持類(lèi)似的生物活性。在基于親水指數(shù)進(jìn)行改變 的過(guò)程中，在某些實(shí)施方式中，包括親水指數(shù)在士2以?xún)?nèi)的氨基酸的置換。在某些實(shí)施方 式中，包括親水指數(shù)在士 1以?xún)?nèi)的氨基酸的置換以及在某些實(shí)施方式中，包括親水指數(shù)在
10士0.5以?xún)?nèi)的氨基酸的置換。在本領(lǐng)域中也知曉的是，相似氨基酸的置換可以在親水性的基礎(chǔ)上有效地進(jìn)行， 尤其是在由此產(chǎn)生的生物學(xué)上的功能蛋白或肽如本文所公開(kāi)意圖用于免疫學(xué)實(shí)施方式的 情況下。在某些實(shí)施方式中，由其鄰近氨基酸的親水性所支配的蛋白質(zhì)的最大局部平均親 水性，與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)相關(guān)。下列親水性值已被賦予這些氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴(lài)氨酸(+3.0)；天冬 氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)； 甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(_0.5士1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨 酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸 (-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于類(lèi)似的親水性值進(jìn)行改變的過(guò)程中，在 某些實(shí)施方式中，包括親水性值在士2以?xún)?nèi)的氨基酸的置換，在某些實(shí)施方式中，親水性值 在士1以?xún)?nèi)的氨基酸的置換，以及在某些實(shí)施方式中，親水性值在士0. 5以?xún)?nèi)的氨基酸的置 換。技術(shù)人員也可以在親水性的基礎(chǔ)上鑒定初級(jí)氨基酸序列的表位。這些區(qū)域也被稱(chēng)為 “表位核心區(qū)(epitopic core regions) ”。示例性氨基酸置換在表1中列出。表1 氨基酸置換 本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以利用熟知技術(shù)確定本文列出的多肽的合適變體。在某些實(shí) 施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以鑒定合適的分子區(qū)域，其可以通過(guò)靶向于被認(rèn)為是對(duì)活 性不重要的區(qū)域而被改變，但不破壞活性。在其它實(shí)施方式中，技術(shù)人員可以鑒定相似的多 肽中保守的分子殘基和部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，甚至對(duì)于生物學(xué)活性或?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)可 能是重要的區(qū)域也可以進(jìn)行保守氨基酸置換而不破壞生物學(xué)活性或沒(méi)有不利地影響多肽 結(jié)構(gòu)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以回顧結(jié)構(gòu)-功能研究，鑒定類(lèi)似多肽中對(duì)活性或結(jié)構(gòu) 重要的殘基。鑒于這樣的比較，技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)蛋白中相對(duì)應(yīng)于類(lèi)似蛋白質(zhì)中對(duì)于活性 或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基之氨基酸殘基的重要性。對(duì)于這種預(yù)測(cè)的重要氨基酸殘基，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以選擇出化學(xué)上相似的氨基酸置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以分析類(lèi)似多肽中的三維結(jié)構(gòu)和與該結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸序 列。根據(jù)這樣的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)與其三維結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽的氨基酸殘基的 排列。在某些實(shí)施方式中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇不要對(duì)經(jīng)預(yù)測(cè)將處于蛋白表面上 的氨基酸殘基進(jìn)行根本性的變化，是因?yàn)檫@樣的殘基可能參與和其它分子的重要相互作 用。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備出在每個(gè)期望的氨基酸殘基處含有單個(gè)氨基酸置換的 測(cè)試變體。然后，應(yīng)用本領(lǐng)域已知的活性測(cè)定篩選變體。這些變體能被用來(lái)收集關(guān)于合適變體的信息。例如，如果技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)一個(gè)特定的氨基酸的改變導(dǎo)致受到破壞的、不期望降低 的、或不適合的活性，那么具有這種改變的變體將被避免。換言之，基于從這類(lèi)常規(guī)實(shí)驗(yàn)中 收集的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定這樣的氨基酸，其中進(jìn)一步的置換應(yīng)被避免， 或者是在單獨(dú)情況下或與其它突變組合時(shí)被避免。大量的科學(xué)出版物已經(jīng)致力于二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。參見(jiàn)Moult，1996，Curr. Op. inBiotech. 7 :422_427 ；Chou 等，1974，Biochemistry 13 :222_245 ；Chou 等 1974， Biochemistry 113 211~222 ；Chou 1978, Adv. Enzymol Relat. Areas Mol. Biol47 45-148 ；Chou 等，1979，Ann. Rev. Biochem. 47 :251_276 ；和 Chou 等，1979，Biophys. J. 26 367-384。而且，計(jì)算機(jī)軟件目前可用來(lái)輔助預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。一種預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法是 基于同源性模型。例如，序列同一性在約30%以上或者序列相似性在40%以上的兩個(gè)多 肽或蛋白質(zhì)，常常具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。最近增大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)增強(qiáng)了二 級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)能力，包括處于多肽的或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)內(nèi)的潛在折疊數(shù)目。參見(jiàn)Holm等， 1999，Nucl. Acid. Res. 27 :244_247。據(jù)認(rèn)為(Brenner 等，1997，Curr. Op. Struct. Biol. 7 369-376)，在一個(gè)給定的多肽或蛋白質(zhì)中存在有限數(shù)目的折疊，并且一旦解析了 5個(gè)結(jié)構(gòu) 的關(guān)鍵數(shù)，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)將會(huì)明顯變得更加精確。預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的其它方法包括“穿引(threading)”(Jones，1997，Curr. Op in. Struct. Biol. 7 :377_87 ；Sippl 等，1996，Structure 4 :15_19)、“序型分析” (Bowie 等， 1991，Science 253 164-170 ；Gribskov 等，1990，Meth.Enzym. 183 :146_159 ；Gribskov 等， 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84 :4355_4358)和“進(jìn)化連鎖(evolutionary linkage) ” (參見(jiàn) Holm, 1999，同上；以及 Brenner, 1997，同上)。在某些實(shí)施方式中，蛋白變體包括糖基化變體，其中糖基化位點(diǎn)的數(shù)目和/或類(lèi) 型與親代多肽的氨基酸序列相比已經(jīng)發(fā)生改變。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)變體包括比天 然蛋白更多或更少數(shù)目的N-聯(lián)接糖基化位點(diǎn)。N-聯(lián)接糖基化位點(diǎn)以序列Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr為特征，其中稱(chēng)為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸之外的任意氨基酸殘基。用 以產(chǎn)生這種序列的氨基酸殘基置換給N-聯(lián)接糖鏈的添加提供了潛在的新位點(diǎn)?？蛇x地，消 除這種序列的置換將會(huì)除去已經(jīng)存在的N-聯(lián)接糖鏈。也提供了 N-聯(lián)接糖鏈的重排，其中 一個(gè)或更多個(gè)N-聯(lián)接糖基化位點(diǎn)(通常是那些天然存在的)被消除，而一個(gè)或更多個(gè)新 的N-聯(lián)接位點(diǎn)產(chǎn)生。另外的優(yōu)選變體包括半胱氨酸變體，其中，與親代氨基酸序列相比，一 個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基被從親代氨基酸序列刪除或被置換為另一種氨基酸(例如絲氨 酸)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)必須重折疊成生物學(xué)上的活性構(gòu)象時(shí)，如不溶性的包含體分離后，半胱氨酸 變體可以是有用的。半胱氨酸變體一般具有比天然蛋白更少的半胱氨酸殘基，并且通常具 有偶數(shù)個(gè)半胱氨酸，以便使由未配對(duì)半胱氨酸所引起的相互作用最小化。在另外的實(shí)施方式中，蛋白變體可以包括突變，如置換、添加、缺失或其任何組 合；并且，其通常根據(jù)本文描述的方法以及本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)，例如Sambrook等， MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,3rd Ed.，2001，Cold Spring Harbor, N. Y. and Berger and Kimmel, METHODS INENZYM0L0GY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc. , San Diego, CA.，通過(guò)弓|用而并入本文)，應(yīng)用一 種或多種誘變寡核苷酸，通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生。根據(jù)某些實(shí)施方式，氨基酸置換是這樣的置換，其(1)降低對(duì)蛋白水解的易感
13性，(2)降低對(duì)氧化的易感性，(3)改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和性，(4)改變結(jié)合 親和性，和/或(5)對(duì)這類(lèi)多肽賦予或改變其它理化或功能性質(zhì)。根據(jù)某些實(shí)施方式， 一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(在某些情況下，保守氨基酸置換)可以在天然存在的序列中 (某些實(shí)施方式中，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))之外的多肽部分中)進(jìn) 行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守氨基酸置換通常基本上不改變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例 如，氨基酸置換不應(yīng)當(dāng)傾向于打破親代序列中存在的螺旋，或者破壞表征親代序列的其它 類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽二級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例在PROTEINS，STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.),1984, ff. H. Freeman and Company, New York ;INTR0DUCTI0NT0 PROTEIN STRUCTURE(C. Branden and J. Tooze, eds.),1991, GarlandPublishing, New York, N. Y.；以及 Thornton 等，1991，Nature 354:105 中進(jìn)行了 描述，其中每一個(gè)通過(guò)引用而并入本文。肽類(lèi)似物作為具有類(lèi)似于模板肽性質(zhì)的非肽藥物常常用在制藥工業(yè)中。這些種 類(lèi)的非肽化合物被稱(chēng)為“肽模擬物(peptide mimetics)”或“模擬肽(p印tidomimetic) ”。 參見(jiàn) Fauchere, 1986，Adv. drug Res. 15 29 ；Veber & Freidinger，1985，TINS p. 392 ；禾口 Evans等.，1987，J. Med. Chem. 30 :1229，它們通過(guò)引用而并入本文，用于任意目的。這些化 合物通常在計(jì)算機(jī)分子建模的輔助下被開(kāi)發(fā)出來(lái)。與有治療上有用的肽在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似的肽 模擬物，可以用來(lái)產(chǎn)生類(lèi)似的治療或預(yù)防效果。一般而言，模擬肽與范例多肽(即，具有生 化性質(zhì)或藥理學(xué)活性的多肽)——如人抗體——結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但卻具有一個(gè)或更多個(gè)這樣的 肽鍵其通過(guò)本領(lǐng)域中周知的方法，被任選地由選自-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH = CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2S0-的連接所替換。在某些實(shí)施方式中， 可以使用相同類(lèi)型的D-氨基酸系統(tǒng)性置換共有序列的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸(如，D-賴(lài)氨 酸替換L-賴(lài)氨酸)，以產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，包含有共有序列或者基本相同的共有序列變 異的受限肽(constrained peptide)可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生(Rizo & Gierasch， 1992，Ann. Rev. Biochem. 61 :387，通過(guò)引用而并入本文，用于任意目的)；例如，通過(guò)添加能 形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基進(jìn)行制備。在本發(fā)明的上下文中，短語(yǔ)“核酸序列”當(dāng)指編碼蛋白、多肽、肽的序列時(shí)，含義包 括編碼同源蛋白、多肽或肽序列以及所公開(kāi)的序列的簡(jiǎn)并核酸序列。(a)修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的特性如本文所用，“修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑”包括描述在美國(guó)專(zhuān)利第 6，028，176號(hào)和第6，313，272號(hào)(通過(guò)引用全部在此并入)中的IL-4RA突變蛋白，該突變 蛋白在成熟IL-4蛋白的一個(gè)或更多個(gè)位置處具有額外的氨基酸置換。示例性三重突變蛋 白(triple muteins)包括但不限于D螺旋中在位置121處天冬氨酸置換精氨酸、在位置 124處天冬氨酸置換酪氨酸和在位置125處天冬氨酸置換絲氨酸；以及D螺旋中在位置13 處天冬氨酸置換蘇氨酸、在位置121處天冬氨酸置換精氨酸和在位置124處天冬氨酸置換 酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，三重突變蛋白進(jìn)一步包含N-端甲硫氨酸。在D-螺旋的這部 分中的變異與在第二結(jié)合區(qū)域處的相互作用的改變正相關(guān)。修飾的IL-4突變蛋白受體拮 抗劑可以進(jìn)一步包括一個(gè)或更多個(gè)置換，其中所述置換能夠使至少一個(gè)非蛋白聚合物，如 聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇(PEG)分子與突變蛋白進(jìn)行位點(diǎn)-特異性偶聯(lián)。PEG的位點(diǎn) 特異性偶聯(lián)，例如，使具有聚乙二醇化(PEG化)分子的益處的修飾突變蛋白產(chǎn)生，即血漿半衰期增加和免疫原性降低同時(shí)相對(duì)于非特異性聚乙二醇化策略，如N-端聚乙二醇化和賴(lài) 氨酸側(cè)鏈聚乙二醇化，保持更大的效力。應(yīng)當(dāng)理解的是，連接的PEG部分的結(jié)構(gòu)在最優(yōu)化本發(fā)明突變蛋白的PEG化中是重 要的。在一個(gè)實(shí)施方式中，PEG部分是線(xiàn)性的。線(xiàn)性PEG部分的大小受制造過(guò)程的限制，是 因?yàn)镻EG- 二醇的量隨著PEG分子量的增加而增加。就線(xiàn)性部分而言，PEG-突變蛋白分子大 小的增加通常通過(guò)增加突變蛋白上PEG連接位點(diǎn)的數(shù)目來(lái)完成。這常常導(dǎo)致次優(yōu)的藥理特 征。在另一實(shí)施方式中，PEG部分從單個(gè)連接位點(diǎn)支化。支化的PEG部分具有增加PEG分 子大小而不增加位點(diǎn)連接的數(shù)目的優(yōu)勢(shì)。因此，在一個(gè)方面，聚乙二醇(PEG)部分具有范圍從約3kD至50kD的分子量。在 一個(gè)實(shí)施方式中，PEG部分為大約40kD。PEG與藥物的共價(jià)連接(也稱(chēng)為“PEG化”)可以 通過(guò)已知的化學(xué)反應(yīng)和/或合成技術(shù)來(lái)完成。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白的PEG化可 以通過(guò)在適合的反應(yīng)條件下使NHS-活化的PEG與突變蛋白反應(yīng)來(lái)完成。在本發(fā)明的另一 個(gè)方面，蛋白的PEG化可以通過(guò)在適合的反應(yīng)條件下使馬來(lái)酰亞胺活化的PEG與蛋白中半 胱氨酸(cytsteine)殘基的巰基(sulhydrylgroup)反應(yīng)來(lái)完成。PEG-突變蛋白偶聯(lián)物可以以三種不同的方式產(chǎn)生可以將單一的大PEG部分連接 在突變蛋白上的單一位點(diǎn)；可以將支化PEG部分(S卩，兩個(gè)或更多個(gè)中間PEG鏈經(jīng)由連接體 連接在一起)連接在突變蛋白上的單一位點(diǎn)；或可以將幾個(gè)小鏈連接在突變蛋白上的多個(gè) 位點(diǎn)。理論上，單位點(diǎn)PEG化的突變蛋白具有更高的活性，是因?yàn)镻EG連接不大可能發(fā)生在 受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域處或其附近。PEG化和其它種類(lèi)的翻譯后修飾(PTM)的改進(jìn)已經(jīng)是廣泛的，并且現(xiàn)在存在大量 本領(lǐng)域中已知的PTM技術(shù)和試劑，以及新的PTM技術(shù)和試劑正在有規(guī)律地被開(kāi)發(fā)。用于PEG 化的技術(shù)和試劑包括，例如(i)專(zhuān)門(mén)的連接體和偶聯(lián)化學(xué)；(ii)支化PEG，其有效地使另外 的PEG基團(tuán)與單一的偶聯(lián)位點(diǎn)連接；(iii)位點(diǎn)特異性PEG化，包括位點(diǎn)特異性單PEG化； 以及(iv)定點(diǎn)酶促PEG化(例如，應(yīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶反應(yīng))。也存在另外的技術(shù)和試劑，其 可從眾多商業(yè)供應(yīng)商獲得(參見(jiàn)，例如Nektar/Shearwater(在萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址nektar. com)、 Sunbio (在萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址 sunbio. com 禾口 sunbio. com/peg-shop)、Celares GmbH(在萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng) 址 celares. com)、NOF Corporation (在萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址 peg-drug, com)以及其它)。還包括在本發(fā)明中的是能使所述分子表達(dá)后正確折疊的氨基酸置換的特異性位 點(diǎn)的選擇。相對(duì)于IL-4RA與IL-4和IL-13結(jié)合的親和力降低，修飾的IL-4突變蛋白受體 拮抗劑與IL-4和IL-13結(jié)合的親和力降低不大于10倍。相對(duì)于IL-4RA抑制IL-4和IL-13 介導(dǎo)的活性的效價(jià)損失，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑抑制IL-4和IL-13介導(dǎo)的活性 的效價(jià)損失不超過(guò)10倍。此外，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑具備比未修飾的IL-4RA 至少長(zhǎng)2至10倍的血漿半衰期。本發(fā)明的IL-4突變蛋白的特征還可以是在一個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn)處的氨基酸插入、 缺失、置換和修飾，所述位點(diǎn)在天然IL-4多肽鏈的其它殘基中或在天然IL-4多肽鏈的其它 殘基處。依照本發(fā)明，任意此類(lèi)插入、缺失、置換和修飾應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致IL-4突變蛋白保持其IL-4 相關(guān)的活性。本發(fā)明的另外方面是提供如實(shí)施例2中所述表達(dá)和重折疊蛋白質(zhì)的方法。IL-4突 變蛋白必須適當(dāng)純化，以便進(jìn)行有效的PEG化。用于純化的示例性方法描述在下面的實(shí)施
15例2中。當(dāng)在巰基保護(hù)劑存在的情況下重折疊突變蛋白時(shí)，共價(jià)二硫鍵在IL-4突變蛋白的 游離半胱氨酸和保護(hù)劑之間形成。相反，巰基保護(hù)劑二硫蘇糖醇(DTT)——其氧化形成穩(wěn) 定的二硫鍵——的應(yīng)用將不與IL-4突變蛋白的游離半胱氨酸形成共價(jià)鍵，從而使其巰基游 離，以與PEG馬來(lái)酰亞胺試劑反應(yīng)。在巰基保護(hù)劑存在的情況下重折疊后純化的IL-4突變 蛋白如果用DTT進(jìn)行處理則可以與PEG試劑反應(yīng)，但卻產(chǎn)生單PEG化產(chǎn)物和多PEG化產(chǎn)物 的混合物，這表明現(xiàn)有的IL-4半胱氨酸也被PEG化?，F(xiàn)有半胱氨酸的PEG化將導(dǎo)致失活的 錯(cuò)折疊產(chǎn)物。修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑與IL-4受體的[[Kd] 可以應(yīng)用本領(lǐng)域中已知 的任意方法進(jìn)行測(cè)定，包括諸如實(shí)施例4中概述的實(shí)時(shí)雙分子相互作用分析(Bimolecular Interaction Analysis(BIA))的技術(shù)。BIA是用于實(shí)時(shí)研究生物特異性相互作用而不用標(biāo) 記任何相互作用物的技術(shù)(例如，BIAcore )。光學(xué)現(xiàn)象表面等離子共振(SPR)的改變可以 被用作生物學(xué)分子之間實(shí)時(shí)反應(yīng)的指示。修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑抑制免疫細(xì)胞增殖應(yīng)答的能力可以應(yīng)用實(shí)施例 5中概述的增殖測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且這種能力被表示為50%抑制濃度(IC5tl)。在BIAcore 測(cè)定中，本發(fā)明的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑以范圍從約LOnM 至約IOOnM的優(yōu)選[[Kd]]Se與人IL-4受體特異性結(jié)合。本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式以大 約0. 5nM至約Ι.ΟμΜ的[[Kd]與人IL-4受體結(jié)合。本發(fā)明的又一更優(yōu)選的實(shí)施方式以 大約0. InM至約Ι.ΟμΜ的[[Kd]]Se與人IL-4受體結(jié)合。另外，本發(fā)明的修飾的IL-4突變 蛋白受體拮抗劑，如所預(yù)想的那樣，將以范圍從約1. OnM至約IOOnM的優(yōu)選IC5tl與人IL-4 受體結(jié)合并且抑制其促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的能力。更優(yōu)選的人拮抗劑以范圍從約0. 5nM至約 1 μ M的IC5tl結(jié)合IL-4受體并且抑制其免疫細(xì)胞增殖能力，以及本發(fā)明的最優(yōu)選的拮抗劑 以大約0. InM至約10 μ M的IC5tl結(jié)合并抑制IL-4受體。本發(fā)明的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的目前的實(shí)施方式還顯示比未修飾的 IL4RA血漿半衰期長(zhǎng)優(yōu)選至少2至10倍的血漿半衰期，以及本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方式顯 示比未修飾的IL4RA血漿半衰期長(zhǎng)10至100倍的血漿半衰期(參見(jiàn)實(shí)施例7)。許多具有上述特性的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑已經(jīng)用上述測(cè)定通過(guò)篩選 候選物而進(jìn)行了鑒定。本發(fā)明的實(shí)施方式具有表2中顯示的多肽序列(SEQ IDNOS 10-16 和 32-33)。表2:多肽序列
SEQ ID NO名稱(chēng)序列9IL-4RA (IL-4DM)MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAA SKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGAT AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLffGLAGLNSCPVKE ANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
16 (b)編碼修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的多核苷酸本發(fā)明還提供編碼修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的多核苷酸。這些多核苷酸 可以，例如，用來(lái)產(chǎn)生大量的拮抗劑用于治療應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼相同的修飾的 IL-4突變蛋白受體拮抗劑的簡(jiǎn)并DNA序列。構(gòu)建和表達(dá)簡(jiǎn)并DNA序列——其能夠作為給定 的多核苷酸序列表達(dá)相同的氨基酸序列——的方法在本領(lǐng)域中是已知的。本發(fā)明的多核苷酸可以以各種方式容易地獲得，包括而不限于化學(xué)合成、cDNA或 基因組文庫(kù)篩選、表達(dá)文庫(kù)篩選和/或cDNA的PCR擴(kuò)增。本發(fā)明描述的重組DNA方法一般是下列中列出的那些=Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)禾口 / 或 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.,Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994)。本發(fā)明提供本文所述的核酸分子和獲得這些分子的方法。一種獲得合適核酸序列的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在該方法中，應(yīng)用酶逆轉(zhuǎn)錄
酶由聚(A)+RNA或總RNA制備cDNA。兩個(gè)引物--通常與修飾的IL-4突變蛋白受體拮
抗劑cDNA的兩個(gè)單獨(dú)的區(qū)域互補(bǔ)——然后與聚合酶如Taq聚合酶一起被添加到cDNA，并且 聚合酶擴(kuò)增這兩個(gè)引物之間的cDNA區(qū)域。制備本發(fā)明核酸分子的另一種手段是化學(xué)合成，所述化學(xué)合成應(yīng)用的是本領(lǐng)域技 術(shù)人員周知的方法，如Engels等，1989，Angew. Chem. Intl. Ed. 28 :716_34描述的那些方法。 這些方法包括用于核酸合成的磷酸三酯、亞磷酰胺和H-磷酸酯方法等等。用于這些化學(xué)合 成的優(yōu)選方法是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)術(shù)的聚合物支持合成。通常，DNA的長(zhǎng)度將是幾百 個(gè)核苷酸。大于約100個(gè)核苷酸的核酸可以應(yīng)用這些方法合成為幾個(gè)片段。然后將所述片 段連接在一起。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法也可以應(yīng)用。可以用來(lái)編碼修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的本發(fā)明的多核苷酸示于表3中 (SEQ ID NO 2-8 禾口 31)。表3:多核苷酸序列 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體和包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞。本發(fā)明的多核苷酸可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。載體通常被 選擇以在使用的具體宿主細(xì)胞中起作用(即，載體與宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)相容，以便基因的擴(kuò)增 和/或基因的表達(dá)可以發(fā)生)。本發(fā)明的多核苷酸可以在原核宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、昆 蟲(chóng)(桿狀病毒系統(tǒng))宿主細(xì)胞和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。宿主細(xì)胞的選擇將取決于各種 因素，諸如期望的病毒水平。對(duì)于表達(dá)載體的評(píng)述，參見(jiàn)Meth. Enz. ,vol. 185 (D. V. Goeddel, ed. , Academic Press 1990)。通常，用在宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體含有用于質(zhì)粒維持的序列和用于外源核苷酸序 列克隆和表達(dá)的序列。這些序列——共同稱(chēng)為“側(cè)翼序列”——在某些實(shí)施方式中通常包 括下列核苷酸序列中的一種或更多種啟動(dòng)子、一個(gè)或更多個(gè)增強(qiáng)子序列、復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄 終止序列、含有供體剪接位點(diǎn)和受體剪接位點(diǎn)的完全內(nèi)含子序列、編碼用于多肽分泌的前 導(dǎo)序列的序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼待表達(dá)核苷酸的核酸的多 聚接頭區(qū)(polylinker region)和可選擇的標(biāo)記元件。這些序列中的每一個(gè)在下面進(jìn)行論 述。側(cè)翼序列可以是同源的(即，來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的物種和/或株系)、異源的 (即，來(lái)自不同于宿主細(xì)胞物種或株系的物種)、雜合的(即，來(lái)自一種以上來(lái)源的側(cè)翼序列 的組合)或合成的，或者側(cè)翼序列可以是通常起調(diào)節(jié)IL-4突變蛋白受體拮抗劑表達(dá)作用的 天然序列。同樣地，側(cè)翼序列的來(lái)源可以是任意原核或真核生物體、任意脊椎生物體或無(wú)脊 椎生物體，或任意植物，條件是側(cè)翼序列在宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)中是有功能的并且可以通過(guò)宿主 細(xì)胞機(jī)構(gòu)活化。可用于本發(fā)明載體的側(cè)翼序列可以通過(guò)本領(lǐng)域中周知的幾種方法中的任意一種 獲得。通常，用在本文中的側(cè)翼序列——除IL-4突變蛋白受體拮抗劑基因側(cè)翼序列外—— 先前已經(jīng)通過(guò)作圖(mapping)和/或限制核酸內(nèi)切酶消化進(jìn)行了鑒定并且可以因此應(yīng)用適 當(dāng)?shù)南拗坪怂醿?nèi)切酶與合適的組織來(lái)源分離。在一些情況下，側(cè)翼序列的全核苷酸序列可 以是已知的。此處，側(cè)翼序列可以應(yīng)用本文中描述的用于核酸合成或克隆的方法來(lái)合成。
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在全部或僅部分側(cè)翼序列已知的情況下，側(cè)翼序列可以應(yīng)用PCR和/或通過(guò)用來(lái) 自相同或另一物種的合適的寡核苷酸和/或側(cè)翼序列片段篩選基因組文庫(kù)來(lái)獲得。在側(cè)翼 序列未知的情況下，含有側(cè)翼序列的DNA片段可以與較大的DNA分離，所述較大的DNA可以 含有，例如編碼序列或甚至另一基因或多個(gè)基因。分離可以通過(guò)下列方法完成限制核酸內(nèi) 切酶消化，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腄NA片段，接著應(yīng)用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen 柱色譜(Chatsworth， CA)或技術(shù)人員已知的其它方法進(jìn)行分離。用以達(dá)到該目的的適合的酶的選擇對(duì)本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員而言將是很明顯的。復(fù)制起點(diǎn)通常是那些商業(yè)購(gòu)得的原核表達(dá)載體的一部分，并且該起點(diǎn)在宿主細(xì)胞 中有助于載體的擴(kuò)增。如果選擇的載體不含有復(fù)制起始位點(diǎn)，則可以基于已知的序列化 學(xué)合成復(fù)制起始位點(diǎn)并且連接到載體中。例如，來(lái)自質(zhì)粒pBR322(NewEngland Biolabs, Beverly, ΜΑ)的復(fù)制起點(diǎn)適用于大部分革蘭氏陰性細(xì)菌以及各種起點(diǎn)(例如，SV40、多瘤、 腺病毒、皰疹性口腔炎病毒(VSV)或乳頭瘤病毒如HPV或BPV)可用于克隆哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 的載體。一般而言，復(fù)制起點(diǎn)組分對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是不需要的(例如，通常僅應(yīng)用 SV40起點(diǎn)，是因?yàn)槠浜性缙趩?dòng)子)。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于多肽編碼區(qū)的3 ‘端并且起終止轉(zhuǎn)錄的作用。通常，原核細(xì) 胞中的轉(zhuǎn)錄終止序列是富含G-C的片段接著聚-T序列。盡管轉(zhuǎn)錄終止序列從文庫(kù)容易地 被克隆或甚至作為載體的一部分商業(yè)購(gòu)得，其也可以應(yīng)用核酸合成的方法如本文描述的那 些容易地進(jìn)行合成?？蛇x擇的標(biāo)記基因元件編碼生長(zhǎng)在選擇培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞生存和生長(zhǎng)必需的 蛋白。通常的選擇標(biāo)記基因編碼這樣的蛋白，所述蛋白(a)賦予原核宿主細(xì)胞對(duì)抗生素或 其它毒素，例如氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素的抗性；(b)補(bǔ)充細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷； 或(c)供給不可從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性基 因、氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。在原核和真核宿主細(xì)胞中，新霉素抗性基因也 可以用于選擇。其它選擇基因可以用來(lái)擴(kuò)增將被表達(dá)的基因。擴(kuò)增是這樣的過(guò)程，其中對(duì)生長(zhǎng)關(guān) 鍵的蛋白的產(chǎn)生需求較大的基因在連續(xù)代的重組細(xì)胞染色體中被串聯(lián)重復(fù)。適于哺乳動(dòng) 物細(xì)胞的可選擇標(biāo)記的實(shí)例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶。將哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn) 化體置于選擇壓力下，在所述選擇壓力下只有轉(zhuǎn)化體由于載體中存在的選擇基因而獨(dú)特地 適合生存。選擇壓力通過(guò)在這樣的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)施加，在所述條件中培養(yǎng)基中 選擇劑(selection agent)的濃度被不斷改變，從而導(dǎo)致選擇基因和編碼修飾的IL_4突變 蛋白受體拮抗劑的DNA的擴(kuò)增。結(jié)果，增加量的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑從擴(kuò)增的 DNA合成。核糖體結(jié)合位點(diǎn)常常對(duì)于mRNA的翻譯起始是必需的并且其特征在于 Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常位于修飾的 IL-4突變蛋白受體拮抗劑的啟動(dòng)子的3'端和編碼序列的5'端。Shine-Dalgarno序列有 很多種，但通常是多聚嘌呤(即，具有高A-G含量)。許多Shine-Dalgarno序列已經(jīng)被鑒 定，其中每一種均可以應(yīng)用本文中所述的方法容易地合成并且用于原核載體中。前導(dǎo)序列或信號(hào)序列可以用來(lái)將修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑引導(dǎo)到宿主細(xì) 胞之外。通常，編碼信號(hào)序列的核苷酸序列位于修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑核酸分子的編碼區(qū)中或者直接位于修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑編碼區(qū)的5'端處。許多信 號(hào)序列已經(jīng)被鑒定，并且在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任意信號(hào)序列可以聯(lián)合修飾的IL-4 突變蛋白受體拮抗劑核酸分子應(yīng)用。因此，信號(hào)序列可以同源(天然存在的)或異源于修 飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑核酸分子。另外，信號(hào)序列可以應(yīng)用本文描述的方法化學(xué)合 成。在大部分情況下，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑由于信號(hào)肽的存在從宿主細(xì)胞的分 泌，將導(dǎo)致信號(hào)肽從分泌的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑中除去。信號(hào)序列可以是載體 的組分，或者其可以是插入載體中的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑核酸分子的一部分。在許多情況下，核酸分子的轉(zhuǎn)錄因一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)含子在載體中存在而增加；這 在多肽產(chǎn)生于真核宿主細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的情況下是尤其正確的。應(yīng)用的 內(nèi)含子可以天然存在于修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑基因內(nèi)，尤其在使用的基因是全 長(zhǎng)基因組序列或其片段的情況下。如果內(nèi)含子沒(méi)有天然存在于基因內(nèi)，則該內(nèi)含子可以由 另一來(lái)源獲得。內(nèi)含子相對(duì)于側(cè)翼序列和修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑基因的位置一 般是重要的，這是因?yàn)閮?nèi)含子必須被有效地轉(zhuǎn)錄。因此，當(dāng)本發(fā)明的核酸分子正在被轉(zhuǎn)錄 時(shí)，內(nèi)含子的優(yōu)選位置是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的3'端和聚-A轉(zhuǎn)錄終止序列的5'端。優(yōu)選地，一 個(gè)或更多個(gè)內(nèi)含子位于cDNA的一側(cè)或另一側(cè)(即，5'或3')，以便其不打斷編碼序列。來(lái) 自任意來(lái)源包括病毒、原核和真核(植物或動(dòng)物)生物體的任意內(nèi)含子可以用來(lái)實(shí)踐本發(fā) 明，條件是其與其插入的宿主細(xì)胞相容。還包括在本文中的是合成內(nèi)含子。任選地，可以在 載體中應(yīng)用一種以上內(nèi)含子。本發(fā)明的表達(dá)和克隆載體通常含有啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子被宿主生物體識(shí)別并且可 操作地連接到本發(fā)明的核酸分子。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因(一般在約100至IOOObp內(nèi)) 起始密碼子的上游(即，5')控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的未轉(zhuǎn)錄的序列。啟動(dòng)子按常規(guī)分為下列 兩類(lèi)中的一類(lèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子響應(yīng)培養(yǎng)條件的一些改變，如 營(yíng)養(yǎng)物的存在或不存在或溫度的改變而在它們的控制下啟動(dòng)增加水平的DNA轉(zhuǎn)錄。另一方 面，組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)連續(xù)的基因產(chǎn)物產(chǎn)生；也即，很少控制基因表達(dá)或不控制基因表達(dá)。 許多啟動(dòng)子——其被各種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別——是周知的。適合的啟動(dòng)子可以通過(guò)限制 酶消化從來(lái)源DNA中除去啟動(dòng)子并且將期望的啟動(dòng)子插入到載體中而可操作地連接到本 發(fā)明的核酸分子。天然IL-4突變蛋白受體拮抗劑啟動(dòng)子序列可以用來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明核酸分 子的擴(kuò)增和/或表達(dá)。異源啟動(dòng)子是優(yōu)選的，然而，條件是其與天然啟動(dòng)子相比允許被表達(dá) 蛋白的更好轉(zhuǎn)錄和更高收率以及其與選擇使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。適于與原核宿主使用的啟動(dòng)子包括β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)；堿性磷酸 酶；色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)；和雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適 用的。它們的序列已經(jīng)被公布，從而使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠應(yīng)用提供任意有用限制位點(diǎn) 所必需的連接體或銜接頭將這些序列連接到期望的DNA序列。適于與酵母宿主使用的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中也是周知的。酵母增強(qiáng)子有利地與酵母 啟動(dòng)子一起使用。適于與哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞使用的啟動(dòng)子是周知的并且包括但不限于那 些從病毒基因組獲得的啟動(dòng)子，所述病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、 牛乳突瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肝炎-B病毒以及最優(yōu)選猿猴病毒 40(SV40)。其它適合的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如熱休克啟動(dòng)子和肌 動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
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可以有益于控制基因表達(dá)的另外的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū) (Bernoist and Chambon，1981，Nature 290:304-10) ；CMV 啟動(dòng)子；在勞斯肉瘤病毒的 3'長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有的啟動(dòng)子(Yamamoto，等，1980，Cell 22 :787_97)；皰疹胸苷 激酶啟動(dòng)子(Wagner 等，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 1444-45)；金屬硫蛋白 (metallothionine)基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster 等，1982，Nature 296 :39_42)；原核表達(dá) 載體如 β -內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff 等，1978，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 75 3727-31)；或 tac 啟動(dòng)子(DeBoer 等，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，80 :21_25)。還 感興趣的是下列動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，所述控制區(qū)顯示組織特異性并且已經(jīng)被應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物中彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，其在胰腺腺泡細(xì)胞中是有活性的(Swift等，1984，Cell 38 :639-46 ;0rnitz 等，1986，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol50 399-409 (1986)； MacDonald, 1987,Hepatology 7:425-515)；胰島素基因控制區(qū)，其在胰腺β細(xì)胞中是有活 性的(Hanahan，1985，Nature 315:115-22)；免疫球蛋白基因控制區(qū)，其在淋巴樣細(xì)胞中是 有活性的(Grosschedl 等，1984，Cell 38 :647_58 ；Adames 等，1985，Nature 318 :533_38 ； Alexander等，1987，Mol. Cell. Biol，7 1436-44)；小鼠乳癌病毒控制區(qū)，其在睪丸細(xì)胞、 乳腺細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中是有活性的(Leder等，1986，Cell 45:485-95)；白蛋 白基因控制區(qū)，其在肝臟中是有活性的(Pinkert等，1987，Genes and Devel 1 :268_76)； 甲胎蛋白基因控制區(qū)，其在肝臟中是有活性的(Krumlauf等，1985，Mol. Cell. Biol, 5 1639-48 ；Hammer等，1987，Science235 :53_58) ； α 1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)，其在在肝臟 中是有活性的(Kelsey等，1987，Genes and Devel. 1 :161_71) ； β-球蛋白基因控制區(qū)， 其在骨髓細(xì)胞中是有活性的(Mogram 等，1985，Nature 315 :338_40 ;Kollias 等，1986， Cell 46:89-94)；髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)，其在腦中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中是有活性的 (Readhead等，1987，Cell 48:703-12)；肌球蛋白輕鏈_2基因控制區(qū)，其在骨骼肌中是有活 性的(Sani，1985，Nature 314:283-86)；以及促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)，其在下丘 腦中是有活性的(Mason 等，1986，Science 234 1372-78)?？梢詫⒃鰪?qiáng)子序列插入到載體中以增加高等真核生物對(duì)本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)錄。 增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，長(zhǎng)度通常為約10-300bp，其對(duì)啟動(dòng)子起作用以增加轉(zhuǎn)錄。增 強(qiáng)子相對(duì)地不依賴(lài)于方向和位置。在轉(zhuǎn)錄單元的5'和3'端已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。幾種可 從哺乳動(dòng)物基因獲得的增強(qiáng)子序列是已知的(例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋 白和胰島素)。然而，通常應(yīng)用來(lái)自病毒的增強(qiáng)子。SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子的 增強(qiáng)子、多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子是用于活化真核增強(qiáng)子的示例性增強(qiáng)元件。盡管增強(qiáng) 子可以在本發(fā)明核酸分子的5'或3'位置處剪接到載體中，但其通常位于啟動(dòng)子的5'位 點(diǎn)處。本發(fā)明的表達(dá)載體可以由起始載體(starting vector)如商業(yè)獲得的載體構(gòu)建。 這些載體可以或可以不含有所有期望的側(cè)翼序列。在載體中不存在一種或更多種本文描述 的側(cè)翼序列的情況下，它們可以單獨(dú)獲得并且連接到載體中。用于獲得每一種側(cè)翼序列的 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選載體是那些與細(xì)菌宿主細(xì)胞、昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 宿主細(xì)胞相容的載體。這些載體包括pCRII、pCR3和pcDNA3. 1 (Invitrogen, SanDiego, CA)、pBSII (Stratagene, La Jolla, CA)、pET15 (Novagen, Madison, WI)、pGEX (Pharmacia
26Biotech, Piscataway, NJ)、pEGFP_N2(Clontech，Palo Alto, CA)、pETL(BlueBacII， Invitrogen)、pDSR-α (PCT Pub. No. WO 90/14363)和 pFastBacDual(Gibco-BRL, Grand Island, NY)等等。另外適合的載體包括但不限于黏粒、質(zhì)?；蛐揎椀牟《?，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將 知曉載體系統(tǒng)必須與選擇的宿主細(xì)胞相容。這些載體包括但不限于質(zhì)粒如Bluescript 質(zhì)粒 衍生物(高拷貝數(shù)的基于ColE的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA)、設(shè) 計(jì)用于克隆Taq-擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的PCR克隆質(zhì)粒(例如，TOPOtmTA Cloning Kit，PCR2.1 質(zhì)粒衍生物，Invitrogen, Carlsbad, CA)和哺乳動(dòng)物、酵母或病毒載體如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (pBacPAK 質(zhì)粒衍生物，Clontech, Palo Alto, CA)。在載體已經(jīng)被構(gòu)建并且本發(fā)明的核酸分子已經(jīng)被插入到載體的適當(dāng)位點(diǎn)中之后， 完成的載體可以插入到適于擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)的宿主細(xì)胞中。本發(fā)明的表達(dá)載體向選擇 的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)周知的方法完成，所述方法包括諸如轉(zhuǎn)染、感染、氯化鈣、電 穿孔、微注射、脂轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖方法或其它已知技術(shù)的方法。選擇的方法將部分與待 使用的宿主細(xì)胞種類(lèi)相關(guān)。這些方法和其它適合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，并且在 上面，例如在Sambrook等中進(jìn)行了闡述。宿主細(xì)胞可以是原核宿主細(xì)胞(如大腸桿菌(E. coli))或真核宿主細(xì)胞(如酵 母、昆蟲(chóng)或脊椎動(dòng)物細(xì)胞)。當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞合成修飾的IL-4 突變蛋白受體拮抗劑，所述拮抗劑可以隨后從培養(yǎng)基中收集(如果宿主細(xì)胞將其分泌到培 養(yǎng)基中)或直接從產(chǎn)生其的宿主細(xì)胞收集(如果其沒(méi)有被分泌)。適合的宿主細(xì)胞的選擇 將取決于各種因素，諸如期望的表達(dá)水平、期望的或?qū)钚远员匦璧亩嚯男揎?如糖基 化或磷酸)和易于折疊成生物活性分子。許多適合的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域中是已知的并且許多可以從American TypeCulture Collection(ATCC)，Manassas，VA獲得。實(shí)例包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO), CHO DHFR (-)細(xì)胞(Urlaub 等，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 97 =4216-20)、人胚腎(HEK) 293或293Τ細(xì)胞或3Τ3細(xì)胞。適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 的選擇以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選、產(chǎn)物產(chǎn)生和純化的方法在本領(lǐng)域中是已知的。其它適合 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是猴C0S-1和C0S-7細(xì)胞系以及CV-I細(xì)胞系。進(jìn)一步的示例性哺乳動(dòng)物 宿主細(xì)胞包括靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞系和嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞系，包括轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系在內(nèi)。正常的二倍體 細(xì)胞、由初生組織的體外培養(yǎng)物衍生的細(xì)胞株以及初始外植體(primary explants)也是適 合的。候選細(xì)胞可以在基因型上缺乏選擇基因或可以含有顯性作用選擇基因(dominantly acting selection gene) 0其它適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括但不限于小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤 N2A細(xì)胞、海拉細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、由Swiss、Balb-c或NIH小鼠衍生的3T3系、BHK或 HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系。這些細(xì)胞系中的每一種都是蛋白表達(dá)領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知得并且是蛋 白表達(dá)領(lǐng)域中的技術(shù)人員可獲得的。同樣用作適于本發(fā)明的宿主細(xì)胞的是細(xì)菌細(xì)胞。例如，各種大腸桿菌菌株(例如， HB101、DH5D、DH10和MCI061)周知為生物技術(shù)領(lǐng)域中的宿主細(xì)胞。各種枯草芽孢桿菌菌株 (B. subtilis)、假單胞菌屬某些種(Pseudomonas spp.)、其它芽孢桿菌屬某些種(Bacillus spp.)、鏈霉菌屬某些種(Sti^ptomyces spp.)等等也可以應(yīng)用在該方法中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多酵母細(xì)胞菌株也可用作宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多肽。優(yōu)選的酵母細(xì)胞包括，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerivisae)和巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)。另外，在期望的情況下，昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)也可以用在本發(fā)明的方法中。這些系統(tǒng) 描述在例如 Kitts 等，1993，Biotechniques，14 :810-17 ；Lucklow,1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4 :564_72 ；和 Lucklow 等，1993，J. Virol. ,67 :4566_79 中。優(yōu)選的昆蟲(chóng)細(xì)胞是 Sf-9 和 Hi5 (Invitrogen)。存在于宿主細(xì)胞中的本發(fā)明的多核苷酸可以與其它細(xì)胞組分如膜組分、蛋白質(zhì)和 脂質(zhì)分離?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)核酸純化技術(shù)從細(xì)胞中分離多核苷酸，或者可以應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)如 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或通過(guò)應(yīng)用自動(dòng)合成器合成多核苷酸。分離多核苷酸的方法在本領(lǐng)域 中是常規(guī)的和已知的。獲得多核苷酸的任意此類(lèi)技術(shù)可以用來(lái)獲得編碼本發(fā)明拮抗劑的分 離多核苷酸。例如，限制酶和探針可以用來(lái)分離編碼所述拮抗劑的多核苷酸。優(yōu)選地，分離 多核苷酸在不含其它分子或至少70、80或90%不含其它分子的制劑中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，本文描述的核酸和多肽分子可以通過(guò)重組和其它 手段產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑cDNA分子可以應(yīng)用mRNA作為 模板用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備。其后，可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的和實(shí)施例1中描述的分 子生物學(xué)技術(shù)復(fù)制cDNA分子。實(shí)施例2描述了 5種特異性重組表達(dá)和純化技術(shù)，所述技術(shù) 被用來(lái)制備本發(fā)明的修飾的突變蛋白拮抗劑。(c)人拮抗劑治療效用的評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)具體拮抗劑在過(guò)敏性哮喘治療中的潛在功效，可以在實(shí)施例5和6中所詳 述的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中對(duì)該拮抗劑進(jìn)行體外測(cè)試。另外，修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的 血漿半衰期可以用實(shí)施例6所述的大鼠藥物動(dòng)力學(xué)研究在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。(d)藥物組合物上面描述的任意修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑可以以包含藥學(xué)上可接受的運(yùn) 載體的藥物組合物進(jìn)行提供。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體優(yōu)選是非熱源性的。組合物可以單獨(dú) 或聯(lián)合至少一種其它藥劑如穩(wěn)定化化合物給藥，其可以在任意無(wú)菌的、生物相容的藥物運(yùn) 載體中給藥，所述藥物運(yùn)載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水。多種含水運(yùn)載體 可以被使用，例如0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸等。這些溶液是無(wú)菌的并且一般不含顆粒物質(zhì)。 這些溶液可以通過(guò)常規(guī)的周知滅菌技術(shù)(例如，過(guò)濾)進(jìn)行滅菌。組合物可以含有所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)。可接受的輔助物質(zhì)優(yōu)選在所 采用的劑量和濃度下對(duì)受者是無(wú)毒的。藥物組合物可以含有這樣的輔助物質(zhì)，所述輔助物 質(zhì)用于改變、維持或保持例如PH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無(wú)菌性、穩(wěn)定 性、溶解或釋放速度、吸收或組合物的滲透。適合的配料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、 谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞 硫酸氫鈉)、緩沖液(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機(jī)酸)、膨 脹劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡(luò)合劑(如咖啡堿、聚乙 烯吡咯烷酮、環(huán)糊精或羥丙基環(huán)糊精)、填料、單糖、二糖和其它糖類(lèi)(如葡萄糖、 甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、 乳化劑、親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成鹽的平衡離子(如鈉)、防 腐劑(如殺藻胺、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、羥苯甲酸丙酯(propylparaben)、雙氯苯雙胍己烷(chlorhexidine)、山梨酸或過(guò)氧化氫)、溶劑 (如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤(rùn)劑 (如Pluronics ；PEG ；山梨聚糖酯；聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 ；triton ； tromethamine ；卵磷脂；膽固醇或tyloxapal)、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增 強(qiáng)劑(如堿金屬鹵化物-優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀-或甘露醇山梨醇)、輸送運(yùn)載體(vehicle)、 稀釋劑、賦形劑和 / 或藥物助劑。參見(jiàn) Remington' sPharmaceutical Sciences (18th Ed.， A. R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Companyl990)。本發(fā)明的拮抗劑在這種藥物配制物中的濃度可以變化很大，S卩，從按重量計(jì)小于 約0. 5 %，常常在約1 %或至少約1 %，至多達(dá)15或20 %，并且主要根據(jù)選擇的具體給藥方 式基于液體體積、粘度等進(jìn)行選擇。如果期望，一種以上拮抗劑——例如對(duì)IL-4受體結(jié)合 具有不同的[[Kd]]Se——可以包含在藥物組合物中。組合物可以單獨(dú)或聯(lián)合其它藥劑、藥物或激素向患者給藥。除活性成分外，這些藥 物組合物可以含有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，所述運(yùn)載體包含促進(jìn)將活性化合物處理成藥學(xué) 上可以應(yīng)用的制劑的賦形劑和輔助劑?？山邮艿呐淞蟽?yōu)選在所采用的劑量和濃度下對(duì)受者無(wú)毒。藥物組合物可以含有這樣的配料，所述配料用于改變、維持或保持，例如pH、滲透 性、粘度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無(wú)菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速度、吸收或組合物的滲 透。適合的配料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸)、抗 微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖液(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、 Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機(jī)酸)、膨脹劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(如乙 二胺四乙酸(EDTA))、絡(luò)合劑(如咖啡堿、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊 精)、填料、單糖、二糖和其它糖類(lèi)(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明 膠或免疫球蛋白)、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、 低分子量多肽、形成鹽的平衡離子(如鈉)、防腐劑(如殺藻胺、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯 乙醇、羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、羥苯甲酸丙酯(propylparaben)、雙氯苯雙胍己烷 (chlorhexidine)、山梨酸或過(guò)氧化氫)、溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露 醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤(rùn)劑(如pluronics ；PEG ；山梨聚糖酯；聚山梨醇酯 如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 ；triton ；氨基丁三醇(tromethamine)；卵磷脂；膽固醇 或tyloxapal)、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增強(qiáng)劑(如堿金屬鹵化物-優(yōu)選 氯化鈉或氯化鉀_或甘露醇山梨醇)、輸送運(yùn)載體(vehicle)、稀釋劑、賦形劑和/或藥物 助劑。參見(jiàn) Remington' s PharmaceuticalSciences (18th Ed.，A. R. Gennaro, ed.，Mack Publishing Company 1990)。最佳的藥物組合物可以由技術(shù)人員根據(jù)例如意圖的給藥途徑、輸送形式和期望的 劑量來(lái)確定。參見(jiàn),例如，上面的Remington' s Pharmaceutical Sciences。這些組合物 可以影響本發(fā)明核酸分子或骨密度調(diào)節(jié)劑的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度和體內(nèi)清除 速度。藥物組合物中主要的運(yùn)載體(vehicle/carrier)本質(zhì)上可以是含水的或不含水 的。例如，用于注射的適合的運(yùn)載體(vehicle/carrier)可以是水、生理鹽水溶液或人造腦 脊髓液，其中可能添加有腸胃外給藥的組合物中常用的其它材料。中性緩沖鹽水或混合有
29血清白蛋白的鹽水是另外的示例性運(yùn)載體。其它示例性藥物組合物包含約PH 7. 0-8. 5的 Tris緩沖液或約pH 4. 0-5. 5的醋酸鹽緩沖液，其可以進(jìn)一步包含山梨醇或適合的替代品。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)將選擇的具有期望純度的組分 與任選的配制劑(formulation agent)(如上 Remington' s Pharmaceutical Sciences) 混合來(lái)制備用于儲(chǔ)存，為凍干餅狀物或含水溶液的形式。進(jìn)一步，可以應(yīng)用適當(dāng)?shù)馁x形劑如 蔗糖將組合物配置為凍干物(lyophilizate)。藥物組合物可以被選擇用于腸胃外輸送?？蛇x地，組合物可以被選擇用于吸入或 用于經(jīng)過(guò)消化道輸送如口服。這些藥學(xué)上可接受的組合物的制備在本領(lǐng)域的技能內(nèi)。配制組分以給藥位點(diǎn)可接受的濃度存在。例如，緩沖液被用來(lái)將組合物維持在生 理pH或略低的pH，通常在約5至約8的pH范圍內(nèi)。當(dāng)考慮腸胃外給藥時(shí)，本發(fā)明中應(yīng)用的治療組合物可以是藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體 中的無(wú)致熱原的、腸胃外可接受的、含水溶液的形式，所述溶液包含本發(fā)明的期望分子。特 別適合的用于腸胃外注射的運(yùn)載體是無(wú)菌蒸餾水，其中所述分子被配置成無(wú)菌的、等張溶 液，適當(dāng)保存。又一種制劑可以牽涉期望的分子與藥劑的配制，如可注射微球、生物可侵蝕 顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚羥乙酸)、珠或脂質(zhì)體，其提供產(chǎn)物的控制或持續(xù)釋放，該 產(chǎn)物然后可以經(jīng)由貯存庫(kù)注射輸送。也可以應(yīng)用透明質(zhì)酸，其可以具有促進(jìn)循環(huán)持續(xù)時(shí)間 的效果。用于導(dǎo)入期望分子的其它適合的手段包括可植入的藥物輸送裝置。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物可以配制成用于吸入。例如，本發(fā)明的核酸分子或 骨密度調(diào)節(jié)劑可以配制成干燥粉末以用于吸入。吸入溶液也可以與推進(jìn)劑(propellant) 一起配制以用于氣溶膠輸送。在又一實(shí)施方式中，溶液可以被霧化。肺部給藥進(jìn)一步描述 在PCT公開(kāi)號(hào)WO 94/20069中，其描述了化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)的肺部輸送。在其它實(shí)施方式中，某些配制物可以口服給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，以這 種方式給藥的本發(fā)明的核酸分子或骨密度調(diào)節(jié)劑可以與或不與固體劑型如片劑和膠囊的 化合中通常應(yīng)用的那些運(yùn)載體一起配制。例如，膠囊可以被設(shè)計(jì)來(lái)在生物利用度最大且預(yù) 系統(tǒng)降解最小時(shí)的點(diǎn)在胃腸道中釋放配制物中的活性部分?？梢园硗獾乃巹┮源龠M(jìn)本 發(fā)明分子或調(diào)節(jié)劑的吸收。也可以應(yīng)用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、 藥片崩解劑和黏合劑。另一種藥物組合物可以牽涉有效量的本發(fā)明核酸分子或骨密度調(diào)節(jié)劑與適于制 造片劑的無(wú)毒賦形劑混合。通過(guò)將片劑溶解在無(wú)菌水或另一種適合的運(yùn)載體中，可以以單 位劑量形式制備溶液。適合的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫 鈉、乳糖或磷酸鈣；或粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹(shù)膠；或潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸 或滑石。另外的藥物組合物對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是明顯的，包括將本發(fā)明的核酸分 子或骨密度調(diào)節(jié)劑包含在持續(xù)或控制釋放配制物中的配制物。配制各種其它持續(xù)或控制輸 送方法如脂質(zhì)體運(yùn)載體、生物可侵蝕微粒或多孔珠和貯存庫(kù)注射液的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。參見(jiàn)，例如，PCT/US93/00829，其描述了用于藥物組合物輸送的多孔聚合微粒 的5種控制釋放。持續(xù)釋放制劑的另外的實(shí)例包括成品形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如膜或微膠 囊。持續(xù)釋放基質(zhì)可以包括聚酯、水凝膠、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利第3，773，919號(hào)和歐洲專(zhuān)利
30第058481號(hào))、L-谷氨酸和Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 22 547-56)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer 等，1981，J. Biomed. Mater. Res. 15 167-277 和 Langer, 1982, Chem. Tech. 12 :98_105)、乙烯醋酸乙烯(Langer 等，同上)或 聚-D (-) -3-羥基丁酸(歐洲專(zhuān)利第133988號(hào))。持續(xù)釋放組合物也可以包括脂質(zhì)體，其 可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的幾種方法中的任一種進(jìn)行制備。參見(jiàn)，例如，Eppstein等，1985， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 3688-92 ；以及歐洲專(zhuān)利第 036676 號(hào)、第 088046 號(hào)和第 143949 號(hào)。用于體內(nèi)給藥的藥物組合物通常必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾來(lái)完 成。在組合物被凍干的情況下，應(yīng)用該方法滅菌可以在凍干和重構(gòu)(reconstitution)之前 或之后進(jìn)行。腸胃外給藥的組合物可以以?xún)龈尚问交蛉芤簝?chǔ)存。此外，腸胃外組合物一般 被置于具有無(wú)菌入口的容器中，例如，靜脈內(nèi)溶液包或小瓶，其具有皮下注射器針頭可刺穿 的塞子。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)許多本文所述的任何數(shù)量的途徑給藥，包括但不限 于口服方式、靜脈內(nèi)方式、肌肉內(nèi)方式、動(dòng)脈內(nèi)方式、脊髓內(nèi)方式、鞘內(nèi)方式、心室內(nèi)方式、經(jīng) 皮方式、皮下方式、腹膜內(nèi)方式、鼻內(nèi)方式、腸胃外方式、局部方式、舌下方式或直腸方式。在藥物組合物已經(jīng)被制備后，可以將它們放置在適當(dāng)?shù)娜萜髦胁⑶屹N上治療所示 病癥的標(biāo)簽。這種標(biāo)簽將包括給藥的量、頻率和方法。(d)治療方法本發(fā)明提供通過(guò)結(jié)合IL-4受體α鏈和抑制IL_4和IL_13_介導(dǎo)的活性來(lái)改善疾 病癥狀的方法。這些疾病包括，而不限于，氣道過(guò)敏和氣道炎癥，其包括肥大細(xì)胞、嗜酸性粒 細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、與哮喘和其它免疫學(xué)或過(guò)敏性疾病相關(guān)的募集和激活。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，治療有效劑量的本發(fā)明修飾的IL-4突變蛋白受體 拮抗劑和/或本發(fā)明藥物組合物被給藥于患有特征是IL-4和IL-13活性升高的疾病如上 述那些疾病的患者。(e)治療有效劑量的確定治療有效劑量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。治療有效劑量指與在治療 有效劑量不存在的情況下明顯的功效相比用于有效治療哮喘的拮抗劑的量。治療有效劑量可以在動(dòng)物模型，常常是大鼠、小鼠、兔、狗、豬或非人靈長(zhǎng)類(lèi)中進(jìn)行 初步估算。動(dòng)物模型也可以用來(lái)確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。這些信息然后可以用來(lái) 確定在人中有用的劑量和給藥途徑。治療功效和毒性，例如，人拮抗劑的ED5tl (50 %的群體治療有效的劑量)和 LD5tl (50%的群體的致命劑量)，可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥物方法確定。毒 性效果與治療效果的劑量比為治療指數(shù)，以及其可以表示為比率，LD50/ED50O顯示大的治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。從動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)被用于配制人 應(yīng)用的劑量范圍。這些組合物中含有的劑量?jī)?yōu)選在包括具有小毒性或無(wú)毒性的ED5tl的循環(huán) 濃度范圍內(nèi)。劑量根據(jù)采用的劑型、患者的敏感性和給藥途徑在該范圍內(nèi)變化。精確劑量將由從業(yè)者根據(jù)與需要治療的患者有關(guān)的因素確定。調(diào)整劑量和給藥以 提供足夠水平的拮抗劑或維持期望的效果。可以考慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度、對(duì)象 的總體健康、對(duì)象的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時(shí)間和頻率、藥物結(jié)合(一種或多種)、
31反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐受/反應(yīng)。長(zhǎng)效藥物組合物可以每3至4天給藥一次、每周給藥 一次或每?jī)芍芙o藥一次，取決于具體配制物的半衰期和清除速度。可以應(yīng)用充分確立的技術(shù)，將編碼本發(fā)明修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的多 核苷酸離體或體內(nèi)構(gòu)建并且導(dǎo)入細(xì)胞中，所述充分確立的技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚 陽(yáng)離子-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、用裸核酸或包封的核酸進(jìn)行的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體_介導(dǎo)的細(xì)胞融合、 DNA-涂覆的乳膠珠(latex bead)的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、“基因 槍”和DEAE-或磷酸鈣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。拮抗劑的有效體內(nèi)劑量在每千克患者體重約5 μ g至約50 μ g、約50 μ g至約5mg、 約100 μ g至約500 μ g和每千克患者體重約200至約250 μ g的范圍內(nèi)。對(duì)于編碼拮抗劑的 多核苷酸的給藥，有效體內(nèi)劑量在約IOOng至約200ng DNA、500ng至約50mg DNA、約1 μ g 至約2mg DNA、約5 μ g至約500 μ gDNA和約20 μ g至約100 μ gDNA的范圍內(nèi)。本發(fā)明的含有修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑的藥物組合物的給藥方式可以是 將拮抗劑輸送至宿主的任意適合的途徑。本發(fā)明的藥物組合物特別適用于腸胃外給藥，即， 皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、氣管內(nèi)或鼻內(nèi)給藥以及其它肺部給藥方式。在本公開(kāi)中引用的所有專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用明確并入本文。上述公開(kāi)一般性 地描述了本發(fā)明。通過(guò)參考下面特定的實(shí)施例可以獲得更加完全的理解，所述實(shí)施例被提 供僅僅用于說(shuō)明目的并且不意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1IL-4-RA和IL-4-RE半胱氨酸突變蛋白的重組產(chǎn)品pET Directional TOPO 表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)被選擇用于IL-4的重組表達(dá)。 該系統(tǒng)應(yīng)用高效的一步“TOPO Cloning”策略來(lái)定向克隆平端PCR產(chǎn)物和T71ac啟動(dòng)子， 以用于大腸桿菌中感興趣基因的高水平表達(dá)和IPTG-可誘導(dǎo)表達(dá)。另外的特征包括用以減 少基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的IacI基因、用于質(zhì)粒的復(fù)制以及維持的PBR322起點(diǎn)和用于選擇的氨芐青霉 素抗性基因。將IL-4克隆到pETlOl/D-TOPO載體中以產(chǎn)生重組IL-4蛋白。寡核苷酸引物顯 示在表4中。正向PCR引物設(shè)計(jì)有用以促進(jìn)定向克隆的5' CACC突出端，其后是用于亞克 隆的獨(dú)特的Ndel限制酶位點(diǎn)和初始ATG起始密碼子。反向PCR引物包括用以確保不摻入 C-端標(biāo)記的兩個(gè)終止密碼子和用于亞克隆的獨(dú)特的BamHI限制酶位點(diǎn)。應(yīng)用先前克隆的人 IL-4作為模板，產(chǎn)生平端IL-4PCR產(chǎn)物。將該產(chǎn)物凝膠純化并且與鹽溶液和TOPO 載體在 室溫下溫育5分鐘，以便定向克隆到pETlOl/D-TOPO載體中。將重組載體轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受 態(tài)One Shot TOP 10大腸桿菌中。將重組質(zhì)粒DNA用于DNA測(cè)序，以確認(rèn)正確的序列。表4 用于產(chǎn)生IL-4RE半胱氨酸突變蛋白的寡核苷酸弓I物SEQ ID NO IL4 RE 的寡聚序列體17T28C Fwd (正向)GAAGACTCTGTGCACCGAGTTGTGCGTAACAGACATCTTTGC18T28C Rev(反向)GCAAAGATGTCTGTTACGCACAACTCGGTGCACAGAGTCTTC19S36C Fwd GTAACAGACATCTTTGCTGCCTGCAAGAACA
CAACTGAG20S36C Rev CTCAGTTGTGTTCTTGCAGGCAGCAAAGATGTCTGTTAC21K37C Fwd CCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCTGCAACACAACTGAGAAGG22K37C Rev CCTTCTCAGTTGTGTTGCAGGAGGCAGCAAAGATGTCTGTTACGG23N38C Fwd GACATCTTTGCTGCCTCCAAGTGCACAACTGAGAAGGAAACC24N38C Rev GGTTTCCTTCTCAGTTGTGCACTTGGAGGCAGCAAAGATGTC25 A104C Fwd GAATTCCTGTCCTGTGAAGGAATGCAACCAGAGTACGTTGG26 A104C Rev CCAACGTACTCTGGTTGCATTCCTTCACAGGACAGGAATTC27 N105C Fwd CCTGTGAAGGAAGCCTGCCAGAGTACGTTGGAAAACTTC28 N105C Rev GAAGTTTTCCAACGTACTCTGGCAGGCTTCCTTCACAGG29 Q106C Fwd CCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACTGCAGTACGTTGGAAAACTTC30 Q106C Rev GAAGTTTTCCAACGTACTGCAGTTGGCTTCCTTCACAGGACAGGIL-4/pET101/D-T0P0 充當(dāng)模板，用 Strategene 的QuikChange 定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?產(chǎn)生IL-4RE半胱氨酸突變蛋白。每一半胱氨酸突變蛋白應(yīng)用兩個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行制備， 每一個(gè)均與載體的相反鏈互補(bǔ)并且含有密碼子TGC或GCA，以摻入期望的半胱氨酸突變。表 4列出了用于制備IL-4RE突變蛋白的引物。含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒應(yīng)用制造商方案中限 定的循環(huán)參數(shù)和條件進(jìn)行制備。將產(chǎn)物用Dpnl核酸內(nèi)切酶在37°C下處理1小時(shí)，以消化甲 基化的、非突變的親代DNA模板。將DpnI-處理的DNA轉(zhuǎn)化到其中突變質(zhì)粒中的切口被修 復(fù)的XL-IBlue超感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序技術(shù)分析誘變的5個(gè)質(zhì)粒DNA，以確認(rèn)正確 的序列。實(shí)施例2重組體表達(dá)和純化將用含有蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21Star(DE3)0ne Shot細(xì)胞(Invitrogen)表征為 最佳表達(dá)并且生長(zhǎng)在37°C下直至OD6tltl達(dá)到大約0. 4以及通過(guò)ImMIPTG(InVitrogen)在 37°C下誘導(dǎo)3小時(shí)。將一升細(xì)胞在13，OOOrpm下離心10分鐘，稱(chēng)重并且儲(chǔ)存在_80°C下。 將冷凍的細(xì)胞沉淀(pellet)重懸浮在細(xì)胞破裂緩沖液(0. IM磷酸鹽緩沖液pH 7.3,0. 1% Triton XlOOUmM EDTA)中，每克細(xì)胞8ml所述緩沖液，并且超聲處理4次，處理1分鐘休 息1分鐘。通過(guò)以35，OOOg離心10分鐘來(lái)除去細(xì)胞裂解液。然后這樣將細(xì)胞沉淀洗滌2-3次重懸浮在30ml細(xì)胞破裂緩沖液，超聲處理1分鐘，接著進(jìn)行離心。將最終的細(xì)胞沉淀， 包含體，儲(chǔ)存在-20°C下。將包含體重懸浮在溶解緩沖液(0. 2M Tris pH 9、7M鹽酸胍)中， 每克細(xì)胞5ml所述緩沖液。添加Sulphotolysis試劑(每克細(xì)胞0. 16克亞硫酸鈉、0. 08克 連四硫酸鉀)并且將包含體在室溫下攪拌2小時(shí)。然后通過(guò)以35，OOOg離心20分鐘，除去 未溶解的組分，留下溶解的包含體。然后將包含體過(guò)Superdex200大小排阻柱(Akta)，以分 離蛋白。用2個(gè)柱體積(CV)的6M鹽酸胍/PBS pH 7以lml/min的流速來(lái)平衡柱子并且蛋 白在1. 5CV中洗脫。收集峰值級(jí)份(每份1. 5ml)并且通過(guò)12%或4-20% Bis-Tris-SDS 凝膠電泳進(jìn)行篩選。匯集含有蛋白質(zhì)的級(jí)份并且添加最終濃度為7. 5mM的DTT，以便還原 蛋白分子。在室溫下溫育2小時(shí)后，將混合物用水稀釋5次并且透析到4. 5L 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4,2mM KCl、120mM NaCl中。透析持續(xù)3-4天，并且更換新鮮緩沖液至少3次。然 后將透析的物質(zhì)濾過(guò)0.2μπι過(guò)濾器并且用醋酸將pH調(diào)節(jié)至5。用IOCV的緩沖液l(25mM 醋酸銨PH5)平衡柱子，接著是20分鐘梯度至100%緩沖液B(25mM醋酸銨ρΗ5/1Μ NaCl)的 后注射。收集峰級(jí)份(每份0. 5ml)并且通過(guò)12%或4-20% Bis-Tris-SDS凝膠電泳進(jìn)行 篩選。收集含有產(chǎn)物的級(jí)份并且用緩沖液A(0.1% TFA/水)稀釋2x。然后應(yīng)用5ml線(xiàn)圈 和lml/min的流速在C4反相-HPLC(Beckman系統(tǒng)Gold)上將蛋白進(jìn)行層析，程序如下注 射期間為10%緩沖液A，10分鐘梯度至40%緩沖液B (0. 1% TFA/ACN)、30分鐘梯度至50% 緩沖液B以及5分鐘梯度至100%緩沖液B。收集峰值級(jí)份(每份0. 5ml)并且通過(guò)12% 或4-20% Bis-Tris-SDS凝膠電泳進(jìn)行篩選。將含蛋白的級(jí)份干燥并且重懸浮在0. IM MES PH 6. 1中，用于分析和試驗(yàn)。實(shí)施例3位點(diǎn)特異性半胱氨酸PEG化和純化方案被確立以經(jīng)由蛋白的巰基和線(xiàn)性22kD甲氧基-聚乙二醇_馬來(lái)酰亞胺衍生 物(Nektar Therapeutics)的馬來(lái)酰亞胺基之間穩(wěn)定的硫醚鍵來(lái)PEG化含有半胱氨酸的 IL4RA突變蛋白。向60 μ M溶解在反應(yīng)緩沖液，0. IM MES, pH 6中的蛋白添加2-倍摩爾過(guò) 量的mPEG-MAL 22kD試劑。在室溫下0. 5小時(shí)后，用相對(duì)于mPEG_MAL 22kD 2-倍摩爾過(guò)量 的半胱氨酸將反應(yīng)終止(圖1)。通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜和大小排阻色譜將PEG化的蛋白與 未反應(yīng)的mPEG-MAL 22kD (用半胱氨酸猝滅)和未反應(yīng)的IL4RA半胱氨酸突變蛋白分離純 化。將粗反應(yīng)混合物施加到用0. 4mL0. IM MES，pH 6平衡的Vivapure Mini S陽(yáng)離子交換柱 (Vivascience)。用0. 4mL 0. lMMES,pH 6將柱子洗滌兩次，每次洗滌后以2，000 X g進(jìn)行離 心。用0. 4mL 0. 6MNaCl/0. IM MES, pH6通過(guò)離心從柱子洗脫樣品。應(yīng)用Beckman HPLC系 統(tǒng) Gold 將 0.4mL 洗脫液加載到 TSK-GEL G2000SWXL HPLC 篩分柱(Tosoh Biosep)上。應(yīng) 用磷酸鹽緩沖鹽水(Dulbecco的PBS)流動(dòng)相在lml/min的流速下解析樣品30min。收集峰 值級(jí)份(0.5ml)并且通過(guò)4-12% Bis-Tris-SDS凝膠電泳對(duì)PEG化的蛋白進(jìn)行評(píng)價(jià)。匯集 含有產(chǎn)物的級(jí)份并且應(yīng)用Ultrafree Biomax-5裝置(Millipore)按照制造商的方案濃縮 到大約60 μ M(或 lmg/ml)，以用于分析和體外試驗(yàn)。PEG化的蛋白的最終濃度通過(guò)氨基 酸分析確定。最終收率描述在表5中。表5 =PEG化的IL4RA半胱氨酸突變蛋白的純化收率突變蛋白 PEG化的 PEG化的 ％回收(mg,最初的)(mg，最終的)
34
IL4RANDNDND
T28C0.2670.06424,
S36C0.3920.05714,
K37C0.2640.0114.
N38C0.3870.08321,
A104C0.2130.0104.
N105C0.2890.04415,
Q106C0.1250.02318,
平均0.1760.04214,實(shí)施例4BiaCore IL-4受體結(jié)合試驗(yàn)通過(guò)胺偶聯(lián)將IL-4受體固定化在BIAcore CM5研究級(jí)感應(yīng)芯片上。用EDC/NHS脈 沖活化感應(yīng)器表面。將IL-4受體溶于IOmM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)中并且注射到流動(dòng)孔 (fl0WCell)2中，接著用1. OM乙醇胺-HCL脈沖使表面失活。受體的固定化水平是 300RU。 流動(dòng)孔1也在無(wú)配體的情況下被活化，以起空白的作用。Biacore Wizard被用來(lái)完成動(dòng)力 學(xué)分析。將候選IL4RE拮抗劑稀釋在HBS-EP (運(yùn)行緩沖液)中并且以30ul/分鐘流速注射 3分鐘以及解離時(shí)間為15分鐘。芯片的再生通過(guò)在接下來(lái)以濃度系列注射之前將IOmM甘 氨酸pH2.5(流速lOOul/min)注射至基線(xiàn)兩次30秒來(lái)完成?；谥苯咏Y(jié)合動(dòng)力學(xué)計(jì)算每 一候選物的解離常數(shù)(Kd)值(表5)。結(jié)果顯示，構(gòu)建物IL4-RE-A104C、IL4-RE-N105C和 IL4-RE-Q106C的解離常數(shù)均低于0. 6nM。實(shí)施例5TF-I細(xì)胞增殖測(cè)試TF-I 細(xì)胞對(duì) IL-4 (0. 5ng/ml,0. 033nM)或 IL-13 (5ng/ml,0. 416nM)的增殖應(yīng)答被 用來(lái)評(píng)價(jià)IL-4RE分子的功能性拮抗活性。在該測(cè)試中，將TF-I細(xì)胞在有或沒(méi)有IL-4或 IL-13和IL-4RE分子的情況下在RPMI+10%血清中于96孔板(1 X IO4/孔，100 μ 1體積)中 培養(yǎng)2-4天。GM-CSF處理被用作陽(yáng)性對(duì)照。在最終讀數(shù)前二十四小時(shí)，向每一孔添加10μ 1 AlamarBlue (10%體積)。應(yīng)用WALLAC Victor 2在530/590nm處測(cè)定熒光。抑制濃度50% (IC50)基于候選IL-4RE分子的劑量滴定進(jìn)行計(jì)算。IL-4和IL-13抑制的TF-I生物測(cè)定結(jié) 果的總結(jié)顯示在表6中。結(jié)果表明，構(gòu)建物IL4-RE-K37C、IL4-RE-N38C和IL4-RE-A104C顯 示出與在IL-4或IL-13存在的情況下IL-4-RA的IC5tl值相當(dāng)?shù)腎C5tl值。表6 在TF-I細(xì)胞增殖試驗(yàn)中PEG化的突變蛋白與IL4RA的PEG_IL4REBIAcore結(jié) 合試驗(yàn)和生物活性評(píng)價(jià)突變蛋白BIAcore 親和性， TF-1/IL_4IC5(1，TF-I/ IL-13IC50,nMnMnMBAY 16-9996IL-4RA 0. 110. 56+0. 86 (η = 17)
1.17+1. 77 (η = 6)IL4-RE-T28C0. 892. 35+0. 75 (η = 2)
2.87+0 (η = 1) 35
IL4-RE-S36C 1. 21+0 (η = 1)IL4-RE-K37C 1. 22+0. 58 (η = 2)IL4-RE-N38C 1. 24+0. 58 (η = 2)IL4-RE-A104C
1.34+1. 21 (η = 2)IL4-RE-N105C
2.11+0 (η = 1)IL4-RE-Q106C 1. 95+0 (η = 1)實(shí)施例6初級(jí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)人初級(jí)細(xì)胞(Τ-細(xì)胞和B-細(xì)胞)對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答也可以在IL-4RE分子預(yù)處 理之后進(jìn)行評(píng)價(jià)。從外周血中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，其中一些用PHA處理4天，以 誘導(dǎo)T細(xì)胞的胚細(xì)胞形成。將PBMC也用抗-⑶40進(jìn)行處理以激活B細(xì)胞活性，并且立即應(yīng) 用。將細(xì)胞接種在96孔板中(每孔IO5細(xì)胞)。將PHA T-細(xì)胞的胚細(xì)胞和B細(xì)胞制劑在 不同濃度的IL-4RE分子存在的情況下用IL-4(10ng/ml，0. 667nM)刺激3天。在溫育的最 后20小時(shí)內(nèi)參入含氚胸苷用作增殖的指示劑。這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示在表7中。結(jié)果表明， 對(duì)于兩種初級(jí)細(xì)胞試驗(yàn)，所有PEG化的構(gòu)建物均顯示出IC5tl大于IL-4RA的IC5tl小于5倍的 IL-4RA 的 I C5tl。表7 在B-細(xì)胞和T-細(xì)胞的胚細(xì)胞增殖試驗(yàn)中PEG-IL4RE生物活性評(píng)價(jià)突變蛋白B-細(xì)胞IC5tl，nMT-細(xì)胞的胚細(xì)胞IC5tl，nMBAY16-9996IL-4RA0.86+0.42 (η =10)3. 22+3. 26 (η =16)
IL4--RE-K37C3.73+2.15 (η =2)13. 86+12. 77 (η=2)
IL4--RE-N38C3.33+2.68 (η =2)9. 94+8. 99 (η =2)
IL4--RE-A104C3.29+1.46 (η =2)4. 67+4. 65 (η =2)實(shí)施例7大鼠藥物動(dòng)力學(xué)研究使用稱(chēng)重為250至300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。將頸靜脈導(dǎo)管插入 大鼠中用于血液樣品收集。另外，將股靜脈導(dǎo)管插入靜脈內(nèi)(IV)劑量組的大鼠中用于藥物 給藥。以1和0. 5mg/kg的劑量分別給予大鼠IL-4RA或修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗 劑。使用IV和SC(皮下)給藥途徑。通過(guò)向留置的股靜脈導(dǎo)管直接注射來(lái)給予IV劑量。 通過(guò)向胸背部區(qū)域注射來(lái)給予SC劑量。每個(gè)劑量組使用3只大鼠。在單一彈丸注射(bolus injection) (IV或SC)后，在給藥前(predose)和預(yù)先確 定的時(shí)間收集血液樣品，一直到給藥后168小時(shí)。樣品的離心在收集的1小時(shí)內(nèi)開(kāi)始。收
1. 151. 20+0. 02 (η=2)
0. 740. 82+0. 01 (η=2)
0. 770. 70+0. 18 (η=2)
0. 560. 55+0. 10 (η= 2)
0. 592. 26+0. 20 (η= 2)
0. 522. 44+0. 68 (η= 2)
36獲血漿并且置于干冰上，然后儲(chǔ)存在大約-70°C下。IL-4RA和修飾的突變蛋白的血漿濃度用酶聯(lián)免疫測(cè)定進(jìn)行定量?？笽L_4抗體被 用作包被試劑和檢測(cè)試劑。這種測(cè)定的定量下限是0. 2ng/ml。應(yīng)用WinNonlin (Pharsight， Mountain view,CA)通過(guò)非區(qū)室分析(non-compartmentalanalysis)來(lái)得到藥物動(dòng)力學(xué)參 數(shù)。特別感興趣的是吸收和消除動(dòng)力學(xué)、分布體積以及吸收的量的估算。實(shí)施例8大腸桿菌編碼的IL-4突變蛋白高純度和高收率的包含體表達(dá)直接影響生產(chǎn)能力和成本。已經(jīng)顯示，IL-4三重突 變蛋白分子可以在實(shí)驗(yàn)室里通過(guò)將應(yīng)用人DNA密碼子的IL-4三重突變蛋白構(gòu)建物包含到 適于在大腸桿菌中表達(dá)的適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中而得到制備。盡管從應(yīng)用人密碼子的IL-4三 重突變蛋白構(gòu)建物可以獲得少量的包含體，但是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程不強(qiáng)烈。觀(guān)察到，應(yīng)用人 密碼子的IL-4三重突變蛋白構(gòu)建物的表達(dá)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞可能是有毒的，引起裂解，導(dǎo)致 包含體的低收率。不局限于某些理論，這種觀(guān)察結(jié)果可能是由于大腸桿菌中有限量的人密 碼子。為了改進(jìn)該方法，通過(guò)QuickChange (Strategene)應(yīng)用大腸桿菌-密碼子IL-4RA質(zhì) 粒來(lái)制備大腸桿菌_編碼的IL4-RE-T13D。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)QuickChange和適合的引物改 造IL-4RA質(zhì)粒，以將在位置丙氨酸104 (密碼子GCT)或天冬酰胺38 (密碼子AAC)處的密 碼子改為半胱氨酸(密碼子TGC)。制備了兩種編碼IL-4TM(IL4-RE-T13D)分子的大腸桿 菌-密碼子IL4-RE-T13D質(zhì)粒(表8)。表8 大腸桿菌_密碼子IL-4TM質(zhì)粒
37 實(shí)施例9PEG 化的 IL-4/IL-13 抑制劑當(dāng)用馬來(lái)酰亞胺-PEG (20kDa，線(xiàn)性的，來(lái)自Nektar、Dow或NOF ；30kDa，線(xiàn)性的，來(lái) 自 Nektar、Dow或NOF ；40kDa，線(xiàn)性的，來(lái)自 Nektar、Dow或NOF ；40kDa，支化的，來(lái)自 Necktar 或N(F)PEG化IL-4TM-N38C或IL-4TM-A104C時(shí)，活性明顯降低——當(dāng)應(yīng)用BIAcore方法、 基于TF-I細(xì)胞的試驗(yàn)或來(lái)自外周血的初級(jí)B或T淋巴細(xì)胞測(cè)定時(shí)(圖2)。此外，觀(guān)察到，放置另外的半胱氨酸的位置是重要的。如表9中所示，在TF-I活性 試驗(yàn)中PEG化的104C表現(xiàn)出的活性是PEG化的38C的約2倍多。表9 JL-4DM與PEG化的IL-4TM的活性比較 為了彌補(bǔ)這種活性損失，應(yīng)用QuikChange、適當(dāng)?shù)囊锖痛竽c桿菌-密碼子N38C 質(zhì)粒，將另外的T13D突變包含在IL-4TM-N38C上。先前已經(jīng)顯示，該T13D突變?cè)黾优c IL-4Ra的結(jié)合親和性(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6，028，176號(hào)，其通過(guò)引用而并入本文)。圖3中 所示，具有40kDa支化PEG的PEG化的T13D-N38C具有與未PEG化的IL_4DM(R121D/Y124D) 相等的BIAcore，但這些數(shù)據(jù)不可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)基于細(xì)胞的測(cè)試，因?yàn)镻EG化影響所有PEG 化的IL-4TM分子的占據(jù)率(on-rate)。正是離去率(off-rate) —般是生物試驗(yàn)中效價(jià)決 定的。應(yīng)用基于TF-I細(xì)胞的試驗(yàn)，具有40kDa支化PEG的PEG化T13D-N38C具有與IL-4DM 相等的活性。在初級(jí)T細(xì)胞試驗(yàn)中觀(guān)察到了類(lèi)似的結(jié)果。在該試驗(yàn)中收集了 10個(gè)供體的全血 并且分離PBMC。將PBMC與PHA-P —起溫育4天，然后將這些“胚細(xì)胞”用于試驗(yàn)。將胚細(xì) 胞與IL-4和IL-4TM測(cè)試化合物的12種稀釋液之一一起溫育3天。在最后18小時(shí)內(nèi)，向 培養(yǎng)物添加3H-腺苷。收獲細(xì)胞并且在b-計(jì)數(shù)器上對(duì)摻入3H-腺苷的DNA進(jìn)行定量。表 10示明了，通過(guò)PEG化的效價(jià)損失以及與104C相比在38C處PEG化所得到的效價(jià)的改善。表 10 還在初級(jí)B細(xì)胞中進(jìn)行了研究。類(lèi)似地，收集5個(gè)供體的全血并且分離PBMC。將 PBMC與小鼠抗人⑶40、IL-4和IL-4TM測(cè)試化合物的12種稀釋液之一一起溫育3天。在 最后18小時(shí)內(nèi)，向培養(yǎng)物添加3H-腺苷。收獲細(xì)胞并且在b-計(jì)數(shù)器上對(duì)摻入3H-腺苷的 DNA進(jìn)行定量(表11)。表11 再次觀(guān)察到與104C位置相比在38C位置處PEG化的改善，以及與IL_4DM(R121D/ Y124D)相比T13D和T13D 40B構(gòu)建物效價(jià)分別增加或類(lèi)似。實(shí)施例10提高IL-4/IL-13抑制劑的重折疊收率IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)在位置38C或104C處含有蛋白序列中的第7個(gè)半胱 氨酸殘基。該奇數(shù)半胱氨酸降低來(lái)自包含體的IL-4TM的重折疊效率。向IL-4TM重折疊緩 沖液添加谷胱甘肽，以最優(yōu)化IL-4TM重折疊的收率，而仍保留38C或104C通過(guò)馬來(lái)酰亞胺 聯(lián)接的PEG分子被PEG化的能力。除向重折疊混合物添加谷胱甘肽外，存在重折疊的時(shí)間 依賴(lài)性，以最優(yōu)化IL-4TM進(jìn)行PEG化的收率。通過(guò)BIAcore試驗(yàn)監(jiān)測(cè)最大蛋白重折疊收 率。一旦達(dá)到最大重折疊收率，用酸將重折疊溶液的PH降低到其中半胱氨酸氧化化學(xué)不 再有效的PH。維持低pH直至IL-4TM在更中性的pH—一其中半胱氨酸-馬來(lái)酰亞胺鍵形 成——與馬來(lái)酰亞胺-PEG反應(yīng)。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
修飾的IL 4突變蛋白受體拮抗劑，其在IL 4的位置28、36、37、38、104、105、106的氨基酸殘基處與非蛋白聚合物偶聯(lián)，其中在位置13、121和124的氨基酸是天冬氨酸，其中所述氨基酸根據(jù)野生型人IL 4進(jìn)行編號(hào)，以及其中所述非蛋白聚合物是聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
2.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述非蛋白聚合物被偶聯(lián) 在IL-4的位置37、38或104的氨基酸殘基處。
3.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其包含SEQID NO :33中列出 的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述非蛋白聚合物是聚乙
5.權(quán)利要求4所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述聚乙二醇為線(xiàn)性的。
6.權(quán)利要求4所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述聚乙二醇為支化的。
7.權(quán)利要求6所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述聚乙二醇為約3kD至 50kD。
8.權(quán)利要求7所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述聚乙二醇為40kD。
9.藥物組合物，其包含a)權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑；以及b)藥學(xué)上可接受的載體。
10.藥物組合物，其包含a)權(quán)利要求8所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑；以及b)藥學(xué)上可接受的載體。
11.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的突變蛋白受 體拮抗劑以約0. InM至約10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的Kd與IL-4 受體α鏈結(jié)合。
12.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變蛋 白受體拮抗劑以約0. InM至約10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑 制TF-I細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答。
13.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變蛋 白受體拮抗劑以約0. InM至約10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑 制TF-I細(xì)胞對(duì)IL-13的增殖應(yīng)答。
14.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變蛋 白受體拮抗劑以約0. InM至約10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑 制人B細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答。
15.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變蛋 白受體拮抗劑以約0. InM至約10 μ Μ、約0. 5ηΜ至約1 μ M或約1. OnM至約IOOnM的IC5tl抑 制人T細(xì)胞對(duì)IL-4的增殖應(yīng)答。
16.權(quán)利要求1所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變 蛋白受體拮抗劑具有比未修飾的IL-4受體拮抗劑血漿半衰期長(zhǎng)至少約2-10倍的血漿半衰 期。
17.權(quán)利要求18所述的修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其中所述修飾的IL-4突變 蛋白受體拮抗劑具有比未修飾的IL-4受體拮抗劑血漿半衰期長(zhǎng)至少約10-100倍的血漿半衰期。
18.編碼多肽的純化多核苷酸，所述多肽包含SEQID NO :33中列出的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑，其包含與聚乙二醇偶聯(lián)的IL-4突變蛋白受體拮抗劑。還提供了用于治療目的的相關(guān)配制物、其給藥劑量和給藥方法。這些修飾的IL-4突變蛋白受體拮抗劑、組合物和方法通過(guò)抑制IL-4和IL-13-介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和嗜曙紅細(xì)胞增多給那些患有呼吸病癥如哮喘的個(gè)體提供治療選擇。更具體而言，這些拮抗劑由于血漿半衰期較長(zhǎng)而相對(duì)于未修飾的IL-4RA具有增加的效應(yīng)持續(xù)時(shí)間。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101918020SQ200880124642
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者A·湯姆金森, D·布瓦韋爾, E·伯邁斯特-蓋茨, K·德拉里爾, M·朗夫里, T·M·翁 申請(qǐng)人:艾羅文斯公司