專利名稱：：用于肥胖癥的小分子介入的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和產(chǎn)業(yè)適用性Prieurianin是革巴向脂肪生成的新型抗肥胖癥藥物。Prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，并降低分化的培養(yǎng)物中脂質(zhì)陽性脂肪細(xì)胞的數(shù)量。另外，Prieurianin是用于探測脂肪生成的生物化學(xué)和生理學(xué)的重要藥理學(xué)工具。
背景技術(shù)：
：近年來，肥胖癥發(fā)生率及其相關(guān)的健康問題的增加已經(jīng)對全球醫(yī)療保健產(chǎn)生了明顯的影響。僅在美國，據(jù)估計(jì)大約三分之二的成年人過重，其中的三分之一認(rèn)為是肥胖。肥胖癥驚人的增長速率很大程度上源于久坐的生活方式習(xí)慣，伴隨過度消耗富含能量的食物，這些食物產(chǎn)生慢性的能量不平衡，而導(dǎo)致身體脂肪形式的體重增加。隨著肥胖的增加，患例如糖尿病、高血壓和心血管疾病的伴隨疾病(comorbidity)的風(fēng)險(xiǎn)也顯著提高了。也認(rèn)識到不是所有的脂肪都生來等同，內(nèi)臟脂肪組織而非皮下脂肪的積累增加了心血管疾病和代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)。事實(shí)上，肥胖癥是觸發(fā)胰島素抵抗、血脂異常(特征在于高三酸甘油酯血癥)、低水平的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、小的密度HDL顆粒以及升高的磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)活性的發(fā)生。因此，在世界范圍內(nèi)肥胖癥流行的增加及其伴隨疾病的全部宿主保證了急需有效的治療性藥物和生活方式改變的發(fā)明，以對抗威脅全球數(shù)十億人的新出現(xiàn)的健康問題。十多年前，瘦素及其體重降低藥理學(xué)作用的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了對脂肪組織功能的新理解。現(xiàn)在已知脂肪組織不僅儲存和釋放脂肪酸，也產(chǎn)生許多對體重調(diào)控和血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)有巨大影響的激素因子或脂肪因子。脂肪組織作為內(nèi)分泌器官發(fā)揮作用，并且產(chǎn)生許多在食物攝取、能量消耗和一系列代謝過程中具有重要作用的物質(zhì)。同時(shí)，脂肪細(xì)胞表達(dá)并釋放參與信號傳導(dǎo)通路并在能量儲存和新陳代謝中起到重要作用的蛋白質(zhì)。這些進(jìn)展還闡述了白色脂肪組織實(shí)際上在調(diào)控能量平衡中起到關(guān)鍵作用，并且作為介導(dǎo)許多生理學(xué)和病理學(xué)過程的分泌/內(nèi)分泌器官發(fā)揮作用。白色脂肪組織量的調(diào)控異常引起肥胖癥和脂肪萎縮。作為脂肪細(xì)胞大小和/或數(shù)量的改變而導(dǎo)致的白色脂肪組織量的改變，由前脂肪細(xì)胞的增殖和分化之間的復(fù)雜相互影響，以及脂肪細(xì)胞分泌的多種蛋白質(zhì)和因子所調(diào)控。由脂肪組織釋放的主要激素因子之一是脂連蛋白(adiponectin)，其是最近發(fā)現(xiàn)的、僅由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的激素。脂連蛋白在血漿中大量存在，并且已經(jīng)顯示其通過刺激脂肪酸氧化來升高胰島素敏感性，降低血漿三酸甘油酯以及改善糖代謝。脂連蛋白與肥胖負(fù)相關(guān)，并且其水平在肥胖受試者中顯著降低。在臨床上，血漿中降低的脂連蛋白水平也與肥胖癥相關(guān)胰島素抵抗和動(dòng)脈硬化相關(guān)聯(lián)。脂連蛋白的抗動(dòng)脈粥樣化和抗炎癥性質(zhì)及其刺激胰島素敏感性的能力使得脂連蛋白成為以潛在治療性應(yīng)用為目標(biāo)的生理學(xué)研究和病理學(xué)研究的重要靶標(biāo)。除了脂連蛋白，包括抵抗素(resistin)、內(nèi)臟脂肪素(visfatin)、腫瘤壞死因子a和促酰化蛋白(acylation-stimulatingprotein)構(gòu)成了多樣的脂肪細(xì)胞來源的激素和細(xì)胞因子，其編織成(orchestrate)脂肪組織對中心和外周代謝信號的應(yīng)答。也確認(rèn)這些蛋白中的一些作為候選藥物乾標(biāo)用于開發(fā)療法以治療肥胖癥，并且現(xiàn)在已經(jīng)在藥物開發(fā)階段中。這些進(jìn)展為可以在不久的將來使用藥物有效治療如今的肥胖癥流行的提供了希望。肥胖癥中的磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)-與肥胖癥相關(guān)聯(lián)的血脂異常的標(biāo)志是高三酸甘油酯癥、低HDLC和升高的血漿PLTP活性。在人類中，現(xiàn)在認(rèn)為血漿PLTP活性在肥胖受試者中顯著升高，并且在與高血漿三酸甘油酯和肥胖癥相關(guān)的胰島素抵抗和2型糖尿病受試者中也顯著升高。而且，胃束帶手術(shù)后的明顯體重?fù)p失導(dǎo)致PLTP活性的顯著降低。認(rèn)為PLTP在調(diào)控HDL的大小和組成，并且因此控制血漿HDL水平中的反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮功能。因此，肥胖個(gè)體中血漿PLTP活性的矛盾(paradoxical)升高產(chǎn)生了其在肥胖癥中起何種作用的問題。PLTP的概要-人PLTP是一種主要的血清蛋白，其由在染色體20ql2-q13.1上的含16個(gè)外顯子、跨越大約13kb的基因編碼，cDNA為1750個(gè)堿基對，476個(gè)氨基酸長。在SDS-PAGE上，純化的PLTP的分子量是大約81kDa，比從cDNA上預(yù)測的蛋白質(zhì)質(zhì)量大的多，其niRNA轉(zhuǎn)錄物在多種組織中可見，其中包括胰腺、肺、腎臟、心臟、肝臟、骨骼肌和大腦，并且在脂肪組織中的皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織之間顯示出貯藏相關(guān)差異。PLTP是脂多糖結(jié)合/脂轉(zhuǎn)移蛋白家族的成員，該家族包括膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、脂多糖結(jié)合蛋白和殺菌性/通透性增加蛋白。殺菌性/通透性增加蛋白的晶體結(jié)構(gòu)說明該家族中的蛋白(包括PLTP)含有內(nèi)在的脂結(jié)合位點(diǎn)，并且表現(xiàn)出作為在脂蛋白之間穿梭的載體蛋白發(fā)揮作用以再分配脂質(zhì)。PLTP的預(yù)測模型結(jié)構(gòu)由2個(gè)特征為非極性殘基的脂結(jié)合凹陷(pocket)構(gòu)成，其中N末端凹陷對PLTP轉(zhuǎn)移活性是關(guān)鍵的，而C末端凹陷涉及脂結(jié)合。PLTP的功能-促動(dòng)脈粥樣硬化(proatherogenic)或抗動(dòng)脈粥樣硬化(antiatherogenic)-在乳糜微粒和VLDL的血管內(nèi)脂類分解作用期間，PLTP以反向的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，運(yùn)送多余的表面磷脂和膽固醇從富含三酸甘油酯的脂蛋白至HDL。另外，體外研究顯示PLTP在脂蛋白和重構(gòu)的嚢泡之間轉(zhuǎn)移不同的磷脂和游離膽固醇。PLTP也能夠修飾HDL顆粒尺寸的分布，被稱為HDL轉(zhuǎn)換或者重塑的過程產(chǎn)生前P-HDL的形成，其被認(rèn)為是膽固醇的一種有效受體。另外，在通過同源重組敲除小鼠中的PLTP缺失提供了HDL水平的大約50%降低，從而說明其在從富含三酸甘油酯的脂蛋白至HDL轉(zhuǎn)移磷脂中的重要作用。有趣的是，過表達(dá)PLTP也降低血漿HDL水平。據(jù)信PLTP有抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛力，而其他人發(fā)現(xiàn)血漿PLTP水平和活性與冠狀動(dòng)脈疾病正和對立相關(guān)，具有提高的懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型培育成PLTP敲除或者過表達(dá)小鼠，證明PLTP的促動(dòng)脈粥樣硬化作用。另外，PLTPmRNA水平和活性始終與肥胖癥相關(guān)，從而提示PLTP在調(diào)控身體脂肪中可能具有其他功能。還沒有完全理解PLTP和肥胖癥之間的這種功能性意義，但推測PLTP合成的升高可能是脂肪組織的量增大的結(jié)果，因?yàn)樵隗w重?fù)p失后PLTP活性下降。這些結(jié)果似乎與基因組范圍掃描研究相一致，該研究顯示與PLTP的染色體座內(nèi)肥胖癥相關(guān)表型聯(lián)系的明顯證據(jù)。然而在幾個(gè)小鼠研究中，染色體2上的影響身體脂肪的基因與人染色體20q上的區(qū)域位于同一個(gè)染色體上。也顯示低水平PLTP與增加的腰圍直接相關(guān)。另外，矛盾的是，在秀麗隱桿線蟲中，通過RM干擾失活PLTP基因引起脂肪儲存的增加，從而提示在哺乳動(dòng)物PLTP同源物中的功能突變能導(dǎo)致肥胖癥。本發(fā)明人在秦的美國專利號7，078，411中鑒定了用于升高反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，其通過施用喜樹堿或喜樹堿衍生物來促進(jìn)PLTP表達(dá)的增加。本發(fā)明人已經(jīng)在本文中提供了用于以有效方式調(diào)控PLTP的進(jìn)一步的進(jìn)展。展。日、、，、、、<:另外，本文還提供了用于開發(fā)有效治療藥物以調(diào)控個(gè)體體重的進(jìn)展。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及用于以轉(zhuǎn)錄方式激活磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)基因表達(dá)的方法，其通過施用有效量的檸檬苦素類化合物(limonoid)，例如prieurianin。另一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)顯著體重?fù)p失和/或食物攝取降低的方法，其通過施用有效量的prieurianin。另一方面，本發(fā)明還提供了以下各項(xiàng)減少內(nèi)臟和皮下脂肪組織的方法，其包括施用有效量的prieurianin。降低血清非酯化脂肪酸水平的方法，其包括施用有效量的prieurianin。抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化的方法，其包括施用有效量的prieurianin。引起在脂肪細(xì)胞中去分化或脂肪積累的損失的方法，其包括施用有效量的prieurianin。本發(fā)明另一方面涉及用于肥胖受試者的體重降低組合物，其包括檸檬苦素類化合物，例如prieurianin。在某些實(shí)施方式中，受試者包括哺乳動(dòng)物。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于探測脂肪生成的生物化學(xué)和生理學(xué)的藥學(xué)組合物，其包括檸檬苦素類化合物。本發(fā)明另一方面涉及用于刺激磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)反式激活(transactivation)的方法，其包括使用prieurianin來i秀導(dǎo)受試者體內(nèi)體重和肥胖的減少。也提供了用于在受試者體內(nèi)抑制前脂肪細(xì)胞增殖和用于阻止前脂肪細(xì)胞分化成成熟脂肪細(xì)胞的方法，該方法包括對受試者施用有效量的prieurianin。在某些實(shí)施方式中，受試者被認(rèn)為是肥胖的。也提供了用于引起在分化的成熟脂肪細(xì)胞中的去分化或用于抑制在分化的成熟脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的積累的方法。該方法包括對受試者施用有效量的prieurianin。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于脂肪生成的一種或多種生物標(biāo)志物。在某些實(shí)施方式中，生物標(biāo)志物包括磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)。也提供了用于調(diào)控PLTP基因表達(dá)的方法，其包括施用有效量的prieurianin。也提供了用于阻止prieurianin對PLTP反式激活的方法，其包括施用有效量的星狀孢菌素(Staurosporine)。在閱讀附圖的指導(dǎo)下，從有限實(shí)施方式的以下詳細(xì)說明，本發(fā)明技術(shù)人員可以清楚本發(fā)明的多種目的和優(yōu)點(diǎn)。圖1.通過DNA微陣列，顯示HepG2細(xì)胞對托泊替康的藥理學(xué)反應(yīng)。用500nM托泊替康多次(A)或者多種濃度的托泊替康(B)處理HepG2！細(xì)胞24小時(shí)。樹狀示磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)的表達(dá)變化。(C)通過Northern印跡分析獨(dú)立地驗(yàn)證了托泊替康對PLTP表達(dá)的i秀導(dǎo)。圖2.托泊替康對PLTP啟動(dòng)子的反式激活。圖2A.托泊替康以劑量依賴方式反式激活融合至螢光素酶報(bào)告基因的1.5Kb的PLTP啟動(dòng)子。圖2B.在含有融合至新霉素可選擇標(biāo)記物盒的PLTP啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因的HepG2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，托泊替康激活PLTP啟動(dòng)子，所述PLTP啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因系(上區(qū))。托泊替康對PLTP啟動(dòng)子的劑量依賴式誘導(dǎo)(下區(qū))。結(jié)果是用海腎(^"i7/a)螢光素酶標(biāo)準(zhǔn)化后的三次實(shí)驗(yàn)的平均S.E.。圖3.prieurianin對PLTP啟動(dòng)子的反式激活。圖3A.在HepG2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中prieurianin對PLTP啟動(dòng)子的劑量依賴反式激活。結(jié)果是用海腎(^/7//")螢光素酶標(biāo)準(zhǔn)化后的三次實(shí)驗(yàn)的平均S.E.。圖3B.星狀孢菌素對PLTP啟動(dòng)子的prieurianin反式激活的抑制。在存在或不存在星狀孢菌素下，用prieurianin處理轉(zhuǎn)基因HepG2/PLTPpLuc細(xì)胞。1，對照；2，DMSO;3,200nM星狀孢菌素；4、5和6分別是500、1000和2000nM的prieurianin;7、8和9分別是500、1000和2000nM大prieurianin+200nM的星狀孢菌素。結(jié)果是一式三份實(shí)驗(yàn)的平均±S.E.。圖4.prieurianin對血液胰島素、糖和NEFA水平的作用。用5mg/kg的prieurianin處理正常和06/06小鼠，然后收集血清樣品用于(圖")胰島素；(圖4B)糖；和(圖4C)非酯化脂肪酸(NEFA)概要分析。結(jié)果是對每種處理的每組中3個(gè)動(dòng)物的平均值。藍(lán)色柱，正常C57BL/6J;紅色柱，瘦素缺陷o6/o6小鼠。圖5.M/o6小鼠中prieurianin對脂肪生成的作用。用5mg/kg的prieurianin處理瘦素缺陷od/o6小鼠，切除皮下和內(nèi)臟脂肪組織并稱重。結(jié)果是如指示(n)的每組3-5個(gè)動(dòng)物的平均值。圖6.prieurianin抑制NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)胞的增殖。用多種濃度(O.5、1和2pM)的prieurianin處理細(xì)胞，通過在7天里每天計(jì)數(shù)來評估生長。結(jié)果是一式三份實(shí)驗(yàn)的平均±S.E.。圖7.prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞分化。誘導(dǎo)NIH-3T3/L1細(xì)胞進(jìn)入分化，并同時(shí)用2pM的prieurianin處理。用油紅0染色分化的細(xì)胞-圖7A，未分化的對照。圖7B.分化的脂肪細(xì)胞。圖7C.存在2pM的prieurianin下，對分化的i秀導(dǎo)。圖7D.膜聯(lián)蛋白V結(jié)合磷脂酰絲氨酸的流式細(xì)胞學(xué)分析，凋亡細(xì)胞在右上象限。所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份。圖8.prieurianin誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞的損失。將NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)進(jìn)入分化。分化后5天，用多種濃度(O.5、1和2jiM)的prieurianin處理細(xì)月包以另外的5天，其后用油紅0染色。從一式三份實(shí)驗(yàn)的代表中獲得顯微圖像。在510nm處，分光光度法定量陽性染色細(xì)胞的異丙醇提取物，顯示在右面的柱形圖中。結(jié)果是一式三份實(shí)驗(yàn)的平均±S.E.。圖9.星狀孢菌素阻止prieurianin誘導(dǎo)的前脂肪細(xì)胞分化。在prieurianin(0.5、1和2jiM)中分化的前脂肪細(xì)胞一起用或不用200nM的星狀孢菌素處理。顯微圖像顯示了誘導(dǎo)后12天，油紅0染色的細(xì)胞。圖9A.未分化的；圖9B.分化的；圖9C.在2jiM的prieurianin中分化的；圖9D.在2pM的prieurianin和200nM的星狀孢菌素中分化的。柱狀圖顯示了來自細(xì)胞的油紅0染色異丙醇提取物對A510nm處的吸光度。結(jié)果是一式三份實(shí)驗(yàn)的平均±S.E.。圖10.由前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，以及在正常小鼠血清中，脂連蛋白和PLTP的釋放。用2jtiM的prieurianin處理前脂肪細(xì)胞(B和D)，36小時(shí)后收集培養(yǎng)基用于前脂肪細(xì)胞(A和B)或者PLTP(C和D)的Western印跡分析。備選地，分化后5天，收集脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(A和C)用于Western分析。E.給予prieurianin或托泊替康(0、2、5和10mg/kg)的正常C57BL/6J小鼠的血清通過Western印跡就PLTP進(jìn)行分析。圖11.細(xì)胞毒性和非細(xì)胞毒性藥物反式激活PLTP啟動(dòng)子。在HepG2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，進(jìn)行多種細(xì)胞毒性和非細(xì)胞毒性藥物反式激活PLTP啟動(dòng)子的測量。結(jié)果是3次試驗(yàn)的平均S.E.。圖12.制滴菌素A(TrichostatinA，TSA)對prieurianin反式激活PLTP啟動(dòng)子的作用。在存在或不存在200nMTSA時(shí)，prieurianin劑量反應(yīng)激活PLTP啟動(dòng)子。結(jié)果是3次試驗(yàn)的平均S.E.。圖13.在正常C45BL/6J或C57BL/6J瘦素缺失小鼠中，prieurianin處理對體重和食物才聶取的作用。圖l4.在正常C57BL/6J或C57BL/6J瘦素缺失小鼠中，prieurianin處理對血清脂蛋白、PLTP活性和痩素水平的作用。圖15.在c^/W和飲食誘導(dǎo)的肥胖Ceacs/z7+小鼠中，prieurianin的作用。圖15A.對10只W/W和小鼠的組，每日i.p.給予3或5mg/kg的prieurianin以30天。圖15B.對遺傳糖尿病Cescayz/—^敲除小鼠飼喂高脂肪飲食以增肥4周，然后每日prieurianin處理(3或5mg/kg)21天。載體處理的M/W和Ceaca/z+小鼠給予等量的Captisol。結(jié)果是每組10只動(dòng)物的平均S.E.。圖16.在飲食誘導(dǎo)的肥胖C57B1/6J小鼠中，prieurianin的作用。對B6小鼠施以60%kcal的高脂肪飲食以大約15周，然后分成每組IO只，然后用1(綠色)或3(棕色)rag/kg的prieurianin每日腹腔內(nèi)處理3周，并與未處理(藍(lán)色)或載體處理(紅色)的對照比較。圖16A.在3周的處理期間，用prieurianin處理的小鼠與對照比較的平均體重變化。圖16B.如在A中用prieurianin處理的B6小鼠的平均食物消耗。圖16C.如在文中描述的，用prieurianin以"開-關(guān)，，循環(huán)時(shí)間表處理4個(gè)循環(huán)的B6小鼠中的平均體重變化。結(jié)果是每組10只動(dòng)物，和3mg/kg組20只小鼠的平均S.E.。圖17.用于克服藥物誘導(dǎo)的耐受性的"開-關(guān)"或"循環(huán)"處理時(shí)間表。該處理策略包括處理的特定劑量用于處理的特定持續(xù)時(shí)間并伴以間歇藥物休息期，能夠克服在代謝病癥和其他病癥的治療中藥物誘導(dǎo)的耐受性、脫敏或缺乏反應(yīng)。圖18.在脂肪生成中，prieurianin對C/EBPa和p以及PPARY介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的作用。將對應(yīng)于C/EBPa和p以及PPARy的反應(yīng)元件克隆入pGL3堿性螢光素報(bào)告基因質(zhì)粒。在存在或不存在克隆入表達(dá)栽體的響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的情況下，用報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Ll前脂肪細(xì)胞，其后用2nM的prieurianin處理。15-24小時(shí)后，收集細(xì)胞用于螢光素酶分析。結(jié)果是一式三份實(shí)驗(yàn)的平均土S.E.。圖19.蟾蜍靈對前脂肪細(xì)胞分化以及脂肪細(xì)胞中的去分化/去脂的作用。誘導(dǎo)NIH-3T3/L1細(xì)胞進(jìn)入分化并同時(shí)用1jiM的蟾蜍靈或2jiM的prieurianin處理。用尼羅紅對分化的細(xì)胞染色。備選地，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞進(jìn)入分化，并且在分化后5天用1的蟾蜍靈或2pM的prieurianin處理細(xì)胞以另外的5天，其后用尼羅紅染色。通過熒光顯微鏡檢查來評估染色的細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述本系統(tǒng)提供了用于誘導(dǎo)PLTP基因表達(dá)的方法。本系統(tǒng)也提供了用于提高PLTP水平和調(diào)控反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的方法。在另一方面中，提供了提高PLTP水平和調(diào)控反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的的非毒性天然產(chǎn)物小分子。在秀麗隱桿線蟲中siRM誘導(dǎo)的PLTP損失升高了脂肪儲存?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)prieurianin反向激活PLTP基因表達(dá)，并且是拒食劑。在另一方面中，本文提供了使用prieurianin作為新型藥學(xué)組合物用于探測脂肪生成的生物化學(xué)和生理學(xué)的方法。prieurianin誘導(dǎo)PLTP基因表達(dá)并有效降低體重和脂肪量。prieurianin也抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，并且引起脂肪細(xì)胞去分化或者阻止脂肪細(xì)胞積累脂質(zhì)。源于prieurianin對06/06小鼠的脂肪細(xì)胞的作用，以及其對培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的抗脂肪生成作用，本發(fā)明人認(rèn)為PLTP是prieurianin對體重和脂肪量降低的抗脂肪生成作用所需要的在另一方面中，提供了使用prieurianin作為有效抗肥胖癥藥物的方法。在小鼠中測試其有效性，并且prieurianin顯著降低總體重、脂肪和食物攝取。該藥物也逆轉(zhuǎn)小鼠的高血糖狀態(tài)至與正常小鼠相當(dāng)?shù)乃?。在另一個(gè)分子學(xué)研究中，認(rèn)為prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞的增殖，并且還阻止前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。Prieurianin能夠引起脂肪細(xì)胞的去分化或者阻止脂肪細(xì)胞積累脂質(zhì)。Prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞的脂連蛋白釋放，因此導(dǎo)致阻止前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。矛盾的是，盡管prieurianin誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中PLTP的分泌，但在前脂肪細(xì)胞中的PLTP釋放不被抑制。在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，prieurianin與托泊替康相比是相對無毒的(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)在給予該藥物的動(dòng)物中，沒有觀察到明顯的毒性。因此，prieurianin是具有靶向脂肪生成的抗肥胖癥作用的天然產(chǎn)物小分子。在特定的實(shí)施方式中，本文顯示prieurianin在肥胖癥小鼠才莫型中具有對產(chǎn)生體重?fù)p耗的作用，具有通過抑制食欲以及另外的通過其在抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化、引起脂肪細(xì)胞的去分化和去脂中的特別的藥理學(xué)性質(zhì)的多種潛在的致病機(jī)制。另外，本文顯示prieurianin的分子機(jī)制據(jù)信是其通過激活NFkB信號傳導(dǎo)通路和通過抑制C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活，而抑制脂肪生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的能力。現(xiàn)在通過如下非限制性的實(shí)施例示例說明上文描述的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例1-HepG2細(xì)胞對托泊替康的藥理學(xué)反應(yīng)研究通過表達(dá)基因組對拓樸異構(gòu)酶(Top)l抑制劑的抗性的機(jī)制，通過進(jìn)行時(shí)間過程和劑量反應(yīng)時(shí)間，用DNA微陣列來研究人肝細(xì)胞母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞對托泊替康的藥理學(xué)反應(yīng)，所述細(xì)胞用500nM的托泊替康(細(xì)胞毒性抗癌試劑)處理多種時(shí)間(0、1、3、5、10、15和24小時(shí))或用多種劑量的托泊替康(0、10、50、100、300、500和1000nM)處理24小時(shí)。托泊替康誘導(dǎo)的整體基因表達(dá)變化是適度的，除了PLTP基因外，其他大多數(shù)基因表現(xiàn)出表達(dá)的低水平改變。圖1中的結(jié)果顯示了PLTP對托泊替康反應(yīng)的時(shí)間過程(圖1A)和劑量反應(yīng)(圖1B)表達(dá)的樹狀圖。托泊替康對PLTP表達(dá)的激活是是時(shí)間調(diào)控和劑量依賴的，具有晚期開始，在24小時(shí)達(dá)到峰值約20倍誘導(dǎo)。通過Northern印跡分析獨(dú)立地評估托泊替康誘導(dǎo)的PLTP表達(dá)，其顯示托泊替康以劑量依賴方式誘導(dǎo)PLTP(圖1C)，與在微陣列研究中觀察到的結(jié)果一致。PLTP基因表達(dá)的誘導(dǎo)是被托泊替康以轉(zhuǎn)錄方式調(diào)控，因?yàn)槿诤现廖灩馑孛笀?bào)告基因的PLTP啟動(dòng)子被托泊替康以劑量依賴方式反式激活(圖2A)，印跡分析。因此，Topl抑制劑誘導(dǎo)培養(yǎng)中的HepG2細(xì)胞中(參見圖1和2)以及小鼠體內(nèi)的PLTP基因表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，本發(fā)明人在本文中顯示PLTP用作肥胖癥的生物標(biāo)志物，并且在肥胖癥的脂肪生成中具有重要作用。實(shí)施例2.篩選PLTP基因表達(dá)的天然產(chǎn)物小分子誘導(dǎo)物PLTP涉及反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。而且，PLTP表達(dá)和活性與肥胖癥相關(guān)。另外，通過RNA介導(dǎo)的干擾失活PLTP基因表達(dá)之后的秀麗隱桿線蟲中脂肪儲存的增加表明靶向PLTP的小分子可用于開發(fā)治療肥胖癥的藥物。為確定非細(xì)胞毒性小分子是否能誘導(dǎo)PLTP表達(dá)，本發(fā)明人將PLTP-啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因亞克隆到含有新霉素(G418)抗性可選擇標(biāo)志物的栽體中，并通過穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染和用G418的選擇產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因HepG2細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有PLTP-啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因。該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系HepG2/PLTPpLuc顯示出與用PLTP-啟動(dòng)子報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相似的托泊替康反應(yīng)(圖2B)。隨后，用來自天然產(chǎn)物的小分子庫來篩選該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。Prieurianin顯示出最強(qiáng)的PLTP啟動(dòng)子反向激活，并且顯示出劑量依賴方式的PLTP誘導(dǎo)(圖3A)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)星狀孢菌素抑制prieurianin對PLTP啟動(dòng)子活性待反向激活，從而暗示prieurianin對PLTP表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控被一種蛋白激酶所調(diào)控(圖3B)。實(shí)施例3.prieurianin的抗肥胖癥作用關(guān)于prieurianin的已知很少。其是一種檸檬苦素類化合物，也是一種天然產(chǎn)物拒食劑(anti-feedant),其在培養(yǎng)中的果蠅細(xì)胞中表現(xiàn)出抗20-羥基蛻皮酮的拮抗作用。在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，該藥物與托泊替康相比是相對地?zé)o細(xì)胞毒性。將prieurianin腹腔內(nèi)施用至12-14周齡的正常C57BL/6J小鼠和遺傳瘦素缺陷小鼠，每周2次(2或5mg/kg)以2周。對照接受等量注射的藥物載體。每3天測量體重和食物攝取，并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集血液樣品。對于2或5mg/kg處理的瘦素缺陷oft/"小鼠在2周后，用prieurianin的處理產(chǎn)生多至10%總體重的劑量依賴式的下降(參見圖13其中包含的表1)。另外，相對與未處理和載體處理對照，在5mg/kg處理組中也觀察到多達(dá)50%的食物攝取的劑量依賴式下降。在正常C57BL/6J小鼠中也觀察到適度的體重?fù)p失以及減少的食物攝取。這些結(jié)果說明所得的體重?fù)p失和食物攝取下降歸因于prieurianin的拒食劑作用。實(shí)施例4.prieurianin的代謝作用肥胖癥導(dǎo)致高血壓、高血清膽固醇、低HDL膽固醇和高血糖癥，從而潛在地導(dǎo)致心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)。腹部肥胖癥特別與代謝風(fēng)險(xiǎn)因子相關(guān)。瘦素缺陷小鼠是高血脂和高血糖的。為測試prieurianin是否改變除了食欲以外的代i射和內(nèi)分泌參數(shù)，測量了血清脂質(zhì)情況、胰島素和糖水平。然而，在prieurianin處理和未處理正常對照以及。6/"小鼠中沒有觀察到三酸甘油酯的顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。在正常未處理或載體處理小鼠中，用或不用prieurianin處理，膽固醇和HDL水平也保持相對不變(參見圖14，其中含有表2)。相反，盡管適度，但在prieurianin處理的ob/ob小鼠中，總膽固醇水平顯著降低。而且在prieurianin處理的ob/ob小鼠中的HDL水平，比未處理和載體處理動(dòng)物中大約4氐2倍。用prieurianin處理也引起在正常C57BL/6J小鼠中血清PLTP活性的升高(圖14)。矛盾的是，給予prieurianin的ob/ob小鼠顯示出血清PLTP活性的降低，即使prieurianin激活了PLTP基因的表達(dá)(圖3)。然而，在prieurianin處理的ob/ob小鼠中PLTP活性的降低與在人肥胖受試者在體重?fù)p失后報(bào)道的情況一致。在正常小鼠中，用prieurianin的處理引起瘦素水平下降，但這在ob/ob小鼠中不能如預(yù)期的那樣檢測到(圖14)。ob/ob小鼠中的高血月旨癥被逆轉(zhuǎn)至與prieurianin(5mg/kg)處理的ob/ob小鼠中正常對照相當(dāng)?shù)乃?參見圖4B)。在ob/ob小鼠中，prieurianin也引起胰島素水平降低大約3-4倍(參見圖4A)。然而，在正常C57BL/6J小鼠中，prieurianin處理不顯著改變胰島素和葡萄糖糖水平。脂解作用和脂肪酸調(diào)控通路中的紊亂在肥胖癥病因?qū)W中是重要的。骨骼肌和脂肪組織攝取非酯化脂肪酸(NEFA)的改變是其在血漿總濃度的關(guān)鍵決定因素。如圖4C所示，與正常C57BL/6J小鼠相比，痩素缺陷ob/ob小鼠中的NEFA水平更高。在正常小鼠中用prieurianin處理導(dǎo)致NEFA水平的降低。然而，在ob/ob小鼠中，施用prieurianin后只觀察到NEFA水平的適度降低。實(shí)施例5.prieurianin對脂肪生成的作用為進(jìn)一步檢查prieurianin對正常C57BL/6J小鼠和ob/ob小鼠的肥胖的作用，我們測量了它們的內(nèi)臟和皮下體脂。與未處理和載體處理的對照相比，prieurianin處理的ob/ob小鼠中總體脂顯著下降大于50%(參見圖5)。任何劑量prieurianin的都沒有顯著改變正常C57BL/6J小鼠的百分比體脂(數(shù)據(jù)未顯示)。之前已經(jīng)顯示TNFa、IL-1(3、IFNy或TGFpi完全抑制培養(yǎng)中的前脂肪細(xì)胞分化成成熟的脂肪細(xì)胞，這與脂連蛋白釋放的消失相伴。因?yàn)閜rieurianin顯著減少ob/ob小鼠中皮下和內(nèi)臟脂肪組織(參見圖5)，本發(fā)明人在細(xì)胞培養(yǎng)研究中檢查了其對以下各項(xiàng)的作用(i)前脂肪細(xì)胞的增殖；(ii)前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞；和(iii)對脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累的抑制或去分化的促進(jìn)。如圖6所示，prieurianin以劑量依賴方式抑制NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)胞的增殖。2jiM的prieurianin在第7天觀察到顯著的抑制(50%)。為確定prieurianin對前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)^^的作用，在開始誘導(dǎo)分化的同一時(shí)間，用或不用所述藥物處理NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)月包。我們發(fā)現(xiàn)prieurianin也以劑量依賴方式防止前脂肪細(xì)胞分化成脂質(zhì)積累的脂肪細(xì)胞，在與未處理/未分化以及分化的對照相比，油紅O染色的脂質(zhì)積累脂肪細(xì)胞的數(shù)量顯著減少是明顯(參見圖7A-C)。有趣的是，與前脂肪細(xì)胞相比，prieurianin處理的前脂肪細(xì)胞獲得了十分不同的形態(tài)(圖7C)，并且沒有如通過缺少膜聯(lián)蛋白V結(jié)合至磷酯酰絲氨酸所示的差異誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡(參見圖7D)。在未處理或載體處理對照和藥物處理的分化細(xì)胞之間的細(xì)胞數(shù)量是相對地相當(dāng)?shù)?數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果說明prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞的增殖，也防止前脂肪細(xì)胞分化成成熟的脂肪細(xì)胞。為評估prieurianin是否對分化的脂肪細(xì)胞具有任何作用，使前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，然后進(jìn)一步培養(yǎng)大約5天，之后用prieurianin處5里月旨肪細(xì)月包以另夕卜的5—6天，其后通過油紅0染色用于脂質(zhì)積累脂肪細(xì)胞的存在。在prieurianin處理的細(xì)胞(參見圖8，下區(qū))中觀察到油紅0染色的細(xì)胞數(shù)量的很大程度的劑量依賴式降低，而載體處理的細(xì)胞顯示出與分化的對照相當(dāng)數(shù)量的脂質(zhì)陽性染色細(xì)胞。當(dāng)用油紅0染色A510吸光度定量時(shí)，我們顯示在2nM的prieurianin,脂質(zhì)陽性細(xì)胞幾乎沒有或者其數(shù)量降低到與未分化對照相當(dāng)?shù)乃?參見圖8,右邊的柱狀圖)。這些結(jié)果還暗示，除了抑制前脂肪細(xì)胞增殖和阻止其分化，prieurianin也作用于分化的成熟脂肪細(xì)胞，這是通過引起其去分化或抑制其脂質(zhì)的積累。實(shí)施例6.星狀孢菌素部分地逆轉(zhuǎn)prieurianin對分化的抑制prieurianin對PLTP的反向激活可被星狀孢菌素所阻止(參見圖3B)，星狀孢菌素是"常規(guī)，，蛋白激酶C(PKC)異構(gòu)酶的有效抑制劑。我們也顯示prieurianin對PLTP的轉(zhuǎn)錄方式激活抑制前月旨肪細(xì)胞分化(參見圖7)。為評估通過星狀孢菌素抑制prieurianin介導(dǎo)的PLTP反向激活是否逆轉(zhuǎn)對分化的阻止，在存在prieurianin(0、0.5、1和2nM)同時(shí)有或沒有200nM的星狀孢菌素情況下誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的分化。與上述結(jié)果相一致(參見圖7),在沒有星狀孢菌素情況下，2fiM的prieurianin幾乎完全抑制前脂肪細(xì)胞分化(參見圖9C)。在分化豫導(dǎo)的同時(shí)加入星狀孢菌素部分地逆轉(zhuǎn)prieurianin產(chǎn)生的抑制(參見圖9D),而單獨(dú)的星狀孢菌素沒有顯示出可觀察到的對分化的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。通過監(jiān)視油紅0染色的前脂肪細(xì)胞的異丙醇提取物的AM。吸光度來驗(yàn)證這些結(jié)果。Prieurianin以劑量依賴方式抑制前脂肪細(xì)胞分化，并且該抑制被星狀孢菌素部分地逆轉(zhuǎn)(參見圖9，柱狀圖)。因此，本發(fā)明人現(xiàn)在認(rèn)為暗示prieurianin謙導(dǎo)的PLTP表達(dá)是抑制前脂肪細(xì)胞分化所需要的。實(shí)施例7.prieurianin對脂肪因子(adipokine)和PLTP分泌的作用脂肪組織含有多種類型的細(xì)胞，其中包括前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。而且，前脂肪細(xì)胞分泌涉及其自身分化的因子。一旦分化，成熟的脂肪細(xì)胞獲得通過分泌瘦素和脂連蛋白遠(yuǎn)距離與其他器官(包括腦、肝和骨骼肌)，局部與其他細(xì)胞(例如前脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)通訊的能力。另外，抗脂肪生成細(xì)胞因子阻止前脂肪細(xì)胞的脂連蛋白釋放。因此，評估了前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的脂連蛋白和PLTP的生產(chǎn)。在用prieurianin處理后大約36小時(shí)，觀察對前脂肪細(xì)胞釋放脂連蛋白進(jìn)入條件培養(yǎng)基的抑制(參見圖10B)。托泊替康誘導(dǎo)PLTP的表達(dá)(參見圖10)，其也顯著地抑制NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)胞產(chǎn)生脂連蛋白(圖10B)。這些結(jié)果與之前的報(bào)道相一致，即對前脂肪細(xì)胞分化的阻止伴隨對脂連蛋白釋放的抑制。另外，prieurianin而不是托泊替康誘導(dǎo)在分化的脂肪細(xì)胞中脂連蛋白的高分子量形式的產(chǎn)生和釋放，以及總脂連蛋白分泌的適度增加(參見圖10A)。也評估了前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的PLTP的表達(dá)和分泌。因此，前脂肪細(xì)胞產(chǎn)生和分泌PLTP的低和高分子量形式，而脂肪細(xì)胞僅分泌低分子量形式進(jìn)入條件培養(yǎng)基(參見圖10C和10D)。意外的是，在用托泊替康或prieurianin處理前脂肪細(xì)胞后，降低PLTP低分子形式的釋放，而沒有降低其高分子形式的釋放(參見圖10D)。相反，托泊替康或prieurianin僅誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中低分子量形式釋放的增加(參見圖10C)。前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間PLTP釋放的這些不同概況暗示對prieurianin藥理學(xué)作用的復(fù)雜內(nèi)源性生理學(xué)反應(yīng)。實(shí)施例8.prieurianin和托泊替康處理后的血清PLTP蛋白水平在微陣列分析中對托泊替康的時(shí)間過程和劑量反應(yīng)研究顯示PLTP是在所述藥物處理后大約12-15小時(shí)開始誘導(dǎo)的晚期基因(參見圖10A)。Prieurianin對PLTP反式激活的開始與托泊替康的作用相似。prieurianin或托泊替康(0、2、5和10mg/kg)對PLTP基因表達(dá)的誘導(dǎo)伴隨血清PLTP蛋白水平的升高(參見圖10E)。實(shí)施例9.-prieurianin對PLTP的反式激活在小鼠中對體重降低和肥胖的藥理學(xué)抑制檢查在正常和ob/ob小鼠中，在肥胖方面星狀孢菌素對prieurianin的藥理學(xué)抑制。PKC激活物，12-0_十四酰佛波-13-乙酯(TPA)誘導(dǎo)PLTP啟動(dòng)子(參見圖11)，并且該激活被PKC抑制劑星狀孢菌素消除。本發(fā)明人認(rèn)為PKC信號傳導(dǎo)通路參與PLTP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些結(jié)果也表明prieurianirH秀導(dǎo)的PLTP啟動(dòng)子活性^皮星狀孢菌素所抑制(參見圖3B)。另外，prieurianin對前脂肪細(xì)胞分化的抑制被星狀孢菌素部分地逆轉(zhuǎn)(參見圖9)，進(jìn)一步指出PKC在PLTP的反式激活和prieurianin對分化的抑制中的潛在作用。因?yàn)閜rieurianin對PLTP的反式激活被星狀孢菌素所阻止，這些結(jié)果表明prieurianin誘導(dǎo)的體重?fù)p失和脂肪生成的抑制可通過共施用星狀孢菌素來取消或逆轉(zhuǎn)。實(shí)施例10.-在脂肪生成方面，星狀孢菌素對prieurianin誘導(dǎo)的PLTP表達(dá)的藥理學(xué)抑制脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體-Y(PPARy)以及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白a和p(C/EBPa和P)在脂肪生成過程中發(fā)生的復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)中起到重要作用。PPARy和RB之間的相互作用通過招募組蛋白脫?；窰DAC3降低PPARy的轉(zhuǎn)錄活性。抑制HDAC活性隨后造成PPARY的強(qiáng)激活。已經(jīng)顯示丙戊酸在小鼠和NIH-3T3/L1前脂肪細(xì)胞中抑制脂連蛋白基因表達(dá)，并且降低C/EBPa蛋白水平及其與脂連蛋白啟動(dòng)子的結(jié)合。因?yàn)閜rieurianin是PLTP的轉(zhuǎn)錄激活物，本發(fā)明人認(rèn)為所述藥物的一些藥理學(xué)作用被這些轉(zhuǎn)錄因子所影響。如圖12所示，HDAC抑制劑制滴菌素A(TSA)盡管是適度地，增強(qiáng)prieurianin對PLTP啟動(dòng)子活性的反式激活，從而表明PPAR在prieurianin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有作用。這些初步的結(jié)果也顯示星狀孢菌素(一種PKC抑制劑)強(qiáng)烈地抑制prieurianin對PLTP的反式激活(參見圖3B),并且也逆轉(zhuǎn)prieurianin對前脂肪細(xì)胞增殖和分化的抑制(參見圖6和7)。盡管prieurianin和內(nèi)皮縮血管肽1對前脂肪細(xì)胞分化的抑制有某些相似性，但星狀孢菌素對prieurianin和內(nèi)皮縮血管肽1的藥理學(xué)作用是不同的，從而說明prieurianin和內(nèi)皮縮血管肽1可能通過不同的通路抑制前脂肪細(xì)胞分化。實(shí)施例11.-prieurianin的抗肥胖癥作用在3個(gè)另外的肥胖癥小鼠;f莫型中測試prieurianin的作用，3個(gè)模式包括遺傳高胰島素血型瘦素受體缺陷db/db、Ceacam-/-糖不耐性/糖尿病、以及々大食誘導(dǎo)肥胖小鼠。將prieurianin腹腔內(nèi)(i.p.)施用至12-14周齡的db/db小鼠，每日3或5mg/kg，30天。對飲食誘導(dǎo)肥胖Ceacam-Z-糖尿病小鼠飼喂高脂肪飲食4周，從而增肥，其后prieurianin處理(3或5mg/kg)3周。栽體處理組接受等量注射的Captisol(CyDexInc.，Lenexa，KS)。每3天測量體重和食物揭^取，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集血液樣品。在prieurianin處理的db/db小鼠中沒有觀察到體重?fù)p失，但我們發(fā)現(xiàn)與未處理或載體處理對照，在3周內(nèi)體重獲得顯著減少50%(參加圖15A)。在飲食誘導(dǎo)的肥胖06&0&111-/-糖尿病小鼠中，與對照相比prieurianin處理的動(dòng)物中觀察到大約20-26%的體重?fù)p失(參見圖15B)，伴隨>50%減少的食物攝取(數(shù)據(jù)未顯示)。在3rag/kg處理組中，體重恢復(fù)到增肥前水平。由于嚴(yán)重的體重?fù)p失和未知毒性，在處理后14天對給予5mg/kg的小鼠實(shí)施安樂死。在這些小鼠的尸體檢查中觀察到，相對于對照的極少皮下或內(nèi)臟脂肪(數(shù)據(jù)未顯示)。密集的高卡路里飲食，伴隨久坐生活方式在全世界的流行造成了肥胖癥發(fā)生率的急劇升高。為了進(jìn)一步測試prieurianin在肥胖癥中的功效，還研究了其在飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)C57BL/6J(B6)小鼠模型中的作用。對B6小鼠飼喂60%kcal的高脂肪飲食大約15周，從而增加體重，然后用1或3mg/kg的prieurianin腹腔內(nèi)每日處理3周。在處理期間，小鼠自由采食60%kcal的飲食。這些結(jié)果顯示在7天的處理期間劑量依賴方式誘導(dǎo)了多至10%總體重的體重?fù)p失(參見圖16A)，并伴隨70-80%的食物消耗下降，在3周治療的結(jié)束時(shí)最終幾乎恢復(fù)到正常水平(參見圖16B)。然而，在2周后，達(dá)到的體重?fù)p失后是體重的逐漸增加。這些結(jié)果暗示prieurianin處理的小鼠可能產(chǎn)生了對所述藥物的耐受性。為防止藥物誘導(dǎo)的耐受性這一問題，開發(fā)了新的方法，其中對DIO小鼠停止prieurianin處理，該小鼠繼續(xù)維持在高脂肪60。/。kcal飲食。4周后，用以下方法再次處理該小鼠3mg/kg的prieurianin處理5天，然后是5天的藥物休息期(無處理)，重復(fù)該處理3個(gè)循環(huán)或更多；或者5mg/kg的prieurianin處理3天，然后是5天的藥物休息期，重復(fù)該處理3個(gè)循環(huán)或更多。觀察到這種"開-關(guān)"處理策略(參見圖17)似乎克服了藥物誘導(dǎo)的耐受性，并且導(dǎo)致更明顯的反應(yīng)，3或5mg/kg的prieurianin處理導(dǎo)致多至20%的體重下降，并且在接近研究結(jié)束時(shí)沒有觀察到體重的升高(圖16C)。食物消耗下降了大約40%，并且在循環(huán)處理方法的持續(xù)時(shí)間內(nèi)保持不變(圖16B)。這些結(jié)果說明每日藥物處理產(chǎn)生的藥物有效性的損失可以通過這種新型的循環(huán)或開關(guān)處理方法來克服，該方法產(chǎn)生了更大的反應(yīng)以及體重?fù)p失的維持，從而防止了藥物誘導(dǎo)的耐受性。本發(fā)明人認(rèn)為食欲抑制性抗肥胖癥藥物(包括曲美(Meridia))和其他抗肥胖癥藥物可能在經(jīng)過延長的處理時(shí)程后損失其有效性，并且因?yàn)閷ζ茐哪芰Υx的藥物治療反應(yīng)的補(bǔ)償性生理激素變化而遭遇耐受性。該新型循環(huán)或開關(guān)處理方法是一種提高抗肥胖癥藥物的功效的方式，并且可用于一般代謝病癥和其他人類病癥的處理。實(shí)施例12.-prieurianin的作用才幾制prieurianin抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，也引起脂肪細(xì)胞的去分化或去脂作用。為查明prieurianin的分子機(jī)制，評價(jià)了prieurianin對脂肪生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。如圖18所示，prieurianin誘導(dǎo)來自NFkB反應(yīng)元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的反式激活，但抑制C/EBPa和(3以及PPARy的反式激活潛力(參見圖18)。這些報(bào)告基因分析從而用于進(jìn)一步篩選可能是prieurianin的化學(xué)類似物或其靶向調(diào)控脂肪生成的這些轉(zhuǎn)錄過程的相關(guān)小分子的家族。因此，用于促進(jìn)誘導(dǎo)NFkB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路或者引起抑制通過C/EBPa和p以及PPARy的轉(zhuǎn)錄(重要地調(diào)控脂肪生成)的小分子的高通量篩選是用于鑒定有效的新型抗肥胖癥藥物的創(chuàng)新方法。實(shí)施例13.-蟾蜍靈和prieurianin對脂肪生成的作用強(qiáng)心類類固醇，蟾蜍靈如prieurianin刺激PLTP啟動(dòng)子，但不抑制前脂肪細(xì)胞分化，而且既不引起脂肪細(xì)胞去分化或去脂作用(參見圖19)也不調(diào)節(jié)NFkB、C/EBPa和卩以及PPARy的轉(zhuǎn)錄活性(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明prieurianin在脂肪生成中作用的特異性，并進(jìn)一步表明prieurianin及其衍生物的藥效團(tuán)在脂肪生成中的特定作用。實(shí)施例14.-用途和/或適應(yīng)癥的非限制性實(shí)施例在另一方面，本文提供了用于在受試者中預(yù)防或治療肥胖癥的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的prieurianin。在某些實(shí)施方式中，所述受試者需要這種治療或預(yù)防。在另一方面，本文提供了用于在受試者皮下脂肪組織內(nèi)下調(diào)PLTP表達(dá)的方法，起包括對所述受試者施用治療有效量的prieurianin。在另一方面，本文提供了用于在哺乳動(dòng)物中改善或預(yù)防脂肪生成的方法，起包括對所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的prieurianin及其衍生物。當(dāng)脂肪生成于疾病相關(guān)時(shí)，也可使用本文所公開的方法。另外，可通過任何合適的方式實(shí)現(xiàn)上述方法，其中包括但不局限于通過注射、口服或皮下注射入脂肪組織來施用。在某些實(shí)施方式中，預(yù)防脂肪生成實(shí)質(zhì)上減少脂肪組織量。實(shí)施例15.-體內(nèi)刺激NFKB信號傳導(dǎo)通路在另一方面，本文提供了用于對有此需要的受試者在體內(nèi)刺激NFKB信號傳導(dǎo)通路的方法，其包括對所述受試者施用prieurianin以誘導(dǎo)減少體重和/或肥胖。在另一方面，本文提供了用于篩選檸檬苦素類化合物或者其他小分子實(shí)體或模擬物的NFkB反應(yīng)元件報(bào)告系統(tǒng)。在另一方面，本文提供了篩選一種或多種小分子實(shí)體或模擬物的方法，其包括使用NFKB反應(yīng)元件報(bào)告系統(tǒng)。在某些實(shí)施方式中，所述分子實(shí)體或模擬物包括一種或多種檸檬苦素類化合物。另外在某些實(shí)施方式中，就在誘導(dǎo)減少體重和/或肥胖中的功效篩選所述檸檬苦素類化合物。實(shí)施例16.-通過天然啟動(dòng)子的體內(nèi)反應(yīng)元件在另一方面，本文提供了用于抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的方法，其包括通過天然啟動(dòng)子在體內(nèi)使用一種或多種反應(yīng)元件。在另一方面，本文提供了篩選用于誘導(dǎo)減少體重和/或肥胖的小分子實(shí)體的方法，其包括通過天然啟動(dòng)子在體內(nèi)使用一種或多種反應(yīng)元件來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。實(shí)施例U.-轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件在另一方面，本文提供了用于抑制一種或多種C/EBPa和卩以及PPARY介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的方法，其包括使用含有所述轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件的反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的才艮告系統(tǒng)。在另一方面，本文提供了篩選用于誘導(dǎo)減少體重和/或肥胖的小分子實(shí)體的方法，其包括通過使用含有所述轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件的反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的報(bào)告系統(tǒng)來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。實(shí)施例18.-在分化的成熟脂肪細(xì)胞中去分化和/或抑制脂質(zhì)積累在另一方面，本文提供了用于在分化的成熟脂肪細(xì)胞中引起去分化或抑制脂質(zhì)積累的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的prieurianin。實(shí)施例19.-克服藥物誘導(dǎo)的耐受性在另一方面，本文提供了通過以"開-關(guān)，，或"循環(huán)，，方案施用所述藥物用于克服藥物誘導(dǎo)的耐受性的方法，所述方法包括以特定的劑量對所述受試者施用所述藥物以第一特定持續(xù)時(shí)間，停止施用所述藥物以第二特定持續(xù)時(shí)間，然后，恢復(fù)施用所述藥物以一個(gè)或多個(gè)特定持續(xù)時(shí)間，以及如果需要，重復(fù)所述方案。在某些實(shí)施方式中，所述方法用于治療肥胖癥。另外在某些實(shí)施方式中，所述藥物包括prieurianin。實(shí)施例20.-藥物治療的最大反應(yīng)在另一方面，本文提供了用于治療其中延長藥物治療導(dǎo)致功效降低、缺少反應(yīng)、脫敏或耐受性的人類中的任何疾病的方法，以從所述藥物治療中獲得最大反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，本文所述的方法特別用于預(yù)防脂肪生成實(shí)質(zhì)上減少脂肪組織量。另外，在具體的實(shí)施方式中，本文公開的方法用于脂肪生成是與疾病相關(guān)的主題。在某些實(shí)施方式中，本文公開的方法用于藥物遞送施用是通過注射。在某些實(shí)施方式中，本文公開的方法用于藥物遞送施用是通過口服。在某些實(shí)施方式中，本文公開的方法用于藥物遞送施用是通過皮下注射入脂肪組織。在某些實(shí)施方式中，本文公開的方法用于藥物遞送施用是通過皮膚方式應(yīng)用在脂肪組織周圍。實(shí)施例21.-配置含有prieurianin的組合物在另一方面，本文提供了用于配置含有prieurianin或其衍生物的組合物的方法，其包括將所述組合物溶解在乳浮或Captisol中。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含prieurianin或其衍生物。另外，在某些實(shí)施方式中，配置所述組合物以用于對有此需要的受試者施用，并且其中所述組合物包括所述組合物的預(yù)攝取形式。在具體實(shí)施方式中，配置所述組合物以用于對有此需要的受試者施用，并且其中所述組合物在體內(nèi)形成藥學(xué)活性代謝物。盡管通過參考多種以及優(yōu)選實(shí)施方式描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可產(chǎn)生多種變化，并且等同物可以替換其元件而不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍。另外，可產(chǎn)生多種修改以適應(yīng)具體的介導(dǎo)或材料從而教授本發(fā)明而不脫離其實(shí)質(zhì)范圍。因此，本發(fā)明旨在不受限于本文公開的、用于實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方式，而是本發(fā)明包括落入其權(quán)利要求書中的所有實(shí)施方式。參考文獻(xiàn)1.Mercer，J.G.(2001)Dietaryandgeneticinfluencesonsusceptibilityorresistancetoweightgainonahighfatdiet.NutrMetabCardiovascDis，11,114-7.2.Muoio，D.M.andNewgard,C.B.(2006)Obesity-relatedderangementsinmetabolicregulation.AnnuRevBiochem,75,367-401.3.Blackburn,G.L.andWaltm叫B.A.(2005)Pharmacotherapytoreducevisceralfat.ClinCornerstone,7,52-60.4.Riches,F.M.,Watts,G.F.，Naoumova，R.P.，Kelly,J.M.,Croft,K.D.andThompson,G.R.(1998)Hepaticsecretionofvery-low-densitylipoproteinapolipoproteinB-100studiedwithastableisotopetechniqueinmenwithvisceralobesity.IntJObesRelatMetabDisord,22,414-23.5.Campfield,L.A.，Smith,F丄，Guisez，Y.，Devos，R.andBurn,P.(1995)RecombinantmouseOBprotein:evidenceforaperipheralsignallinkingadiposityandcentralneuralnetworks.Science,269,546-9.6.Halaas,J丄.，Gajiwala，K.S.,Maffei，M.,Cohen,S.L.,Chait,B.T.，Rabinowitz,D"Lallone，R丄"Burley,S,K.andFriedman,J.M.(1995)Weight-reducingeffectsoftheplasmaproteinencodedbytheobesegene.Science,269，543-6.7.PeJJeymounter,M.A.,Cullen,M丄，Baker,MB.，Hecht,R.,Winters,D.,Boone，T-andCollins,F.(1995)Effectsoftheobesegeneproductonbodyweightregulationinob/obmice.Science,269，540-3.8.Zhang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的方法，其包括通過天然啟動(dòng)子在體內(nèi)使用一種或多種反應(yīng)元件來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。38.用于抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARY介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的方法，其包括使用含有所述轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件的反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的報(bào)告系統(tǒng)。39，篩選用于誘導(dǎo)減少體重和/或肥胖的小分子實(shí)體的方法，其包來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。40.用于在分化的成熟脂肪細(xì)胞中引起去分化或抑制脂質(zhì)積累的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的prieurianin。41.通過以"開-關(guān)"或"循環(huán)"方案施用所述藥物用于克服藥物誘導(dǎo)的耐受性的方法，所述方法包括以特定的劑量對所述受試者施用所述藥物以第一特定持續(xù)時(shí)間，停止施用所述藥物以第二特定持續(xù)時(shí)間，然后，恢復(fù)施用所述藥物以一個(gè)或多個(gè)特定持續(xù)時(shí)間，以及如果需要，重復(fù)所述方案。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療肥胖癥。43.權(quán)利要求41的方法，其中所述藥物中包括prieurianin。44.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法用于治療其中延長藥物治療導(dǎo)致功效降低、缺少反應(yīng)、脫敏或耐受性的人類中的任何疾病，以從所述藥物治療中獲得最大反應(yīng)。45.用于配置含有prieurianin或其4汙生物的組合物的方法，其包括將所述組合物溶解在乳浮或Captisol中。46.含有prieurianin或其衍生物，并溶解在乳浮或Captisol中的組合物。47.權(quán)利要求45的組合物，其中配置所述組合物以用于對有此需要的受試者施用，并且其中所述組合物包括所述組合物的預(yù)攝取形式。48.權(quán)利要求45的組合物，其中配置所述組合物以用于對有此需要的受試者施用，并且其中所述組合物在體內(nèi)形成藥學(xué)活性代謝物。全文摘要用于激活PLTP基因表達(dá)的方法和組合物，其包括施用有效量的檸檬苦素類化合物。文檔編號A61K31/585GK101541329SQ200780038818公開日2009年9月23日申請日期2007年10月17日優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日發(fā)明者K-V·秦申請人:托萊多大學(xué)