專利名稱：：穩(wěn)定化免疫調(diào)控性rna(simra)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—般而言，本發(fā)明涉及免疫學(xué)和使用寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)控劑的免疫療法應(yīng)用的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及免疫調(diào)控性RNA組合物和使用它們經(jīng)由Toll樣受體8(TLR8)、Toll樣受體7(TLR7)及TLR7和TLR8二者調(diào)控免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
：基于應(yīng)答中牽涉的細(xì)胞子集，免疫應(yīng)答牽涉先天性和適應(yīng)性應(yīng)答兩者。例如，經(jīng)典的細(xì)胞介導(dǎo)的功能(諸如遲發(fā)型超敏感性和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活化)中牽涉的T輔助(Th)細(xì)胞是Thl細(xì)胞，而作為B細(xì)胞活化的輔助細(xì)胞牽涉的Th細(xì)胞是Th2細(xì)胞。免疫應(yīng)答的類型受到響應(yīng)抗原暴露而生成的細(xì)胞因子和趨化因子的影響。細(xì)胞因子通過影響T輔助細(xì)胞1(Thl)和T輔助細(xì)胞2(Th2)的平衡(其直接影響發(fā)生的免疫應(yīng)答的類型)而為控制免疫應(yīng)答提供一種手段。若平衡朝向更高數(shù)目的Thl細(xì)胞，則發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活化。在平衡朝向更高數(shù)目的Th2細(xì)胞時(shí)，則發(fā)生體液的或抗體的免疫應(yīng)答。這每一種免疫應(yīng)答導(dǎo)致不同的一組細(xì)胞因子自Thl和Th2細(xì)胞分泌。由Thl和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的差異可能是這兩種T細(xì)胞子集的不同生物學(xué)功能的結(jié)果。Thl細(xì)胞牽涉身體對(duì)抗原(例如病毒感染、細(xì)胞內(nèi)病原體、和腫瘤細(xì)胞)的先天性應(yīng)答。對(duì)抗原的初始應(yīng)答可以是自抗原呈遞細(xì)胞(例如活化的巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)分泌IL-12和伴隨的Thl細(xì)胞活化?；罨疶hl細(xì)胞的結(jié)果是某些細(xì)胞因子(例如IL-2、IFN-y和其它細(xì)胞因子)的分泌和伴隨的抗原特異性CTL的活化。已知Th2細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌、寄生物、抗原和變應(yīng)原而活化，并且可經(jīng)由分泌某些細(xì)胞因子(例如IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-IO、IL-13和其它細(xì)胞因子)和趨化因子而介導(dǎo)身體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(例如免疫球蛋白生成和嗜曙紅細(xì)胞活化)。這些細(xì)胞因子中某些的分泌可導(dǎo)致B細(xì)胞增殖和抗體生成升高。另外，這些細(xì)胞因子中的某些可剌激或抑制其它細(xì)胞因子的釋放(例如IL-IO抑制自Thl細(xì)胞分泌IFN-y和自樹突細(xì)胞分泌IL-12)。最后，Thl和Th2細(xì)胞之間的平衡及響應(yīng)選定的剌激物而釋放的細(xì)胞因子和趨化因子能在身體的免疫系統(tǒng)如何響應(yīng)疾病中具有重要的作用。例如，IFN-a可抑制丙型肝炎，而MIP-la和MIP-1P(分別也稱為CCL3和CCL4)可抑制HIV-1感染。Thl/Th2免疫應(yīng)答的最佳平衡呈現(xiàn)使用免疫系統(tǒng)治療和預(yù)防多種疾病的機(jī)會(huì)。在哺乳動(dòng)物中，可以通過例如引入細(xì)菌或含有非甲基化CpG二核苷酸的合成DNA來誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答源自于特定寡核苷酸序列(例如非甲基化的CpG)被呈3遞給某些免疫細(xì)胞上稱為樣式識(shí)別受體(PRR)的受體。這些PRR中的某些是Toll樣受體(TLR)。在響應(yīng)微生物感染而誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答中緊密牽涉TLR。在脊椎動(dòng)物中，TLR由已知識(shí)別病原體相關(guān)分子樣式的十種蛋白質(zhì)(TLR1至TLR10)的一個(gè)家族組成。在這十種蛋白質(zhì)中，已知TLR3、7、8、和9位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中，而且識(shí)別核酸(DNA和RNA)和小分子諸如核苷和核酸代謝物。已知TLR3和TLR9分別識(shí)別存在于病毒的和細(xì)菌的和合成的DNA中的核酸諸如dsRNA和非甲基化CpG二核苷酸。已經(jīng)顯示了，細(xì)菌DNA活化免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生抗腫瘤活性(TokunagaT等，J.Natl.CancerInst.(1984)72:955-962;ShimadaS等，Jpn.HcancerRes，1986，77，808-816;YamamotoS等，Jpn.J.CancerRes.，1986，79，866-73;Messina，J等，J.I匪nolo.(1991)147:1759-1764)。使用含有CpG二核苷酸的反義寡核苷酸的其它研究已經(jīng)顯示了免疫應(yīng)答的剌激(ZhaoQ等，Biochem.Pharmacol.1996，26，173-82)。隨后的研究顯示了TLR9識(shí)別存在于細(xì)菌的和合成的DNA中的非甲基化CpG基序(HemmiH等，Nature.(2000)408:740-5)。對(duì)含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修飾也能影響它們經(jīng)由TLR9起作用和調(diào)控免疫應(yīng)答的能力(參見例如Zhao等，Biochem.Pharmacol.(1996)51:173-182;Zhao等，BiochemPharmacol.(1996)52:1537-1544;Zhao等，AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7:495-502;Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1999)9:3453-3458;Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)10:1051-1054;Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)10:2585-2588;Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2001)11:2263-2267;及Kandimalla等，Bioorg.Med.Chem.(2001)9:807-813)。另外，結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究已經(jīng)容許鑒定如下的合成基序和新的基于DNA的結(jié)構(gòu)，它們誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答序型(profile)與那些源自于非甲基化CpG二核苷酸的截然不同(KandimallaER等，ProcNatlAcadSciUSA.(2005)102:6925-30.KandimallaER等，ProcNatlAcadSciUSA.(2003)100:14303-8.CongYP等，BiochemBiophysResCo匪n.(2003)310:1133-9.KandimallaER等，BiochemBiophysResCo匪n.(2003)306:948-53.KandimallaER等，NucleicAcidsRes.(2003)31:2393-400.YuD等，BioorgMedChem.(2003)11:459-64.BhagatL等，BiochemBiophysResCo匪n.(2003)300:853-61.YuD等，NucleicAcidsRes.(2002)30:4460-9.YuD等，JMedChem.(2002)45:4540-8.YuD等，BiochemBiophysResCo匪n.(2002)297:83-90.KandimallaER等，BioconjugChem.(2002)13:966-74.YuD，K等，NucleicAcidsRes.(2002)30:1613-9.YuD等，BioorgMedChem.(2001)9:2803-8.YuD等，BioorgMedChemLett.(2001)11:2263-7.KandimallaER等，BioorgMedChem.(2001)9:807-13.YuD等，BioorgMedChemLett.(2000)10:2585-8.PuttaMR等，NucleicAcidsRes.(2006)34:3231-8)。然而，直到最近，TLR7和TLR8的天然配體仍是未知的。已經(jīng)顯示了，TLR7和8識(shí)別病毒的和合成的單鏈RNA及小分子，包括多種核苷(Diebold，S.S.等，Sciencev:303，1529-1531(2004))。Diebold等(Science,303:1529-1531(2004))顯示了，對(duì)流感病毒的IFN-a應(yīng)答要求流感基因組RNA的內(nèi)體識(shí)別及通過TLR7和MyD88的信號(hào)傳導(dǎo)，而且鑒定了ssRNA為一種TLR7配體。某些合成化合物，即咪唑喹諾酮(imidazoquinolones)、咪喹莫特(imiquimod)(R-837)和雷西莫特(resiquimod)(R-848)是TLR7和TLR8的配體(HemmiH等，(2002)NatImmunol3:196—200;JurkM等，(2002)NatImmuno13:499)。另外，已經(jīng)顯示了某些鳥苷類似物諸如7-脫氮-G、7-硫-8-氧-G(T0G)、和7-烯丙基-8-氧-G(洛索立賓(loxoribine))在高濃度時(shí)活化TLR7(LeeJ等，ProcNatlAcadSciUSA.2003，100:6646-51)。然而，還已知這些小分子例如咪喹莫特經(jīng)由其它受體起作用(SchonMP等，(2006)J.InvestDermatol.，126，1338-47)。TLR7或TLR8識(shí)別和潛在地廣泛范圍的剌激性ssRNA分子缺乏任何已知的特定ssRNA基序提示，TLR7和TLR8能識(shí)別自身的和病毒的RNA兩者。最近顯示了，某些富含GU的寡核糖核苷酸在與N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨甲基硫酸鹽(DOTAP)或其它脂質(zhì)劑復(fù)合時(shí)是免疫剌激性的，并且經(jīng)由TLR7和TLR8起作用(Heil等，Science,303:1526-1529(2004);Lipford等，W003/086280;Wagner等，W098/32462)。然而，RNA分子已經(jīng)被使用了很多年，例如作為核酶和更新近地，作為siRNA和微小RNA，而且作為核酶、siRNA、和微小RNA采用的RNA含有GU二核苷酸。另外，已經(jīng)顯示了，多種這些RNA分子在脂質(zhì)存在的情況中經(jīng)由TLR剌激而引起免疫應(yīng)答(Kariko等，Immunity(2005)23:165-75;MaZ等，BiochemBiophysResCommun.，(2005)330，755-9)。然而，這些RNA分子的不穩(wěn)定性阻礙了許多領(lǐng)域(例如人類疾病的預(yù)防和治療)中使用和應(yīng)用這些分子的進(jìn)展。含有核糖或脫氧核糖的寡核苷酸和寡脫氧核苷酸已經(jīng)在極其多種領(lǐng)域中使用，包括但不限于診斷探測(cè)、PCR引發(fā)、基因表達(dá)的反義抑制、siRNA、微小RNA、適體、核酶、和基于Toll樣受體(TLR)的免疫治療劑。最近，許多出版物已經(jīng)證明了寡脫氧核苷酸作為免疫調(diào)控劑的用途，以及它們?cè)趯?duì)許多疾病諸如變態(tài)反應(yīng)、哮喘、自身免疫、癌癥和傳染病的免疫療法應(yīng)用中單獨(dú)的或作為佐劑的用途。DNA寡核苷酸受到TLR9識(shí)別，而RNA寡核苷酸受到TLR7和/或TLR8識(shí)別的實(shí)情最可能是由于DNA和RNA之間的結(jié)構(gòu)構(gòu)造差異。然而，DNA和RNA之間的化學(xué)差異也使DNA在化學(xué)和酶方面遠(yuǎn)比RNA更穩(wěn)定。RNA被普遍存在的胞外核糖核酸酶(RNA酶)快速降解，這確保少許的(若有的話)自體ssRNA到達(dá)抗原呈遞細(xì)胞。外切核酸酶對(duì)核酸的降解主要是3'-核酸酶消化的，及較小比例經(jīng)由5'-外切核酸酶作用的。在外切核酸酶消化外，RNA還能被RNA酶的內(nèi)切核酸酶活性降解。目前為止，基于RNA的分子不得不與脂質(zhì)復(fù)合來提供針對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性。雖然這些核糖核酸酶提供預(yù)防自身免疫反應(yīng)性的必要功能，但是它們還給為用于免疫療法而設(shè)計(jì)的任何合成ssRNA分子呈現(xiàn)了一個(gè)實(shí)質(zhì)性問題，即核糖核酸酶會(huì)快速降解合成的和天然的ssRNA兩者。為了克服此障礙，已經(jīng)如下嘗試了保護(hù)ssRNA分子免于降解，即在脂質(zhì)體中包囊ssRNA，用聚乙撐亞胺將其縮合(condense)，或?qū)⑵渑c諸如N_[l_(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基銨甲基硫酸鹽(D0TAP)等分子復(fù)合。然而，這些保護(hù)措施是對(duì)仍然不穩(wěn)定的ssRNA應(yīng)用的第二手措施，而且這些保護(hù)措施對(duì)ssRNA(天然的或合成的)的體內(nèi)效力和免疫調(diào)控活性的影響仍然不清楚。Agrawal等(11/697，422)記載了一類新的SIMRA組合物。然而，開發(fā)別的化合物仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，所述化合物保留裸RNA，使得其繼續(xù)被識(shí)別為TLR7和/或TLR8的配體，同時(shí)改善其穩(wěn)定性，使得它能成為在體內(nèi)有用的分子。理想地，可以經(jīng)由設(shè)計(jì)天性穩(wěn)定的基于RNA的分子來應(yīng)對(duì)此挑戰(zhàn)，所述分子能充當(dāng)新型免疫治療劑，其會(huì)在許多臨床相關(guān)應(yīng)用中找到應(yīng)用，諸如在共施用時(shí)改善疫苗接種的效果或者在引起或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有益時(shí)，治療和/或預(yù)防疾病，例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。發(fā)明概述在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新型穩(wěn)定化免疫調(diào)控性RNA("SIMRA")化合物(下文有進(jìn)一步定義)及其用于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途。依照本發(fā)明的新型化學(xué)實(shí)體提供了誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物，其在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面實(shí)質(zhì)上更有效且對(duì)于降解實(shí)質(zhì)上更不敏感。依照本發(fā)明的方法使得能夠?yàn)槊庖忒煼☉?yīng)用使用SIMRA來改變細(xì)胞因子和/或趨化因子序型。在第一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR8激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR7和TLR8二者激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR7激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為佐劑的SIMRA化合物。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物。這些組合物包含本發(fā)明的任一種SIMRA組合物和生理學(xué)可接受的或藥學(xué)可接受的載體。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療性處理患有會(huì)受益于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的疾病或病癥(例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病)的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給患有此類病癥或疾病的患者施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在脊椎動(dòng)物中預(yù)防會(huì)受益于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的疾病或病癥(例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病)的方法，該方法包括給易患此類病癥或疾病的脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種如下的方法，即分離能夠生成細(xì)胞因子或趨化因子的細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞、PBMC)，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此類細(xì)胞，用至少一種本發(fā)明的SIMRA化合物離體處理此類細(xì)胞，使得所分離的細(xì)胞生成或分泌水平升高的細(xì)胞因子或趨化因子，并給需要細(xì)胞因子或趨化因子療法以預(yù)防或治療疾病的患者施用或再施用經(jīng)處理的細(xì)胞。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，給需要細(xì)胞因子或趨化因子療法以預(yù)防或治療疾病的患者施用與一種或多種SIMRA化合物組合的分離的、經(jīng)SMRA處理的細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述依照實(shí)施例1合成本發(fā)明的SIMRA化合物。圖1是用于本發(fā)明SIMRA化合物的平行合成的合成方案。匿Tr=4，4'-二甲氧基三苯甲基；CE=氰乙基。圖2A描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活性。簡(jiǎn)言之，用150iig/mlTLR8激動(dòng)劑剌激HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，并使用SEAP(分泌型人胚胎堿性磷酸酶)測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2B描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活性。簡(jiǎn)言之，用150iig/mlTLR8激動(dòng)劑剌激HEK293細(xì)胞達(dá)20小時(shí)，并使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2C-圖2E描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活性。簡(jiǎn)言之，用150iig/mlTLR8激動(dòng)劑剌激HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，并使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-k3水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2F描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF_kB活性。簡(jiǎn)言之，用0、20、50、100、200、或300iig/ml激動(dòng)劑剌激表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2G描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞中的NF_kB活性。簡(jiǎn)言之，用0、20、50、100、200、或300iig/ml激動(dòng)劑剌激表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2H、圖2J和圖2L描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活性。簡(jiǎn)言之，用0、20、50、100、200、或300yg/ml激動(dòng)劑剌激表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖21、圖2K和圖2M描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活性。簡(jiǎn)言之，用0、20、50、100、200、或300yg/ml激動(dòng)劑剌激表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-kB水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖3A-圖3C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用50iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖4A-圖4C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用200iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖4D-圖4AA描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化7因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用濃度漸增的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的、劑量依賴性的、TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖5A-圖5C描繪了來自依照實(shí)施例3分離、處理、和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(plasmacytoiddendriticcell,pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用50iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖5D描繪了來自依照實(shí)施例3分離、處理、和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用50iig/ml或200iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖6A、圖6B、圖6C、圖6E和圖6F描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人類槳細(xì)胞樹突細(xì)胞(PDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用200iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖6D描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用100iig/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖7A-圖7C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人髓樣樹突細(xì)胞(myeloiddendriticcell,mDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡(jiǎn)言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離mDC，并用50yg/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖8A和圖8B描繪了依照實(shí)施例4處理和分析C57BL/6小鼠后2小時(shí)，C57BL/6小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，給C57BL/6小鼠皮下注射25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖9A和圖9B描繪了依照實(shí)施例4處理和分析BALB/c小鼠后2小時(shí)，BALB/c小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，給BALB/c小鼠皮下注射25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。8圖9C-圖9F描繪了依照實(shí)施例4處理和分析BALB/c小鼠后2小時(shí)，BALB/c小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，給BALB/c小鼠皮下注射10mg/kg或25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖10A-圖10H描繪了依照實(shí)施例5處理的來自表2的例示性SIMRA化合物的血清穩(wěn)定性。簡(jiǎn)言之，將約0.5個(gè)OD的例示性SIMRA化合物個(gè)別地在含1%人血清的PBS中于37t:溫育30分鐘。30分鐘溫育結(jié)束時(shí)，在陰離子交換HPLC上分析SMRA化合物以測(cè)定保留的全長(zhǎng)SIMRA化合物與血清處理前存在的SIMRA化合物量相比的百分比。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)控劑用于免疫療法應(yīng)用的治療用途。具體地，本發(fā)明提供了具有改善的體內(nèi)穩(wěn)定性的基于RNA的寡核苷酸，其經(jīng)由單獨(dú)的TLR7、TLR7和TLR8二者、或單獨(dú)的TLR8調(diào)控免疫應(yīng)答(SIMRA化合物)。通過啟動(dòng)多種多樣的先天性和獲得性免疫應(yīng)答機(jī)制，例如經(jīng)由用穩(wěn)定的TLR7和/或TLR8激動(dòng)劑或者SIMRA化合物活化樹突細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞，所得的細(xì)胞因子序型能導(dǎo)致對(duì)病原體、受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的破壞以及抗原特異性抗體和CTL應(yīng)答的發(fā)生。如此，本發(fā)明提供了一組多種多樣的SIMRA化合物，每種具有其自己的獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)特征。因此，能針對(duì)不同醫(yī)學(xué)適應(yīng)證定制免疫應(yīng)答的范圍和性質(zhì)，即提供具有針對(duì)該適應(yīng)證的想要的一組免疫調(diào)控特征的SIMRA化合物。通過提及而將本文中所引用的授權(quán)專利、專利申請(qǐng)、和參考文獻(xiàn)收入本文，其程度如同具體地和個(gè)別地指明通過提及而收錄每一篇一樣。在本文中所引用的任何參考文獻(xiàn)的任何教導(dǎo)與本說明書之間不一致的情況中，對(duì)本發(fā)明來說以后者為準(zhǔn)。本發(fā)明提供了用于使用SIMRA化合物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。此類方法會(huì)在免疫療法應(yīng)用中找到應(yīng)用，諸如但不限于成年和兒科人類和獸醫(yī)應(yīng)用中癌癥、自身免疫性病癥、哮喘、呼吸變態(tài)反應(yīng)、食物變態(tài)反應(yīng)、皮膚變態(tài)反應(yīng)、和細(xì)菌、寄生物和病毒感染的治療。如此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了對(duì)免疫療法具有最佳水平的免疫調(diào)控效果的新型SIMRA化合物及用于制備和使用此類化合物的方法。另外，本發(fā)明的SIMRA化合物作為佐劑或者與可用于治療疾病或狀況且不降低SIMRA化合物的免疫調(diào)控效果的藥劑組合用于預(yù)防和治療疾病是有用的。定義術(shù)語"2'_取代的核糖核苷"或"2'-取代的阿拉伯糖苷(arabinoside)"—般包括如下的核糖核苷或阿拉伯糖核苷，其中戊糖模塊2'位置的羥基被取代而生成2'-取代的或2'-O-取代的核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述取代是用含有l(wèi)-6個(gè)飽和的或不飽和的碳原子的低級(jí)烴基、用鹵素原子、或用具有6-10個(gè)碳原子的芳基進(jìn)行的，其中所述烴基或芳基可以是未取代的或者可以是取代的，例如用鹵素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、羰烷氧基(carboalkoxy)、或氨基取代。本發(fā)明的阿拉伯糖核苷包括但不限于阿拉伯糖-GJ可拉伯糖-CJ可拉伯糖-仏阿拉伯糖-A。2'-0-取代的核糖核苷或2'_0-取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于2'-氨基、2'-氟、2'-烯丙基、2'-O-烴基和2'-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷、2'-0-甲基核糖核苷或2'-0-甲基阿拉伯糖苷和2'-0-甲氧基乙氧基核糖核苷或2'-0-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。9術(shù)語"3'"在用于方向時(shí)一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置3'(朝向糖的3'位置)的區(qū)域或位置。術(shù)語"5'"在用于方向時(shí)一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置5'(朝向糖的5'位置)的區(qū)域或位置。術(shù)語"約"一般意味著確切的數(shù)目不是至關(guān)重要的。如此，寡核糖核苷酸中核糖核苷殘基的數(shù)目不是至關(guān)重要的，而且涵蓋少一個(gè)或兩個(gè)核糖核苷或阿拉伯糖苷殘基或者多一個(gè)至數(shù)個(gè)核糖核苷或阿拉伯糖苷殘基的寡核糖核苷酸作為上文所述每一個(gè)實(shí)施方案的等同方案。術(shù)語"佐劑"一般指如下物質(zhì)，其在被添加至諸如疫苗或抗原等免疫原性劑時(shí)在暴露于該混合物的受體宿主中增強(qiáng)或加強(qiáng)針對(duì)所述藥劑的免疫應(yīng)答。術(shù)語"氣道炎癥"一般包括但不限于由傳染性變應(yīng)原引起的呼吸道炎癥，包括哮喘。術(shù)語"變應(yīng)原"一般指抗原或在暴露于受試者后引發(fā)變態(tài)反應(yīng)的分子(通常是蛋白質(zhì))的抗原性部分。典型的是，受試者對(duì)變應(yīng)原是過敏的，如通過例如風(fēng)團(tuán)(wheal)和潮紅(flare)測(cè)試或本領(lǐng)域已知的任何方法所指出的。即使只有一小部分受試者在暴露于該分子后展現(xiàn)出變應(yīng)性(例如IgE)免疫應(yīng)答，也說該分子是變應(yīng)原。術(shù)語"變態(tài)反應(yīng)"一般包括但不限于食物變態(tài)反應(yīng)、呼吸變態(tài)反應(yīng)和皮膚變態(tài)反應(yīng)。術(shù)語"抗原"一般指受到抗體或T細(xì)胞抗原受體識(shí)別和選擇性結(jié)合的物質(zhì)。抗原可以包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸及其組合?？乖梢允翘烊坏幕蚝铣傻模乙话阏T導(dǎo)對(duì)該抗原特異性的免疫應(yīng)答。術(shù)語"自身免疫性病癥"一般指其中"自身"抗原遭受免疫系統(tǒng)攻擊的病癥。阻斷3'或5'降解或者"帽"或"加帽"意味著寡核糖核苷酸的3'或5'端附著于另一分子(例如接頭或其它非RNA核苷酸)以充分抑制核酸酶降解(例如3'外切核酸酶降解)。術(shù)語"載體"一般涵蓋任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、油、脂、含脂的囊泡、微球體、脂質(zhì)體封裝、或本領(lǐng)域公知用于藥物配制劑的其它物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，載體、賦形劑、或稀釋劑的特征會(huì)取決于用于特定應(yīng)用的施用路徑。含有這些物質(zhì)的藥學(xué)可接受配制劑的制備記載于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第18版，A.Ge皿aro編，MackPublishingCo.，Easton，PA，1990。術(shù)語"共施用"一般指在足夠近的時(shí)間里施用至少兩種不同物質(zhì)以調(diào)控免疫應(yīng)答。共施用包括同時(shí)施用至少兩種不同物質(zhì)。術(shù)語"互補(bǔ)的"一般意味著具有與核酸雜交的能力。所述雜交通常是互補(bǔ)鏈之間氫鍵鍵合的結(jié)果(優(yōu)選形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基對(duì))，雖然其它模式的氫鍵鍵合以及堿基堆積也能導(dǎo)致雜交。術(shù)語"免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸"一般指在給諸如魚類、鳥類或哺乳類等脊椎動(dòng)物施用時(shí)誘導(dǎo)或遏制免疫應(yīng)答的寡核糖核苷酸。術(shù)語"與...組合"一般意味著在治療同一患者的同一疾病的過程中，而且包括以任意次序施用SIMRA化合物和可用于治療疾病或狀況且不降低SIMRA化合物的免疫調(diào)控效果的藥劑，包括同時(shí)施用或共施用，以及相隔幾秒鐘至數(shù)天的時(shí)間上有間隔的次序。此類組合處理還可包括超過一次的SIMRA化合物和/或獨(dú)立的所述藥劑的施用。SIMRA化合物和所述藥劑的施用可以是通過相同或不同的路徑的。術(shù)語"個(gè)體"或"受試者"一般指哺乳動(dòng)物，諸如人。哺乳動(dòng)物一般包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類、大鼠、小鼠、貓、犬、馬、牛(cattle)、奶牛(cows)、豬、綿羊和家兔。術(shù)語"線性合成"一般指在免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的一端開始并線性進(jìn)展至另一端的合成。線性合成容許將相同或不同(就所摻入的長(zhǎng)度、堿基組成和/或化學(xué)修飾而言)的單體單元摻入免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。術(shù)語"接頭"一般指能借助共價(jià)或非共價(jià)鍵合經(jīng)由糖、堿基、或主鏈附著至寡核糖核苷酸的任何模塊。接頭可用于附著兩個(gè)或更多個(gè)核苷，或者可附著至寡核糖核苷酸的5'和/或3'末端核苷酸。所述接頭可以是非核苷酸接頭或核苷酸接頭。術(shù)語"經(jīng)過修飾的核苷"一般是包括經(jīng)過修飾的雜環(huán)堿基、經(jīng)過修飾的糖模塊、或其任意組合的核苷。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的核苷是非天然嘧啶或嘌呤核苷，如本文所述。為了本發(fā)明，經(jīng)過修飾的核苷、嘧啶或嘌呤類似物或非天然存在的嘧啶或嘌呤可互換使用，指包括非天然存在的堿基和/或非天然存在的糖模塊的核苷。為了本發(fā)明，如果某堿基不是鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶，那么認(rèn)為該堿基是非天然的。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的核苷是2'-取代的核糖核苷和阿拉伯糖核苷或2'-脫氧-2'-取代的阿拉伯糖苷，可以將它們替代入寡核糖核苷酸的選定位置中以提高穩(wěn)定性而不干擾TLR7或TLR8活性。術(shù)語"調(diào)控"或"剌激"一般指變化，諸如響應(yīng)的升高或響應(yīng)的定性差異，這可以源于對(duì)響應(yīng)的引發(fā)和/或增強(qiáng)。術(shù)語"非核苷酸接頭"一般指能借助共價(jià)或非共價(jià)鍵合附著至寡核糖核苷酸的、核苷酸連接以外的化學(xué)模塊。優(yōu)選的是，所述非核苷酸接頭的長(zhǎng)度是約2埃至約200埃，而且可以是順式或反式取向。術(shù)語"核苷酸連接"一般指經(jīng)由它們的糖(例如3'_3'、2'_3'、2'_5'、3'-5')接合兩個(gè)核苷的化學(xué)連接，其由相鄰核苷間的磷酸酯、非磷酸酯、帶電荷的、或中性的基團(tuán)(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)組成。術(shù)語"肽"一般指長(zhǎng)度和組成足以影響生物學(xué)應(yīng)答(例如抗體生成或細(xì)胞因子活性，無論該肽是否是半抗原)的多肽。術(shù)語"肽"可以包括經(jīng)過修飾的氨基酸(無論是天然存在的還是非天然存在的)，其中所述修飾包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂化(lipidization)和甲基化。術(shù)語"藥學(xué)可接受的"或"生理學(xué)可接受的"一般指不干擾依照本發(fā)明的化合物的效力和與生物學(xué)系統(tǒng)(諸如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、或生物體)相容的物質(zhì)。優(yōu)選的是，所述生物學(xué)系統(tǒng)是活的生物體，諸如脊椎動(dòng)物。術(shù)語"藥學(xué)有效量"一般指足以實(shí)現(xiàn)期望生物學(xué)效應(yīng)(諸如有益結(jié)果)的量。如此，"藥學(xué)有效量"會(huì)取決于施用它的背景。藥學(xué)有效量可以在一次或多次預(yù)防性或治療性施用中施用。術(shù)語"SIMRA"—般指由TLR7和/或TLR8識(shí)別為配體的穩(wěn)定化的免疫調(diào)控性RNA化合物，其中所述化合物可含有單鏈RNA(ssRNA)和/或雙鏈RNA(dsRNA)，和用于保護(hù)或穩(wěn)定其3'末端的修飾(例如通過阻斷3'降解或通過為3'末端加帽或通過連接兩條或更多條寡核糖核苷酸的3'末端)，倘若SIMRA在體內(nèi)比未經(jīng)修飾的寡核糖核苷酸更加穩(wěn)定且如此實(shí)現(xiàn)(affect)它的免疫調(diào)控能力。SIMRA可含有經(jīng)過修飾的寡核糖核苷酸。SIMRA化合物還可含有用于保護(hù)其5'末端以進(jìn)一步改善寡核糖核苷酸穩(wěn)定性的修飾(例如通過阻斷5'降解或給5'末端加帽)。SIMRA可以是線性的或分支的，其中核酸是經(jīng)由例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或備選連接相連接的核糖核苷聚合物。SIMRA可以由共價(jià)附著至核糖殘基或其衍生物的嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)或其衍生物(例如7-脫氮-G、阿拉伯糖-G和阿拉伯糖-A))或嘧啶(胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或其衍生物(例如阿拉伯糖-C和阿拉伯糖-U))堿基組成。術(shù)語"治療"或"處理"一般指旨在獲得有益的或期望的結(jié)果(其可以包括癥狀的緩和或者疾病進(jìn)展的延遲或改善)的辦法。術(shù)語"病毒性疾病"一般指具有病毒作為其起病性因子的疾病，包括但不限于乙肝、丙肝、流感、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、和帶狀皰疹。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新的SIMRA化合物。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了修飾免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸以保護(hù)其3'末端(例如通過阻斷3'降解或者給3'末端加帽或者通過連接兩條或更多條寡核糖核苷酸的3'末端)令人驚訝地影響其免疫調(diào)控能力。另外，已確定這種保護(hù)令人驚訝地改善寡核糖核苷酸的穩(wěn)定性，不再需要脂質(zhì)聯(lián)合或其它保護(hù)手段。進(jìn)一步地，在保護(hù)3'末端外或者與保護(hù)3'末端組合，阻斷5'降解或給5'末端加帽還能改善寡核糖核苷酸的穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，演示了用新型SIMRA化合物活化TLR8，并誘導(dǎo)獨(dú)特的免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞因子和/或趨化因子序型的變化)。此外，在此類人TLR8活化性RNA中摻入某些化學(xué)修飾還能活化TLR7，導(dǎo)致獨(dú)特的免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子和/或趨化因子序型的變化。如此，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了，通過使用經(jīng)修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)(包括經(jīng)修飾的堿基、經(jīng)修飾的糖、主鏈、接頭、連接和/或帽)作為免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的一部分能經(jīng)由活化TLR8和/或TLR7來調(diào)控與之相關(guān)的細(xì)胞因子和/或趨化因子序型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫調(diào)控性化合物，其包含至少兩條基于RNA的寡核苷酸，這些寡核苷酸在它們的3'末端、或核苷間連接、或者官能化的核堿基或糖處與非核苷酸接頭連接。本發(fā)明的此實(shí)施方案可以具有至少一個(gè)易接近的5'末端，其可以是加帽的或未加帽的。已經(jīng)確定了，此結(jié)構(gòu)為SIMRA化合物提供了進(jìn)一步的穩(wěn)定性(例如抑制外切核酸酶活性)而無需脂質(zhì)聯(lián)合或其它保護(hù)。"易接近的5'末端"意味著SIMRA的5'端不以阻止SIMRA化合物經(jīng)由TLR7和/或TLR8調(diào)控免疫應(yīng)答的方式修飾。本發(fā)明這個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方案包含至少兩條寡核糖核苷酸，其中所述免疫調(diào)控性化合物具有如下的結(jié)構(gòu)，包括但不限于那些如表i式i-x中所詳述的。表1:寡核糖核苷酸式I-X12<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>域A、B、C、和D的長(zhǎng)度可以獨(dú)立為約2個(gè)至約35個(gè)核糖核苷酸，且在一些實(shí)施方案中為約2個(gè)至約20個(gè)、或約2個(gè)至約12個(gè)、或約2個(gè)至約11個(gè)、或約2個(gè)至約8個(gè)核糖核苷酸。域A、B、C、和/或D可以是或者可以不是相同的。域A、B、C、和D可以獨(dú)立為具有或沒有自我互補(bǔ)域、同源(homo)或異源(hetero)核糖核苷酸序列、或者接頭的5'-3'或2'-5，腿。"n"可以為1至無限的數(shù)目。"X"是連接域A、B、C、和/或D或給域A、B、C、和/或D加帽的接頭，其可以是經(jīng)由3'或5'連接、磷酸酯基團(tuán)、核堿基、非RNA核苷酸、或非核苷酸接頭，其可以是脂肪族的、芳香族的、芳基、環(huán)狀的、手性的、非手性的、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、脂肪酸、單-、三-或六聚乙二醇、或雜環(huán)模塊、或其組合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了SIMRA化合物，其包含至少兩條通過非核苷酸接頭連接的寡核糖核苷酸，其中免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的序列可以是至少部分自我互補(bǔ)的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到的，所述寡核糖核苷酸的互補(bǔ)序列容許分子間氫鍵鍵合，由此給予寡核糖核苷酸二級(jí)結(jié)構(gòu)。別的寡核糖核苷酸能結(jié)合在一起，由此創(chuàng)建依照本發(fā)明的寡核糖核苷酸的鏈或多聚物。類似的考慮適用于有不同堿基序列的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸之間的分子間堿基配對(duì)。如此，在一起使用眾多免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的情況中，所述眾多免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸可以但非必須包括彼此至少部分互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述眾多免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸包括具有第一序列的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸和具有第二序列的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸，其中所述第一序列和所述第二序列至少50%互補(bǔ)。例如，如在至少50%互補(bǔ)的兩條8聚物之間的，它們可以形成4、5、6、7、或8個(gè)G-C、A-U、和/或G-U擺動(dòng)堿基對(duì)。此類堿基對(duì)可以但非必然牽涉位于互補(bǔ)的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸任一末端的堿基。互補(bǔ)程度可取決于免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸之間的比對(duì)，并且此比對(duì)可以包括或不包括單個(gè)或多個(gè)核苷突出端。在其它實(shí)施方案中，互補(bǔ)程度是至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或甚至100%。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可的，因?yàn)橛虻男蛄惺腔パa(bǔ)的，容許分子間氫鍵鍵合，所以所描繪的免疫調(diào)控性化合物可具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，如從式I至X能想到的，別的連接的基于RNA的寡核苷酸能經(jīng)由分子間氫鍵鍵合而結(jié)合，由此創(chuàng)建鏈或多聚物，其中可以摻入任意數(shù)目的連接的基于RNA的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫調(diào)控性化合物，其包含至少兩條基于RNA的寡核苷酸，所述寡核苷酸在它們的3'或5'末端處，或者經(jīng)由核苷間連接或官能化的核堿基或糖連接至非核苷酸接頭，且其中將接頭(例如帽)附著至至少一個(gè)5'末端。已經(jīng)確定了此結(jié)構(gòu)為SIMRA化合物提供了進(jìn)一步的穩(wěn)定性(例如抑制外切核酸酶活性)。SIMRA的5'端不以阻止SIMRA化合物經(jīng)由TLR7和/或TLR8調(diào)控免疫應(yīng)答的方式修飾。在一些實(shí)施方案中，寡核糖核苷酸各自獨(dú)立具有約2個(gè)至約35個(gè)核糖核苷殘基。如此，在某些實(shí)施方案中，寡核糖核苷酸可以獨(dú)立長(zhǎng)2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)或35個(gè)核糖核苷酸。優(yōu)選地，寡核糖核苷酸為約4個(gè)至約30個(gè)核糖核苷殘基，更優(yōu)選約4個(gè)至約20個(gè)核糖核苷殘基，或者約4個(gè)至約ll個(gè)核糖核苷殘基。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸包含具有約1個(gè)至約18個(gè)、或約1個(gè)至約11個(gè)、或約5個(gè)至約14個(gè)核糖核苷殘基的寡核糖核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述寡核糖核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)具有11個(gè)核糖核苷酸或約8個(gè)至約14個(gè)核糖核苷酸或約10個(gè)至約12個(gè)核糖核苷酸。在免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的背景中，優(yōu)選的實(shí)施方案具有約1個(gè)至約35個(gè)核糖核苷酸，優(yōu)選約5個(gè)至約26個(gè)核糖核苷酸，更優(yōu)選約13個(gè)至約26個(gè)核糖核苷酸。優(yōu)選地，免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸包含至少一個(gè)磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯核糖核苷間連接。在例示性的實(shí)施方案中，每個(gè)核糖核苷單元包括雜環(huán)堿基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)、海藻糖、阿拉伯糖、2'-脫氧-2'-取代的阿拉伯糖、2'-O-取代的核糖或阿拉伯糖、或己糖糖基團(tuán)。核糖核苷殘基可以通過多種已知的核糖核苷間連接中的任一種彼此偶聯(lián)。此類核糖核苷間連接包括但不限于磷酸二酯(phosphodiester)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、烴基膦酸酯(alkylphosphonate)、烴基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酉旨(phosphotriester)、氛基石粦酸酉旨(phosphoramidate)、娃氧焼(siloxane)、石發(fā)酸酯(carbonate)、羰烷氧基(carboalkoxy)、氨基乙酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、嗎啉代(morpholino)、硼代(borano)、硫醚(thioether)、橋接氨基磷酸酉旨(bridgedphosphor咖idate)、橋接亞甲基膦酸酉旨(bridgedmethylenephosphonate)、橋接硫代磷酸酯(bridgedphosphorothioate)、和砜(sulfone)核苷間連接。下文式XI中指出了偶聯(lián)核糖核苷酸的可能位點(diǎn)，其中B代表雜環(huán)堿基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>本發(fā)明的SIMRA化合物可以包括天然存在的核糖核苷、經(jīng)修飾的核糖核苷、或其混合物。在本發(fā)明中，新的SIMRA化合物受到人TLR8識(shí)別，并且在此人TLR8活化性RNA中摻入某些化學(xué)修飾能使它們受到人TLR7識(shí)別并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此類化學(xué)修飾包括但不限于鳥嘌呤類似物，諸如7-脫氮-G、ara-G、6-硫-G、肌苷、異-G、洛索立賓(loxoribine)、TOG(7-硫-8-氧)_G、8-溴-G、8-羥基_G、5_氨基間型霉素(aminoformycin)B、氧間型霉素(0油rmycin)、7-甲基_G、9_對(duì)-氯苯基-8-氮_G、9_苯基_G、9_己基-鳥嘌呤、7-脫氮-9-節(jié)基-G、6-氯-7-脫氮鳥嘌呤、6-甲氧基-7-脫氮鳥嘌呤、8-氮7-脫氮-G(PPG)、2_(二甲基氨基)鳥苷、7-甲基-6-硫鳥苷、8-芐氧基鳥苷、9-脫氮鳥苷、和l-(B-D-呋喃核糖基)-2-氧_7-脫氮-8-甲基-嘌呤?；瘜W(xué)修飾還包括但不限于腺嘌呤類似物，諸如9-芐基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤、2-氨基-N2-0-、甲基腺苷、8_氮-7-脫氮_A、7-脫氮-A、ara-A、Vidarabine(阿糖腺苷)、2-氨基腺苷、N1-甲基腺苷、8-氮腺苷、5-碘殺結(jié)核菌素?；瘜W(xué)修飾還包括但不限于胞嘧啶和尿嘧啶類似物，諸如假尿苷、arc-C、ara-U、5-甲基胞苷、4_硫尿苷、N4-乙基尿苷、^13111￡11^116、5-氨基烯丙基尿苷^3_甲基尿苷、5_氟尿苷。依照本發(fā)明的"免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸"是如下的SIMRA化合物，其包含至少兩條在它們的3'-或2'-端或官能化核糖或官能化核糖核堿基處經(jīng)非核苷酸或核苷酸接頭共價(jià)或非共價(jià)連接的寡核糖核苷酸。下文列出了接頭的數(shù)個(gè)例子。非共價(jià)連接包括但不限于靜電相互作用、疏水相互作用、n_疊加相互作用和氫鍵鍵合。在其它實(shí)施方案中，所述非核苷酸接頭是具有容許附著至寡核糖核苷酸的官能團(tuán)的有機(jī)模塊。此類附著優(yōu)選是通過穩(wěn)定的共價(jià)連接。作為一個(gè)非限制性例子，所述接頭可以附著至核苷酸上的任何合適位置。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭附著至3'-羥基。在此類實(shí)施方案中，所述接頭優(yōu)選包含羥基官能團(tuán)，其優(yōu)選依靠基于磷酸酯的連接(像磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)或非基于磷酸酯的連接附著至3'-羥基。在一些實(shí)施方案中，所述非核苷酸接頭是小分子、大分子或生物分子，包括但不限于多肽、抗體、脂質(zhì)、抗原、變應(yīng)原、和寡糖。在一些其它實(shí)施方案中，所述非核苷酸接頭是小分子。為了本發(fā)明，小分子是分子量小于l，000Da的有機(jī)模塊。在一些實(shí)施方案中，所述小分子具有小于750Da的分子量。在一些實(shí)施方案中，所述小分子是脂肪族或芳香族碳?xì)浠衔?烴)，二者任選可以在連接寡核糖核苷酸或附著于寡核糖核苷酸的線性鏈中包括一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，包括但不限于羥基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲、或硫脲。所述小分子可以是環(huán)狀的或無環(huán)的。小分子接頭的例子包括但不限于氨基酸、碳水化合物、環(huán)糊精、金剛烷(adamantane)、膽固醇、半抗原和抗生素。然而，出于描述非核苷酸接頭的目的，術(shù)語"小分子"并非意圖包括核苷。在一些實(shí)施方案中，所述非核苷酸接頭是烴基接頭或氨基接頭。所述烴基接頭可以是分支的或不分支的，環(huán)狀的或無環(huán)的，取代的或未取代的，飽和的或不飽和的，手性的、非手性的或外消旋的混合物。所述烴基接頭可以具有約2個(gè)至約18個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，此類烴基接頭具有約3個(gè)至約9個(gè)碳原子。一些烴基接頭包括一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，包括但不限于羥基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲、和硫醚。此類烴基接頭可包括但不限于l-丙醇、l，2-丙二醇、l，3-丙二醇、l，2，3-丙三醇、三甘醇、六甘醇、聚乙二醇接頭(例如[-0-CH2-CH2-]n(n=1_9))、甲基接頭、乙基接頭、丙基接頭、丁基接頭、或己基接頭。在一些實(shí)施方案中，此類烴基接頭可包括肽或氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述非核苷酸接頭可以包括但不限于表2所列那些。表2:代表性的非核苷酸接頭<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>0107表2續(xù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>表2:續(xù)oQ2NOHOH1，6-脫水-P-D-葡萄糖NO'2HCT丫、OHOH4，6-硝基連苯三酚OHO、人/s^,HO人N人OOH1，3，5-三(2-羥乙基)-氰尿酸(X、JDH沒食子酸OHO3，5，7-三羥基黃酮表2:續(xù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>表2:續(xù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>OH1，3，4-異丁三醇氰尿酸在一些實(shí)施方案中，所述小分子接頭是甘油或式HO-(CH》。-CH(OH)-(CH》p-OH的甘油同系物，其中o和p獨(dú)立為1至約6、1至約4、或1至約3的整數(shù)。在一些其它實(shí)施方案中，所述小分子接頭是1，3-二氨基-2-羥基丙烷的衍生物。一些此類衍生物具有式HO-(CH2)m-C(0)NH-CH2-CH(OH)_CH2_NHC(0)-(CH2)m_0H，其中m是0至約10、0至約6、2至約6、或2至約4的整數(shù)?！┮勒毡景l(fā)明的非核苷酸接頭容許附著超過兩條寡核糖核苷酸，如表1所描繪的。例如，小分子接頭甘油具有三個(gè)羥基，可供寡核糖核苷酸共價(jià)附著。因此，一些依照本發(fā)明的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸包含超過兩條經(jīng)非核苷酸接頭連接的寡核糖核苷酸(例如域C等，別的域包含如上文為域A、B、C、和D定義的寡核糖核苷酸)。在本發(fā)明這個(gè)方面的又一個(gè)實(shí)施方案中，SIMRA可含有三條或更多條在它們的3'或5'端處、或經(jīng)由核苷間連接或官能化核堿基或糖連接至兩個(gè)或更多個(gè)接頭的寡核糖核苷酸，如表l所描繪的。本發(fā)明這個(gè)方面的寡核糖核苷酸可具有相同或不同的序列。本發(fā)明這個(gè)方面的接頭可以是相同的或不同的。本發(fā)明的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸可以方便地使用自動(dòng)化合成儀和亞氨基磷酸酯法合成。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸是通過線性合成法合成的。另一種合成模式是"平行合成"，其中自中央接頭模塊向外進(jìn)行合成(見圖1)?？梢允褂酶街诠腆w支持物的接頭來進(jìn)行平行合成，如美國(guó)專利No.5，912，332中所記載的。或者，可以使用通用固體支持物(諸如附著有磷酸酯的受控孔徑玻璃)。免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的平行合成相對(duì)于線性合成具有數(shù)項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)(1)平行合成容許摻入相同的單體單元；(2)與線性合成不同，所有單體單元都是在同一時(shí)間合成的，由此合成步驟的數(shù)目和合成所需要的時(shí)間與單體單元的是相同的；和(3)合成步驟的減少提高了最終的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。在通過線性合成或平行合成方案進(jìn)行的合成結(jié)束時(shí)，可以用濃氨水溶液或像亞氨基磷酸酯供應(yīng)商推薦的那樣(如果摻入有經(jīng)過修飾的核苷的話)方便地使免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸脫保護(hù)。將產(chǎn)物免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸優(yōu)選通過反相HPLC純化，脫三苯甲基化，脫氧和透析。表3顯示了依照本發(fā)明的基于RNA的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。除非另有規(guī)定，所有核苷是核糖核苷。表3:穩(wěn)定化的基于RNA的免疫調(diào)控性寡核苷酸(SIMRA)序列22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>G丄=7-脫氮-rG;G2=ara-G;G3=7_脫氮-ara-G;Q=ara-C;C2=2，_F_C;C4=5-甲基-CA=ara-A;仏=ara-U;U2=2'_F_U;M=順，順-環(huán)己烷三醇接頭；m=順，反-環(huán)己烷三醇；Z=1，3，5-戊三醇接頭；X二甘油接頭A=1，2，4-丁三醇接頭；X2=氰尿酸；X3=異丁三醇接頭；Y=1，3-丙二醇；L=1，5-戊二醇；1^=l'，2'-二脫氧核糖；6Eg=六甘醇接頭；3Eg=三甘醇接頭；4Eg=四甘醇接頭；P=硫代磷酸酯；E=乙二醇。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含依照本發(fā)明的SIMRA化合物和藥學(xué)可接受載體的藥物配制劑。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生TLR7和/或TLR8介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，此方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在一些實(shí)施方案中，所述脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，給需要免疫調(diào)控的脊椎動(dòng)物施用SMRA化合物。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療性處理患有疾病或病癥的患者的方法，此方法包括給所述患者施用依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在各種實(shí)施方案中，要治療的疾病或病癥是可能想要免疫調(diào)控的。例如但不限于癌癥、自身免疫性病癥、傳染病、氣道炎癥、炎性病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病。病原體包括細(xì)菌、寄生物、真菌、病毒、類病毒和朊病毒。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防疾病或病癥的方法，此方法包括給患者施用依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在各種實(shí)施方案中，要預(yù)防的疾病或病癥是可能想要免疫調(diào)控的。例如但不限于癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病。病原體包括細(xì)菌、寄生物、真菌、病毒、類病毒、和朊病毒。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療病癥的方法，此方法包括分離能夠生成細(xì)胞因子或趨化因子的細(xì)胞(包括但不限于免疫細(xì)胞、B細(xì)胞、T調(diào)節(jié)性細(xì)胞、B細(xì)胞、PBMC、pDC和淋巴樣細(xì)胞)；在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此類細(xì)胞，用SMRA離體處理此類細(xì)胞，使得所分離的細(xì)胞生成或分泌水平升高的細(xì)胞因子或趨化因子，并給需要細(xì)胞因子或趨化因子治療以預(yù)防或治療疾病的患者施用或再施用經(jīng)處理的細(xì)胞。本發(fā)明的這個(gè)方面會(huì)依照標(biāo)準(zhǔn)過繼性細(xì)胞免疫療法技術(shù)來產(chǎn)生活化的免疫細(xì)胞。在本發(fā)明這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，可以自患有或不患有疾病或病癥的受試者分離能夠生成細(xì)胞因子或趨化因子的細(xì)胞。此分離可以包括鑒定和選擇，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞分離規(guī)程(包括下文的具體實(shí)施例中所列出的那些)來實(shí)施。依照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程并使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件(其可以包括下文的具體實(shí)施例中所列出的培養(yǎng)規(guī)程和條件)來培養(yǎng)此類分離的細(xì)胞。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的又一個(gè)方面，在存在至少一種SIMRA的情況中培養(yǎng)分離的細(xì)胞，SIMRA的量和培養(yǎng)的時(shí)限足以與在沒有所述一種或多種SIMRA的情況中培養(yǎng)的分離細(xì)胞相比誘導(dǎo)、提高或增強(qiáng)細(xì)胞因子和/或趨化因子的生成和/或分泌。此時(shí)間可以從若干分鐘至若干小時(shí)、至若干天。此類分離的、經(jīng)SMRA處理的細(xì)胞可用于給供體再施用或者給第二位組織學(xué)相容患者施用，其中此供體或第二患者需要誘導(dǎo)、提高或增強(qiáng)細(xì)胞因子和/或趨化因子的生成和/或分泌。例如，給患有癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病的供體再施用或者給患有癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病的第二患者施用?？梢允褂冒▽?dǎo)管或注射施用或任何其它有效路徑的多種方式來實(shí)現(xiàn)此再施用或施用。本發(fā)明的這個(gè)方面還可應(yīng)用于可能具有有限的或不完全的啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力的患者或免疫受損的患者(例如受HIV感染的患者或骨髓移植的患者)。本發(fā)明的這個(gè)方面還可應(yīng)用于與給施用或再施用分離的、經(jīng)SIMRA處理的細(xì)胞的患者進(jìn)行SIMRA施用的組合。在依照本發(fā)明的任何方法中，SIMRA化合物能通過單獨(dú)地或與任何其它對(duì)治療或預(yù)防疾病或疾患有用的、不降低SIMRA化合物的免疫調(diào)控效果的藥劑組合地產(chǎn)生直接免疫調(diào)控效果而以各種方式起作用。在依照本發(fā)明的任何方法中，對(duì)治療或預(yù)防疾病或疾患有用的藥劑包括但不限于疫苗、抗原、抗體(優(yōu)選單克隆抗體)、細(xì)胞毒劑、變應(yīng)原、抗生素、siRNA、微小RNA、反義寡核苷酸、TLR激動(dòng)劑(例如TLR9激動(dòng)劑和/或TLR7激動(dòng)劑和/或TLR8激動(dòng)劑)、化療劑(傳統(tǒng)的化療和現(xiàn)代的靶向療法二者)、靶向治療劑、活化的細(xì)胞、肽、蛋白質(zhì)、基因療法載體、肽疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗、佐劑、和共剌激分子(例如細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式激活因子、肽或包含經(jīng)修飾氨基酸的肽)、或其組合。例如，在癌癥的治療中，可以將SIMRA化合物與一種或多種化療化合物、耙向治療劑和/或單克隆抗體組合施用。或者，所述藥劑可包括編碼抗原或變應(yīng)原的DNA載體。或者，所述SIMRA化合物可以與其它佐劑組合施用以增強(qiáng)針對(duì)所述SIMRA化合物的免疫應(yīng)答的特異性或強(qiáng)度。在依照本發(fā)明的任何方法中，SIMRA化合物的施用(單獨(dú)的或與任何其它藥劑組合的)可通過任何合適路徑來進(jìn)行，包括但不限于胃腸外(parenteral)、粘膜投遞(mucosaldelivery)、口月艮(oral)、舌下(sublingual)、經(jīng)皮(transdermal)、表面(topical)、吸入(inhalation)、鼻內(nèi)(intranasal)、氣溶膠(aerosol)、目艮內(nèi)(intraocular)、氣管內(nèi)(intratracheal)、直腸內(nèi)(intrarectal)、陰道(vaginal)、通過基因槍(genegun)、皮月夫貝占片(dermalpatch)或滴目艮劑(eyedrop)或、嫩口水(mouthwash)形式。SIMRA化合物的治療性組合物的施用可使用已知規(guī)程以有效減輕疾病的癥狀或替代標(biāo)志物的藥學(xué)有效量和時(shí)限來進(jìn)行。例如，SIMRA化合物用于治療疾病和/或病癥的藥學(xué)有效量可以是緩和或減輕癥狀，或者延遲或改善腫瘤、癌癥、或細(xì)菌、病毒或真菌感染所必需的量。作為疫苗佐劑使用的藥學(xué)有效量可以是對(duì)加強(qiáng)受試者對(duì)疫苗或抗原的免疫應(yīng)答有用的量。在施用調(diào)控針對(duì)共施用的抗原的免疫應(yīng)答的組合物的背景中，SIMRA化合物和抗原的藥學(xué)有效量是足以與在單獨(dú)施用該抗原時(shí)所獲得的免疫應(yīng)答相比實(shí)現(xiàn)想要的調(diào)控的量。任何具體應(yīng)用的有效量可以隨諸如所治療的疾病或疾患、所施用的具體寡核苷酸、受試者的體型、或疾病或疾患的嚴(yán)重程度等因素而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能憑經(jīng)驗(yàn)決定具體寡核苷酸的藥學(xué)有效量而沒有過度實(shí)驗(yàn)的必要。在系統(tǒng)性施用時(shí)，優(yōu)選以足夠劑量施用治療性組合物以使SIMRA化合物的血液水平達(dá)到約0.0001微摩爾至約10微摩爾。對(duì)于局部施用，比這低得多的濃度可以是有效的，而且可耐受高得多的濃度。優(yōu)選的是，SIMRA化合物的總劑量的范圍為約0.001mg每名患者每天至約200mg每kg體重每天。可能希望對(duì)個(gè)體同時(shí)地或順序地施用治療有效量的一種或多種本發(fā)明治療性組合物作為單次處理事件。SIMRA化合物可任選是與一種或多種變應(yīng)原和/或抗原(自身的或外來的)、免疫原性蛋白質(zhì)或肽相連接的，諸如匙孔i威血藍(lán)蛋白(KLH)、霍亂毒素B亞基、或任何其它免疫34原性載體蛋白。SIMRA化合物還可與其它化合物(例如佐劑)組合使用，包括但不限于TLR激動(dòng)劑(例如TLR2激動(dòng)劑和TLR9激動(dòng)劑)、弗氏不完全佐劑、KLH、單磷?；|(zhì)A(MPL)、明砜、和皂苷(包括QS-21和咪喹莫特(imiquimod))，或其組合。依照本發(fā)明這個(gè)方面的方法對(duì)于免疫系統(tǒng)的模型研究是有用的。所述方法對(duì)于人或動(dòng)物疾病的預(yù)防性或治療性處理也是有用的。例如，所述方法對(duì)于兒科和獸醫(yī)疫苗應(yīng)用是有用的。以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步例示本發(fā)明的某些例示性實(shí)施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的合成在自動(dòng)化DNA/RNA合成儀上使用亞氨基磷酸酯化學(xué)法化學(xué)合成免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。N-乙?；Ｗo(hù)的(除U外)2'-O-TBDMSRNA單體(A、G、C和U)購(gòu)自Sigma-Aldrich。7-脫氮-G、肌苷購(gòu)自ChemGenesCorporation。0.25M5-乙硫基-1H-四唑、PAC-酐C即A和C即B購(gòu)自GlenResearch。二氯甲烷(DCM)中的3%三氯乙酸(TCA)和5%3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物(Beaucage試劑)均自行制備。使用標(biāo)準(zhǔn)RNA合成方案以1-2iiM規(guī)模合成免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。切割和堿基脫保護(hù)自固體支持物切割免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸，并在甲胺和氫氧化銨溶液中除去外_環(huán)_胺的保護(hù)基團(tuán)。在SpeedVac中完全干燥所得溶液。IEHPLC純化通過離子交換HPLC來純化免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。使用DionexDNAPac100柱。將粗制的免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸溶液注射入HPLC中。實(shí)施上文的梯度，并收集級(jí)分?；旌纤泻谐^90%期望產(chǎn)物的級(jí)分，然后通過RotoV即將溶液濃縮至幾乎干的。添加不含RNA酶的水使終體積為10ml。C-18反相脫鹽如下清洗購(gòu)自Waters的tC-18S印-Pak筒(cartridge)，即用10ml乙腈流過，接著10ml0.5M乙酸鈉流過該筒。然后將10ml免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸溶液加載至該筒上。然后使用15ml水來洗去鹽。最后使用lml在水中的50%乙腈來洗脫免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。將該溶液放置在SpeedVac中達(dá)30分鐘。將剩余溶液流過0.2微米濾器過濾，然后凍干。然后將固體在不含RNA酶的水中再溶解以得到想要的濃度。在低于(TC貯存終溶液。通過毛細(xì)管電泳、離子交換HPLC和PAGE分析來對(duì)寡核糖核苷酸分析純度，并通過MALDI-ToF質(zhì)譜術(shù)來分析分子量。實(shí)施例2:用表達(dá)TLR的HEK293細(xì)胞進(jìn)行的測(cè)定法的方案將HEK293或HEK293XL/人TLR7或者HEK293或HEK293XL/人TLR8細(xì)胞(Invivogen，SanDiego，CA)在5%C02培養(yǎng)箱中在48孔板中在補(bǔ)充有10%熱滅活FBS的250ii1/孔DMEM中培養(yǎng)。報(bào)告基因轉(zhuǎn)化將穩(wěn)定表達(dá)人TLR7或TLR8的HEK293或HEK293XL細(xì)胞(Invivogen，SanDiego，35CA)在5%0)2培養(yǎng)箱中在48孔板中在補(bǔ)充有10X熱滅活FBS的250iil/孔匿EM中培養(yǎng)。在80%匯合時(shí)，在培養(yǎng)基中存在4ii1/mlLipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)的情況中用400ng/mlSEAP(分泌形式的人類胚胎堿性磷酸酶)報(bào)告質(zhì)粒(pNifty2-Se即)(Invivogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物。將質(zhì)粒DNA和Lipofectamine在不含血清的培養(yǎng)基中分開稀釋，并于室溫溫育5分鐘。溫育后，混合稀釋的DNA和Lipofectamine，并將混合物于室溫溫育20分鐘。將含有100ng質(zhì)粒DNA和1ii1Lipofectamine的25ii1DNA/Lipofectamine混合物的等分試樣添加至細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。頂0處理轉(zhuǎn)染后，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液。用0、20、50、100、150、200、或300iig/mlTLR7或TLR8激動(dòng)劑，即SIMRA剌激表達(dá)人TLR7或TLR8的HEK293或HEK29XL細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)-20小時(shí)。SIMRA處理結(jié)束時(shí)，自每項(xiàng)處理采集30y1培養(yǎng)物上清液，并遵照制造商的方案(Invivogen)用于SEAP測(cè)定法。SEAP(分泌形式的人類胚胎堿性磷酸酶)測(cè)定法簡(jiǎn)言之，將培養(yǎng)物上清液與對(duì)硝基苯基磷酸酯底物一起溫育，并通過讀板儀在405nm處測(cè)量所生成的黃色。數(shù)據(jù)顯示為NF-kB活性相對(duì)于PBS對(duì)照的倍數(shù)增加。(PuttaMR等，NucleicAcidsRes.，2006，34:3231-8)。實(shí)施例3:人細(xì)胞培養(yǎng)方案人PBMC分離通過Ficoll密度梯度離心法(Histopaque-1077，Sigma)自新鮮采集的健康志愿者血液(CBRLaboratories,Boston,MA)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。人pDC分離通過Ficoll密度梯度離心法(Histopaque-1077，Sigma)自新鮮采集的健康志愿者血液(CBRLaboratories,Boston,MA)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。使用BDCA4細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec)依照制造商的指令通過正選擇自PBMC分離pDC。人mDC分離通過Ficoll密度梯度離心法(Histopaque-1077，Sigma)自新鮮采集的健康志愿者血液(CBRLaboratories,Boston,MA)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。使用BDCA4細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec)依照制造商的指令通過正選擇自PBMC分離髓樣樹突細(xì)胞(mDC)。多重細(xì)胞因子測(cè)定法使用5xl(f個(gè)細(xì)胞/ml，在48孔板中分配人PBMC。使用lx106個(gè)細(xì)胞/ml，在96孔皿中分配pDC。以終濃度20、50、100、200或300iig/ml或如圖中所指示的將在DPBS(pH7.4;Mediatech)中溶解的SIMRA添加至細(xì)胞培養(yǎng)物。然后于37。C溫育細(xì)胞達(dá)24小時(shí)，并收集上清液用于Luminex多重測(cè)定法或ELISA測(cè)定法。在一式三份的孔中實(shí)施實(shí)驗(yàn)。通過三明治式ELISA來測(cè)量IFN-a、IL-6、或TNF-a水平。需要的試劑(包括細(xì)胞因子抗體和標(biāo)準(zhǔn)品)購(gòu)自PharMingen。在Luminex100/200儀器上使用Biosource人多重細(xì)胞因子測(cè)定法試劑盒來實(shí)施Luminex多重測(cè)定法，并使用由AppliedCytometrySystems(Sacramento,CA)供應(yīng)的StarStation軟件來分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例4:用TLR9激動(dòng)劑化合物處理的小鼠模型中的體內(nèi)細(xì)胞因子分泌5-6周齡的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠得自TaconicFarms(Germantown，NY)并依照IderaPharmaceutical的IACUC批準(zhǔn)的動(dòng)物方案來飼養(yǎng)。以25mg/kg(單劑)給小鼠(n=3)皮下(s.C)注射表3的各穩(wěn)定化免疫調(diào)控性基于RNA的寡核苷酸。施用免疫調(diào)控性寡核苷酸后2小時(shí)通過眶后采血來收集血清，并通過三明治式ELISA或Luminex多重測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞因子和趨化因子水平。結(jié)果顯示在圖8A、圖8B、圖9A和圖9B中，并且證明體內(nèi)施用依照本發(fā)明的SIMRA寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞因子和趨化因子序型。所有試劑(包括細(xì)胞因子和趨化因子抗體和標(biāo)準(zhǔn)品)都購(gòu)自PharMingen(SanDiego，CA)。實(shí)施例5:血清穩(wěn)定性測(cè)定法將約O.5個(gè)0D的來自表3的例示性SIMRA化合物個(gè)別地于37t:在含1%人血清的PBS中溫育30分鐘。在1%人血清中溫育30分鐘后，在陰離子交換HPLC上分析SIMRA化合物以測(cè)定與血清處理前存在的SIMRA化合物量相比保留的全長(zhǎng)SIMRA化合物的百分比。結(jié)果顯示在圖10A-圖10H中，并且證明了對(duì)基于RNA的化合物進(jìn)行的依照本發(fā)明的化學(xué)修飾能增強(qiáng)其穩(wěn)定性。等同方案雖然出于澄清和理解的目的已經(jīng)較為詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后會(huì)領(lǐng)會(huì)，可以對(duì)形式和細(xì)節(jié)做各種改變而不背離本發(fā)明和所附權(quán)利要求的真正范圍。權(quán)利要求一種SIMRA化合物，其選自由SIMRA#1至SIMRA#189組成的組。2.一種組合物，其包含權(quán)利要求l的S工MR化合物和生理學(xué)可接受載體。3.一種用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用依照權(quán)利要求l的S工MRA化合物。4.一種用于治療性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的依照權(quán)利要求l的S工MRA化合物。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。6.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物。7.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用靶向治療劑。8.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用抗體。9.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用DNA疫苗。10.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用蛋白質(zhì)疫苗。11.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用肽疫苗。12.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用抗原。13.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包含佐劑。14.一種用于預(yù)防性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的依照權(quán)利要求l的S工MRA化合物。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病或病癥是脊椎動(dòng)物中的癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。16.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物。17.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用靶向治療劑。18.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用抗體。19.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用DNA疫苗。20.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用蛋白質(zhì)疫苗。21.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用肽疫苗。22.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用抗原。23.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用佐劑。全文摘要本發(fā)明涉及新型穩(wěn)定化寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)節(jié)劑用于免疫療法應(yīng)用的治療用途。具體地，本發(fā)明提供了新的基于RNA的寡核糖核苷酸，其具有改善的核酸酶和RNA酶穩(wěn)定性，而且具有經(jīng)由TLR7和/或TLR8的免疫調(diào)控活性。文檔編號(hào)A61K48/00GK101795715SQ200880106124公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2008年7月7日優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日發(fā)明者蘭濤,埃坎巴·R·坎迪馬拉,王大慶,蘇迪爾·阿格拉沃爾,萊克什米·巴加特申請(qǐng)人:艾德拉藥物股份有限公司