專利名稱：用于制備聚合物軛合物的方法
用于制備聚合物軛合物的方法 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2006年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第
60/861， 995號(hào)和于2007年11月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第_號(hào)
即代理人參考號(hào)41714-8029. USOO的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，這些申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容 通過(guò)引用并入本文。
領(lǐng)域
除了其他方面之外，本發(fā)明通常涉及用于將一種或多種水溶性聚 合物共價(jià)連接到活性劑的方法。
背景
多年以來(lái)，已經(jīng)使用了很多種將水溶性聚合物如聚乙二醇共價(jià)連 接到生物活性劑的合成方法。聚乙二醇化的早期嘗試通常使得PEG非 特異性共價(jià)連接到活性劑(最常見(jiàn)的是多肽或蛋白質(zhì))的多個(gè)反應(yīng)位 點(diǎn)。就多肽而言，最常見(jiàn)的用于共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)基是賴氨酸的a或s 氨基基團(tuán)。早期聚乙二醇化化學(xué)通常使用低分子量的線性PEG試劑， 并且大部分輒合物(conjugate)通過(guò)?；a(chǎn)生(Roberts, M. J.等人， 脅露e"r"g 2 e/!Ve/y y e7/譜，54 (2002)， 459-476)。這些早 期聚乙二醇化的藥物經(jīng)常產(chǎn)生差的藥物性能和/或顯示低的批間重現(xiàn) 性。
第二代聚乙二醇化化學(xué)產(chǎn)生了設(shè)計(jì)用來(lái)克服很多與笫 一代聚乙二 醇化試劑有關(guān)的問(wèn)題一二醇污染、副反應(yīng)、不穩(wěn)定的鍵和缺乏將聚合 物共價(jià)連接到活性劑的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的選擇性的方法(Roberts, M. J. 等人，同上)。開(kāi)發(fā)了新PEG試劑，其中包括，如PEG丙酪(美國(guó)專利 第5， 252, 714號(hào))、PEG乙烯基砜(美國(guó)專利第5， 446， 090號(hào))和PEG馬來(lái)酰亞胺(美國(guó)專利第6,602，498號(hào))，并且描述了與它們的使用有關(guān) 的方法。非線性PEG如分枝(美國(guó)專利第5,932,462號(hào))和叉狀PEG (美 國(guó)專利第6,437,025號(hào))也變得更廣泛可得，例如可從公司如Nektar Therapeut ics和廳得到。
盡管治療劑的聚乙二醇化已更廣泛地用作一種用于改善治療劑藥 理學(xué)和其他性質(zhì)的可行方法，但是用于連貫形成明確具有有益的藥理 學(xué)性質(zhì)的聚乙二醇化治療劑的合成挑戰(zhàn)仍持續(xù)上升。特別是如果這些 方法適合于大規(guī)模生產(chǎn)，它們應(yīng)盡量避免多個(gè)反應(yīng)步驟，并使所需的 保護(hù)、脫保護(hù)和純化步驟數(shù)減至最少，并以連貫的方式和適當(dāng)?shù)牧己?收率形成產(chǎn)物。
發(fā)明概迷
在一個(gè)方面中，本文提供的是用于將聚乙二醇聚合物共價(jià)連接到 活性劑的方法。所述方法包括以下步驟(i)提供包含第一官能團(tuán)的 活性劑，所述第一官能團(tuán)選自氨基、羥基和羧基(以及活化的羧基等同 物，如反應(yīng)性酯或類似物)，和(ii)將所述活性劑與包含對(duì)第一官能 團(tuán)具有反應(yīng)性的第二官能團(tuán)的聚乙二醇反應(yīng)。所述反應(yīng)在偶聯(lián)劑和對(duì) 甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鐵鹽(DPTS)的存在下、在有效促進(jìn)第一 官能團(tuán)與第二官能團(tuán)之間的反應(yīng)的條件下進(jìn)行，從而形成聚乙二醇-
活性劑輒合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)劑是碳二亞胺。代表性的偶聯(lián)劑包 括選自由如下組成的組的那些二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 N，N， -二異 丙基碳二亞胺(DIC) 、 l-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDAC)、 l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、 N-叔丁基-N，-甲基碳二亞胺(TBMC)和N-叔丁基-N，-乙基碳二亞胺(TBEC)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)劑是N,N， -二異丙基碳二亞胺。
所述反應(yīng)通常在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑包括二氯甲烷、氯 仿、乙腈和四氬吹喃(tehtrahydrofuran )。
7在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，反應(yīng)在范圍為(TC至100。C的溫 度、更優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。
在所述方法的又另一個(gè)實(shí)施方案中，DPTS的量范圍為相對(duì)于所述 第一官能團(tuán)的約0. 05當(dāng)量至0. 75當(dāng)量，更優(yōu)選為相對(duì)于所述第一官 能團(tuán)的約0. 10當(dāng)量至0. 60當(dāng)量。
在還有一個(gè)另外的實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)劑的量范圍為相對(duì)于所 述第一官能團(tuán)的約1. 25當(dāng)量至5當(dāng)量。
優(yōu)選的第二官能團(tuán)包括氨基、羥基和羧基。
適合在所述方法中使用的活性劑包括蛋白質(zhì)、寡肽、多肽、小分 子、抗體、核普酸、寡核苷酸和脂質(zhì)。
在所述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述活性劑是包含為羥基 或羧基的第一官能團(tuán)的小分子。在某些實(shí)例中，所述活性劑具有多于 一個(gè)的所述第一官能團(tuán)。
特別優(yōu)選的小分子包括紫杉烷類(例如多烯紫杉醇或紫杉醇)和喜 樹(shù)堿類。
在還有一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一官能團(tuán)與第二官能團(tuán) 之間的反應(yīng)導(dǎo)致形成酯鍵。
在還有一個(gè)甚至更具體的實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致形成具有通 過(guò)酯鍵與多烯紫杉醇上單個(gè)羥基位點(diǎn)(例如2，羥基位點(diǎn))共價(jià)連接的 聚乙二醇的多烯紫杉醇-聚乙烯軛合物。
在所述方法中，所述聚乙二醇可具有許多種幾何形狀中的任一種， 例如線性、分枝、叉狀和多臂聚乙二醇。優(yōu)選地，所述聚乙二醇是具 有從約3個(gè)至約25個(gè)臂的多臂聚合物。
優(yōu)選的多臂聚合物是包括多元醇或聚胺核的那些。示例性的多元 醇核包括甘油、三羥甲基丙烷、山梨糖醇、六甘油和季戊四醇。
在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇包括約1個(gè)至約10 個(gè)第二官能團(tuán)。在一個(gè)甚至更具體的實(shí)施方案中，所述聚乙二醇包括 選自l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和6個(gè)的多個(gè)第二官能團(tuán)。在又一 個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇具有選自3個(gè)、4個(gè)和5個(gè)的多個(gè)第二官能團(tuán)。
在所述方法的又另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性劑包括多于一個(gè)的 第一官能團(tuán)，且所述方法不包括保護(hù)步驟。
在所述方法的又另 一個(gè)替代性實(shí)施方案中，所述活性劑包括多于 一個(gè)的第一官能團(tuán)(例如多于一個(gè)羥基基團(tuán))，且所述方法有效地導(dǎo)致 形成具有僅與所述活性劑上單個(gè)位點(diǎn)共價(jià)連接的聚乙二醇的軛合物。
在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法有效地導(dǎo)致形成少于約15%的 N-?；甯碑a(chǎn)物，且優(yōu)選地，少于約10%的N-?；甯碑a(chǎn)物，且甚至 更優(yōu)選地，少于約5%的N-?；甯碑a(chǎn)物。
除非另有指出，本發(fā)明中在此描述的特征中的每一個(gè)表示同樣地
應(yīng)用到如本文所述的每一類和每一個(gè)實(shí)施方案。
當(dāng)與下列詳述結(jié)合閱讀時(shí)，本發(fā)明的這些和其他對(duì)象和特征將變
得更加明顯。 附圖簡(jiǎn)述
圖i是如在實(shí)施例3中所述、表示三種不同劑量的多烯紫杉醇ao
mg/kg、 20mg/kg和30mg/kg)和圖中表示為"4臂PEG-20k-GLY-DOC" 的4臂PEG2。k-甘氨酸-多烯紫杉醇(20 mg/kg、 40 mg/kg和60 mg/kg) 中每一種的兩個(gè)劑量在移植有H460非小細(xì)胞肺癌腫瘤的雌性異種移 植無(wú)胸腺棵小鼠中的效應(yīng)隨時(shí)間的圖示。
圖2是如在實(shí)施例4中所述、表示三種不同劑量的多烯紫杉醇(10 mg/kg、 20 mg/kg和30 mg/kg)和4臂PEG漁-甘氨酸-多烯紫杉醇(20 mg/kg、 40 mg/kg和60 mg/kg)中每一種的兩個(gè)劑量在移植有DU-145
前列腺腫瘤的雌性異種移植無(wú)胸腺棵小鼠中的效應(yīng)隨時(shí)間的圖示。
圖3是如在實(shí)施例5中所述、表示多烯紫杉醇和4臂PEG2。k-甘氨
酸-多烯紫杉醇分別在移植有MCF-7乳腺腫瘤的小鼠中的抗腫瘤效應(yīng) 隨時(shí)間的圖示。
發(fā)明詳述現(xiàn)在在下文中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明可以以很多
不同的形式體現(xiàn)，且不應(yīng)理解為受限于本文所列舉的實(shí)施方案；相反， 提供了這些實(shí)施方案以使公開(kāi)內(nèi)容更徹底且完整，并將本發(fā)明范圍克 全傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。 定乂
必須注意到，除非本文另有明確規(guī)定，否則在本說(shuō)明書(shū)中使用的 單數(shù)形式"一(a)" 、 "一(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)形式。因此， 例如，提及的"聚合物，，包括單個(gè)聚合物和兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同 的聚合物，提及的"軛合物"是指單個(gè)軛合物和兩個(gè)或更多個(gè)相同或 不同的軛合物，提及的"賦形劑"包括單個(gè)賦形劑和兩個(gè)或更多個(gè)相 同或不同的賦形劑，等。
在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時(shí)，根據(jù)下文所述的定義使用下列術(shù)語(yǔ)。 "官能團(tuán)，，是在正常的有機(jī)合成條件下可用于在與之連接的結(jié)構(gòu) 和通常具有其他官能團(tuán)的另一種結(jié)構(gòu)之間形成共價(jià)鍵的基團(tuán)。所述官 能團(tuán)一般包括多個(gè)鍵和/或雜原子。下文描述了在本文提供的聚合物和 活性劑中使用的優(yōu)選的官能團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)性(reactive)"是指在常規(guī)的有機(jī)合成條件下容易地 或以實(shí)際速率反應(yīng)的官能團(tuán)。這與不會(huì)反應(yīng)或者為了反應(yīng)需要強(qiáng)催化 劑或不實(shí)際的反應(yīng)條件的那些基團(tuán)(即"無(wú)反應(yīng)性"或"惰性"基團(tuán)) 相反。
關(guān)于反應(yīng)混合物中分子上存在的官能團(tuán)，"非易反應(yīng)性"表示該 基團(tuán)在有效產(chǎn)生期望反應(yīng)的條件下在反應(yīng)混合物中保持大部分完整。
羧酸的"活化的衍生物"是指易與親核體反應(yīng)、通常與未衍生化 的羧酸相比與親核體反應(yīng)容易得多的羧酸衍生物?；罨聂人岚?， 例如?；|(如?；?、酸酐、碳酸鹽(carbonate)和酯。這些酯包括， 例如咪唑基酯和苯并三唑酯和酰亞胺酯如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 酯。活化的衍生物可通過(guò)羧酸與各種試劑中的一種反應(yīng)而原位形成， 所述試劑如六氟磷酸苯并三唑-l-基氧基三吡咯烷基磷総鹽(PyB0P)， 優(yōu)選與1-羥基苯并三唑(HOBT)或l-羥基-7-偶氮苯并三唑(H0AT);六氟磷酸0- (7-偶氮苯并三唑-l-基)-N， N， N， ， N，-四甲基脲総鹽(HATU); 或雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)組合使用。
官能團(tuán)的"化學(xué)等同物"是基本上具有與所述官能團(tuán)相同類型的 反應(yīng)性的基團(tuán)。例如， 一個(gè)經(jīng)歷SN2反應(yīng)的官能團(tuán)被認(rèn)為是另一個(gè)這 種官能團(tuán)的功能等同物。
"保護(hù)基，，是在某些反應(yīng)條件下防止或阻斷分子中特定的化學(xué)反 應(yīng)性官能團(tuán)的反應(yīng)的部分。所述保護(hù)基根據(jù)受保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)基的類
變。、可受保護(hù)的官J團(tuán)包括，例如羧酸基團(tuán):氨基k::、幾基i團(tuán)、
硫醇基團(tuán)、羰基基團(tuán)及類似官能團(tuán)。代表性的羧酸保護(hù)基包括酯類(如 對(duì)甲氧基爺酯)、酰胺類和酰肼類；代表性的氨基基團(tuán)保護(hù)基，包括氨 基甲酸酯類(如叔丁氧基羰基)和酰胺類；代表性的羥基基團(tuán)保護(hù)基， 包括醚類和酯類；代表性的硫醇基團(tuán)保護(hù)基，包括疏醚類和硫酯類；
代表性的羰基基團(tuán)保護(hù)基，包括縮醛和縮酮；等。這些保護(hù)基為本領(lǐng) 域才支術(shù)人員眾所周知，并且例如在T.W. Greene和G. M. Wuts， 戶rc^ec〃/2g Gro";7S //z ^r^s力2'c 5y/7t力eW有機(jī)合成的保護(hù)基)，第 三版，Wiley, New York, 1999和在其中所引用的參考文獻(xiàn)中描述。
"受保護(hù)形式，，的官能團(tuán)是指具有保護(hù)基的官能團(tuán)。如本文所用， 術(shù)語(yǔ)"官能團(tuán)"或其任何同義詞意指包括其受保護(hù)的形式。
本文所用的"PEG"或"聚(乙二醇)"意指包括任何水溶性聚(氧 化乙烯)。通常地，本發(fā)明中使用的PEG將包括以下兩種結(jié)構(gòu)中的一種 "-(CH2CH20)n-，，或"-(CH2CH20)n—XH2CH廣"，這取決于是否末端氧例 如在合成轉(zhuǎn)化時(shí)被替代。變量(n)為3至3000，且所有PEG的末端基 團(tuán)和結(jié)構(gòu)可改變。"PEG"表示包含大多數(shù)也就是說(shuō)超過(guò)50%的是 -0120120-的亞單元的聚合物。本發(fā)明中使用的PEG包括具有在下文更 為詳述的多種分子量、結(jié)構(gòu)或幾何形狀的PEG。
在本發(fā)明的水溶性聚合物如PEG的背景中的"分子質(zhì)量"是指聚 合物標(biāo)稱的平均分子質(zhì)量，這通常由尺寸排阻色譜法、光散射技術(shù)或 在1，2，4-三氯苯中的固有速率測(cè)定來(lái)確定。在水溶性聚合物如PEG的背景中的分子量可表示為數(shù)均分子量或重均分子量。除非另有指出， 本文所有提及的分子量是指重均分子量。數(shù)均和重均這兩種分子量測(cè) 定都可使用凝膠滲透色語(yǔ)法或其他液體色譜技術(shù)來(lái)測(cè)量。也可使用用 于測(cè)量分子量值的其他方法，如使用末端基團(tuán)分析或測(cè)量依數(shù)性(例如 冰點(diǎn)下降、沸點(diǎn)提高或滲透壓)來(lái)確定數(shù)均分子量或者使用光散射技 術(shù)、超離心法或粘度測(cè)定法來(lái)確定重均分子量。本發(fā)明的聚合物通常 為多分散的(即聚合物的數(shù)均分子量和重均分子量不相等)，具有低多
分散性值如少于約1.2、少于約1.15、少于約I.IO、少于約1.05和 少于約1.03。如本文所用，有時(shí)候會(huì)提及具有重均分子量或數(shù)均分子 量的單個(gè)水溶性聚合物；應(yīng)理解，這些提及表示單個(gè)水溶性聚合物是
從具有所述分子量的水溶性聚合物的組合物中獲得的。
術(shù)語(yǔ)"連接體(linker)"在本文用來(lái)指原子或原子的集合，其用 于連接互連部分如有機(jī)基核和聚合物片段。連接體部分可以是水解穩(wěn) 定的或可包括生理學(xué)上可水解或可酶促降解的鍵。
術(shù)語(yǔ)"間隔基"在本文用來(lái)指原子的集合，其用于連接互連部分 如聚合物片段和活性劑D。間隔基部分可以是水解穩(wěn)定的或可包括生 理學(xué)上可水解或可酶促降解的鍵。
"可水解的"鍵是在生理?xiàng)l件下與水反應(yīng)(即被水解)的相對(duì)弱的 鍵。鍵在水中水解的趨勢(shì)不僅取決于連接兩個(gè)中心原子的鍵的一般類 型，而且取決于與這些中心原子連接的取代基。示例性的水解不穩(wěn)定 的鍵包括羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、 原酸酯、肽和寡核苷酸。
"水解穩(wěn)定的，，鍵(1 inkage)或鍵(bond)是指化學(xué)鍵，通常是共價(jià) 鍵，其在水中基本上是穩(wěn)定的，也就是說(shuō)在生理?xiàng)l件下在延長(zhǎng)的一段 時(shí)間內(nèi)不發(fā)生達(dá)到任何可察覺(jué)程度的水解。水解穩(wěn)定的鍵的實(shí)例包括 但不限于以下碳-碳鍵(例如在脂肪族鏈中)、醚、酰胺、聚氨酯 (urethanes)及類似的水解穩(wěn)定的鍵。 一般地，水解穩(wěn)定的鍵是在生理 條件下顯示每天少于約1_2%的水解速率的鍵。代表性的化學(xué)鍵的水解 速率可在大部分標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)教科書(shū)中發(fā)現(xiàn)。
12就聚合物的幾何形狀或全部結(jié)構(gòu)而言，"多臂"是指聚合物具有
3個(gè)或更多個(gè)聚合物所包含的"臂"。因此，多臂聚合物可具有3個(gè) 聚合物臂、4個(gè)聚合物臂、5個(gè)聚合物臂、6個(gè)聚合物臂、7個(gè)聚合物 臂、8個(gè)聚合物臂或更多，這取決于其構(gòu)型和核結(jié)構(gòu)。高度分枝的聚 合物的一種具體類型是樹(shù)枝狀聚合物或樹(shù)枝狀大分子(dendrimer)，其 為了本發(fā)明的目的，被認(rèn)為具有不同于多臂聚合物結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。
"支化點(diǎn)"是指包括一個(gè)或多個(gè)原子的分叉點(diǎn)，在所述分叉點(diǎn)聚 合物從線性結(jié)構(gòu)分裂成或分枝成一個(gè)或多個(gè)另外的聚合物臂。多臂聚 合物可具有一個(gè)支化點(diǎn)或多個(gè)支化點(diǎn)。
"樹(shù)枝狀大分子"是球形的、尺寸單分散的聚合物，在該聚合物 中所有鍵從中心焦點(diǎn)或核呈放射狀，具有規(guī)則的分支式樣和具有重復(fù) 單元，每個(gè)重復(fù)單元貢獻(xiàn)支化點(diǎn)。樹(shù)枝狀大分子顯示某些樹(shù)枝狀態(tài)性 質(zhì)如核包封(core encapsulation)，使它們不同于其他類型的聚合 物。
"大致上"或"基本上"是指幾乎全部或完全，例如，某一給定 量的95%或更多。
"烷基"是指烴鏈，通常長(zhǎng)度范圍為約1個(gè)至20個(gè)原子。這些烴 鏈優(yōu)選但不必然是飽和的，且可以是支鏈或直鏈，盡管通常直鏈?zhǔn)莾?yōu) 選的。示例性的烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、l-曱 基丁基、1-乙基丙基、3-曱基戊基及類似烷基。如本文所用，當(dāng)提及 三個(gè)或更多個(gè)碳原子時(shí)，"烷基"包括環(huán)烷基。
"低級(jí)烷基"是指包含1個(gè)至6個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，且可以是 直鏈或支鏈，例如曱基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基。
"環(huán)烷基"是指飽和的或不飽和的環(huán)狀烴鏈，包括優(yōu)選由3個(gè)至 約12個(gè)碳原子、更優(yōu)選3個(gè)至約8個(gè)碳原子組成的橋接、稠合或螺環(huán) 化合物。
"無(wú)擾取4戈基(Non-interfering substituent)，，是當(dāng)存在于分 子中時(shí)，通常是對(duì)其他包含在分子內(nèi)的官能團(tuán)無(wú)反應(yīng)性的那些基團(tuán)。 例如在"取代的烷基，，中的術(shù)語(yǔ)"取代的"是指被一個(gè)或多個(gè)無(wú)
13擾取代基取代的部分(例如烷基基團(tuán))，所述無(wú)擾取代基例如但不限于 C「C8環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基等；鹵素，例如氟、氯、溴和碘； 氰基；烷氧基、低級(jí)苯基；取代的苯基；及類似無(wú)擾取代基。對(duì)于苯 環(huán)上的取代基而言，所述取代基可以在任何方向(即鄰位、間位或?qū)?位)。
"烷氧基"是指-0-R基，其中R是烷基或取代的烷基，優(yōu)選C,-C2。 烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)，優(yōu)選d-C7。
"親電子體"是指離子、原子或可以是離子的原子集合，它們具 有親電子中心(即尋找電子的中心)，能與親核體反應(yīng)。
"親核體"是指離子或原子或可以是離子的原子集合，它們具有 親核中心(即尋找親電子中心的中心)，且能與親電子體反應(yīng)。
本文所用的"活性劑"包括提供經(jīng)常有益的、可在體內(nèi)或體外得 以證明的一些藥理學(xué)效應(yīng)的任何劑。如本文所用，這些術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步包 括任何生理學(xué)上或藥理學(xué)上活性的物質(zhì)，其在患者中產(chǎn)生局部效應(yīng)或 全身效應(yīng)。
本文可互換使用的"雙官能的(Difunctional )"或"雙功能的 (bifunct ional)"表示諸如聚合物的實(shí)體具有包含在該聚合物中的、 通常是在聚合物末端的兩個(gè)官能團(tuán)。當(dāng)所述官能團(tuán)相同時(shí)，該實(shí)體被 稱為是同型雙官能的(homodifunctional)或同型雙功能的 (homobifunctional)。當(dāng)所述官能團(tuán)不同時(shí)，該聚合物被稱為是異雙 官負(fù)巨的(heterodifunct ional)或異雙功能的(heterobifunct ional)。
本文所述的堿性或酸性反應(yīng)物包括中性的、荷電的以及其任何對(duì) 應(yīng)的鹽形式。
術(shù)語(yǔ)"受治療者"、"個(gè)體"或"患者"在本文可互換使用，且 是指脊推動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于鼠類、嚙齒動(dòng) 物類、猿猴類、人、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、竟技動(dòng)物(sport animal)和寵物。 這些受治療者通?；加谢蛞谆疾睿霾羁赏ㄟ^(guò)施用通常但不必 然是本文所述的聚合物-活性劑軛合物形式的本發(fā)明聚合物來(lái)預(yù)防或 治療。特別就給定量提及時(shí)，術(shù)語(yǔ)"約"表示包括加或減5%的偏差。
"任選的，，或"任選地"表示隨后描述的情況可以發(fā)生或可以不 發(fā)生，以使該描述包括情況發(fā)生的實(shí)例和情況不發(fā)生的實(shí)例。
"小分子，，可廣泛定義為通常具有少于約1000的分子量的有機(jī)化 合物、無(wú)機(jī)化合物或有機(jī)金屬化合物。本發(fā)明的小分子包括具有少于 約1000的分子量的寡肽和其他生物分子。
在提及本發(fā)明軛合物時(shí)"活性劑部分"是指未修飾的母體活性劑 的部分或殘余部分(residue)， 一直到由藥物(或者其活化的或化學(xué) 修飾的形式)與聚合物共價(jià)連接形成的共價(jià)鍵。在活性劑部分與多臂聚 合物之間的可水解鍵水解后，釋放出活性劑本身。
祭迷
多烯紫杉醇(Taxotere⑧)是化學(xué)治療劑，其主要用來(lái)治療乳腺癌、 卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌(Lyseng-Williamson KA， Fenton, C. / ru^ ， 2005; 65 (17): 2513-31)。它是紫杉醇的半合成類似物，且在其化學(xué) 結(jié)構(gòu)的兩個(gè)位置不同于紫杉醇。紫杉醇和多烯紫杉醇之間的主要化學(xué) 差異是側(cè)鏈上的3，-氮的取代基(BOC m.苯甲酰基)和紫杉烷核的10-位(游離醇m.乙酸酯)。這兩種紫杉烷類都與許多不希望的副作用有 關(guān)，并且它們的弱的水溶性阻礙其臨床應(yīng)用。
在努力克服這些缺點(diǎn)的過(guò)程中，已經(jīng)描述了多種合成紫杉醇的前 體藥物和各種類似物的方法。相比之下，已報(bào)道的針對(duì)多烯紫杉醇修
飾的研究明顯更少，即使在體外和體內(nèi)測(cè)定中多烯紫杉醇比紫杉醇都 更具活性，由此看來(lái)使得多烯紫杉醇成為了一個(gè)用于修飾的更有前途 的候選物。這種差異可能是由于，至少部分是由于多烯紫杉醇的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。多烯紫杉醇包括位于l、 7、 10和2，-位的四個(gè)游離羥基基團(tuán)。 明確地，當(dāng)嘗試該藥物或者同樣具有多個(gè)反應(yīng)基的任何藥物的單個(gè)位 點(diǎn)#"飾時(shí)，在7、 10、 2，-位的三個(gè)仲醇帶來(lái)了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。很多 報(bào)道的多烯紫杉醇衍生物不是直接由母體化合物而是由受保護(hù)的前體 制備的。
這種合成方法經(jīng)常包括獲得所需手性中心的多步驟反應(yīng)和復(fù)雜的
15化學(xué)轉(zhuǎn)化。 一些研究員已嘗試選擇性地保護(hù)多烯紫杉醇上的特定羥基 基團(tuán)，但是由于低反應(yīng)收率和難以分離所得的位置異構(gòu)體，故很少獲 得成功。修飾的或增強(qiáng)藥物遞送的活性劑的合成必須產(chǎn)生合理的收率 以使任何這類方法更具有經(jīng)濟(jì)上的吸引力。
部分發(fā)明者使用常規(guī)的二環(huán)己基碳二亞胺/二甲氨基吡啶偶聯(lián)化
學(xué)制備示例性的PEG-多烯紫杉醇軛合物的努力導(dǎo)致形成大量的一種 或多種副產(chǎn)物一一這可能是由于，至少部分是由于所用PEG試劑上的 活化基團(tuán)的空間位阻環(huán)境。
由前述看來(lái)，發(fā)明者已認(rèn)識(shí)到對(duì)用于制備PEG軛合物、特別是小 分子軛合物的簡(jiǎn)單方法的迫切需要，其中這類方法在軛合之前不需要 保護(hù)小分子上的反應(yīng)基。這類方法對(duì)具有多個(gè)反應(yīng)基的小分子特別有 利，并在本文中詳細(xì)描述。
由具有多個(gè)反應(yīng)基的劑制備單個(gè)位點(diǎn)聚合物修飾的活性劑的常規(guī)
些反應(yīng)經(jīng)常受到低收率和難以分離所需產(chǎn)物的阻礙。在嘗試避免使用 受保護(hù)的活性劑前體中，發(fā)明者首次嘗試將示例性的小分子多烯紫杉 醇直接偶聯(lián)到說(shuō)明性多臂聚合物，如在實(shí)施例1A中詳述。多烯紫杉醇 的結(jié)構(gòu)如下所示，其中箭頭示出分子中能進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的多個(gè)羥基基 團(tuán)。<image>image see original document page 16</image>
筒要來(lái)說(shuō)，多臂PEG試劑4臂PEG漁-甘氨酸利用常規(guī)偶聯(lián)劑二環(huán) 己基碳二亞胺和二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)與多烯紫杉醇反應(yīng)。該反應(yīng)(i)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物N-?；澹?ii)難以分析和純化。
還開(kāi)發(fā)了形成期望產(chǎn)物的替代性方法，在所述方法中候選物小分 子多烯紫杉醇首先用連接體甘氨酸(Fmoc-甘氨酸)修飾，之后與PEG 試劑共價(jià)連接(實(shí)施例1B)。遺憾的是，純化之后，期望的2，-甘氨酸 修飾的多烯紫杉醇的收率很低，約為20%，并且伴隨有數(shù)種不同的位 置異構(gòu)體的形成。
為了克服上述的技術(shù)問(wèn)題，除了別的之外，發(fā)明者已發(fā)展用于制 備PEG軛合物的偶聯(lián)反應(yīng)，其抑制不希望的副反應(yīng)并且促進(jìn)形成良好 收率和純度的期望產(chǎn)物，而不必從具有一種或多種保護(hù)基的活性劑開(kāi) 始(即利用未受保護(hù)的起始物料)。
本文提供的合成方法利用由4-(二曱氨基)吡啶和對(duì)甲苯磺酸形 成的分子復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)形成高收率和高純度的PEG軛合物。本文所述 的合成路徑有效地抑制不希望的副反應(yīng)，且粗產(chǎn)物經(jīng)?？赏ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單沉 淀而得以純化。
特別地，本文提供的是用于將聚乙二醇聚合物與活性劑共價(jià)連接 的方法。所述方法包括以下步驟(i)提供含有第一官能團(tuán)的活性劑， 所述第一官能團(tuán)例如選自氨基、羥基和羧基(以及其活化等同物)，和 (U)將所述活性劑與包含對(duì)第一官能團(tuán)具有反應(yīng)性的第二官能團(tuán)的 聚乙二醇反應(yīng)。所述反應(yīng)在偶聯(lián)劑和對(duì)甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶 総鹽(DPTS)的存在下、在有效促進(jìn)第一官能團(tuán)與第二官能團(tuán)之間的反 應(yīng)的條件下進(jìn)行，從而形成聚乙二醇-活性劑軛合物。
聚乙二醇試劑
聚乙二醇試劑可具有許多種幾何形狀中的任一種，例如線性、分 枝、叉狀和多臂聚乙二醇。PEG試劑包含至少一個(gè)適于與活性劑上的 官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)(在本文一般稱為"第二官能團(tuán)"，以便區(qū)分這種 官能團(tuán)與包含在所述活性劑中的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán))，從而形成期望的 軛合物。用于與活性劑偶聯(lián)的示例性官能團(tuán)包括氨基、羥基和羧基， 并且在適用時(shí)，旨在包括其活化形式。適于應(yīng)用的PEG試劑包括在Nektar Advanced PEGylation Catalog, 2005-2006中所述的那些PEG試劑、得自NOF Corporation 的活化PEG及類似PEG試劑。
在所述方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述聚乙二醇是具有約3個(gè) 至約25個(gè)臂的多臂聚合物，或更優(yōu)選地，是具有選自3個(gè)、4個(gè)、5 個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)和IO個(gè)臂的許多臂的多臂聚合物。
多臂聚合物可包括許多種不同聚合物核如多元醇或聚胺核，如在 美國(guó)專利申請(qǐng)第2005/0112088號(hào)中所述的那些中的任一種。優(yōu)選的形 成多臂聚合物核(一個(gè)或多個(gè)PEG臂從該聚合物核延伸)的多元醇包括 甘油、三幾曱基丙烷、還原糖如山梨糖醇或季戊四醇，和甘油低聚體 如六甘油。
通常地，聚乙二醇試劑的總數(shù)均分子量為約800道爾頓(Da)至約 100， 000 Da，更優(yōu)選為約10， 000 Da至約60， 000 Da，最優(yōu)選為約15， 000 至約60， 000 Da。除了其他數(shù)均分子量之外，特別優(yōu)選具有約5， 000 Da、 約8，000 Da、約10，000 Da、約12， 000 Da、約15, 000 Da、約20， 000 Da、約25， 000 Da、約30, 000 Da、約35， 000 Da、約40， 000 Da、約 45,000 Da、約50, 000 Da和約60,000 Da的數(shù)均分子量的聚合物。 在這種情況下，聚合物是多臂聚合物，當(dāng)然，多臂聚合物的實(shí)際分子 量取決于聚合物臂的數(shù)目和整個(gè)多臂聚合物中每個(gè)聚合物臂的分子 量，以及聚合物的多分散性程度。
通常地，聚乙二醇包括約l個(gè)至約10個(gè)第二官能團(tuán)。例如，聚乙 二醇可包含選自l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和6個(gè)的許多個(gè)第二官 能團(tuán)。
適于在本方法中使用的說(shuō)明性多臂聚合物試劑以及其對(duì)應(yīng)的軛合 物在美國(guó)專利申請(qǐng)第2005/0112088號(hào)中描述。
優(yōu)選的用于本方法的多臂聚合物包括下式，其中下列結(jié)構(gòu)可進(jìn)一 步包括連接一個(gè)或多個(gè)PEG臂(理想的是，PEG臂中的每個(gè))與活性劑 的其他連接體或官能團(tuán)~(OCH2CH2)n-
(CH2CH20)^~
O
~(OCH2CH2)n
.0~~(CH2CH2C%~
和
(CH2CH2C%~
(pH2CH20tH~
<CH2CH20)^~
~(OCH2CH2)n
CH2CH2(%r
其中n的范圍通常為從約5至約400，且m的范圍從O至約5。 一種特別優(yōu)選的多臂試劑是4臂PEG-甘氨酸(結(jié)構(gòu)如下所示)，盡 管甘氨酸連接體可被任何其他合適的連接體替代
o
O ~(CH2CH20)n、
下面提供的是表示可由該方法形成的理想化軛合物的說(shuō)明性結(jié) 構(gòu)，假定母體多元醇中的幾基的每一個(gè)已轉(zhuǎn)化成聚合物臂并且每個(gè)聚
合物臂具有與其共價(jià)連接的藥物。在下面說(shuō)明性實(shí)例中，Q通常表示0, 但是可同樣地被認(rèn)為表示S、 -NH-或-匪-C(O)-，且POLY表示聚乙二 醇?！?POLY,.X-D
D-X-POLY廣Q
Q-POLY卜X-D 'Q-POLYi.X-D
Q-POLY.X-D
Q-POLY卜X-D
D-X-POLY,-Q D-X-POLY廣Q '
Q-POLY!-X-D
-POLY卜X-D
Q-POLY卜X-D
D-X-POLY廣Q Q-POLY"X-D D-X-POLY廣Q
D-X-POLY,-Q —
D-X-POLY，-Q Q-POLY,.X-D 關(guān)于前述的示例性結(jié)構(gòu)，X表示最典型地包括可水解鍵的間隔基， 其中所述可水解鍵與活性劑D直接連接。聚合物和每個(gè)藥物分子之間的所有鍵優(yōu)選地包括可水解降解的部分如酯鍵，以使所述活性劑隨時(shí) 間從多臂聚合物核中釋放。間隔基的特定同一性將至少部分取決于在
本方法中所使用的具體PEG試劑。
通常地，可水解鍵的至少一個(gè)原子被包含在未修飾形式的活性劑 中以使含在X內(nèi)的可水解鍵水解之后，釋放出活性劑D。 一般來(lái)說(shuō)， 間隔基具有從約4個(gè)原子至約50個(gè)原子、或更優(yōu)選地從約5個(gè)原子至 約25個(gè)原子、或甚至更優(yōu)選地從約5個(gè)原子至約20個(gè)原子的原子長(zhǎng) 度。通常地，間隔基具有選自由4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、 10個(gè)、ll個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19 個(gè)和20個(gè)原子組成的組的原子長(zhǎng)度。當(dāng)考慮原子鏈長(zhǎng)度時(shí)，僅考慮有 助于所有間距的原子。 例如， 具有 -^2-^(0)-^11-^2^22-^2^22-2(0)-^"結(jié)構(gòu)的間隔基具有11個(gè)原子 的鏈長(zhǎng)，因?yàn)椴徽J(rèn)為取代基有效地有助于間隔基的長(zhǎng)度。
活性劑
適于在本方法中使用的活性劑包括蛋白質(zhì)、寡肽、多肽、小分子、 抗體、核苷酸、寡核苷酸和脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述活性劑是包含第一官 能團(tuán)的小分子，所述第一官能團(tuán)是羥基或羧基，或適于與聚乙二醇試 劑共價(jià)連接的任何其他部分。在某些實(shí)例中，所述活性劑可具有多于 一個(gè)的第一官能團(tuán)。本文所提供的方法尤其有利于這些活性劑。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述活性劑部分是具有少于約1000 的分子量的小分子。在還有其他的實(shí)施方案中，所述小分子藥物具有 少于約800、或甚至少于約750的分子量。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述小分子藥物具有少于約500、或在某些實(shí)例中甚至少于約300的 分子量。
優(yōu)選的活性劑部分包括抗癌劑。特別優(yōu)選的是具有至少一個(gè)羥基 基團(tuán)的溶瘤劑(oncolytics)。
特別優(yōu)選的小分子包括紫杉烷類(例如多烯紫杉醇或紫杉醇)和喜 樹(shù)堿類。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"喜樹(shù)堿化合物"包括植物堿20(S)-喜樹(shù)堿以及其藥學(xué)活性的衍生物、類似物和代謝產(chǎn)物。喜樹(shù)堿衍生物的實(shí)例包括
但不限于9-硝基-20(3)-喜樹(shù)堿、9-氨基-20(S)-喜樹(shù)堿、9-甲基-喜樹(shù)堿、9-氯-喜樹(shù)堿、9-氟-喜樹(shù)堿、7-乙基喜樹(shù)堿、10-甲基-喜樹(shù) 堿、10-氯-喜樹(shù)堿、10-溴-喜樹(shù)堿、lO-氟-喜樹(shù)堿、9-甲氧基-喜樹(shù)堿、 11-氟-喜樹(shù)堿、7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN38) 、 10，11-亞甲基二氧基 喜樹(shù)堿和10， ll-亞乙基二氧基喜樹(shù)堿、和7-(4-甲基哌溱基亞甲 基)-10，ll-亞曱基二氧基喜樹(shù)堿、7-乙基-10-(4-(l-哌啶基 (piperdino))-l-哌啶基)-羰氧基-喜樹(shù)堿、9-羥基-喜樹(shù)堿和11-幾基 -喜樹(shù)堿。特別優(yōu)選的喜樹(shù)堿化合物包括喜樹(shù)堿、伊立替康和托泊替康。 某些優(yōu)選的喜樹(shù)堿化合物符合如下一般結(jié)構(gòu)。
XI
其中R廣Rs各自獨(dú)立地選自由以下組成的組氫；卣；?；?；烷基 (例如C1-C6烷基)；取代的炕基；烷氧基(例如Cl-C6烷氧基)；取代 的烷氧基；鏈烯基；炔基；環(huán)烷基；羥基；氰基；硝基；疊氮基；酰 氨基；肼；氨基；取代的氨基(例如單烷氨基和二烷氨基)；羥基羰基 (hydroxcarbonyl);烷氧基羰基；烷基羰氧基；烷基羰基氨基；氨 基甲?；趸环蓟酋；趸?；烷基磺?；趸?；-C (R7)-N-(0) i-R8， 其中R7是H、烷基、鏈烯基、環(huán)烷基或芳基，i是Q或l,且Rs是H、 烷基、鏈烯基、環(huán)烷基或雜環(huán)；且R,C(O)O-，其中R,是鹵素、氨基、 取代的氨基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)或R!。-0-(CH2)f，其中m是l-IO的整 數(shù)且Rw是烷基、苯基、取代的苯基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)或 取代的雜環(huán)；或
22R2與R3—起或R3與L一起形成取代的或未取代的亞甲基二氧基、 亞乙基二氧基或亞乙基氧基；且
Rs是H或OR，，其中R，是烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、卣烷基或羥 烷基。
示例性的取代基包括幾基、氨基、取代的氨基、卣、烷氧基、烷 基、氰基、硝基、羥基羰基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰基氨 基、芳基(例如苯基)、雜環(huán)和糖基基團(tuán)。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，D是伊立替康，其中20-位羥基上 的H在最終的多臂前體藥物軛合物中不存在。
在又另一個(gè)實(shí)施方案中，D是紫杉醇或多烯紫杉醇。 一個(gè)特別優(yōu) 選的D是多烯紫杉醇，其中2，位的H在最終的多臂聚合物軛合物中 不存在。
HO^ Aco 5c(0)C6H5
優(yōu)選地，本發(fā)明中所用的活性劑具有至少一個(gè)游離羥基、羧基、 硫基、氨基基團(tuán)或適于與聚合物共價(jià)連接的類似基團(tuán)(即"柄 (handle)")。優(yōu)選地，活性劑具有至少一個(gè)當(dāng)與聚乙二醇試劑反應(yīng)時(shí) 適于形成可水解鍵的官能團(tuán)，但是也可具有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè) 這樣的官能團(tuán)。優(yōu)選地，所述聚合物僅與所述活性劑中這些官能團(tuán)中的一個(gè)連接(即僅在單個(gè)位點(diǎn)連接)。
在小分子(或任何分子)中的期望的連接點(diǎn)空間受阻的情況下，單 個(gè)步驟軛合反應(yīng)可能難以達(dá)到有意義的收率。在這些情況下，該分子
中期望的連接點(diǎn)(例如多烯紫杉醇中的2，羥基)或PEG試劑可通過(guò)與 短連接體或間隔基部分的反應(yīng)而被官能化。這種方法可適用于很多小 分子，特別是具有難以接近到來(lái)的反應(yīng)性聚合物的共價(jià)連接位點(diǎn)的那 些小分子。所用的優(yōu)選連接體包括t-BOC-甘氨酸或具有受保護(hù)的氨基 基團(tuán)和可用的羧酸基團(tuán)的其他氨基酸(參見(jiàn)Zalipsky等人，
"Attachment of Drugs to Polyethylene Glycols (藥物與聚乙二醇 的連接)"，f"r.第19巻，No. 12，第1177-1183頁(yè)(1983))。 參見(jiàn)，例如本文實(shí)施例IA和1B。優(yōu)選的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸。
其他合適的間隔基還可用于替代上述的氨基酸。
偶聯(lián)劑
本方法中所用的優(yōu)選偶聯(lián)劑是碳二亞胺類。代表性的偶聯(lián)劑除了 其他之外，包括選自由以下組成的組的那些二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 N，N， -二異丙基碳二亞胺(DIC)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽(EDAC)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、 N-叔 丁基-N，-甲基碳二亞胺(TBMC)、 N-叔丁基-N，-乙基碳二亞胺(TBEC) 和1， 3-二-對(duì)甲苯基碳二亞胺。這些偶聯(lián)劑可從例如Sigma-Aldrich 獲得。
一個(gè)特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑是N，N， -二異丙基碳二亞胺。 對(duì)甲苯磺酸4- (二甲氨基)-吡啶総鹽(DPTS)
所述偶聯(lián)反應(yīng)通常是在對(duì)甲苯磺酸4- (二甲氨基)-吡啶絲鹽即由 4-(二甲氨基)吡啶和對(duì)甲苯磺酸形成的1: 1分子復(fù)合物的存在下進(jìn)行 的(Jeffrey S. Moore和Samuel I. Stupp， i^"o邁o7eci/7es, 1990， 23， 65-70)。優(yōu)選地，所述試劑是在使用之前新鮮制備的。
所述試劑是非吸濕性的，且可在室溫下長(zhǎng)期貯存。
反應(yīng)條件所述偶聯(lián)反應(yīng)通常在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑除了其他之外， 包括二氯甲烷、氯仿、乙腈和四氫呋喃。
通常地，所述偶聯(lián)反應(yīng)在范圍為約ox:至約100'c的溫度下進(jìn)^ 。 優(yōu)選地，所述反應(yīng)在室溫下(即沒(méi)有加熱或冷卻)進(jìn)行，且可伴隨攪拌。
室溫的范圍通常為從約18。C至約23°C。
一般地，DPTS的量范圍為相對(duì)于第一官能團(tuán)(即活性劑中期望的 連接點(diǎn))的約0. 05當(dāng)量至約0. 75當(dāng)量，更優(yōu)選為相對(duì)于第一官能團(tuán)的 約0. 10當(dāng)量至0. 60當(dāng)量。所述偶聯(lián)劑的量一般范圍為相對(duì)于第一官 能團(tuán)的約1.25當(dāng)量至5當(dāng)量。優(yōu)選的第一官能團(tuán)是羥基和羧基。
優(yōu)選的第二官能團(tuán)(即存在于聚乙二醇試劑中的反應(yīng)基)包括氨 基、羥基和羧基以及其活化等同物，當(dāng)然，其中選擇第一官能團(tuán)和第 二官能團(tuán)使之相互反應(yīng)。
優(yōu)選地，第一官能團(tuán)與第二官能團(tuán)之間的反應(yīng)導(dǎo)致形成酯鍵(例 如，由羧酸或活化羧酸與醇的羥基基團(tuán)的反應(yīng)產(chǎn)生)。
在某些實(shí)例中，所述活性劑包括多于一個(gè)的第一官能團(tuán)，并且所 述方法不包括(或缺少)保護(hù)步驟，以使所得的軛合物產(chǎn)物僅在單個(gè)"第 一官能團(tuán)"位點(diǎn)得以修飾。
本方法的一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是使由碳二亞胺偶聯(lián)劑產(chǎn)生的N-?；?脲副產(chǎn)物形成降至最低。 一般地，所述方法有效地導(dǎo)致形成少于約15% 的N-?；甯碑a(chǎn)物，并且優(yōu)選地，少于約10%的N-?；甯碑a(chǎn)物，并 且甚至更優(yōu)選地，少于約5%的N-?；甯碑a(chǎn)物。參見(jiàn)實(shí)施例2，其中 合成方法導(dǎo)致形成具有通過(guò)酯鍵與多烯紫杉醇上的單個(gè)羥基位點(diǎn)(例 如2，幾基位點(diǎn))共價(jià)連接的聚乙二醇的多烯紫杉醇-聚乙烯軛合物， 而沒(méi)有形成可檢測(cè)量的N-?；甯碑a(chǎn)物。
經(jīng)本方法制備的期望的聚乙二醇-活性劑軛合物的收率通常大于 約70%，優(yōu)選大于約75%，更優(yōu)選大于約80%，甚至更優(yōu)選大于85%， 且最優(yōu)選大于90%。
可進(jìn)一步純化前體藥物產(chǎn)物。純化和分離的方法包括沉淀、之后 過(guò)濾和干燥，以及色語(yǔ)法。適宜的色譜法包括凝膠過(guò)濾色譜法和離子交換色譜法。
放y^
本文所提供的方法適于制備許多PEG-輒合物中的任一種，并且特 別有利于制備具有與分子中的單個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(該分子具有多于一個(gè)的 這種反應(yīng)位點(diǎn))共價(jià)連接的PEG的軛合物，而避免多個(gè)保護(hù)/脫保護(hù)步 驟、低收率并使不希望的副反應(yīng)降至最低。本文所提供的合成方法極 其有效，且非常適于大規(guī)模生產(chǎn)。
此外，已顯示示例性的根據(jù)本文提供的方法所形成的4臂PEG-甘 氨酸-多烯紫杉醇軛合物作為抗癌劑特別有用。參見(jiàn)，例如實(shí)施例3、 4和5。這種說(shuō)明性軛合物在顯著減少某些實(shí)體瘤的生長(zhǎng)中有效，如通 過(guò)小鼠中的代表性肺癌、前列腺癌和乳腺癌體內(nèi)研究所證明，
應(yīng)理解，盡管已描述了本發(fā)明連同其優(yōu)選的特定實(shí)施方案，但是 前文的描述以及隨后的實(shí)施例旨在說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。 本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)是明顯的。
本文提及的所有文章、書(shū)籍、專利和其他出版物的全部?jī)?nèi)容據(jù)此 通過(guò)引用并入。
實(shí)施例
除非另有指出，本發(fā)明的實(shí)施將使用常規(guī)的有機(jī)合成技術(shù)及類似 的技術(shù)，這些技術(shù)都在本領(lǐng)域的技能水平內(nèi)。如果這些技術(shù)未在本文 中詳細(xì)列出，則它們?nèi)吭谖墨I(xiàn)中描述。試劑和材料都市售可得，除 非另有明石角i兌明。參見(jiàn)，伊J^口， J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure (高等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理和 結(jié)構(gòu))，第4版，(New York: ley-Interscience， 1992), /^7丄和 Comprehensive Organic Functional Group Transformations II(綜 合性有機(jī)官能團(tuán)轉(zhuǎn)化II)，第l-7巻，第2版l"5-2003合成文獻(xiàn)的 綜述(有機(jī)化學(xué)叢書(shū))，Katritsky， A丄等人編，Elsevier Scie腦。
在下列實(shí)施例中，已努力確保關(guān)于所用數(shù)字的準(zhǔn)確性(例如量、溫度等)，但是應(yīng)解釋一些試驗(yàn)誤差和偏差。除非另有規(guī)定，溫度是以攝 氏度計(jì)，并且壓力為在海平面的大氣壓或接近海平面的大氣壓。
盡管將提及為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他縮寫(xiě)，還將使用其 他試劑和材料，并且還將使用其他為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法， 但是為了便利的原因，仍提供了以下列表和方法描述。
縮寫(xiě)
CM 羧甲基或羧基亞曱基(-CH2COOH)
DCC 1，3-二環(huán)己基碳二亞胺
DCM 二氯甲烷
DIC N，N， -二異丙基碳二亞胺
DPTS對(duì)甲苯磺酸4- (二甲氨基)-吡啶総鹽
DMF 二甲基甲酰胺
DMAP4- (N， N-二甲氨基)吡咬
DMSO 二曱亞砜
DI 去離子的
HC1 鹽酸
HOBT 幾基節(jié)基三唑
HPLC 高效液相色譜法
IPA 異丙醇
K或kDa 千道爾頓
MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間 MeOH 曱醇
MW 分子量 NMR 核磁共振 RT 室溫
SCM 琥珀酰亞胺基羧甲基(-CH2-C00-N-琥珀酰亞胺基)
SDS-PAGE十二烷基疏酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 SEC 尺寸排阻色鐠法 TFA 三氟乙酸THF 四氫呋喃 TLC 薄層色i脊法 材料與方法
多烯紫杉醇(Taxotere⑧)購(gòu)自中國(guó)杭州HETD藥物化工有限公司。
4臂PEG2。「CM和4臂PEG漁-SCM從4臂PEG漁-OH (Nektar， Huntsville， Alabama)制得。
下列試劑的來(lái)源如下甘氨酸叔丁酯(98%， Aldrich); 4-二甲氨 基吡啶(DMAP， 99%, Aldrich); ^ #， -二異丙基碳二亞胺(DIC， 99%, Acros), M iV， -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC, 99%， Acros) , ^ A^二異 丙基乙胺(DIPEA， 99%， Aldrich)和對(duì)甲苯磺酸(PTSA， 98.5%, Aldrich)，并且所有試劑在到貨時(shí)即使用。在使用之前干燥溶劑。
DPTS:對(duì)甲苯磺酸通過(guò)苯溶液的共沸蒸餾而千燥，之后添加DMAP 在苯中的等摩爾溶液。將所得懸浮液冷卻至室溫，并經(jīng)抽濾收集固體。
4臂PEG2。k-甘氨酸具有下列結(jié)構(gòu)
C葉CH20-(CH2CH20)5K-CH2C-NH-CHrC OH \ / 4
4臂PEG2。K.甘氨酸
所有^NMR數(shù)據(jù)通過(guò)由Bruker制造的300或400 MHz NMR光譜儀產(chǎn)生。
實(shí)施例1
A. 4臂PEG織-甘氨酸-多烯紫杉醇的合成DMAP-DCC偶聯(lián) 將4臂PEGm-甘氨酸(500 mg， 0.025 raraol)溶解于10 mL二氯曱 烷(DCM)中。邊攪拌邊將4-二甲氨基吡啶(19 mg, 0. 15 mmol)和DCC (32 mg， 0.15 ranol)加入到PEG溶液。5分鐘后加入多烯紫杉醇(121 mg， 0. 15mmo1)，并將反應(yīng)混合物在室溫下繼續(xù)攪拌另外的24小時(shí)。結(jié)束 后，將反應(yīng)混合物在醚/IPA(l: l)的混合溶劑系統(tǒng)中沉淀。通過(guò)抽濾收 集所得的白色固體，將之再溶解于DCM (2mL)，并使用二乙醚單溶劑 系統(tǒng)(IOO mL)再沉淀，抽濾后得到期望的產(chǎn)物。
28^ NMR分析顯示存在顯著量的N-?；?5 1-2.5 ppm)副產(chǎn)物。 隨后通過(guò)HPLC的藥物釋放研究顯示了約40% PEG (每個(gè)聚合物分子的 一個(gè)或多個(gè)羧基)部分轉(zhuǎn)化成N-?；?DMAP-DCC偶聯(lián)反應(yīng)中常見(jiàn)的 副產(chǎn)物)。因?yàn)镹-?；甯碑a(chǎn)物不能水解回到原先的PEG起始物料， 所以產(chǎn)物純度特征極其復(fù)雜。而且，PEG起始物料對(duì)于轉(zhuǎn)化成N-?；?脲的部分是不可回收的。不進(jìn)行產(chǎn)物混合物的進(jìn)一步表征即結(jié)構(gòu)、栽 藥量(drug loading)、釋放率。
B.替代方法
甘氨酸連接體與多烯紫杉醇的共價(jià)連接
鑒于低收率且難以從實(shí)施例1A中所形成的混合物中純化期望的 軛合物產(chǎn)物，因此研究了制備期望軛合物的替代方法。
與其說(shuō)研究了在偶聯(lián)劑的存在下4臂PEG皿-甘氨酸與多烯紫杉醇 的直接反應(yīng)，還不如說(shuō)研究了甘氨酸在多烯紫杉醇2，位的共價(jià)連接， 然后與對(duì)應(yīng)的PEG試劑偶聯(lián)以形成期望的4臂PEG2。k-甘氨酸-多烯紫杉 醇。
使用1當(dāng)量的受保護(hù)的Fmoc-甘氨酸，以便致力于使各位點(diǎn)而不 是2，位的修飾降至最低。反應(yīng)條件在下面反應(yīng)流程中示出。
<formula>formula see original document page 29</formula>在硅膠柱上純化后，期望的軛合物(A)的收率僅為20%。由于2，-修飾的多烯紫杉醇的低收率和所形成的多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物，所以不進(jìn)行進(jìn) 一步轉(zhuǎn)化成4臂PEG皿-甘氨酸-多烯紫杉醇。
實(shí)施例2
<formula>formula see original document page 30</formula>
4臂PEG2。f甘氨酸多烯紫杉醇的全部合成在上面流程中示出。"0" 表示假設(shè)載藥量完全時(shí)，每4臂聚合物中多烯紫杉醇分子的理論數(shù)目。
A. 4臂PEG漁-甘氨酸叔丁酯的制備
將4臂PEG漁-CM (12.5 g， 0.625 mmol)溶解于100 mL DCM中。 然后在攪拌下將4-二甲氨基吡啶(610 mg， 5. 00 mmol)和DCC (625 mg， 3. 0Ommol)加入到溶液中。攪拌5分鐘后，加入甘氨酸叔丁酯'HC1 (503 mg， 3.00 mmol)并將混合物在室溫下繼續(xù)攪拌過(guò)夜。結(jié)束后，使用醚 /IPA(1: l)的混合溶劑系統(tǒng)將反應(yīng)混合物沉淀，抽濾后得到期望的4 臂PEG漁-甘氨酸叔丁酯產(chǎn)物(10. 5 g， 0.525 mmol,收率84%)。
'H NMR (CDCh) 5 4.11 (《8H) ， 4.05 8H), 3.90-3.37 U， —1900H), 1.48 (s， 36H)。
B. 4臂PEG漁-甘氨酸叔丁酯脫保護(hù)形成4臂PEG2。k-甘氨酸 使用三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM, 3:1)將4臂PEG漁-甘氨酸叔
丁酯脫保護(hù)并在室溫下攪拌3小時(shí)。通過(guò)將醚(600 mL)加至反應(yīng)混合物使產(chǎn)物沉淀，抽濾后得到期望的4臂PEG漁-甘氨酸(9. 2 g)。
^ NMR (CDC13) 5 4.11 ((/， 8H) ， 4.05 ( ， 8H)， 3,90-3.37 (頂， —1900H)。
C. 4臂PEG織-甘氨酸-多烯紫杉醇的制備
將多烯紫杉醇(776 mg， 0,96 mmol)和4臂PEG準(zhǔn)-甘氨酸(4. 0 g， 0. 2 mmol)溶解于50 mL DCM中，然后在攪拌下加入新鮮制備的DPTS (155 mg， 0.53 mmol) (Jeffrey S. Moore和Samuel I. Stupp， 他c濯o7ecw7es， 1990， 23, 65-70)和DIC (404 mg， 3. 2畫(huà)1)。在 室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。使用醚/IPA(l: l)的混合溶劑系 統(tǒng)使反應(yīng)混合物沉淀。通過(guò)抽濾收集所得的白色固體，將之再溶解于 5 ml DCM中，并使用醚單溶劑系統(tǒng)(300 mL)再沉淀，抽濾后得到期望 的4臂PEGm-甘氨酸-多烯紫杉醇。收率(步驟C)為90%。
腿(CDC1》5 8.12 (《8H)， 7.73 (邁，4H) ， 7.61 O， 4H)， 7.52 (范，8H)， 7.41 (頂，8H) ， 7.33 (/ ， 8H) ， 6.20 "， 4H) ， 5.69 (邁，8H)， 5.60 Oz ， 4H), 5.36 4H) ， 5.22 U ， 4H) ， 4.97 (《4H)， 4.33 Oz ， 8H)， 4.30 (歷，12H)， 4.06 (《 8H)， 3.98 (s， 8H), 3.90—3.24 (邁，—1900H), 2.60 U/， 4H) ， 2.36 (邁，20H)， 1.96 (s， 12H)， 1.86 Ow， 8H)， 1.75 (s， 12H)， 1.68 0z ， 8H) ， 1.35 "， 36H)， 1.2512H)， 1.1312H)。所有化學(xué)位移值以ppm (5)表示。
D. 4臂PEG漁-甘氨酸-多烯紫杉醇的載藥量和水解
通過(guò)NMR(8。/。)和RP-HPLC(6. 2%)分析方法測(cè)定栽藥量，而僅通 過(guò)RP-HPLC測(cè)定水解速率(在磷酸鹽緩沖液中)。 通過(guò)111 NMR計(jì)算載藥量
制備不同的PEG-多烯紫杉醇濃度的樣品，然后掃描次數(shù)隨樣品的 濃度而變化。根據(jù)所有獲得的波譜的平均質(zhì)子峰積分，確定載藥量。 通過(guò)HPLC計(jì)算載藥量和水解速率 儀器HP 1100 柱Cm柱
流動(dòng)相A: H20中的0. 1% TFA; B:乙腈流速0. 5 mL /分4中 梯度表
時(shí)間(分 鐘)
060%40%
15090%
栽藥量測(cè)定:實(shí)驗(yàn)上如下測(cè)定栽藥量和水解速率使用上述的 HPLC法，將10. 8 mg多烯紫杉醇溶解于乙腈/PBS的混合溶劑系統(tǒng)(1: 1， 10 mL， pH 7. 4)中。將這種儲(chǔ)備溶液進(jìn)一步連續(xù)稀釋，得到下列濃度 的多烯紫杉醇溶液540 ug/mL、 405 n g/mL、 300 |i g/mL、 216 m g/mL、 108 jug/mL和54 ju g/瓜L。得到每種濃度的峰面積，從而產(chǎn)生 標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將30.4 mg 4臂PEG漁-多烯紫杉醇溶解于10 raL PBS， pH 7. 4。將溶液過(guò)濾，然后將0. 3mL的等分試樣置于10個(gè)獨(dú)立的HPLC 小瓶中。將這些小瓶貯存在37。C下，并在使用之前，加入O. 3mL乙腈 以確保存在于樣品中的所有PEG-多烯紫杉醇和游離多烯紫杉醇溶解。 每次注入使用一個(gè)小瓶，并且在200小時(shí)的時(shí)程(8. 3天)中于不同的 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行注入。監(jiān)控游離藥物從PEG-軛合物中釋放的出現(xiàn)，并在結(jié) 束后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定終濃度。
載藥量值是指在4臂PEG^-甘氨酸-多烯紫杉醇產(chǎn)物中與聚合物 共價(jià)連接的多烯紫杉醇分子的平均數(shù)目。假設(shè)每個(gè)4臂聚合物含有4 個(gè)多烯紫杉醇分子，則計(jì)算出4臂PEG2。k-甘氨酸-多烯紫杉醇產(chǎn)物的分 子量為約23,232。多烯紫杉醇的分子量為808。假設(shè)載藥量完全(每個(gè) 聚合物4個(gè)多烯紫杉醇)，則包含在產(chǎn)物中的藥物的理論重量百分比為 (3232/23232) 100或13. 9、經(jīng)HPLC測(cè)定，藥物的實(shí)測(cè)重量為6. 2%， 這表示每個(gè)聚合物多烯紫杉醇的平均數(shù)目為1.78。通過(guò)^NMR測(cè)定的 栽藥量值為8%，這表示每個(gè)聚合物多烯紫杉醇分子的平均數(shù)目為約 2.3。因此，對(duì)于此次制備，根據(jù)兩種方法的平均，每個(gè)聚合物多烯紫 杉醇分子的平均數(shù)目略高于2. 00。
半衰期測(cè)定.水解速率(報(bào)告為半衰期)的測(cè)定利用上文對(duì)于載藥
32量所述的相同分析方法。
一旦藥物釋放結(jié)束，通過(guò)測(cè)定游離藥物的濃
度(面積％)等于50%的時(shí)間或者如果線性極佳的情況下通過(guò)測(cè)定曲線 的斜率(ln 1-S% vs.小時(shí))并使用下列方程來(lái)計(jì)算半衰期 半衰期- In (2) /斜率
測(cè)定4臂PEG2。k-多烯紫杉醇的半衰期為15. 3小時(shí)。 實(shí)施例3
4臂PEG皿-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有NCI-H460肺腫瘤的小鼠 中的抗腫瘤活性
將人NCI-H460肺腫瘤(每個(gè)30至40個(gè)片段)皮下植入到小鼠 (Charles Rivers Labs: NCr nu/nu)的右腋域附近。指定植入的當(dāng)天 為第0天，并在治療前使腫瘤達(dá)到100-245 mg的重量。
以在治療的第1天中值肺瘤重量與彼此盡可能地接近的方式，將 動(dòng)物隨機(jī)分組。
治療小鼠接受l種或2種靜脈劑量的測(cè)試化合物或栽體(鹽水)。
腫瘤測(cè)量稱量動(dòng)物，并在施用第一次注射后每周測(cè)量腫瘤兩次。 通過(guò)測(cè)徑器測(cè)量值(mm)和使用如下橢圓形球體的公式測(cè)量腫瘤體積L x2= mm3,其中L和W是指在每次測(cè)量所采集的較大和較小法線 尺寸(perpendicular dimension )。假設(shè)單位密度為(1 mra3 = 1 mg )， 此公式還用于計(jì)算腫瘤重量。
研究持續(xù)時(shí)間在研究終止前，將發(fā)現(xiàn)瀕死的任何動(dòng)物或其腫瘤 達(dá)到4000 mg、形成潰瘍或脫落的任何動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。
結(jié)果.進(jìn)行兩種不同的效果研究。第l種研究評(píng)價(jià)了 4臂PEG漁-多烯紫杉醇和多烯紫杉醇抗H460 NSCLC腫瘤的效果。

圖16A-C說(shuō)明了 單劑量的每個(gè)化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。觀察到，20 mg/kg和"mg/kg 劑量的聚乙二醇化多烯紫杉醇相比于未聚乙二醇化的游離化合物提供 了改善的抗腫瘤作用。10 mg/kg劑量在兩個(gè)化合物之間顯示出顯著差異。
在第2種研究中，測(cè)量最多達(dá)無(wú)胸腺棵小鼠的最大耐受劑量的抗 腫瘤(H460 NSCLC胂瘤)效果。動(dòng)物耐受最多30 mg/kg的多烯紫杉醇和最多60 mg/kg的PEG-多烯紫杉醇。圖l說(shuō)明了每個(gè)化合物的兩種 劑量(q7d x 2)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。根據(jù)結(jié)果又可明顯看出，聚乙二 醇化的化合物相比于多烯紫杉醇化合物提供了改善的抗肺瘤作用。當(dāng) 與三種未聚乙二醇化的藥物劑量比較時(shí)，劑量響應(yīng)在三種聚乙二醇化 的藥物劑量中是清楚明顯的。 實(shí)施例4
4臂PEG皿-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有DU-145前列腺胂瘤的小 鼠中的抗腫瘤活性
如上面實(shí)施例3所述進(jìn)行此項(xiàng)研究，除了所使用的胂瘤為DU-145 前列腺腫瘤。
評(píng)價(jià)最多達(dá)每個(gè)化合物的最大耐受劑量抗前列腺腫瘤(DU-145)的 抗腫瘤效果。動(dòng)物耐受最多30 mg/kg的多烯紫杉醇和最多60 mg/kg 的PEG-多烯紫杉醇。
圖2說(shuō)明了每個(gè)化合物的兩種劑量(q7d x 2)的抗腫瘤作用。根 據(jù)結(jié)果又可明顯看出，在所有3種所測(cè)試的劑量下，聚乙二醇化的化 合物完全抑制肺瘤生長(zhǎng)，并且抑制持續(xù)78天觀察期。多烯紫杉醇化合 物顯示良好的活性，但是腫瘤在30-50天后恢復(fù)并生長(zhǎng)。
實(shí)施例5
4臂PEGm-甘氨酸-多烯紫杉醇在移植有MCF-7乳腺腫瘤的小鼠中 的抗腫瘤活性
在細(xì)胞接種前至少2天，通過(guò)外科手術(shù)將17(3-雌二醇(雌激素) 小片(l.OO mg/小片；Innovative Research of America, Sarasota， Florida, USA)皮下植入到多達(dá)100只小鼠(Charles Rivers Labs: CD-I Fox nl nu)的頸部側(cè)面(lateral side)。這些小片在植入后 以0.011 nig/天的速率釋放雌激素達(dá)90天。手術(shù)后，將0. 1 mL體積 的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/Matrigel (1: 1 v/v)中約1 x 106 MCF-7細(xì) 胞皮下注射到右肋中。使腫瘤達(dá)到50-150 nun3的范圍。此項(xiàng)研究的第 0天表示給藥的第一天。
以在治療的第1天中值腫瘤重量與彼此盡可能地接近的方式，將動(dòng)物隨纟幾分組。
治療小鼠接受l種或2種靜脈劑量的測(cè)試化合物或栽體(鹽水)。 腫瘤測(cè)量稱量動(dòng)物，并在施用第一次注射后每周測(cè)量腫瘤兩次。 通過(guò)測(cè)徑器測(cè)量值(mm)和使用如下橢圓形球體的公式測(cè)量胂瘤體積L x W7 2= mm3，其中L和W是指在每次測(cè)量所采集的較大和較小法線 尺寸。假設(shè)單位密度為(1 mm3 = 1 mg)，此公式還用于計(jì)算腫瘤重 量。
研究持續(xù)時(shí)間在研究終止前，將發(fā)現(xiàn)瀕死的任何動(dòng)物或其腫瘤 達(dá)到1500 cc、形成潰瘍或脫落的任何動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。
結(jié)果以10 mg/kg、 20 mg/kg和30 mg/kg的劑量評(píng)價(jià)抗乳腺腫 瘤(MCF-7)的抗肺瘤效果。結(jié)果顯示兩種所測(cè)試的化合物在兩種高劑 量時(shí)都完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。圖3說(shuō)明了 10mg/kg劑量(q7d x 2)的抗
肺瘤效果。
由于具有存在于前述描述中的教導(dǎo)的益處，故本發(fā)明所屬領(lǐng)域技
術(shù)人員可想到本發(fā)明的很多變更和其他實(shí)施方案。因此，應(yīng)理解，本 發(fā)明并不限于所公開(kāi)的特定實(shí)施方案，且預(yù)期變更和其他實(shí)施方案包 括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管本文使用特定術(shù)語(yǔ)，但是它們僅以 通用和描述性的含義使用，并不出于限定的目的。
權(quán)利要求
1.一種將聚乙二醇聚合物與活性劑共價(jià)連接的方法，所述方法包括以下步驟提供包含第一官能團(tuán)的活性劑，所述第一官能團(tuán)選自氨基、羥基和羧基，和在偶聯(lián)劑和對(duì)甲苯磺酸4-(二甲氨基)-吡啶鎓鹽(DPTS)的存在下，在有效促進(jìn)所述第一官能團(tuán)與第二官能團(tuán)之間的反應(yīng)的條件下，將所述活性劑與包含對(duì)所述第一官能團(tuán)具有反應(yīng)性的第二官能團(tuán)的聚乙二醇反應(yīng)，從而形成聚乙二醇-活性劑軛合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑是碳二亞胺。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑選自由二環(huán)己基 碳二亞胺(DCC)、 N，N， -二異丙基碳二亞胺(DIC) 、 l-(3-二曱氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC) 、 l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺(EDC)、 N-叔丁基-N，-曱基碳二亞胺(TBMC)和N-叔丁基-N，-乙基 碳二亞胺(TBEC)組成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑是N，N， -二異丙 基碳二亞胺。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟在 選自由二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氫呋喃組成的組的有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟在范圍為0°C 至IO(TC的溫度下進(jìn)行。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟在室溫下進(jìn)行。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中DPTS在所述反應(yīng)步 驟中的量范圍為相對(duì)于所述第一官能團(tuán)的約0. 05當(dāng)量至0. 75當(dāng)量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中DPTS在所述反應(yīng)步驟中的量 范圍為相對(duì)于所述第一官能團(tuán)的約0. 10當(dāng)量至0. 60當(dāng)量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述偶聯(lián)劑的量范 圍為相對(duì)于所述第一官能團(tuán)的約1. 25當(dāng)量至5當(dāng)量。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二官能團(tuán)選自由氨基、羥基和羧基組成的組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述活性劑選自由 蛋白質(zhì)、寡肽、多肽、小分子、抗體、核苷酸、寡核苷酸和脂質(zhì)組成的 組。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述活性劑是蛋白質(zhì)或多肽。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述活性劑是小分子。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述活性劑是包含為羥基 或羧基的第一官能團(tuán)的小分子。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述活性劑具有多于一個(gè) 的所述第一官能團(tuán)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一官能團(tuán)與 第二官能團(tuán)之間的反應(yīng)導(dǎo)致形成酯鍵。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述小分子是紫杉烷或喜 樹(shù)械。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述小分子是多烯紫杉醇 或紫杉醇。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述反應(yīng)導(dǎo)致形成具有通 過(guò)酯鍵與多烯紫杉醇上單個(gè)羥基位點(diǎn)共價(jià)連接的聚乙二醇的多烯紫杉 醇-聚乙烯軛合物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述單個(gè)位點(diǎn)是多烯紫杉 醇的2'-羥基基團(tuán)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所迷聚乙二醇選自 由線性、分枝、叉狀和多臂聚乙二醇組成的組。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚乙二醇包括3個(gè)至 25個(gè)臂。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所迷的方法，其中所述聚乙二醇包括選自3 個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)和10個(gè)的多個(gè)臂。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述聚乙二醇包括多元醇 或聚胺核。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述聚乙二醇包括選自甘 油、三羥甲基丙烷、山梨糖醇、六甘油和季戊四醇的多元醇核。
27. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚乙二醇包括 約1個(gè)至約IO個(gè)所述第二官能團(tuán)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述聚乙二醇包括選自1 個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)和6個(gè)的多個(gè)所述第二官能團(tuán)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述聚乙二醇包括選自以 下的結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>其中n范圍為從約5至約400， m范圍從0至5，且多臂聚合物的總分子量的范圍從約1500至約60， 000道爾頓。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述活性劑包括多于一個(gè) 的所述第一官能團(tuán)，且所述方法不包括保護(hù)步驟。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述活性劑是多烯紫杉醇。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述聚乙二醇是
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟形成具有僅 在其2，位與所述聚乙二醇共價(jià)連接的多烯紫杉醇的軛合物。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟形成了每個(gè) 聚乙二醇所具有的多烯紫杉醇分子的平均數(shù)目范圍為約2.1個(gè)至3.75 個(gè)的扼合物。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟形成了每個(gè) 聚乙二醇所具有的多烯紫杉醇分子的平均數(shù)目范圍為約2. 3個(gè)至3. 2個(gè) 的輒合物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟導(dǎo)致形成少 于約15%的N-?；甯碑a(chǎn)物。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟導(dǎo)致形成少 于約10%的N-酰基脲副產(chǎn)物。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟導(dǎo)致形成少 于約5%的N-?；甯碑a(chǎn)物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述軛合物的收率 大于約70%。
全文摘要
本文提供的是用于將聚乙二醇聚合物共價(jià)連接到活性劑的簡(jiǎn)單且有效的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101583380SQ200780044217
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
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