專利名稱：：正義單鏈RNA包膜病毒的2-氨基-2,7-雙脫氧-α-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒感染的治療，具體指正義單鏈RNA包膜病毒感染。
背景技術(shù)：
：正義單鏈RNA包膜病毒，例如，黃病毒科的成員，人類和動(dòng)物種群目前健康有關(guān)的問題。例如，丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝病的主要原因，導(dǎo)致肝硬化和肝癌(1)。這是世界范圍約1.7億個(gè)體的主要病原體感染(1，2)。另外一個(gè)正義單鏈RNA包膜病毒的例子是登革熱病毒。登革熱病毒(DV)感染包括一個(gè)由四個(gè)血清型DV(1-4型)之一感染引起的疾病的頻譜，發(fā)生在世界上許多熱帶和亞熱帶地區(qū)。登革熱的地理分布已傳播持續(xù)了30年，包括100多個(gè)國家(WH0(3))?；诟腥綝V的數(shù)字(約5000萬/年)以及每年成千上萬嚴(yán)重登革熱病例的事實(shí)(WHO,(3))，在2005年，美國疾病控制中心(CDC)認(rèn)為登革熱是影響人類的最重要的蚊子傳播的病毒性疾病。DV的全球分布比得上瘧疾，估計(jì)有25.0億人在疫情傳播的高危地區(qū)居住。每年都有成千上萬登革出血熱(DHF)的病例報(bào)道，達(dá)到病例約5%的死亡率，其中大多數(shù)是兒童和年輕人。由于這些病毒造成的健康問題，有必要研究正義單鏈RNA包膜病毒，以便找到治療或抑制病毒感染的適當(dāng)方法。用于研究這樣的病毒的一個(gè)模型系統(tǒng)是復(fù)制子。病毒復(fù)制子是RNA分子，或RNA區(qū)域，即來自單一復(fù)制源的復(fù)制。丙型肝炎病毒RNA復(fù)制子裝備有新霉素抗性基因，允許丙型肝炎病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抑制劑的篩選和鑒定。但是，由于復(fù)制子不進(jìn)行完整的復(fù)制周期，藥物篩選程序和單靠這些化驗(yàn)為基礎(chǔ)的行動(dòng)研究機(jī)制可能無法識(shí)別靶向病毒復(fù)制周期早期(病毒粒附著，進(jìn)入，脫殼)或晚期(病毒顆粒組裝，出口)階段的化合物。此外，可能負(fù)面影響新霉素抗性的藥物有可能也會(huì)抑制丙型肝炎病毒RNA復(fù)制子的病毒復(fù)制，而不會(huì)影響任何病毒機(jī)制，從而需要附加的篩選以過濾出假陽性。在這方面，氨基苷類，如新霉素類似物，利用該丙型肝炎病毒復(fù)制子篩選通常不會(huì)被認(rèn)為是潛在抗病毒藥物。鑒于研究丙型肝炎病毒的問題，其他的病毒可能是更好的研究模型。其中一種丙型肝炎病毒的此類模型是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。BVDV通常用作丙型肝炎病毒感染的替代模型。BVDV是一種正義單鏈RNA包膜病毒，屬于黃病毒科科(4)。BVDV是已知能導(dǎo)致感染的動(dòng)物消化道嚴(yán)重病變隨后死亡(5，6)。可以從感染動(dòng)物分離出兩種生物型細(xì)胞病變(cpBVDV)和非細(xì)胞病變(ncpBVDV)(7)。但是，只有cpBVDV誘導(dǎo)細(xì)胞病理學(xué)敏感細(xì)胞類型，如馬-達(dá)氏牛腎(細(xì)胞(MDBK)。因?yàn)楦鞣N原因BVDV是一種良好的HCV模型。牛病毒性腹瀉病毒具有類似丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)組織(8)。與HCV—樣，BVDV可利用低密度脂蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞，使用功能類似的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)轉(zhuǎn)錄，利用具有同源NS3蛋白酶的NS4A輔助因子，具有類似NS3解旋酶/核苷三磷酸酶(NTPase)以及機(jī)械地類似NS5BRNA依賴的RNA聚合酶，并有顯然類似機(jī)制的病毒粒子成熟、組裝和出口(8)。由于大量與這些病毒相關(guān)的人類的問題，迫切需要預(yù)防和/或治療正義單鏈RNA包膜病毒感染的組合物和方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是式11的化合物Kg￡3其中I^包括H、環(huán)烷基、碳水化合物、肽或核苷酸基團(tuán)其中R2和R3各獨(dú)立地包括H、烷基、環(huán)烷基、羥烷基、烷氧基烷基、卣代烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、?；?、芳?；?、雜芳?；被驶屯檠趸驶?，所有這些基團(tuán)可以任選地被以下基團(tuán)取代羥基、烷氧基、烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亞硫?；⑼榛酋；?、氰基、硝基和/或鹵素其中R4、R5和R6各獨(dú)立地包括0R2、鹵素、S(0)nR8、CR9R1(IRU、CH20R、CN、C02R、C0NR12R13和NR12R13，其中R和R8-R13獨(dú)立地選自以下組成的群組H、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、鹵代烷基、芳烷基、雜芳基烷基，并且n=0-2附帶條件是當(dāng)R2和R3=H，且R4、R5和R6=OH時(shí)，&不包括H。優(yōu)選的化合物包括那些化合物，其中&選自鏈霉胺或2-脫氧鏈霉胺組成的群組，R2和R3是H，以及R4、R5和R6是0H。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種用于治療正義單鏈RNA包膜病毒感染的組合物，包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其類似物。所述組合物降低病毒顆粒的傳染性。所述的組合物可用于治療選自以下組成的群組中的病毒丙肝病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、黃熱(YFV)、登革熱病毒(DV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)和辛德畢斯病毒(SINV)，或所述的病毒的組合。所述組合物的所述氨基糖苷可以包括未修飾的2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分，或其類似物。優(yōu)選的組合物包括遺傳霉素或作為氨基糖苷的其類似物?？梢栽谒?-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的氨基或羥基基團(tuán)上利用修飾基團(tuán)官能化。所述修飾基團(tuán)選自以下組成的群組烷基、環(huán)烷基、羥烷基、烷氧基烷基、鹵代烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、?；?、芳?；㈦s芳?；?、氨基羰基和烷氧基羰基，所有這些基團(tuán)可以任選地被以下基團(tuán)取代羥基、烷氧基、7烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亞硫?；⑼榛酋；?、氰基、硝基和/或鹵素。此外，所述2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖_吡喃庚糖基成分的羥基或氨基基團(tuán)中的一個(gè)可以被利用選自以下群組的取代基取代鹵素、S(0)nR、NR"2、0R、酰氧基(0acy1)、CI^I^Rs、CH20R、CN、C02R、C0NR凡，其中R、&、R2、R3獨(dú)立地選自以下組成的群組H、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、鹵代烷基、芳烷基和雜芳基烷基，并且n二0-2。具體地，6-0H可以被這樣取代。同樣，所述2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的所述2-氨基基團(tuán)可以被利用?；鶊F(tuán)進(jìn)行官能化，所述?；鶊F(tuán)包括脂肪酸。所述2-氨基基團(tuán)也可以被烷基化，例如被甲基化。本發(fā)明的所述的組合物可以進(jìn)一步包括藥劑學(xué)上可接受的載體且該載體無結(jié)合至核糖體RNA的組分并抑制包膜病毒蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯，和/或病毒顆粒的組裝或釋放。所述氨基糖苷成分存在的濃度以重量計(jì)從約0.001%到約40%，并可以進(jìn)一步包括至少一種選自以下組成的群組的添加劑抗菌劑、穩(wěn)定劑、抗真菌劑、止痛劑、抗氧化劑、緩沖劑、遮光劑、化妝用齊U、芳香齊U、潤滑齊U、油齊U、增濕齊IJ、醇、干燥齊IJ、防腐齊IJ、乳化齊IJ、增稠齊IJ、清潔齊IJ、增塑劑、滲透促進(jìn)劑，或它們的混合物。所述的組合物還可以進(jìn)一步包括至少一種選自以下組成的群組的附加抗病毒劑干擾素、三氮唑核苷和正亞氨基糖。本發(fā)明的另一實(shí)施例是一種用于治療多細(xì)胞生物體中正義單鏈RNA包膜病毒感染的方法，包括給感染了正義單鏈RNA包膜病毒的所述的多細(xì)胞生物體施用一組合物，該組合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其類似物，以及藥劑學(xué)上可接受的載體。所述組合物的所述氨基糖苷降低病毒顆粒的傳染性。所述方法的所述組合物在包括至少一日的時(shí)間段內(nèi)至少每日被施用一次。本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施例是一種用于治療多細(xì)胞生物體中正義單鏈RNA包膜病毒感染的方法，包括首先診斷所述正義單鏈RNA包膜病毒在所述生物體內(nèi)表現(xiàn)的臨床癥狀，隨后給所述生物體施用一組合物，該組合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-雙脫氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其類似物，以及藥劑學(xué)上可接受的載體。臨床癥狀包括可檢測(cè)的體液中的病毒抗體存在、體液中的病毒滴度的診斷水平、疼痛、腫脹、發(fā)高燒、炎癥、發(fā)紅、麻剌感、癢、皮膚損傷、或它們的組合。所述組合物的施用可以是局部、口服、舌下、粘膜、經(jīng)膜、皮下、靜脈、肌肉、含服、腸外、陰道、肛門、經(jīng)皮、側(cè)腦室注射、經(jīng)由離子電泳作用，或它們的組合。本發(fā)明的還以實(shí)施例是一種用于防止正義單鏈RNA包膜病毒感染傳播的方法，包括給感染了正義單鏈RNA包膜病毒的生物體以生理學(xué)上適當(dāng)?shù)姆绞绞┯靡唤M合物，該組合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其類似物，以及藥劑學(xué)上可接受的載體。所述組合物的所述氨基糖苷降低病毒顆粒的傳染性。圖1表示在72小時(shí)感染后遺傳霉素對(duì)NADL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性保護(hù)。(頂部畫面)遺傳霉素(geneticin)(31-250yg/ml)對(duì)MDBK細(xì)胞生活力沒有影響。(底部畫面)遺傳霉素(1.5-25i!g/ml)治療改善受感染細(xì)胞的生活力，相比未受治療的感染細(xì)胞。圖2表示遺傳霉素抑制感染了BVDV的NADL或NY-1株的MDBK細(xì)胞內(nèi)的病毒載量。畫面A)遺傳霉素，6、12和25iig/ml，在24和48小時(shí)感染后對(duì)NADL的活性病毒滴度的影響。畫面B)遺傳霉素，6、12和25iig/ml，在24和48小時(shí)感染后對(duì)NY-l的活性病毒滴度的影響。圖3表示遺傳霉素介導(dǎo)的對(duì)NADL的細(xì)胞保護(hù)作用，相比卡那霉素和慶大霉素。畫面A)本研究使用的卡那霉素、慶大霉素和遺傳霉素結(jié)構(gòu)圖。畫面B)只有遺傳霉素提供對(duì)MDBK細(xì)胞內(nèi)BVDV的NADL株的細(xì)胞保護(hù)作用(所有治療每劑藥12yg/ml)。干擾素正控制在100IU使用。圖4表示遺傳霉素對(duì)病毒翻譯和NS3或RNA復(fù)制過程沒有影響。畫面A表示利用NS3的主要抗體(Mab20.10.6)的免疫印跡分析。畫面B表示在6和12yg/ml遺傳霉素存在下感染BVDV的NADL株的MDBK細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR分析。發(fā)明詳細(xì)描述遺傳霉素(G418，圖3A)是由革蘭氏陽性土壤細(xì)菌紅橙小單孢菌生產(chǎn)的氨基糖苷類抗生素。氨基糖苷類是修飾的糖類，氨基基團(tuán)被糖類羥基基團(tuán)中的一個(gè)取代。遺傳霉素已被主張用作人類抗寄生蟲劑(9)。此外，遺傳霉素(10)或相關(guān)的慶大霉素(11)的施用已經(jīng)證明在治療遺傳性疾病患者中有幫助(12)。遺傳霉素是含新霉素的含2-氨基-2，7-雙脫氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基類似物，廣泛用于選擇轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞(13，14)。遺傳霉素也可用于黃病毒科病毒的穩(wěn)定病毒復(fù)制子的轉(zhuǎn)染；然而，沒有關(guān)于遺傳霉素對(duì)這些RNA病毒的效果的現(xiàn)有信息。本發(fā)明表明，遺傳霉素確實(shí)是抗病毒劑，由MDBK細(xì)胞對(duì)cpBVDV(NADL)的細(xì)胞病變效應(yīng)和cpBVDV(NADL)和ncpBVDV(NY-l)生產(chǎn)的抑制證明，用約4微克/毫升EC5。。遺傳霉素抗病毒效果是濃度依賴性(圖1)。用于抗BVDV活性的EC5。濃度為4微克/毫升(表1)，并在12.5微克/毫升，它增加未感染控制細(xì)胞的水平的細(xì)胞活力。遺傳霉素的這種抗病毒和細(xì)胞保護(hù)活性可以與那些干擾素相比，其在100IU抑制BVDV導(dǎo)致的CPE，其是用于BVDV體系中干擾素的抗病毒活性的EC9。[20，21]。在如400微克/毫升以上的高劑量，遺傳霉素被證明具有細(xì)胞毒性，由在這些濃度細(xì)胞活性的下降曲線反映。本發(fā)明還表明，遺傳霉素阻礙與NADL介導(dǎo)的細(xì)胞病理學(xué)相關(guān)的單分子層破裂。遺傳霉素的這種抗病毒活性感染后72-120小時(shí)可以觀察出，表明病毒的傳播受到抑制。此外，病毒復(fù)制的特性，通過測(cè)量進(jìn)入細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基的傳染性病毒，表明在感染后24和48小時(shí)，遺傳霉素(6-25微克/毫升)抑制BVDV的NADL和NY_1株二者的病毒產(chǎn)量10到100倍(圖2)。在感染的第一個(gè)48小時(shí)遺傳霉素明顯減少病毒產(chǎn)量至低于10%控制水平。雖然不想以任何具體的理論進(jìn)行限制，根據(jù)在我們研究中使用的病毒滴度方法的事實(shí)，只有測(cè)量進(jìn)入培養(yǎng)基中的活性傳染性顆粒的釋放，人們可以得出遺傳霉素抑制病毒釋放或降低病毒顆粒的傳染性。遺傳霉素在濃度為25微克/毫升對(duì)病毒蛋白NS3，BVDV轉(zhuǎn)譯的標(biāo)記物沒有影響，在10的多重感染(MOI)感染后24小時(shí)(圖4)。24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)被用來證明穩(wěn)定的BVDV轉(zhuǎn)譯，因?yàn)楦進(jìn)OI(例如，MOI值為10)和稍后的時(shí)間點(diǎn)，病毒細(xì)胞病理學(xué)和細(xì)胞死亡發(fā)生，使分析不可靠的[14]。此外，遺傳霉素不阻止NS2-NS3蛋白的處理(圖4)，其通常被觀察為BVDV的非致細(xì)胞病變株，表明遺傳霉素介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用不是由于對(duì)病毒蛋白處理的抑制。另外，120kDa條帶的NS2-NS3，通常在感染ncpBVDV過程中被觀察到，不能在遺傳霉素處理或感染NADL的未經(jīng)處理細(xì)胞中找到。這些數(shù)據(jù)表明，遺傳霉素盡管蛋白質(zhì)合成抑制劑(15，16)，但是不直接通過抑制轉(zhuǎn)譯或復(fù)制而抑制病毒產(chǎn)量。此外，由于病毒進(jìn)入在轉(zhuǎn)譯之前，所以極不可能的是遺傳霉素在轉(zhuǎn)譯之前阻止病毒生理反應(yīng)。此外，假定轉(zhuǎn)譯與RNA數(shù)量成比例，則遺傳霉素不可能阻止RNA轉(zhuǎn)錄。因此，遺傳霉素控制活性病毒的組裝或釋放，或者它降低病毒顆粒的傳染性。該結(jié)論也得到菌斑測(cè)定的支持，其中均勻6和12微克/毫升的遺傳霉素顯著減小菌斑大小，而不影響菌斑數(shù)量。氨基糖管類被認(rèn)為通過干涉病毒進(jìn)入以及抑制病毒RNA的轉(zhuǎn)譯來抑制病毒復(fù)制(17-19);但遺傳霉素對(duì)BVDV的抗病毒行為是唯一不同的，因?yàn)槠錂C(jī)制似乎與隨后的病毒轉(zhuǎn)譯、處理和復(fù)制的時(shí)間有關(guān)。要確定是否遺傳霉素調(diào)控病毒RNA的復(fù)制，用RT-qPCR測(cè)定病毒RNA的細(xì)胞內(nèi)累積。在用BVDV(M015)感染后24小時(shí)，并缺乏或存在不同濃度遺傳霉素情況下細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的數(shù)量無差異。此外，抗病毒濃度的遺傳霉素?zé)o法抑制病毒RNA在感染24小時(shí)在細(xì)胞內(nèi)累積后也提示需要病毒RNA合成的病毒NS5B被成功地轉(zhuǎn)譯和處理。因此，病毒RNA的復(fù)制不由遺傳霉素調(diào)控。表1顯示遺傳霉素的抗病毒活性的總結(jié)。細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)(CPEA)是病毒引起細(xì)胞死亡的測(cè)定；產(chǎn)生的值保護(hù)50%的細(xì)胞免受病毒引起死亡的藥物有效濃度(EC5。)。產(chǎn)量減少檢測(cè)是感染的細(xì)胞釋放的活性感染性病毒顆粒數(shù)目的測(cè)定；產(chǎn)生的值是降低病毒滴度50%的藥物有效濃度(EC5。)。殺死50%細(xì)胞所需的細(xì)胞中毒濃度被定義為(1:5。，且是對(duì)藥品內(nèi)在毒性的測(cè)定。雖然不想以任何特定的理論進(jìn)行限制，目前的數(shù)據(jù)表明遺傳霉素以及可能的其它含有2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的抗病毒劑減小了病毒顆粒的感染性并抑制病毒的傳播和改善病毒感染的癥狀。表1.遺傳霉素對(duì)黃病毒和瘟病毒的抗病毒活性的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>aDV=登革熱病毒，YFV=黃熱病毒，BVDV=牛病毒性腹瀉病毒bBHK=幼倉鼠腎，BND=寬吻海豚細(xì)胞，MDBK=馬-達(dá)氏牛腎eCPEA=細(xì)胞病變效應(yīng)檢測(cè)(CPEA)，檢測(cè)細(xì)胞死亡；EC5。=保護(hù)50%的細(xì)胞免受病毒引起死亡的藥物有效濃度產(chǎn)量減少檢測(cè)是感染的細(xì)胞釋放的活性感染性病毒顆粒數(shù)目的測(cè)定；產(chǎn)生的值是降低病毒滴度50%的藥物有效濃度dYRA=產(chǎn)量減少檢測(cè)。檢測(cè)感染的細(xì)胞釋放的活性感染性病毒顆粒數(shù)目的減少EC5。=使病毒滴度降低50%的藥物有效濃度6CC5。=殺死50%細(xì)胞所需的細(xì)胞中毒濃度fnd=未定遺傳霉素具有不可逆轉(zhuǎn)的耳毒性和腎毒性的可能，如大多數(shù)氨基糖苷類一樣。毒性較低的新類似物將大大有助于治療和/或與預(yù)防正義單鏈RNA包膜病毒感染。斜勾-雄條藩成,分遺傳霉素的結(jié)構(gòu)-功能分析，與其接近結(jié)構(gòu)類似物卡那霉素B和慶大霉素比較，發(fā)現(xiàn)只有遺傳霉素具有對(duì)cpBVDV活性，通過顯著提高感染細(xì)胞的活力顯示(圖3)。此外，慶大霉素和卡那霉素再實(shí)驗(yàn)濃度下降低感染細(xì)胞的細(xì)胞活力。所有這三個(gè)化合物結(jié)構(gòu)上有共同的環(huán)n(2-脫氧鏈霉胺類)，表明遺傳霉素的正義單鏈RNA包膜的抗病毒活性與環(huán)II沒有關(guān)系。此外，慶大霉素和遺傳霉素關(guān)于環(huán)III是相同的，從而排除它作為抗病毒成分。因此，環(huán)I，2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖(式I)，似乎確定遺傳霉素作為正義單鏈RNA包膜的抗病毒劑的特性。當(dāng)確認(rèn)時(shí)，不包含2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的其它有關(guān)氨基糖苷類，如巴龍霉素，沒有對(duì)BVDV的抗病毒活性。此外，結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的抗生素，例如，四環(huán)素和夫西地酸，對(duì)BVDV無效。此結(jié)構(gòu)-功能分析不同于蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類抑制，通過結(jié)合到30S核糖體的A點(diǎn)(20)，對(duì)此遺傳霉素特性約束與環(huán)II的存在相關(guān)(圖3A)(21)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式I關(guān)于環(huán)I的化學(xué)結(jié)構(gòu)，遺傳霉素的2-氨基-2，7-雙脫氧_a-D-甘油_D_葡糖-吡喃庚糖成分，吡喃糖環(huán)的碳_3和碳_4(式I和圖3A)用羥基取代，并在兩個(gè)取代中相同和配置為卡那霉素的環(huán)I的結(jié)構(gòu)(圖3A)，其沒有抗病毒活性。然而，對(duì)于遺傳霉素，在2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的碳_6上的取代不同于卡那霉素的環(huán)I，醇作為通過碳-6的附加甲基取代的仲醇。因此，這兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)相關(guān)的差異與吡喃糖環(huán)外部的碳原子，碳_6的官能化相關(guān)。仲羥基加上位置_6上甲基取代的組合給遺傳霉素至小亞基核糖體最低的親和力(明哥特_勒克萊爾等，1999年；普菲斯特PS等2005)。這些觀察表明，對(duì)遺傳霉素抗病毒活性的結(jié)構(gòu)要求不同于那些確定轉(zhuǎn)譯的抑制，并支持結(jié)論2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分負(fù)責(zé)遺傳霉素的正義單鏈RNA包膜抗病毒活性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供下式II表示的抗病毒化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式II其中&包括H、環(huán)烷基、碳水化合物、肽或核苷酸基團(tuán)其中R2和R3各獨(dú)立地包括H、烷基、環(huán)烷基、羥烷基、烷氧基烷基、卣代烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、?；?、芳?；?、雜芳?；?、氨基羰基和烷氧基羰基，所有這些基團(tuán)可以任選地被以下基團(tuán)取代羥基、烷氧基、烷基、鹵代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亞硫酰基、烷基磺?；?、氰基、硝基和/或鹵素其中R4、R5和R6各獨(dú)立地包括0R2、鹵素、S(0)nR8、CR具。Rn、CH20R、CN、C02R、C0NR12R13和服12113，其中R和R8-R13獨(dú)立地選自以下組成的群組H、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、鹵代烷基、芳烷基、雜芳基烷基，并且n=0-2附帶條件是當(dāng)R2和R3=H，且R4、R5和R6=0H時(shí)，&不包括H。本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括式H表示的那些化合物，其中&選自H和環(huán)己胺類似物鏈霉胺和2-脫氧鏈霉胺組成的群組，R2和R3是H，以及R4、R5和R6是0H。此處所述的術(shù)語"低烷基"包括支鏈和直鏈Q(jìng)到C6烷基。術(shù)語"環(huán)烷基"包括C3到Q。環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)己基和環(huán)癸基。術(shù)語"脂肪酸"包括飽和或不飽和、直鏈或支鏈的Q-C^羧酸。組合物本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供包括或基本上由抗病毒劑組成的組合物，其包括2_氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分和/或能抑制正義單鏈RNA包膜病毒傳播和感染的其類似物，藥劑學(xué)上可接受的載體，當(dāng)以生理學(xué)上合適的方式試用至多細(xì)胞生物體，如人類或動(dòng)物時(shí)，降低所述生物體內(nèi)的RNA病毒的滴度并預(yù)防或改善所述生物體內(nèi)感染有關(guān)的癥狀的發(fā)生。本發(fā)明的抗病毒劑可以包括2-氨基-2，7-雙脫氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖本身或其類似物。所述2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分可以如上述進(jìn)行修飾或不修飾。一種優(yōu)選的抗病毒劑是遺傳霉素。所述的組合物的抗病毒劑存在的濃度以重量計(jì)從約0.001%到約40%，優(yōu)選為以重量計(jì)從約0.1%到約1%。所述組合物也可以進(jìn)一步包括一種或多種添加劑，例如抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、止痛劑、抗氧化劑、緩沖劑、遮光劑、化妝用劑、芳香劑、潤滑劑、油齊U、增濕齊U、醇、干燥齊U、防腐齊U、乳化齊iJ、增稠齊iJ、清潔齊iJ、增塑齊iJ、滲透促進(jìn)劑，或它們的混合物。此外，藥劑學(xué)上可接受的載體無結(jié)合至核糖體RNA的組分并抑制包膜病毒蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯，和/或病毒顆粒的組裝或釋放?？梢允褂酶鞣N載體，只要它們與人體或動(dòng)物的血液和組織相容，以使所述組合物可以被注射或吸收而不導(dǎo)致有害的生理效果或干擾活性成分的功能。對(duì)于水溶性抗病毒劑，所述載體可以是水。此外，所述的組合物可以進(jìn)一步包括附加抗病毒劑。具體而言，通過不同于遺傳霉素及其類似物機(jī)制的行為抑制病毒復(fù)制的抗病毒劑，當(dāng)其與本發(fā)明的抗病毒劑結(jié)合時(shí)，可以增強(qiáng)抗病毒反應(yīng)并允許減少劑量，從而減小毒性和使不期望的副作用最小化。而且具有不同機(jī)制的行為的此類抗病毒劑的結(jié)合可以用于減小病毒發(fā)展耐藥性的傾向。此類抗病毒劑的例子包括干擾素、三氮唑核苷和正亞氨基糖。本發(fā)明的一個(gè)代表性可注射實(shí)施例包括2-氨基-2，7-雙脫氧-a_D_甘油_D_葡糖_吡喃庚糖和/或其類似物，濃度從約0.Olmg/mL至約500mg/mL，懸浮在等滲氯化鈉的載體溶液中，該載體溶液包含適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，諸如約O.1至約1.5%苯甲醇，穩(wěn)定劑，諸如約0.25至約1%羧甲基纖維素鈉和約0.005至約0.1聚山梨醇酯80，加上足量氫氧化鈉或鹽酸以調(diào)節(jié)pH至約5.0至約7.5之間(所有百分比都以重量計(jì))。病毒本發(fā)明含2-氨基-2，7-雙脫氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基的抗病毒劑選擇性用于正義單鏈RNA包膜病毒。負(fù)義單鏈RNA包膜病毒，例如流感病毒，以及雙鏈DNA病毒，例如，單純皰疹病毒(HSV)和乙型肝炎病毒(HBV)不受影響。典型的正義單鏈RNA包膜病毒包括丙肝病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、黃熱(YFV)、登革熱病毒(DV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)和辛德畢斯病毒(SINV)。正義單鏈RNA包膜病毒的一個(gè)科，黃病毒具有單分體、線性、正極性的單鏈RNA基因組、長度9.6-12.3kb。病毒顆粒被包覆且為球形。在所述科中有幾個(gè)屬，包括黃病毒屬，具有黃熱病病毒、西尼羅病毒和登革熱病毒種；肝炎病毒屬，唯一丙肝病毒種；以及瘟病毒屬，包括牛病毒性腹瀉病毒和馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)種，其它感染非人類的哺乳動(dòng)物。由黃病毒科所造成的主要疾病包括登革熱、圣路易斯腦炎、西尼羅腦炎、黃熱病和丙型肝炎。辛德畢斯病毒(SINV)是披膜病毒科的成員，在甲病毒亞科。該病毒由蚊子傳播并導(dǎo)致人體辛德比斯熱，癥狀包括關(guān)節(jié)痛、皮疹和不適。類似物關(guān)于遺傳霉素的環(huán)I，2-氨基-2，7-雙脫氧_a-D-甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基成分(式I;同樣式II，其中R15R2和R3=H，以及R4，R5和R6=OH)可以利用各種修飾基團(tuán)進(jìn)行官能化以形成與本發(fā)明的抗病毒劑一樣活性的衍生物。例如，連接至碳-3，_4，和/或-6羥基可被官能化以形成衍生物。在非限制的例子中，羥基可以利用鹵代烷或其它烷化劑烷基化以形成烷氧基團(tuán)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。作為選擇，使用諸如酰氯或酸酐的?；瘎?，例如醋酸酐，?；u基以形成酰氧基。同樣，連接至碳-2的氨基可以被烷基化或?；苑謩e形成烷和酰胺基。例如，酰基基團(tuán)可以是脂肪酸，具有4-28碳范圍；和烷基基團(tuán)可以是具有l(wèi)-6碳范圍的低烷基，如甲基、乙基、正丁基或正己基。附加的修飾或官能化基團(tuán)包括烷基、環(huán)烷基、羥烷基、烷氧基、卣代烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、?；⒎减；㈦s芳?；?、氨基羰基和烷氧基羰基，所有這些基團(tuán)可以任選地被以下基團(tuán)取代羥基、烷氧基、烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亞硫?；?、烷基磺?；⑶杌?、硝基和/或鹵素。本文中所使用的術(shù)語"類似物"包括上述衍生物，其中2-氨基-2，7-雙脫氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分已被利用各種修飾基團(tuán)取代或官能化。該術(shù)語還包括下述的分子，其中一個(gè)核心分子的一個(gè)或多個(gè)功能團(tuán)，例如，羥基或氨基，已被其它原子或基團(tuán)取代。此外術(shù)語"類似物"也包括2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖與其他生物相關(guān)分子的軛合物，例如，肽和其他碳水化合物，如下所述。關(guān)于等量取代化學(xué)，2-氨基-2，7-雙脫氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基成分的羥基和/或氨基基團(tuán)可以利用鹵素取代，如氟和氯。其它羥基和/或氨基取代可以包括S(0)nR、0R、酰氧基、CR^RpCH2OR、CN、C02R和CONR凡，其中R、&、R2、R3獨(dú)立地選自以下組成的群組H、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、鹵代烷基、芳烷基和雜芳基烷基，并且n=0-2，該合成方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。修飾的具體有用方面是碳-6羥基基團(tuán)，在吡喃糖環(huán)外部。式III的化合物是羥基基團(tuán)的衍生物，如上所述。下面式IV的化合物是類似物，其中6-羥基基團(tuán)已由另一功能基團(tuán)(X)取代，如上所述。式III<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>式IV2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖與碳水化合物、脂肪酸、肽或核酸、以及它們的衍生物的軛合物，在治療多細(xì)胞生物體特別是人類的正義單鏈RNA包膜病毒感染中也有用，降低病毒顆粒的傳染性，從而抑制病毒的傳播及改善的病毒感染癥狀。修飾或未修飾2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的軛合物可以包括但不限于碳水化合物、其它氨基糖、氨基糖等排物，例如，鏈霉胺和2-脫氧鏈霉胺、脂肪酸、肽和/或核酸、以及它們的衍生物和類似物。此處上文所述的結(jié)構(gòu)修飾影響親脂/親水平衡(也稱為LogP或LogK。J、水溶性、極性和其它直接與藥物吸收和分布有關(guān)的理化特性。這種修飾可以提高本發(fā)明的抗病毒制劑的療效。它們可能也有助于緩和潛在毒性。治療的方法在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于治療多細(xì)胞生物體特別是人類的正義單鏈RNA包膜病毒感染的方法，包括給感染了RNA包膜病毒的生物體以生理學(xué)上適當(dāng)?shù)姆绞绞┯靡唤M合物，其中該組合物包括至少一種抗病毒劑，其包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7_雙脫氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖或其類似物，其可以抑制正義單鏈RNA包膜病毒組裝、釋放和/或傳播，以及藥劑學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的抗病毒劑包括遺傳霉素或其類似物?？共《拘Ч峭ㄟ^降低病毒顆粒的傳染性實(shí)現(xiàn)。此治療可以用于預(yù)防最初感染，減慢存在的感染進(jìn)程或改善存在正義單鏈RNA包膜病毒感染或病毒爆發(fā)期的癥狀。所述抗病毒劑存在的濃度以重量計(jì)從約0.001%到約40%，優(yōu)選以重量計(jì)約0.1%至約1%。所述的組合物至少每日被施用一次，并在包括至少一日的時(shí)間段。所述的治療方法還包括診斷所述正義單鏈RNA包膜病毒在所述生物體內(nèi)的臨床癥狀的初步步驟。這些臨床癥狀包括可檢測(cè)的體液中的病毒抗體存在、體液中的病毒滴度的診斷水平、疼痛、腫脹、發(fā)高燒、炎癥、發(fā)紅、麻剌感、癢、皮膚損傷、或它們的組合。所述治療正義單鏈RNA包膜病毒感染的方法還可包括一組合物的使用，該組合物進(jìn)一步包括一添加劑，例如抗菌齊U、穩(wěn)定齊U、抗真菌齊U、止痛齊U、抗氧化齊U、緩沖齊U、遮光齊U、化妝用齊U、芳香齊U、潤滑齊U、油齊U、增濕齊U、醇、干燥齊U、防腐齊iJ、乳化齊iJ、增稠齊iJ、清潔齊iJ、增塑齊iJ、滲透促進(jìn)劑，或它們的混合物。此外，所述治療正義單鏈RNA包膜病毒感染的方法還可包括一組合物的使用，該組合物進(jìn)一步包括附加抗病毒劑。具體而言，通過不同于遺傳霉素及其類似物機(jī)制的行為抑制病毒復(fù)制的抗病毒劑，當(dāng)其與本發(fā)明的抗病毒劑結(jié)合時(shí)，可以增強(qiáng)抗病毒反應(yīng)并允許減少劑量，從而減小毒性和使不期望的副作用最小化。而且具有不同機(jī)制的行為的此類抗病毒劑的結(jié)合可以用于減小病毒發(fā)展耐藥性的傾向。此類附加抗病毒劑的例子包括干擾素、三氮唑核苷和正亞氨基糖。所述組合物的施用可以是局部、口服、舌下、粘膜、經(jīng)膜、皮下、靜脈、肌肉、含服、腸外、陰道、肛門、經(jīng)皮、側(cè)腦室注射、經(jīng)由離子電泳作用，或它們的組合。本發(fā)明的另一實(shí)施例提供防止正義單鏈RNA包膜病毒感染傳播的方法。該方法包括給感染了正義單鏈RNA包膜病毒的生物體以生理學(xué)上適當(dāng)?shù)姆绞绞┯靡唤M合物，其中該組合物包括至少一種含有氨基糖苷成分2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖或其類似物的抗病毒劑，以及藥劑學(xué)上可接受的載體。通過降低病毒顆粒的傳染性抑制病毒傳播。優(yōu)選的抗病毒劑是遺傳霉素或其類似物。實(shí)例實(shí)例1.原料與方法化學(xué)藥品所有的細(xì)胞培養(yǎng)用品獲得自英杰(Invitrogen)(卡爾斯巴德，加利福利亞，美國)。除非列明，所有其他試劑都是由SigmaAldrich(圣路易斯，密蘇里州，美國)提供。細(xì)胞和病毒MDBK細(xì)胞(ATCC-CCL22)種在含4.5克葡萄糖4.5和10%馬血清的達(dá)樂伯克改良培養(yǎng)基(DMEM)中，或在最低必需培養(yǎng)基(MEM)具有10%無BVDA抗體的照射胎牛血清。在細(xì)胞培養(yǎng)基或只在模擬感染的細(xì)胞培養(yǎng)基中，50到70%融合細(xì)胞的單層感染了斑純化cpBVDV株NADL或ncpBVDV株NY-1。在我們的研究中使用的cpBVDV的滴度足以產(chǎn)生0.1到0.5感染(MOI)的輸入多重性。經(jīng)過利用病毒在細(xì)胞培養(yǎng)孵化l小時(shí)(5%二氧化碳，37°0的初步培養(yǎng)，培養(yǎng)基中已更改為新的無病毒培養(yǎng)基。對(duì)于氨基糖甙類或干擾素的實(shí)驗(yàn)，藥品以所需最終濃度加入至50到70%的融合細(xì)胞單層并接著成長另外24到72小時(shí)。干擾素被用作積極抗病毒控制。細(xì)胞生活力MDBK細(xì)胞以密度l-2xl(f細(xì)胞/孔鍍?cè)?6孔板中。在初始感染后1小時(shí)隨后的一日，清洗細(xì)胞并將含有不同濃度的抑制劑添加至細(xì)胞并和培養(yǎng)所需時(shí)間。細(xì)胞生活力被使用刃天青(resaruzin)(奧爾馬爾藍(lán)色(almarBlue))指示劑染料評(píng)估[10]。染料轉(zhuǎn)換(AFU)的定量分析測(cè)定用具有激發(fā)/發(fā)射=550/580nm熒光板讀出器測(cè)量。對(duì)于毒性研究，細(xì)胞生活力表現(xiàn)為控制百分比(AFUtaated/AFU。。ntral)。細(xì)胞生活力的藥物介導(dǎo)的保護(hù)表示如下的存活百分比％存活=[(AFUt咖ted)BVDV-AFU一jBVDV]/[(AFU。?！纺M-(AFUe。ntral)BVDV]，其中(AFUteeated)BVDV是感染BVDV并用一定遺傳霉素稀釋液治療的細(xì)胞的AFU，(AFUe。ntMl)BVDV是感染BVDV并不治療的細(xì)胞的AFU，和(AFUe。ntral)是模擬感染并不治療的細(xì)胞的AFU。50%有效濃度(EC5。)被定義為提供了對(duì)病毒引起細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞的50%保護(hù)的化合物的濃度，并利用對(duì)數(shù)內(nèi)插法計(jì)算[11]。16[OO93]板生活力試驗(yàn)MDBK細(xì)胞被BVDV的NADL株感染，MOI為0.1并分布到膠原涂層，24孔板。在培養(yǎng)6小時(shí)后，在37t:和5%二氧化碳下用磷酸緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞一次，隨后將2.5%甲基纖維素加入含5X熱滅活馬血清的匿EM的培養(yǎng)基。5日后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。測(cè)定病毒滴度12孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔種有1.5xl05MDBK細(xì)胞并在37。C具有5%二氧化碳下培養(yǎng)24小時(shí)。然后，在去除培養(yǎng)基和沖洗單層之后，細(xì)胞感染BVDV約1到2的M01以確保感染效率。接著病毒在4t:被吸收到細(xì)胞1小時(shí)并在增加生長培養(yǎng)基中遺傳霉素所需的濃度之前用冷PBS沖洗。在感染后24小時(shí)和48小時(shí)，從每個(gè)孔收獲0.25ml等分試樣的上清液并在進(jìn)一步病毒滴度分析之前在-7(TC下儲(chǔ)存。要確定病毒滴度，制備收獲的上清液的10倍稀釋液(10—1到10—8)且50微升每份稀釋液被置于8個(gè)直立孔中的每個(gè)孔，96孔板的每份稀釋液含有50微升MDBK細(xì)胞。細(xì)胞然后在37t:培養(yǎng)96到120小時(shí)且孔由于病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)而被記下，以根據(jù)里德-明希(Reed-Muench)確定病毒滴度[12]。對(duì)于ncpBVDV(NY-l)，滴度板在120h利用20%丙酮固定。用BVDVMAb20.10.6利用免疫過氧化物試驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)存在的病毒。病毒NS3蛋白免疫印跡(WesternBlot)分析在存在或不存在25微克/毫升遺傳霉素情況下MDBK細(xì)胞感染BVDV的NADL株(MOI10)。根據(jù)以前的出版物[13]，18到24小時(shí)感染后時(shí)間點(diǎn)被選擇以確定感染細(xì)胞中的病毒蛋白質(zhì)。此外，以前曾表明在MDBK細(xì)胞中在36小時(shí)，具有高M(jìn)OI，細(xì)胞單層惡化非常迅速，導(dǎo)致病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[14]。因此，在24小時(shí)感染后，細(xì)胞培養(yǎng)液被去除，細(xì)胞用PBS洗幾次。接著，2x濃縮的電泳樣品緩沖液被加入，從盤上刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至微型離心機(jī)。為了降低粘度，樣本簡短地經(jīng)聲波處理或通過26規(guī)針多次并煮沸5分鐘。15微克溶菌樣本連續(xù)10%SDS-PAGE，然后被轉(zhuǎn)漬。在封閉液中封閉1小時(shí)(PBS中0.05%吐溫20中5%奶粉)，膜被培養(yǎng)養(yǎng)具有一抗(MAb20.10.6)[15]1:1，000稀釋在封閉液中60分鐘，室溫并并PBS中0.05%吐溫20清洗。在利用二抗(抗'鼠IgG-HRP;西格瑪)培育之后，l:200稀釋封閉液60分鐘，室溫，NS3被利用阿默舍姆(Amersham)ECL試劑盒根據(jù)制造商的指示檢測(cè)(阿默舍姆生物科學(xué)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的RT-PCR技術(shù)定量使用感染后24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)檎w病毒RNA合成在感染后48小時(shí)在感染細(xì)胞中下降約兩至三倍，所述在感染細(xì)胞在病毒生產(chǎn)減少可能是由于在該高M(jìn)OI觀測(cè)的快速細(xì)胞死亡[14]。因此，在存在或缺席6和12微克/毫升遺傳霉素情況下，在用BVDV的NADL株(MOI10)感染后24小時(shí)，培養(yǎng)基被從細(xì)胞單層去除并用PBS洗3次。使用RNAeasy試劑盒(恰根，瓦倫西亞，加利福利亞，美國)分離RNA。50微升RT定量PCR(qPCR)是根據(jù)先前的出版物[16]進(jìn)行，利用相應(yīng)核苷酸103'123(5-TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3)的前置引子、相應(yīng)核苷酸176196(5-GACGACTACCCTGTACTCAGG-3)的反置引子和TaqMan探針(6:羧基熒光素-AACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTT-6-羧基四甲基羅丹明)。PCR擴(kuò)增包括在94。C變性40周期20s和退火和延長1分鐘在62°C的ABI7000序列檢測(cè)器。在三個(gè)復(fù)制反應(yīng)中所有樣本進(jìn)行了分析。圖1顯示，遺傳霉素對(duì)NADL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用保護(hù)在感染后72小時(shí)。頂部畫面顯17示遺傳霉素(31-250微克/毫升)對(duì)MDBK細(xì)胞生活力無影響。細(xì)胞生活力表示為遺傳霉素治療細(xì)胞對(duì)控制(未治療)細(xì)胞的細(xì)胞生活力百分比。底部畫面顯示遺傳霉素(1.5-25微克/毫升)提高感染細(xì)胞的細(xì)胞生活力，相比未經(jīng)處理的病毒感染細(xì)胞。細(xì)胞生活力表示為遺傳霉素治療的NADL感染的細(xì)胞對(duì)未治療的感染細(xì)胞的細(xì)胞生活力百分比。細(xì)胞生活力在96孔板中估定，用刃天青(Resaruzin)(奧爾馬爾藍(lán)色)指示劑染料(22)。染料轉(zhuǎn)換的定量分析測(cè)定用具有激發(fā)/發(fā)射=550/580nm熒光板讀出器測(cè)量。誤差線顯示每一濃度的遺傳霉素(n=6)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)例2.圖2顯示遺傳霉素抑制病毒載量在感染NADL或NY-1的MDBK細(xì)胞中。畫面A顯示遺傳霉素，6、12和25微克/毫升，在感染后24、48和72小時(shí)對(duì)NADL的活性病毒滴度的影響。畫面B顯示遺傳霉素，6、12和25微克/毫升，在感染后24、48和72小時(shí)對(duì)NY-1的活性病毒滴度的影響。根據(jù)里德_明希測(cè)定病毒滴度(斯佩克特，S.和隆茨，G.，1986年，臨床病毒學(xué)手冊(cè)，Elsevier科學(xué)出版有限公司，紐約，pp.194，斯奈德，M.L.，斯圖爾特，W.C.，克雷瑟，J.l，PRV和TGE微型化中和試驗(yàn)，1981年，血清微型化技術(shù)，NVSL，USDA，埃姆斯，艾奧瓦州，pp.44-45)，分別使用NADL或NT-1的CPE或NS3Mab20.10.6。誤差線表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和遺傳霉素(n=3)規(guī)定的濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)例3.圖3顯示遺傳霉素介導(dǎo)的對(duì)NADL的細(xì)胞保護(hù)作用，相比卡那霉素和慶大霉素。畫面B顯示只有遺傳霉素提供對(duì)NADL的細(xì)胞保護(hù)作用。所有氨基糖苷類使用6，12和25微克/毫升。細(xì)胞生活力在96孔板中估定，用刃天青(奧爾馬爾藍(lán)色)指示劑染料(22)。染料轉(zhuǎn)換的定量分析測(cè)定用具有激發(fā)/發(fā)射=550/580nm熒光板讀出器測(cè)量。誤差線顯示每一氨基糖苷和指定濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)例4.圖4顯示遺傳霉素對(duì)NS3的轉(zhuǎn)譯和處理無影響。畫面A:在缺席或存在25yg/ml遺傳霉素情況下MDBK細(xì)胞感染BVDV的NADL株，并在感染后24小時(shí)，膜和胞液碎片被制備。樣本經(jīng)過SDS-PAGE和免疫印跡分析，利用NS3的一抗(Mab20.10.6)。畫面B顯示在存在6和12iig/ml遺傳霉素情況下感染BVDV的NADL株的MDBK細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)病毒RNA在感染后24小時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析。病毒RNA表達(dá)被定義為從遺傳霉素處理的感染細(xì)胞收集的病毒RNA對(duì)從未處理的感染細(xì)胞檢測(cè)的RNA的百分比。誤差線表示每個(gè)指定的條件(n=3)的標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)例5.這個(gè)例子描述本發(fā)明的使用遺傳霉素的注射用組合物。遺傳霉素，O.l-10mg/kg，溶解在含1.0%防腐劑苯甲醇和1%羧甲基纖維素鈉和0.05%吐溫80作為穩(wěn)定劑的等張氯化鈉的無菌載體溶液中。利用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整PH到7.0。實(shí)例6.這個(gè)例子描述本發(fā)明的注射用組合物，使用2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖_吡喃庚糖和其它附加抗病毒劑干擾素。2-氨基-2，7-雙脫氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，O.l-10mg/kg，溶解在含1.0%防腐劑苯甲醇和1%羧甲基纖維素鈉和0.05%吐溫80作為穩(wěn)定劑的等張氯化鈉的無菌載體溶液中。利用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整18pH到7.0。加入干擾素IOOOIU。實(shí)例7.這個(gè)例子說明本發(fā)明所述的治療登革病毒感染的方法。顯示登革出血熱(DHF)癥狀的病人每日注射實(shí)例5的組合物，注射7日。所述劑量范圍從0.1到10mg/kg。實(shí)例8.這個(gè)例子說明本發(fā)明所述的治療HCV感染的方法。病人被診斷為具有HCV的臨床癥狀，包括血液中HCV的存在。該病人每日注射實(shí)例6的組合物，注射至少30日。本發(fā)明的抗病毒劑的劑量范圍從0.1到10mg/kg。檢測(cè)血液中HCV的存在。持續(xù)反應(yīng)意味病人在體制治療6個(gè)月保持無HCV。這并不意味著病人痊愈，但在體內(nèi)活性HCV水平非常低且可能不造成很大損害。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到前述實(shí)例是為了舉例說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明于所揭示的具體形式。被本發(fā)明和所附權(quán)利要求包含的其它實(shí)施例可以被預(yù)想到。[cms]參考文獻(xiàn)1.沃特HJ，瑟夫LB.丙型肝炎病毒感染恢復(fù)、持久性和后遺癥長期結(jié)果的觀點(diǎn)，西民肝病2000;20(1):17-35。2.科恩J.丙型肝炎的科學(xué)挑戰(zhàn)，1999年7月2日;285(5424):26-30。3.登革熱/登革出血熱，威克利流行病學(xué)研究，2000年6月16日，75(24):193-6。4.利特MS，安德森DK，瑞特澤爾E.BVDV與黃病毒科成員病毒性比較，J.根.崴歐爾，1988年10月，69(pt10):2637-43。5.布朗利J.，克拉克MC，，霍華德CJ，致命牛粘膜病的實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)，獸醫(yī)研究，1984年6月2日，114(22):535-6。6.柏林SR，邁克魯肯RC，卡特利MF，通過重復(fù)感染細(xì)胞病變BVDV感染非細(xì)胞病變BVDV在牛體內(nèi)產(chǎn)出的嚴(yán)重臨床疾病，阿姆J維特研究，1985，3，46(3):573-6。7.布朗利J.BVDV發(fā)病機(jī)制病毒生物型的途徑，ArchVirolSu卯l，1991年，3:79-96。8.別克沃德VE，比爾BE，多尼RO，BVDV作為丙型肝炎病毒的抗病毒制劑代理模型評(píng)價(jià)抗病毒劑，抗病毒研究，2003年9月；60(1):1-15。9.格里菲思JK，巴納克瑞松森納R，威德默G，特茲坡瑞S和巴龍霉素和遺傳霉素抑制細(xì)胞內(nèi)隱孢子蟲而不影響通過宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)藥物輸送含義，感染與免疫，1998年8月，66(8):3874-83。10.霍華德MT，謝特斯BH，彼得LM，弗拉尼KM，解斯特蘭德RF，阿特金斯JF，氨基糖甙類序列特異性誘導(dǎo)停止通讀治療杜氏肌影響營養(yǎng)不良含義，A皿Neurol.2000年8月，48(2):164-9。11.斯蒂芬森J.抗生素顯示保證治療遺傳性疾病，賈馬，2001.4.25,285(16):2067-8。12.巴頓-戴維斯ER，科迪爾L，肖特瑪DI，利蘭德SE，斯威尼HL，氨基糖甙類抗生素恢復(fù)mdx鼠的肌營養(yǎng)不良蛋白功能，JClinInvest.1999.8月，104(4):375-81。13.丹尼爾森KG，納珀?duì)朖E，肯特爾FS，比特爾JS，梅迪納D，德班EM，鼠標(biāo)乳腺細(xì)胞，COMMA-D，保留在體內(nèi)克隆形態(tài)發(fā)生能力，InVitroCellDevBiol。1989年6月，25(6):19535-43。14.桑泰爾RF，艾倫NE，小霍布斯JN，饒RN，施密特RJ，對(duì)潮霉素B和G418篩選的顯性L細(xì)胞在小鼠抗選擇標(biāo)記基因的原核表達(dá)，基因，1984年10月，30(l-3):147-56。15.卡巴納斯MJ，威茲克孜D，莫多萊J.通過氨基糖苷類抗生素轉(zhuǎn)譯的核糖體易位的抑制，生化生物物理研究通訊，1978年8月14日，83(3):991-7。16.尤斯蒂斯DC，威廉JM，真核蛋白質(zhì)的合成中氨基糖苷類的行動(dòng)機(jī)制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自以下組成的群組干擾素、三氮唑核苷和正亞氨基糖。46.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包括至少一種附加抗病毒劑。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的抗病毒劑選自以下組成的群組干擾素、三氮唑核苷和正亞氨基糖。全文摘要本發(fā)明涉及一種化合物、組合物和方法，包括式(II)表示的氨基糖苷成分，用于治療和預(yù)防正義單鏈RNA包膜病毒感染的傳播。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例使用遺傳霉素或其類似物，包括2-氨基-2，7-雙脫氧-α-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，作為抗病毒劑。本發(fā)明所述的化合物、組合物和方法應(yīng)用于丙肝病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、馬動(dòng)脈炎病毒和/或辛德畢斯病毒(SINV)導(dǎo)致的感染。文檔編號(hào)A61K31/70GK101772347SQ200880101722公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日發(fā)明者亞歷山大·V·貝克,愛德華·J·杜博維,黑茲爾·H·司徒申請(qǐng)人:肝炎與病毒研究所