專利名稱：：生物凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物凝膠，和用于形成該生物凝膠的試劑盒、制劑和方法。在優(yōu)選的方面，該生物凝膠是組織粘合劑。可以將該生物凝膠或組織粘合劑用于包括止血、封閉傷口愈合、組織工程或定位的藥物遞送的多種應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在凝血過程中，通過凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。纖維蛋白原包含彼此通過二硫鍵連接的兩組三個(gè)不同鏈(oc、(3和y)。這些鏈一起形成與兩個(gè)遠(yuǎn)端球狀結(jié)構(gòu)域(d結(jié)構(gòu)域)相連的中心球狀結(jié)構(gòu)域(E結(jié)構(gòu)域)。凝血酶切割在纖維蛋白原中心E結(jié)構(gòu)域中的四個(gè)精氨酸-甘氨酸肽鍵，從兩個(gè)a鏈中的每一個(gè)的釋放A肽，且從兩個(gè)P鏈中的每一個(gè)均釋放B肽。將A和B肽命名為纖維蛋白肽。缺乏這些纖維蛋白肽的纖維蛋白原分子被稱為纖維蛋白單體。纖維蛋白單體自發(fā)的組裝為稱為纖維蛋白的有序纖維陣列。通過在纖維蛋白纖維中不同分子側(cè)鏈之間形成共價(jià)交聯(lián)來穩(wěn)定纖維蛋白。在轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)中在特定谷氨酰胺和賴氨酸側(cè)鏈之間形成肽鍵，該反應(yīng)由因子XIIIa催化。一旦被激活，血小板也參與形成血塊的基本部分。血小板附著到暴露的傷口表面和被激活。血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa經(jīng)歷構(gòu)象的改變，使其結(jié)合纖維蛋白原。纖維蛋白原能夠結(jié)合多個(gè)血小板，從而使血小板凝聚在一起。血小板凝聚形成在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)所形成血塊的基本結(jié)構(gòu)。纖維蛋白組織粘著劑(FTA)是對(duì)通過模擬凝血連鎖反應(yīng)最后步驟所形成產(chǎn)物的命名，使用該凝血連鎖反應(yīng)以形成纖維蛋白凝塊。商品化的FTA試劑盒快速產(chǎn)生強(qiáng)的生物可降解凝膠，其被用于止血、藥物6遞送和作為外科膠和組織塑封。通常經(jīng)由注射裝置遞送纖維蛋白原、因子xin、凝血酶和釣離子，在貯存期間該裝置將纖維蛋白原和因子xni與鈣離子和凝血酶分開。在從注射器釋放期間組分被混合，導(dǎo)致纖維蛋白原的溶栓，產(chǎn)生纖維蛋白，其自組裝形成凝膠，之后通過鈣離子激活的因子XIII被交聯(lián)。但是，許多FTA使用牛凝血酶，其可以在患者中誘發(fā)過敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)。Zhang等人(BioconjugateChem.2002(13):640-646)描述了基于纖維蛋白原的水凝膠的形成，該過程是通過光激活從脂質(zhì)體釋放4丐離子，隨后激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化纖維蛋白原交聯(lián)。但是，這些水凝膠的形成是復(fù)雜的，并且需要專門形成脂質(zhì)體和因子XIII。Hidas等人(Urology67(4)，2006:697-700)描述了白蛋白戊二醛組織粘合劑在無縫合腎保留手術(shù)中的用途。將牛血清白蛋白和戊二醛混合。戊二醛暴露導(dǎo)致牛血清白蛋白的賴氨酸分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞表面彼此結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)共價(jià)鍵。但是，這一粘合劑的缺點(diǎn)在于，戊二醛是有毒的，和具有牛血清白蛋白可能在患者中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要提供凝膠或組織粘合劑，其不需要使用毒性物質(zhì)，最小化過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且其可以容易地從能夠在穩(wěn)定條件下容易貯存的成份中產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明，提供生物試劑盒(即，用于形成生物凝膠的試劑盒)，其包含多個(gè)載體、固定于各載體上的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分和纖維蛋白原，其中各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分。本文使用的術(shù)語"生物凝膠"包括包含一種或多種成份的凝膠，所述成份是天然或重組的生物分子(或化學(xué)合成的生物分子)、或其衍生自生物分子(例如，保留生物分子的一種或多種功能的衍生物)。可以通過將纖維蛋白原和載體接觸形成生物凝膠。因?yàn)槎鄠€(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分被固定于各個(gè)載體，且因?yàn)楦鱾€(gè)纖維蛋白原分子能夠7結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，所述纖維蛋白原分子經(jīng)由所述載體而連接在一起。在所述纖維蛋白原分子和所述纖維蛋白原結(jié)合部分之間形成非共價(jià)鍵。因此，根據(jù)本發(fā)明，還提供形成生物凝膠的方法，其包括使纖維蛋白原分子與多個(gè)載體接觸，其中各個(gè)載體具有多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，和各個(gè)纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，蛋白原分子之間形^的非共價(jià)鍵，經(jīng)由載體連i在一:。、，根據(jù)本發(fā)明，還提供包含纖維蛋白原分子和多個(gè)載體的生物凝膠，其中各個(gè)載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，和各個(gè)纖維蛋白原分子結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從而所述纖維蛋形成的非共價(jià)鍵，經(jīng)由載體連接在一起。除了纖維蛋白原結(jié)合部分，該載體可以具有固定于各個(gè)載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體，其中各個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。為了使用這樣的載體形成生物凝膠，需要將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化成纖維蛋白原結(jié)合部分，從而該纖維蛋白原結(jié)合部分而后能夠結(jié)合至纖維蛋白原分子。因此，根據(jù)本發(fā)明還提供生物凝膠試劑盒(即，用于形成生物凝膠的試劑盒)，其包含多個(gè)載體、固定于各個(gè)載體上的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體，其中各個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體可以被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分；和纖維蛋白原，其中各個(gè)纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分。根據(jù)本發(fā)明還提供形成生物凝膠的方法，其包括提供多個(gè)載體，各個(gè)載體包含固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體；將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分；和將纖維蛋白原分子與所述纖維蛋白原結(jié)合部分接觸，其中各個(gè)纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從而所述纖維蛋白原分子通過在所述纖維蛋白原結(jié)合部分和所述纖維蛋白原分子之間形成的非共價(jià)鍵，經(jīng)由8栽體連接在一起。本發(fā)明的生物凝膠不需要能夠粘著于組織基底。然而，本發(fā)明的生物凝膠優(yōu)選是組織粘合劑。本文使用的術(shù)語"組織粘合劑"意指能夠粘附于組織基片底(例如皮膚，或粘膜表面)的物質(zhì)?？梢詫⒈景l(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑用于止血、作為封閉劑、用于組織工程(例如用作支持物)，或用于定位藥物遞送。所述栽體可以是可溶或不溶載體，但不是血小板。所述載體應(yīng)該適合局部施用于受試者的組織位點(diǎn)，例如，出血傷口位置，或者粘膜位置。相對(duì)局部施用而言，可溶性載體可能更適于靜脈內(nèi)施用。所述載體可以包含可溶或不溶蛋白質(zhì)、治療藥物、多聚體(例如生物相容的多聚體，例如聚乙二醇)、或這些的任意組合。蛋白載體的實(shí)例是酶或非酶的蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白?？扇苄栽泽w可以是微粒(包括固體、中空或多孔的微粒優(yōu)選基本球狀的微粒)。該微?？梢杂扇我夂线m的物質(zhì)形成，例如交聯(lián)蛋白。合適的蛋白質(zhì)是白蛋白(源自血清的或重組的，人或非人序列的)?？梢酝ㄟ^使用眾所周知的噴霧干燥技術(shù)，例如在W092/18164中所述，通過噴霧干燥人血清白蛋白形成在本發(fā)明中適合用作不溶載體的微粒。用作載體的微粒的備選包括脂質(zhì)體、合成的聚合體顆粒(例如聚乳酸、聚乙醇酸和多聚(乳酸/乙醇酸)、或細(xì)胞膜碎片。本文使用的術(shù)語"纖維蛋白原"包括天然纖維蛋白原、重組纖維蛋白原，或能夠通過凝血酶轉(zhuǎn)化形成纖維蛋白的纖維蛋白原的衍生物(例如，天然或重組的纖維蛋白單體，或可以或不能自發(fā)組裝的纖維蛋白單體的衍生物)。該纖維蛋白原應(yīng)該能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分?？梢詮娜魏蝸碓?，和從任何物種(包括牛纖維蛋白原)獲得該纖維蛋白原，但優(yōu)選人纖維蛋白原?？梢詮淖泽w血液或捐獻(xiàn)血液中獲得人纖維蛋白原。優(yōu)選自身的纖維蛋白原，因?yàn)樵趯⒈景l(fā)明的生物凝膠(或粘合劑)施用于受試者時(shí)，這降低了感染的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選的，該纖維蛋白原結(jié)合部分與纖維蛋白原結(jié)合的解離常數(shù)9(KD)在l(T至1(TM之間，例如約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400nM或更多。優(yōu)選K。約為100nM。可以在平衡狀態(tài)測(cè)量解離常數(shù)。例如，可以將已知濃度的放射性標(biāo)記的纖維蛋白原和已經(jīng)交聯(lián)有纖維蛋白原結(jié)合部分的微球體孵育。通常，5jnM肽與lmg微球體交聯(lián)，或15-40微摩爾肽與lmg微球體交聯(lián)。將肽-連接的微球體稀釋至0.5mg/ml，和在pH7.4的等滲緩沖液(例如，含有0.15MNaCl的0.01MHepes緩沖液)中，與濃度為0.05-0.5mg/ml的放射性標(biāo)記的纖維蛋白原在20。C孵育長達(dá)1小時(shí)?？梢酝ㄟ^離心從游離的纖維蛋白原中將結(jié)合在微球體上纖維蛋白原結(jié)合部分的纖維蛋白原分離，并測(cè)量游離和結(jié)合的纖維蛋白原的量。然后通過繪制結(jié)合的纖維蛋白原濃度與結(jié)合游離纖維蛋白原濃度的比的關(guān)系曲線，通過Scatchard分析計(jì)算解離常數(shù)，其中曲線的斜率代表K。。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，纖維蛋白原結(jié)合部分優(yōu)選選擇性地結(jié)合纖維蛋白原。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選纖維蛋白原結(jié)合部分能夠結(jié)合纖維蛋白原，和單獨(dú)結(jié)合纖維蛋白單體和/或纖維蛋白。優(yōu)選與纖維蛋白原和纖維蛋白單體和/或纖維蛋白的結(jié)合是選擇性的。纖維蛋白原結(jié)合部分優(yōu)選是纖維蛋白原結(jié)合肽或肽類似物?？梢允褂萌魏魏线m的纖維蛋白原結(jié)合肽。例如，該肽可能能夠結(jié)合于天然結(jié)合纖維蛋白或通過血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa結(jié)合纖維蛋白的纖維蛋白原的區(qū)域。在Mosesson等人，2001,Ann.N.Y.Acad.Sci.，936，11-30中討論結(jié)合于纖維蛋白原的纖維蛋白。在Bennett,2001，AnnalsofNYAcad.ScL,936，340-354中討論GPIIb-Ilia與纖維蛋白原的結(jié)合。該肽可能能夠結(jié)合于纖維蛋白原oc鏈的羧基和/或氨基末端結(jié)構(gòu)域。具體而言，該肽可能能夠結(jié)合在一個(gè)或兩個(gè)這些結(jié)構(gòu)域中含有RGD的基序(例如，在氨基酸95-98的RGDF(SEQIDNO:1)，或在氨基酸572-575的RGDS(SEQIDNO:2))。該肽可能能夠結(jié)合于纖維蛋白原Y鏈的羧基末端結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選結(jié)合于此結(jié)構(gòu)域的最后12個(gè)氨基酸10(序列HHLGGAKQAGDV(SEQIDNO:3))。該肽可能能夠結(jié)合于纖維蛋白原Y鏈的D-結(jié)構(gòu)域，例如D-結(jié)構(gòu)域的P鏈區(qū)段。纖維蛋白結(jié)合肽可以包含衍生自GPIIb或GPIIIa的纖維蛋白原-結(jié)合區(qū)的序列。例如，該肽可能包含對(duì)應(yīng)于GPIIb的294-314氨基酸殘基序列的序列AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM(SEQIDNO:4)，或者其保留了纖維蛋白原結(jié)合活性的片段或衍生物。已知保留纖維蛋白原結(jié)合活性的片段是TDVNGDGRHDL(296-306)(SEQIDNO:5)、GDGRHDLLVGAPL(300-312)(SEQIDNO:6)和GAPL(SEQIDNO:7)。TDVNGDGRHDL的合適的4汙生物包括:T(D，E)VNG(D，E)GRH(D，E)L(SEQIDNO:8);TD(V，L)NGDGRHDL(SEQIDNO:9);TDV(N，Q)GDGRHDL(SEQIDNO:10);T羅GDG(R，K)HDL(SEQIDNO:11)。纖維蛋白原結(jié)合肽可以包含GPIIIa的殘基95-223序列，或其保留了纖維蛋白原結(jié)合活性的片段或衍生物。例如，包含序列SVSR畫APEGG(SEQIDNO:12)的殘基211-222被認(rèn)為是GPIIIa中重要的纖維蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。GPIIIa的其它合適的區(qū)域包括殘基109-171和164-202。纖維蛋白原結(jié)合肽可以包含通過凝血酶作用而暴露于纖維蛋白原上的殘基的序列，和其結(jié)合纖維蛋白原作為產(chǎn)生纖維蛋白的聚合反應(yīng)中的第一步。凝血酶從纖維蛋白原的a和(3鏈的N末端切割肽(釋放纖維蛋白肽a和b)從而分別暴露序列NH廣GPR-(SEQIDNO:13)和NH2-GHR-(SEQIDNO:14)。因此，纖維蛋白原結(jié)合肽的優(yōu)選實(shí)例包含在其氨基末端的氨基酸序列NH2-G(P，H)RX-(SEQIDNO:15)，其中X是任意的氨基酸，和(P，H)意指在該位置是脯氨酸或組氨酸。該肽優(yōu)選在其氨基末端包含序列NH廣GPRP-(SEQIDNO:16)。該纖維蛋白原結(jié)合肽長度優(yōu)選是4-30,更優(yōu)選4-10個(gè)氨基酸殘基。纖維蛋白原結(jié)合前體不應(yīng)該結(jié)合纖維蛋白原，因此當(dāng)所述栽體與纖維蛋白原接觸時(shí)，纖維蛋白原分子經(jīng)由帶有固定的纖維蛋白原結(jié)合前體的載體被連接在一起。優(yōu)選纖維蛋白原結(jié)合前體對(duì)纖維蛋白原的ii解離常數(shù)大于lxl(^M。所述纖維蛋白原結(jié)合前體可以是肽或肽類似物，但是優(yōu)選是肽。纖維蛋白原結(jié)合前體不應(yīng)該是纖維蛋白原或不應(yīng)該包含纖維蛋白原。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維蛋白原結(jié)合前體包含在其氨基末端結(jié)合于阻斷元件(優(yōu)選肽)的纖維蛋白原結(jié)合肽，所述阻斷元件阻斷或抑制(即，減少)纖維蛋白原結(jié)合于纖維蛋白原結(jié)合肽。通過轉(zhuǎn)化劑(優(yōu)選凝血因子，例如凝血酶)對(duì)纖維蛋白原前體的切割，暴露結(jié)合于載體的纖維蛋白原結(jié)合肽，從而將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。在這樣的實(shí)施方案中，該阻斷元件阻斷或抑制纖維蛋白原結(jié)合肽結(jié)合纖維蛋白原的能力，直至切割發(fā)生。優(yōu)選該阻斷元件是長度為l-30個(gè)氨基酸的肽。應(yīng)該了解在這樣的實(shí)施方案中，所述纖維蛋白原結(jié)合前體應(yīng)該包含能夠被轉(zhuǎn)化劑特異性識(shí)別的切割位點(diǎn)，且其位于所述纖維蛋白原結(jié)合肽和阻斷元件之間。凝血酶是優(yōu)選的轉(zhuǎn)化劑。然而，可以使用其它的絲氨酸蛋白酶或凝血因子來切割纖維蛋白原結(jié)合前體。已知凝血酶切割精氨酸殘基羧基末端的肽鍵，且通常在精氨酸和甘氨酸殘基之間切割。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維蛋白原結(jié)合前體是在其氨基末端包含了氨基酸序列NH2-ZYXR/GPRP-(SEQIDNO:17)的肽，其中"/"代表凝血酶切割位點(diǎn)，和X是任意的氨基酸，但是優(yōu)選脯氨酸，Y是任意的氨基酸，但是優(yōu)選天冬氨酸或丙氨酸，和Z是至少一個(gè)氨基酸，其優(yōu)選為亮氨酸或脯氨酸。例子為NH2-LVPR/GPRP-(SEQIDNO:18)、NH2-ADPR/GPRP-(SEQIDNO:19)、NH廣LDPR/GPRP-(SEQIDNO:20)、或NH2-LVPR/GPRV-(SEQIDNO:21)。纖維蛋白原結(jié)合部分或前體可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄?，但一般通過共價(jià)鍵結(jié)合于載體。優(yōu)選的共價(jià)鍵的例子是二硫鍵、硫醚鍵或酰胺鍵。當(dāng)纖維蛋白原結(jié)合部分或前體是包含半胱氨酸的肽且載體包含巰基反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，可以形成合適的共價(jià)鍵。這使該肽能夠通過半胱氨酸的-SH基團(tuán)與載體上的巰基反應(yīng)基團(tuán)連接而結(jié)合于載體。優(yōu)選將末端12半胱氨酸基團(tuán)摻入纖維蛋白原結(jié)合肽或前體肽，從而使該肽與栽體上的巰基反應(yīng)基團(tuán)相交聯(lián)。或者，當(dāng)纖維蛋白原部分或前體是包含順丁烯二酰亞胺基(優(yōu)選在其羧末端，例如，連接于該肽的羧基末端賴氨酸)的肽，且載體包含巰基的時(shí)候，可以形成共價(jià)鍵。而后，可以通過使該肽的順丁烯二酰亞胺基與載體的巰基反應(yīng)，使該肽結(jié)合于載體。通常，在纖維蛋白原結(jié)合部分或前體和載體之間需要間隔子以確保該纖維蛋白原結(jié)合部分的纖維蛋白原結(jié)合活性(如果一旦從纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化需要)沒有受到載體的不利影響。合適的間隔子是肽，或非肽，例如聚乙二醇。其中纖維蛋白原結(jié)合部分或前體是包含纖維蛋白原結(jié)合肽的肽，且該部分或前體通過末端氨基酸殘基結(jié)合于不溶載體，間隔序列優(yōu)選在末端氨基酸殘基和纖維蛋白原結(jié)合肽的部分或前體之間存在。該間隔子長度可以是，例如，1-20，優(yōu)選5-20個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選GGGGGG(SEQIDNO:22)或GGGGG(SEQIDNO:23)的間隔子序列。應(yīng)該理解，對(duì)于最佳生物凝膠(或組織粘合劑)形成所需的每個(gè)載體的纖維蛋白原結(jié)合部分或前體的數(shù)目，和載體(每個(gè)載體具有多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或前體)和纖維蛋白原的相對(duì)量，可以隨著載體和纖維蛋白原的不同制備而改變。因此，可能需要或期望測(cè)試各新批次的栽體或纖維蛋白原以確定用于生物凝膠形成的載體和纖維蛋白原的最佳相對(duì)量。優(yōu)選每個(gè)載體各具有平均至少5個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或前體。理論上，每個(gè)載體的纖維蛋白原結(jié)合部分或前體的數(shù)目沒有上限。最佳數(shù)目可能決定于許多因素，例如載體的特性，和在各個(gè)栽體上用于連接纖維蛋白原結(jié)合部分或前體的反應(yīng)基團(tuán)數(shù)目。然而，優(yōu)選每個(gè)載體各自具有平均在100個(gè)以上的纖維蛋白原結(jié)合部分或前體。優(yōu)選的范圍是每個(gè)載體的纖維蛋白原結(jié)合部分或前體為10-20個(gè)。優(yōu)選地，與纖維蛋白原結(jié)合部分或前體的摩爾數(shù)相比，使用的纖維蛋白原的量是存在的纖維蛋白原摩爾數(shù)的至少四分之一(優(yōu)選至少一半)。優(yōu)選的，纖維蛋白原的摩爾數(shù)相對(duì)于纖維蛋白原結(jié)合部分或13前體的摩爾數(shù)是在l:4至4:1范圍?？梢允褂脛?dòng)力學(xué)振動(dòng)測(cè)量來評(píng)估根據(jù)本發(fā)明形成的生物凝膠的粘彈性特征。在粘彈性固體中儲(chǔ)能模量(GO和損耗模量(G")測(cè)量代表彈性部分貯存的能量，和代表粘性部分的作為熱消散的能量。Tandelta是損耗模量(G")與儲(chǔ)能模量(G')的比率。因此它是彈性和粘性貢獻(xiàn)的量化，其中數(shù)值大于1表示液體狀的粘性行為，而數(shù)值小于l表示彈性行為。優(yōu)選本發(fā)明的生物凝膠具有小于1的tandelta。這表明凝膠的組分被交聯(lián)?？梢栽?Hz頻率和1%的恒應(yīng)變(constantstrain)確定tandelta。測(cè)量tandelta的合適方法在以下實(shí)施例中有更具體的描述?？梢员舜朔珠_的貯存本發(fā)明試劑盒的組份，或者如果這些組份貯存在一起不會(huì)相互反應(yīng)，也可以將試劑盒的一些或全部組份貯存在一起。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施方案，其中該試劑盒包含帶有固定的纖維蛋白原結(jié)合部分的栽體，應(yīng)該理解纖維蛋白原應(yīng)該與所述載體分開貯存，以使它不與所述載體反應(yīng)。本發(fā)明的試劑盒包含了纖維蛋白原和帶有固定的纖維蛋白原結(jié)合前體的載體，該前體不結(jié)合纖維蛋白原，該試劑盒的重要優(yōu)勢(shì)在于，所述栽體和所迷纖維蛋白原能夠一起貯存。點(diǎn)的裝置(例如，注射器)內(nèi)彼此分開貯存?？梢栽O(shè)置該裝置從而使所述組份在遞送至組織或其它位點(diǎn)時(shí)彼此接觸。本發(fā)明的試劑盒可以包括關(guān)于如何使用試劑盒的組份來產(chǎn)生生物凝膠或組織粘合劑的說明書。本發(fā)明的試劑盒具有這樣的好處不需要毒性劑，可以簡(jiǎn)單使用試劑盒的組份產(chǎn)生生物凝膠(或組織粘合劑)，和可以容易的在穩(wěn)定條件貯存組份。還應(yīng)該理解，使用本發(fā)明的試劑盒在生物凝膠或組織粘合劑的形成中不需要存在凝血酶(或其它酶)。特別有利的是本發(fā)明的試劑盒不包括凝血酶，因?yàn)橄鄬?duì)于使用外源凝血酶形成的生物凝膠或組織粘合劑，使用這樣的試劑盒產(chǎn)生的生物凝膠或組織粘合劑產(chǎn)生過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)被降低了。不包括凝血酶(或其它酶)的本發(fā)明試14劑盒的另一優(yōu)點(diǎn)在于不需要在保持酶活性的條件貯存該試劑盒的組份。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，可以通過轉(zhuǎn)化劑將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化成纖維蛋白原結(jié)合部分，所述轉(zhuǎn)化劑存在于施用了具有固定的纖維蛋白原結(jié)合前體的載體的位點(diǎn)。這樣的好處在于不需要將轉(zhuǎn)化劑作為該試劑盒的部分。因此，不需要在保持轉(zhuǎn)化劑活性的條件下貯存該試劑盒的組份。優(yōu)選該轉(zhuǎn)化劑是傷口位點(diǎn)劑。本文中使用術(shù)語"傷口位點(diǎn)劑"意指在傷口位點(diǎn)存在的制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該傷口位點(diǎn)劑是凝血因子。合適的凝血因子的例子包括凝血酶、因子VIIa、因子Xa或因子XIa。優(yōu)選該凝結(jié)因子是凝血酶。根據(jù)其它的實(shí)施方案，本發(fā)明的試劑盒還可以包含轉(zhuǎn)化劑，其將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。該轉(zhuǎn)化劑應(yīng)該與載體分開。在這樣的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化劑可以是不預(yù)期存在于待施用載體的位點(diǎn)的制劑?；蛘咴撧D(zhuǎn)化劑可以是存在于施用了載體的位點(diǎn)的制劑。該轉(zhuǎn)化劑可以是凝血因子，例如凝血酶、因子VIIa、因子Xa、或因子XIa。以包含凝血因子。本發(fā)明的試劑盒包含纖維蛋白原結(jié)合前體，所述前體可以通過凝血因子被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，所述試劑盒可以包含凝血因子，該因子不會(huì)將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。在這樣的實(shí)施方案中，可以提供凝血因子(其不轉(zhuǎn)化纖維蛋白原結(jié)合前體)作為試劑盒的獨(dú)立成份，或與載體和/或纖維蛋白原一起提供。凝結(jié)因子可以被固定于載體，例如偶聯(lián)于各纖維蛋白原結(jié)合前體。當(dāng)本發(fā)明的試劑盒包含凝結(jié)因子(例如凝血酶)時(shí)，優(yōu)選人序列的凝結(jié)因子，而不是非人的凝結(jié)因子(例如牛凝結(jié)因子)，以減少對(duì)凝結(jié)因子的過敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)?？梢栽谑┯糜诮M織位點(diǎn)之前形成，或者在組織位點(diǎn)，例如在傷口15位點(diǎn)，原位形成本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑。在組織位點(diǎn)的生物凝膠或組織粘合劑優(yōu)選包含局部施用的載體。應(yīng)該理解可以在施用或形成本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑的組織位點(diǎn)存在凝血酶。例如，如果該組織位點(diǎn)是出血傷口位點(diǎn)，宿主凝血酶可能存在于傷口位點(diǎn)。當(dāng)然，如果本發(fā)明的試劑盒提供，可以備選或另外存在凝血酶。如果在凝血酶存在下形成本發(fā)明的生物凝膠或粘合劑，或一旦形成本發(fā)明的生物凝膠或粘合劑后與凝血酶接觸，則使用能夠結(jié)合纖維蛋白原和獨(dú)立結(jié)合纖維蛋白單體和/或纖維蛋白的纖維蛋白結(jié)合部分是有利的。如果凝血酶與纖維蛋白原和具有固定的纖維蛋白原結(jié)合部分的栽體一起存在，則該凝血酶將至少部分纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體。應(yīng)該理解，在這些條件下，優(yōu)選纖維蛋白原結(jié)合部分也結(jié)合纖維蛋白單體，從而可以通過栽體將由凝血酶形成的纖維蛋白單體連接起來。如果一旦形成本發(fā)明的生物凝膠或粘合劑即與凝血酶接觸，那么如果結(jié)合于纖維蛋白原結(jié)合部分的纖維蛋白原能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白這樣的情況^F，在;維蛋^原和纖維蛋白原結(jié)合部分之間形成的非共價(jià)鍵將不會(huì)由于纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體而斷裂。如果結(jié)合于纖維蛋白原結(jié)合部分的至少一些的纖維蛋白原能夠組裝形成纖維蛋白同時(shí)保持結(jié)合于纖維蛋白原結(jié)合部分，也是有利的。在這些情況下，可以通過形成纖維蛋白而強(qiáng)化生物凝膠或組織粘合劑。如果存在凝血酶(例如，來自本發(fā)明的試劑盒，或傷口位點(diǎn)的宿主凝血酶)，優(yōu)選在接觸凝血酶之前使載體和纖維蛋白原彼此接觸，或使載體、纖維蛋白原和凝血酶在基本相同的時(shí)間彼此接觸。如果在與載體接觸之前凝血酶和纖維蛋白原彼此接觸，盡管可能形成生物凝膠或組織粘合劑，可能預(yù)期其作用小于在接觸凝血酶之前將載體和纖維蛋白原彼此接觸，或?qū)⑤d體、纖維蛋白原和凝血酶在基本相同的時(shí)間彼此接觸。這是因?yàn)槟割A(yù)期將纖維蛋白原分子轉(zhuǎn)化16為纖維蛋白單體，該單體在與載體接觸之前凝結(jié)形成不溶的纖維蛋白。然而，在一些情況下，例如，如果凝血酶直到接觸載體或之后是無活或組織粘合劑可能是恰當(dāng)?shù)?。，z'、根據(jù)本發(fā)明還提供形成生物凝膠的方法，其包括將多個(gè)載體與纖維蛋白原分子和凝血酶接觸(其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分被固定于各載體)，且各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從而形成生物凝膠，其中纖維蛋白單體通過在纖維蛋白原結(jié)合部分和纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵，經(jīng)由栽體被連接在一起。生物凝膠可以包含或不包含纖維蛋白。因此，纖維蛋白可以是生物凝膠中的纖維蛋白部分，或纖維蛋白單體可以不是生物凝膠中的纖維蛋白部分。根據(jù)本發(fā)明還提供生物凝膠，其包含纖維蛋白單體和多個(gè)載體，各載體具有多個(gè)固定于所述載體的纖維蛋白原結(jié)合部分，其中通過在纖維蛋白原結(jié)合部分和纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵，經(jīng)由所述載體將所述纖維蛋白單體連接在一起。根據(jù)本發(fā)明還提供生物凝膠，其包含纖維蛋白和多個(gè)栽體，各載體具有多個(gè)固定于所述載體的纖維蛋白原結(jié)合部分，其中通過在纖維蛋白原結(jié)合部分和纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵，經(jīng)由所述載體將所述纖維蛋白的纖維蛋白單體連接在一起。在優(yōu)選的方面，所述生物凝膠是組織粘合劑。本發(fā)明的試劑盒可以包含因子XIII,和任選的鈣離子和凝血酶以激活因子xni成為因子xnia(如果這樣，鈣離子和凝血酶應(yīng)該與因子xin分隔開)。備選的或另外的，可能在施用或形成本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑的組織位點(diǎn)存在因子xnia。例如，如果該組織位點(diǎn)是出血傷口位點(diǎn)，可能在傷口位點(diǎn)存在宿主因子XIIIa。如果使因子XIIIa與包含纖維蛋白的本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑接觸，可以進(jìn)一步通過因子XIIIa與纖維蛋白的反應(yīng)來共價(jià)交聯(lián)纖維蛋白而強(qiáng)化該生物凝膠或組織粘合劑。17根據(jù)本發(fā)明還提供形成生物凝膠的方法，其包括將多個(gè)載體與纖維蛋白原分子和凝血酶接觸，其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分被固定部分，形成包含纖維蛋白的;物凝:，、其中所述纖維蛋白的纖^蛋白價(jià)鍵，經(jīng)由所述載體被連接在一起；和將生物凝膠與因子XIIIa接觸，從而所述纖維蛋白的纖維蛋白單體可以通過肽鍵被共價(jià)連接在一起。根據(jù)本發(fā)明還提供生物凝膠，其包含纖維蛋白和多個(gè)載體，各載體具有固定于載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，其中所述纖維蛋白的纖維蛋白單體通過肽鍵被共價(jià)連接在一起，且所述纖維蛋白的纖維蛋共價(jià)鍵，經(jīng)由所述載體被連接在一起。在優(yōu)選的方面，該生物凝膠是組織粘合劑。本發(fā)明的試劑盒還可以包含傷口愈合的促進(jìn)劑。合適的實(shí)例包括生長因子，例如血小板衍生的生長因子。該促進(jìn)劑可以是試劑盒的單獨(dú)的組份，或固定于所述載體。本發(fā)明的試劑盒還可以包含抗微生物劑，例如抗生素。所述抗微生物劑可以是試劑盒的獨(dú)立的組份，或固定于所述載體。應(yīng)該理解，如果將具有多個(gè)固定于各栽體的纖維蛋白原結(jié)合部分的載體施用于其中存在宿主纖維蛋白原的組織位點(diǎn)(例如，在出血傷口位點(diǎn))，該載體將與宿主的纖維蛋白原反應(yīng)，在組織位點(diǎn)原位形成生物凝膠或組織粘合劑。相似的，如果將具有多個(gè)固定于各載體的纖維蛋白原結(jié)合前體的載體施用于其中存在轉(zhuǎn)化劑和宿主纖維蛋白原的組織位點(diǎn)(例如出血傷口位點(diǎn))，該轉(zhuǎn)化劑將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，所述纖維蛋白原結(jié)合前體將被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，且該載體而后將與宿主纖維蛋白原反應(yīng)，在組織位點(diǎn)原位形成生物凝膠或組織粘合劑。例如，可以通過宿主凝血酶或另一凝血因子將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。18因此，根據(jù)本發(fā)明還提供包含局部施用的載體和內(nèi)源性纖維蛋白原的生物凝膠，各載體具有多個(gè)固定于所述栽體的纖維蛋白原結(jié)合部分，其中內(nèi)源性纖維蛋白原的各分子結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部性纖維蛋白原分子之間的非共價(jià)鍵，經(jīng)由所述載體被連接在一起。本文使用的術(shù)語"內(nèi)源性纖維蛋白原"意指該纖維蛋白原是宿主纖維蛋白原，其在施用載體的位點(diǎn)存在。通常，存在宿主纖維蛋白原是因?yàn)樵趥谖稽c(diǎn)存在宿主的血液。根據(jù)本發(fā)明還提供載體用于形成生物凝膠的用途，該栽體具有固生物凝膠優(yōu)選是組織粘合劑。可以使用載體形成生物凝膠或組織粘合劑用于止血、作為封閉劑、用于定位的藥物遞送、或用于組織工程。因?yàn)椴恍枰庠葱岳w維蛋白原或凝血酶，不需要毒性劑，且所述栽體可以容易的在穩(wěn)定條件下貯存，使用載體形成生物凝膠或組織粘合劑具有宿主過敏反應(yīng)最小化的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明還提供在存在宿主纖維蛋白原的位點(diǎn)控制出血的方法，其包括向該位點(diǎn)局部施用多個(gè)載體，其中各載體具有固定于所述載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，和在該位點(diǎn)的宿主纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分。根據(jù)本發(fā)明還提供在存在宿主纖維蛋白原和凝結(jié)因子的位點(diǎn)控制出血的方法，其包括向該位點(diǎn)局部施用多個(gè)載體，其中各載體具有固定于所述載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體，且能夠通過宿主凝血因子將該纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，且在該位點(diǎn)的宿主纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)所述纖維蛋白原結(jié)合部分。根據(jù)本發(fā)明還提供多個(gè)載體在制備用于控制出血或治療或封閉傷口的藥物(例如生物凝膠或組織粘合劑)中的用途，其中各載體具有根據(jù)本發(fā)明還提供多個(gè)載體在形成生物凝膠中的用途，所述各載19體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。根據(jù)本發(fā)明還提供用于(例如，作為生物凝膠或組織粘合劑)控制出血或治療或封閉傷口的多個(gè)載體，其中各載體具有固定于載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。栽體可以是不溶或可溶的。可以將栽體局部施用。如果載體是可溶載體，具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體的載體的優(yōu)選局部制劑是液體制劑，優(yōu)選生理pH的等滲制劑。如果載體是不溶載體，具有固定的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體的載體的優(yōu)選局部制劑是能夠被噴霧，例如施于組織位點(diǎn)上的粉末的形式?？梢允褂萌魏魏线m的方法形成粉末化的栽體，包括包含噴霧干燥的方法或冷凍干燥載體的懸浮液，所述栽體具有固定于各栽體(例如在生理pH等滲緩沖液中懸浮的載體)的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。優(yōu)選使用噴霧干燥，因?yàn)檫@是比冷凍干燥更快速和容易標(biāo)定的干燥方法。合適的噴霧干燥方法描述于W092/18164。根據(jù)本發(fā)明還提供用于形成生物凝膠的制劑，該制劑包含可溶性載體，其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體固定于各載體。根據(jù)本發(fā)明還提供用于形成生物凝膠的制劑，該制劑包含不溶載體，所述載體具有固定于各載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體，其中該物質(zhì)是通過非冷凍干燥而形成的粉末形式。根據(jù)本發(fā)明還提供形成粉末制劑的方法，該制劑包含具有固定于各載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體的不溶載體，其中該方法包含對(duì)所述制劑的懸浮液的噴霧干燥。優(yōu)選的，該制劑適合局部施用。如果該制劑包含具有固定于各載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體的可溶栽體，則該制劑可適合于靜脈施用。20可以將所述栽體或制劑作為試劑盒的組份提供。該試劑盒還可以包含凝血因子、傷口愈合的促進(jìn)劑、或抗微生物劑。該凝血因子、傷口愈合的促進(jìn)劑、或抗微生物劑可以是獨(dú)立的試劑盒的組份，或固定于載體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷凝血因子、傷口愈合的促進(jìn)劑、或抗微生物劑可以是纖維蛋白原結(jié)合前體的部分，從而當(dāng)纖維蛋白原結(jié)合前體被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分時(shí)其被釋放。本發(fā)明的試劑盒可以是間隔化的試劑盒，其中該試劑盒的組份需要彼此分開的保存，被保存在分開的間隔或容器內(nèi)。本發(fā)明的試劑盒可包括使用試劑盒組份來執(zhí)行本發(fā)明方法的說明書?？梢詫⒈景l(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑局部施用于組織位點(diǎn)，例如皮膚或粘膜組織。可以將本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑用于止血、作為封閉劑、用于定位的藥物遞送或用于組織工程。可以通過在將凝膠或粘合劑與施用位點(diǎn)接觸之前形成凝膠或粘合劑，或通過在施用位點(diǎn)形成生物凝膠或組織粘合劑來施用本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑。也應(yīng)該理解，可以以靜脈注射施用包含可溶載體的制劑，例如用于控制出血或用于藥物遞送，其中各能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體被固定于各載體。優(yōu)選的靜脈注射制劑是20%的等滲水溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過凝血酶來轉(zhuǎn)化纖維蛋白原結(jié)合前體。根據(jù)本發(fā)明還提供控制出血的方法，其包括靜脈內(nèi)的施用包含可溶載體的制劑，其中各能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體被固定于各載體。根據(jù)本發(fā)明還提供向受試者遞送藥物的方法，其包括向受試者靜脈內(nèi)的施用包含可溶載體的制劑，其中各能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體被固定于各栽體，且其中所述栽體包含藥物或藥物被固定于該載體。當(dāng)然局部或靜脈注射制劑應(yīng)該是無菌的。本發(fā)明的生物凝膠和組織粘合劑還可以包含傷口愈合促進(jìn)劑，或21抗微生物劑。根據(jù)本發(fā)明還提供控制出血的方法，其包括向出血位點(diǎn)局部施用本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑。根據(jù)本發(fā)明還提供治療或封閉傷口的方法，其包括向傷口位點(diǎn)施用(優(yōu)選局部地)本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑。根據(jù)本發(fā)明還提供本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑作為藥物。制出血或用于治療或封閉傷口中的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明還提供本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑，其用于控制出血或治療或封閉傷口。本發(fā)明的生物凝膠或組織粘合劑可以被局部的使用。如果該生物凝膠或組織粘合劑與可溶載體和從纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化而來的纖維蛋白原結(jié)合部分一起形成，該用途可以是靜脈內(nèi)的。實(shí)施例現(xiàn)在僅通過實(shí)施例來描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，多個(gè)肽在其羧基末端被連接于載體，所述各肽在其氨基末端包含纖維蛋白原結(jié)合序列(例如序列GPRPGGGGGGC(SEQIDNO:24)的肽)，其為可溶蛋白質(zhì)(例如白蛋白)。通過將肽連接的栽體與纖維蛋白原接觸形成生物凝膠。而后可以將該生物凝膠局部施用于傷口作為包扎。根據(jù)本發(fā)明的第二優(yōu)選的實(shí)施方案，將第一優(yōu)選的實(shí)施方案的肽連接的載體與纖維蛋白原在傷口位點(diǎn)混合從而原位形成生物凝膠。根據(jù)本發(fā)明的第三優(yōu)選的實(shí)施方案，將第一優(yōu)選的實(shí)施方案的肽連接的栽體施用于傷口位點(diǎn)以原位形成生物凝膠，在所述位點(diǎn)存在來自宿主血液的纖維蛋白原。根據(jù)本發(fā)明的第四優(yōu)選的實(shí)施方案，多個(gè)肽于其羧基末端被連接于載體，所述各肽包含在其氨基末端偶聯(lián)于封閉肽序列(例如，序列LVPRGPRPGGGGGGC(SEQIDNO:25)的肽)的纖維蛋白原結(jié)合序列，該栽體是可溶蛋白質(zhì)(例如白蛋白)?？梢詫⒃撾倪B接的栽體與纖維22蛋白原組合，而后作為單個(gè)混合物應(yīng)用于傷口。在傷口位點(diǎn)存在的宿主凝血酶切割該肽，釋放封閉肽，并暴露纖維蛋白原結(jié)合序列。具有暴露的纖維蛋白原結(jié)合序列的載體與纖維蛋白原反應(yīng)，原位形成生物凝膠。備選的，可以靜脈內(nèi)的施用第四優(yōu)選的實(shí)施方案的肽連接的載體。在傷口位點(diǎn)的宿主凝血酶切割該肽釋放封閉肽并暴露纖維蛋白原結(jié)合序列。具有暴露的纖維蛋白原結(jié)合序列的載體與宿主纖維蛋白原反應(yīng)以控制傷口位點(diǎn)的出血。上述第四優(yōu)選的實(shí)施方案的生物凝膠可以是組織粘合劑。在任意以上優(yōu)選的實(shí)施方案中(除了靜脈內(nèi)施用)，可以使用不溶載體(例如白蛋白微球體)代替可溶蛋白載體。在任意以上優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用分支的聚乙二醇(PEG)或任何其它的生物可溶性的聚合物代替可溶的蛋白質(zhì)載體。如果其中纖維蛋白原是被固定于載體上，在任意以上優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將凝血因子固定于載體上，所述凝血因子不會(huì)將纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。在任意以上優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體還可以包含傷口愈合的促進(jìn)劑(例如，生長因子，如血小板衍生的生長因子)。在下列實(shí)施例中參考附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案做進(jìn)一步描述，其中圖l以示意圖表明(a)具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合肽的白蛋白載體；(b)纖維蛋白原分子；和(c)生物凝膠，其中由所述載體將所述纖i蛋白原分子連接在三起；''、圖2顯示在20°C(A)和37°C(B)的在25u1的肽修飾的HSA和32mg/ml纖維蛋白原的混合物中，儲(chǔ)能模量(正方形)和損耗模量(三角形)與應(yīng)變百分?jǐn)?shù)的關(guān)系曲線圖3顯示在20°C(具有1%應(yīng)變波幅(stainamplitude))的對(duì)23于25|a1的肽修飾的HSA與32mg/ml纖維蛋白原的混合物中，儲(chǔ)能模量(正方形)和復(fù)數(shù)粘度(三角形)與頻率的關(guān)系曲線圖；和圖4顯示在加入肽修飾的HSA之前(a)和之后(b)纖維蛋白原溶液的顯像。實(shí)施例1:使用纖維蛋白原形成生物凝膠或組織粘合劑，和固定于載體的纖維蛋白原結(jié)合肽包含人血清白蛋白。將人血清白蛋白(HSA)與40倍摩爾過量的接頭琥珀酰亞氨基-4-(^馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC)在pH7.4反應(yīng)。對(duì)修飾的蛋白質(zhì)(HAS-SMCC)進(jìn)行純化，并測(cè)定出平均一摩爾的HAS被18摩爾SMCC修飾。將GPRPGGGGGGC(BIO;SEQIDNO:24)或LVPRGPRPGGGGGGC(TC-15;SEQIDNO:25)肽以相對(duì)于馬來酰亞胺部分超出1.5摩爾的量加入到HSA-SMCC。然后從未反應(yīng)的肽純化肽^^飾的HSA蛋白，并以7mg/ral貯存在-80°C。按照供應(yīng)商所述，將冷凍干燥的人纖維蛋白原以16mg/ml溶解于水中(蘇格蘭國家血液輸送服務(wù)中心)。將肽修飾的HSA蛋白(5jj1)加入0.3mi的纖維蛋白原溶液，對(duì)于BIO-HAS立即觀察到凝膠而對(duì)于TC-15沒有觀察到凝膠。已知暴露的GPRP肽序列結(jié)合于在纖維蛋白原的兩個(gè)遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域(D)的羰基區(qū)域內(nèi)的口袋"a"(圖lb)。認(rèn)為用多個(gè)暴露的GPRP序列(BIO)修飾的HAS作為纖維蛋白原的聚合作用的分支點(diǎn)(圖lc)。在缺乏凝血酶的條件下形成該凝膠。實(shí)施例2-5合成肽修飾的HSA的方法將lOmg/ml的人血清白蛋白(HSA)與5、10、20或40倍摩爾過量的接頭硫代琥珀酰亞氨基-4-(薩馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(硫代-SMCC)在pH7.4反應(yīng)，總反應(yīng)體積為Q.7ml。通過Zebra脫鹽柱(Pierce,Rockford，IL)純化x修飾的蛋白(HSA-SMCC),并測(cè)定出平均一摩爾的HSA分別經(jīng)5、8、16或18摩爾的硫代-SMCC修飾。為了測(cè)定每個(gè)HSA分子結(jié)合的馬來酰亞胺基數(shù)，在緩沖液中，將3納摩爾的HSA與已知量的半胱氨酸(100納摩爾)在室溫溫育30分鐘。24然后將剩余的半胱氨酸與1毫摩爾的5，5-二疏代雙(2-硝基苯甲酸鹽)(DTNB)反應(yīng)20分鐘，并測(cè)量在Aw的吸光度。通過比較對(duì)照和蛋白樣品的吸光度，計(jì)算馬來酰亞胺水平。以相對(duì)于馬來酰亞胺部分超過1.5摩爾的量，將GPRPGGGGGGC(BIO;SEQIDNO:24)或LVPRGPRPGGGGGGC(TC-15;SEQIDNO:25)肽加入到HSA-SMCC。然后使用Zebra脫鹽柱(Pierce,Rockford，IL)從未反應(yīng)的肽純化肽修飾的HSA蛋白，和以7mg/ral貯存在-80。C。將冷凍干燥的人纖維蛋白原(蘇格蘭國家血液輸送服務(wù)中心，愛丁堡，蘇格蘭)以8、16、32和64rag/ml濃度溶解于水中。使用1%纖維蛋白原E28。=15和1%HSAE28Q=13.8的轉(zhuǎn)化因子通過在28Qnm(A2S。)的吸光度測(cè)定纖維蛋白原和白蛋白的濃度。流變學(xué)特征使用動(dòng)力振蕩測(cè)量來評(píng)估該凝膠的粘彈性。使該混合物在室溫平衡過夜，并將該凝膠轉(zhuǎn)移至PhysicaMCR-501(AntonPaar，德國)流速計(jì)的低平板上，該流速計(jì)具有25mm直徑平板的錐體和1°的錐度。在濕潤的空氣中以20或37士。C進(jìn)行試驗(yàn)。在1%的恒應(yīng)變波幅，在0.01和50Hz之間進(jìn)^f亍頻率掃描。用流速計(jì)提供的專用的AntonPaar軟件處理檢查到的流變學(xué)參數(shù)。實(shí)施例2肽修飾的HSA的量和纖維蛋白原濃度對(duì)凝膠形成的影響。在混合纖維蛋白原和HSA溶液之后，先目測(cè)監(jiān)控纖維蛋白原的聚合作用。將用5、8、16或18摩爾的纖維蛋白原結(jié)合肽修飾的肽修飾HSA綴合于一摩爾的HSA。將25ju1的肽修飾的HSA樣品或未修飾的HSA與8、16、32或64mg/ml的0.2ml的纖維蛋白原混合。在室溫0.5小時(shí)之后，目測(cè)凝膠的形成。對(duì)于未修飾的HSA或用5或8摩爾的肽修飾的HSA，在測(cè)試的全部纖維蛋白原濃度均未觀察到凝膠形成。僅在32或64mg/ml纖維蛋白原觀察到聚合作用，所述纖維蛋白原帶有16或18摩爾結(jié)合肽的肽修飾的HSA。圖4顯示在加入肽修飾的HSA(25jj1，18摩爾肽)之前(a)和之后(b)的纖維蛋白原溶液(0.2ml32mg/ml纖維蛋白原)的顯影。根據(jù)本發(fā)明形成的生物凝膠在(b)中顯示。25實(shí)施例3肽修飾的HSA量的影響為測(cè)定肽修飾的HSA和纖維蛋白原的量對(duì)混合物的流變性質(zhì)的影響，用25或50jli1的肽修飾的HSA與32和64mg/ml的纖維蛋白原進(jìn)行剪切強(qiáng)度測(cè)量。每摩爾HSA是用16摩爾的結(jié)合肽修飾，使用該肽修飾的HSA用于本試驗(yàn)。為了確保該動(dòng)力學(xué)振蕩試驗(yàn)是在凝膠的線性粘彈性應(yīng)變極限內(nèi)完成，進(jìn)行應(yīng)變掃描。圖2顯示對(duì)25p1的肽修飾的HSA混合32mg/ml的纖維蛋白原在20。C和37。C的應(yīng)變掃描。儲(chǔ)能模量(GO和損耗模量(G")都顯示在所述范圍內(nèi)穩(wěn)定，并在此線性粘彈性應(yīng)變范圍內(nèi)選擇1%的恒應(yīng)變。頻率掃描證明G'值是大于G"，其為交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的指標(biāo)(表1)。在該表中顯示的數(shù)值是在1Hz的頻率記錄的。Tandelta是損耗模量對(duì)儲(chǔ)能模量的比率。因此它是彈性和粘性貢獻(xiàn)的定量，其中數(shù)值大于1表示類似液體的粘性行為，而小于l表示彈性行為。復(fù)數(shù)粘度n、定義為復(fù)數(shù)模量G-除以角頻率(co)，在相同條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。在這些條件下顯示肽修飾的HSA和纖維蛋白原的量都不非常影響該凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。表1:纖維蛋白原(rag/ml)3264肽修飾的HSA(u1)25502550儲(chǔ)能模量(^)432439421588復(fù)數(shù)粘度(/7*)88707794ra/2cTe〃a0.220.110.240.2不同批次的肽修飾的HSA，每個(gè)HSA結(jié)合18個(gè)肽(25"1)和32mg/ml纖維蛋白原，顯示G'為5200，復(fù)數(shù)粘度為820和Tandelta為0.105。實(shí)施例4溫度對(duì)流變性質(zhì)的影響當(dāng)用于外科體溫或局部應(yīng)用時(shí)，溫度對(duì)凝膠影響的檢查對(duì)于該產(chǎn)品的應(yīng)用是重要的。我們?cè)?0和37。C評(píng)估該凝膠的機(jī)械強(qiáng)度，并在表2給出在1Hz頻率采集的數(shù)值。增加該凝膠的溫度導(dǎo)致G和復(fù)數(shù)粘度都下降(表2),該凝膠是由32mg/ml的纖維蛋白原和用16摩爾的肽修飾的25jj1的HSA產(chǎn)生。在20。C和37°C，tandelta都小于1,26因此(非共價(jià)的)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是維持在37°C。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例5在人血漿中的凝膠形成研究肽修飾的HSA是否能夠在人血漿中聚合纖維蛋白原，這對(duì)于該產(chǎn)品作為外科膠/粘合劑的應(yīng)用是重要的。將用18摩爾肽修飾的肽修飾的HSA(75ju1)與O.8ml的人混合血漿混合。關(guān)于血漿衍生凝膠的流變學(xué)在37。C進(jìn)行，和給出G'值為6100，tandelta為O.104。從此結(jié)果推論，肽修飾的HSA能夠在人血漿聚合纖維蛋白原，在37。C產(chǎn)生(非共價(jià))交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。權(quán)利要求1.形成生物凝膠的試劑盒，其包含多個(gè)載體，各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，和單獨(dú)的纖維蛋白原，其中各個(gè)纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分。2.形成生物凝膠的試劑盒，其包含多個(gè)載體，各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體，其中各纖維蛋白原結(jié)合前體能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分；和纖維蛋白原，其中各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分。3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述纖維蛋白原結(jié)合前體能夠通過傷口位點(diǎn)劑被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。4.根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，其中該傷口位點(diǎn)劑是凝血因子。5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其還包含不將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的凝血因子。6.根據(jù)權(quán)利要求5的試劑盒，其中各纖維蛋白原結(jié)合前體偶聯(lián)于所述凝血因子。7.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其還包含將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的轉(zhuǎn)化劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中該轉(zhuǎn)化劑是傷口位點(diǎn)劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其中該傷口位點(diǎn)劑是凝血因子。10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其還包含不將所述纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的凝血因子。11.根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其還包含凝血因子。12.根據(jù)任意前述的權(quán)利要求的試劑盒，其還包含傷口愈合促進(jìn)劑或抗微生物劑。13.根據(jù)任意前述的權(quán)利要求的試劑盒，其中所述載體是可溶載體。14.根據(jù)任意前述的權(quán)利要求的試劑盒，其中所述載體包含生物相容的聚合物。15.根據(jù)任意前述的權(quán)利要求的試劑盒，其用于形成組織粘合劑。16.用于形成生物凝膠的試劑，該制劑包含可溶栽體，其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體被固定于各栽體，所述各纖維蛋白原結(jié)合前體能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。17.形成生物凝膠的試劑，該試劑包含不溶性栽體，所述不溶性載結(jié)合前體，所述各纖維蛋白原結(jié)合前體能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，其中所述試劑是以除凍干之外的方式形成的粉末形式。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的試劑，其中所述纖維蛋白原結(jié)合前體能夠通過傷口位點(diǎn)劑被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分。19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑，其中該傷口位點(diǎn)制劑是凝血因子。20.根據(jù)權(quán)利要求16至19的任一項(xiàng)的試劑，其用于形成組織粘合劑。21.包含纖維蛋白原分子和多個(gè)栽體的生物凝膠，其中各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，且各纖維蛋白原分子結(jié)合至至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從而所述纖維蛋白原分子通過在所述纖維蛋白原結(jié)合部分和所述纖維蛋白原分子之間的非共價(jià)鍵經(jīng)由所述載體被連接在一起。22.包含纖維蛋白單體和多個(gè)載體的生物凝膠，其中各載體具有固定于該栽體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，且所述纖維蛋白單體通過在所述纖維蛋白原結(jié)合部分和所述纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵經(jīng)由所述載體被連接在一起。23.包含纖維蛋白和多個(gè)載體的生物凝膠，各栽體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，其中該纖維蛋白的纖維蛋白單體通過肽鍵被共價(jià)連接在一起，且該纖維蛋白的纖維蛋白單體通過在所述纖維蛋白原結(jié)合部分和所述纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵經(jīng)由所述載體被連接在一起。24.根據(jù)權(quán)利要求21至23的任一項(xiàng)的生物凝膠，其為組織粘合劑。25.形成生物凝膠的方法，其包括將纖維蛋白原分子與多個(gè)載體接觸，其中各載體具有固定于該栽體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，且各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從而所述纖維蛋形成非共價(jià)鍵而經(jīng)由所述載體被連接在一起。26.形成生物凝膠的方法，其包括提供多個(gè)載體，各載體包含固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體；將該纖維蛋白原結(jié)合前體轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分；并使纖維蛋白原分子接觸該纖維蛋白原結(jié)合部分，其中各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，從原分子之間形成非共價(jià)鍵而經(jīng)由所述栽體被連接在一起。27.形成生物凝膠的方法，其包括使多個(gè)載體與纖維蛋白原分子和凝血酶接觸，其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分被固定于各載體，且各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分從而形成生物凝膠，體之間的非共價(jià)鍵經(jīng)由所述載體被連接在一起。28.形成生物凝膠的方法，其包括使多個(gè)栽體與纖維蛋白原分子和凝血酶接觸，其中多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分被固定于各載體，且各纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分從而形成包含纖維蛋白的生物凝膠，其中所述纖維蛋白的纖維蛋白單體通過在所述纖維蛋白原結(jié)合部分和所述纖維蛋白單體之間的非共價(jià)鍵經(jīng)由所述栽體被連接在一起；并使所述生物凝膠與因子XIIIa接觸，從而該纖維蛋白的纖維蛋白單體通過肽鍵被共價(jià)連接在一起。29.形成用于形成生物凝膠的粉末制劑的方法，該制劑包含具有固其中該方法包括噴霧干燥該制劑的懸浮液。30.根據(jù)權(quán)利要求25至29的任一項(xiàng)的方法，其中該生物凝膠是組織粘合劑。31.在存在有宿主纖維蛋白原的位點(diǎn)處控制出血的方法，其包括向該位點(diǎn)局部施用多個(gè)栽體，其中各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分，且在該位點(diǎn)處的宿主纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)所述纖維蛋白原結(jié)合部分。32.在存在有宿主纖維蛋白原和凝血因子的位點(diǎn)處控制出血的方法，其包括向該位點(diǎn)局部施用多個(gè)載體，其中各載體具有固定于該栽體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體，且該纖維蛋白原結(jié)合前體能夠通過宿主凝血因子被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分，且在該位點(diǎn)處的宿主纖維蛋白原分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)所述纖維蛋白原結(jié)合部分。33.控制出血的方法，其包括向出血位點(diǎn)局部施用根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項(xiàng)的生物凝膠。34.處理或封閉傷口的方法，其包括向傷口位點(diǎn)局部施用根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項(xiàng)的生物凝膠，或多個(gè)載體，各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。35.控制出血的方法，其包括靜脈內(nèi)施用包含可溶載體的制劑，其中各自能夠被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白原結(jié)合部分的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合前體被固定于各載體上。36.多個(gè)載體用于形成生物凝膠的用途，各載體具有固定于該栽體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其用于止血、作為封閉劑、用于定位的藥物遞送、或用于組織工程。38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的用途，其用于形成組織粘合劑。39.根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項(xiàng)的生物凝膠的用途，其用于止血、作為封閉劑、用于定位的藥物遞送、或用于組織工程。40.根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項(xiàng)的生物凝膠，或根據(jù)權(quán)利要求16至20的任一項(xiàng)的制劑，其被用作藥物。41.根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項(xiàng)的生物凝膠、或根據(jù)權(quán)利要求16至20的任一項(xiàng)的制劑在制備用于控制出血、或用于處理或封閉傷口的藥物中的用途。42.多個(gè)載體在制備用于控制出血、或用于治處理或封閉傷口的生物凝膠中的用途，其中各載體具有固定于該載體的多個(gè)纖維蛋白原結(jié)合部分或纖維蛋白原結(jié)合前體。全文摘要本發(fā)明描述了生物凝膠、和用于形成該生物凝膠的試劑盒、制劑和方法?？梢允褂迷撋锬z用于多種應(yīng)用，包括止血、封閉傷口、組織工程或定位的藥物遞送。文檔編號(hào)A61L24/00GK101687061SQ200780044184公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2007年11月27日優(yōu)先權(quán)日2006年11月27日發(fā)明者G·沃克申請(qǐng)人:哈莫斯塔蒂斯有限公司