專利名稱：：作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代的吲哚基-烷基-氨基衍生物的制作方法作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代的吲哚基-烷基-氨基衍生物本發(fā)明涉及具有組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。本發(fā)明還涉及它們的制備方法，包括它們的組合物，以及它們在體外和體內(nèi)抑制HDAC和作為藥品的用途，例如作為藥品用于抑制增殖性病癥，例如癌癥和牛皮褲。核組蛋白被稱為機器的整體和動態(tài)組分，所述機器負責調(diào)節(jié)基因轉錄以及其它DNA-模板過程例如復制、修復、再結合和染色體分離。它們是翻譯后修飾包括乙?；?、磷酸化、曱基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化的對象。組蛋白脫乙酰酶，在此稱為"HDACs",是催化除去蛋白賴氨酸殘基上乙?；?務飾的酶，包括核小體組蛋白H2A、H2B、H3和H4。與組蛋白轉乙酰酶一起，在此稱為"HATs",HDACs調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化的水平。核小體組蛋白乙?；钠胶庠谠S多基因的轉錄中起重要作用。組蛋白的次乙?；c縮合染色質結構有關，該縮合染色質結構導致基因轉錄的抑制，而乙?；M蛋白與更開放的染色質結構和轉錄激活有關。已經(jīng)描述了十一個結構有關的HDACs并分成兩種類型。I類HDACs由HDAC1、2、3、8和11組成，而II類HDACs由HDAC4、5、6、7、9和IO組成。第三類HDACs的成員在結構上是與第I類和II類HDACs無關的。I類/II類HDACs通過鋅-相關的機理起作用，而m類HDACs是NAD-相關的。除組蛋白外，其它蛋白也是乙?；牡孜铮貏e是轉錄因子例如p53、GATA-1和E2F;核受體例如糖皮質激素受體、曱狀l泉受體、雌激素受體；和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白例如pRb。蛋白乙?；c蛋白穩(wěn)定有關，例如p53穩(wěn)定，輔助因子的募集和增加DNA結合。p53是一種肺瘤抑制基因，響應各種應激信號，例如DNA損傷，其可以誘導細胞周期停滯或細胞調(diào)亡。p53-誘導的細胞周期停滯的主要靶標似乎是p21基因。緊接于它由p53導致的激活，p21已經(jīng)根據(jù)它與細胞周期蛋白/依賴細胞周期蛋白的激酶絡合物的結合被識別，其導致Gl和G2階段細胞周期停滯，老年期間上調(diào)，以及它與增殖細胞核抗原的相互作用。HDAC抑制劑的研究表明，它們在細胞周期停滯、細胞分化、細胞凋亡和變異表型反轉中起重要作用。抑制劑曲古抑菌素A(TSA),例如，在G1和G2階段引起細胞周期停滯，恢復各種細胞系的變異表型，以及誘導弗羅德白血病細胞及其他的分化。已經(jīng)報道TSA(和辛二酰苯胺異羥肟酸SAHA)在小鼠中抑制細J包生長、i秀導終末分化和預防腫瘤形成(Finnin等，Nature,401:188-193,1999)。還報道曲古抑菌素A用于治療纖維變性，例如肝纖維化和肝硬化(Geerts等，歐洲專利申請EP0827742,1998年3月11日公開)。HDAC抑制劑的藥效基團由金屬-結合區(qū)域組成，其與HDACs的含鋅-活性位點、連接基區(qū)域和表面識別區(qū)域或封端區(qū)域相互作用，其在活性位點的邊緣上與殘基相互作用。還報道HDACs抑制劑誘導p21基因表達。由這些抑制劑所引起的p21基因的轉錄激活通過如下促進染色質重新塑造，接著在p21啟動子區(qū)域中的組蛋白H3和H4的乙?；21的這種激活以p53-獨立方式存在，因此HDAC抑制劑在含突變p53基因的細胞是有效的，其中突變p53基因是許多腫瘤的標志。此外，HDAC抑制劑可以具有間接活性，例如增大宿主免疫應答和抑制腫瘤血管生成，并因此可以抑制原發(fā)性腫瘤的生長和阻礙轉移(Mai等，MedicinalResearchReviews,25:261-309,2005)。鑒于上述，HDAC抑制劑在治療細胞增殖性疾病或病癥中，包括具有突變p53基因的腫瘤可能具有很大的潛力。2003年8月14日公開的專利申請EP1472216公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的雙環(huán)異羥肟酸鹽。2003年9月18日7^開的專利申請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378等公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代哌。秦基嘧啶基異羥肟酸，此外EP1485365公開了R306465。2003年10月9日公開的專利申請EP1492534公開了作為HDAC抑制劑的包含哌嗪鍵的氨基甲酸化合物。2003年10月23日公開的專利申請EP1495002公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代哌。泰基苯基苯曱酰胺化合物。2003年11月13日公開的專利申請EP1501508公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯曱酰胺。2004年l月29日公開的專利申請WO04/009536公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的在芳基和異羥肟酸鹽之間含烷基連接基的衍生物。2004年2月12日公開的專利申請EP15251997^開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的(雜)芳基烯基取代的雙環(huán)異鞋肟酸鹽。2004年6月24日公開的專利申請EP1572626公開了作為藥理學試劑的亞芳基-羧酸(2-氨基-苯基)-酰胺衍生物。2004年7月29日公開的專利申請EP1581484公開了具有抗炎和抗肺瘤活性的N-羥基-苯甲酰胺衍生物的衍生物。2004年7月29日^^開的專利申請EP1585735^A開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代芳基異羥肝酸鹽衍生物。2004年8月19日公開的專利申請EP1592667公開了作為藥理學試劑的單-?；疧-亞苯基二胺衍生物。2004年8月19日公開的專利申請EP15卯340公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的二氨基亞苯基衍生物。2004年8月26日公開的專利申請EP1592665z^開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯甲酰胺衍生物。2004年8月26日公開的專利申請WO04/072047公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的丐l"呆、苯并。米哇和萘并咪唑。2004年9月30日公開的專利申請EP1608628^A開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的與非芳族雜環(huán)體系連接的異羥肟酸鹽。2004年IO月14日公開的專利申請EP1613622公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的肝書f生物。2004年10月28日公開的專利申請EP1611088公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的異羥坊酸鹽衍生物。2005年3月31日公開的專利申請WO05/028447公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯并n米唑。2005年4月7日公開的專利申請WO05/030704和WO05/030705公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯曱酰胺。2005年5月6日乂>開的專利申請WO05/040101乂>開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的酰基脲連接的和磺?；暹B接的異羥肟酸鹽。同樣在2005年5月6日公開的專利申請WO05/040161公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的二芳基連接的異羥肟酸鹽。2005年8月18日/>開的專利申請WO05/075469z^開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的瘞唑基異輕肟酸和p塞二唑基異羥將酸。2005年9月22日公開的專利申請WO05/086898公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的雜五環(huán)異幾肟酸。2005年10月6日7>開的專利申請\￥005/0928997>開了作為組蛋白脫乙酰酶的烯基苯甲酰胺。本發(fā)明的化合物在結構、它們的藥理學活性和/或藥理學效力方面不同于現(xiàn)有技術。所解決的問題是提供具有高酶和細胞活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑，其具有增加的生物利用度和/或體內(nèi)效力。本發(fā)明的新化合物解決了上述問題。本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出極好的組蛋白脫乙酰酶抑制酶和細胞活性。它們具有大容量以激活p21基因。它們可能具有所希望的藥物動力學曲線和^f氐的P450酶親和性，其降4氐不利的藥物-藥物相互作用的風險，使其提供寬的安全范圍。本發(fā)明化合物的有利特點可能是代謝穩(wěn)定性、溶解性和/或p21誘導能力。本發(fā)明涉及式(I)的化合物其N-氧化物形式、藥學上可接受的加成鹽和立體化學異構形式，其中n是0或l以及當n是0時，那么是指直接鍵；m是0、l或2以及當n是0時，那么是指直接鍵；p是0或l以及當n是0時，那么是指直接鍵；每個X獨立地是N或CH;每個Y獨立地是O、NH、N-d-6烷基、CH或CH2，以及當Y是CH時,那么所述取代基與環(huán)結構的Y原子相連；W是羥基或式(a-l)的基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>R"是羥基或-NH2;R"是氫、噻吩基、呋喃基或苯基，并且每個噻吩基、呋喃基或苯基可以任選被鹵素、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、Q-6烷基、(二Cw烷基)氨基、d-6烷氧基、苯基d-6烷氧基、羥基d-6烷基、Cw烷氧基羰基、羥基羰基、Cw烷基羰基、多囟代d-6烷氧基、多卣代C"烷基、d-6烷基磺?；⒘u基羰基d-6烷基、Cw烷基羰基氨基、氨基磺?；被酋；鵆w烷基、異噁唑基、氨基羰基、苯基Cw烯基、苯基C3_6炔基或吡啶基C3-6炔基取代；R6、R7和RS每個獨立地是氫、-NH2、硝基、呋喃基、鹵素、Cw烷基、C^烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、d-6烷基羰基氨基、氨基羰基Cw烷基或-OC-CH2-RH;其中RH是氫、Cw烷基、羥基、氨基或Cw烷氧基；RZ是d—6烷基、Cw環(huán)烷基、CL6烷基氨基羰基或Cw烷氧基羰基；R3是氫、d-6烷基、C3—7環(huán)烷基、羥基Cw烷基、CL6烷氧基C"烷基、C^烷氧基羰基或d-6烷基氨基羰基；或112和113可以是橋連的(即形成環(huán)狀的環(huán)體系)，具有亞甲基、亞乙基或亞丙基橋連基；R4是氫、d—6烷基、陽C(=0)國C服H-S(=0)2陽N(CH3)2;^巾每個R"和R"獨立地是氫、氨基、d—6烷基或氨基C!-6烷基；和W是氫、羥基、氨基、卣素、C"烷基、多卣代C^烷基、C"烷氧基羰基、羥基羰基、C"烷基羰基氨基、d—6烷氧基或單-或二(Cw烷基)氨基。/人取4戈基上引入雙環(huán)體系的線表示該4建可以與雙環(huán)體系的任何合適的環(huán)原子相連。術語"組蛋白脫乙酰酶抑制劑"或"組蛋白脫乙酰酶的抑制劑"用來識別化合物，該化合物能夠與組蛋白脫乙酰酶相互作用并抑制它的活性，更特別地抑制它的酶活性。抑制組蛋白脫乙酰酶酶活性是指減少組蛋白脫乙酰酶從組蛋白中除去乙?；哪芰Α?yōu)選地，這種抑制是專一性的，即在抑制劑濃度低于產(chǎn)生某種其它的、無關的生物效應所需要的抑制劑的濃度時，該組蛋白脫乙酰酶抑制劑降低組蛋白脫乙酰酶從組蛋白中除去乙?；哪芰?。如在上述定義和下文中所使用，卣代通常是指氟、氯、溴和碘；d-6烷基是指具有l(wèi)-6個碳原子的直鏈和支鏈飽和烴基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、l-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、己基、2-曱基戊基等；C2—6烯基是指含有一個雙鍵以及具有2-6個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-曱基-2-丁烯基等；Cw炔基是指含有一個三鍵以及具有3-6個碳原子的直鏈和支鏈鏈烴基，例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；多卣代d—6烷基是指含有三個相同的或不同的鹵素取代基的C^6烷基，例如三氟甲基；以及C3—7環(huán)烷基包括具有3-6個碳的環(huán)烴基團，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)庚基等。藥學上可接受的加成鹽包括藥學上可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的堿加成鹽。在本文中以上所述的藥學上可接受的酸加成鹽是指包含治療活性的無毒酸加成鹽形式，其中式(I)的化合物能夠生成。具有堿性質的式(I)化合物通過用合適的酸處理所述堿形式，可以轉化成它們的藥學上可接受的酸加成鹽。合適的酸包括例如無才幾酸，例如氫囟酸，例如鹽酸或氫溴酸；石克酸；^肖酸；-岸酸等酸；或有才幾酸，例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、焦葡萄酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯>^黃酸、對曱苯-黃酸、環(huán)拉酸、水楊酸、對氨基水楊酸、樸酸等酸。具有酸性質的式(I)化合物通過用合適的有機或無機堿處理所述酸形式，可以轉化成它們的藥學上可接受的堿加成鹽。合適的堿鹽形式包括例如銨鹽，堿金屬和堿土金屬鹽，例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽等，與有機堿形成的鹽，例如千星(benzathine)、N-曱基-D-葡糖胺、哈胺鹽，以及與氨基酸例如精氨酸、賴氨酸等形成的鹽。術語"酸或堿加成鹽"還包括水合物和溶劑加成形式，其中式(I)的化合物能夠形成。這些形式的實例例如是水合物、醇化物等。在此所使用的術語"式(I)化合物的立體化學異構形式"是指由相同的原子、通過相同的連接順序構成的、但具有不同的三維結構的所有可能的化合物，其是不可互換的，其中式(I)的化合物可能具有。除非另作說明或表明，化合物的化學名稱包括所述化合物可能具有的所有可能的立體化學異構形式的混合物。所述混合物可能含有所有所述化合物基本分子結構的非對映異構體和/或對映體。式(I)化合物的所有立體化學異構形式，包括純的形式或彼此的混合物，擬包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。式(I)化合物的N-氧化物形式是指包含式(I)化合物的那些，其中一個或數(shù)個氮原子被氧化成所謂的N-氧化物，特別是其中哌啶-、哌溱或噠溱基-氮中的一個或多個被N-氧化的那些N-氧化物。式(I)的一些化合物還可以以它們的互變異構形式存在。雖然沒有明確地表示在上面式中的這些形式擬包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當在下文中使用時，術語"式(I)的化合物"是指還包括藥學上可接受的加成鹽以及所有立體異構形式。在此所使用的術語"組蛋白脫乙酰酶"和"HDAC"擬指任何一族的酶，其從組蛋白N-末端處的賴氨酸殘基的s-氨基中除去乙?；３潜疚闹辛碛姓f明，術語"組蛋白"是指任何組蛋白蛋白，包括來自任何物種的H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白或基因產(chǎn)物包括但不局限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC國6、HDAC國7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC國IO和HDAC-11。所述的組蛋白脫乙酰酶還可以源自原生動物或真菌來源。第一組感興趣的化合物由式(I)的那些化合物組成，其中應用一個或多個下列限制條件a)n是l;b)p是0;c)每個X是N;d)每個Y是CH;e)W是羥基；f)R2是Cw烷基；g)R和RS可以是用亞甲基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連的；h)113是氫;i)R4是d-6烷基；和j)115是氫。第二組感興趣的化合物由式(I)的那些化合物組成，其中應用一個或多個下列限制條件a)n是l;b)p是O;c)每個Y是CH;d)R"是氬;e)R6、R和RS每個獨立地是氫，f)R2是d-6烷基；g)112和113可以是用亞甲基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連的；h)R3是氬；i)R4是d-6烷基；和j)R5是氫。第三組感興趣的化合物由式(I)的那些化合物或第一組和第二組的那些化合物組成，其中應用一個或多個下列限制條件a)n是O;b)每個Y獨立地是O、CH或CH2;c)W是羥基；和d)RS是C3.7環(huán)烷基、d-6烷氧基羰基或d-6烷基氨基羰基。四組感興趣的4t合物由式(I)的那些化合物組成，其中應用一個或多個下列限制條件a)n是l;b)m是l或2;c)p是O;d)每個X是N;e)每個Y是CH;f)112和113是用亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連的；g)R4是d-6烷基；h)115是氫。一組優(yōu)選的化合物由式(I)的那些化合物組成，其中n是l;p是0;每個X是N;每個Y是CH;W是羥基；112是(^-6烷基和R3是氫或者R2和R3可以與亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基一起橋連；R"是d-6烷基；以及115是氫。另一組優(yōu)選的化合物由式(I)的那些化合物組成，其中n是1;p是0;每個Y是CH;111()是氳；R6、R7和118每個獨立地是氫，！^是d-6烷基以及R3是氫或者R2和R3可以與亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基一起橋連；W是Cw烷基；以及W是氫。一組更優(yōu)選的化合物由式(I)的那些化合物組成，其中n是l;m是l或2;p是0;每個X是N;每個Y是CH;R"和R"與亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基一起橋連；R"是d-6烷基；以及115是氬。最優(yōu)選的化合物是化合物No.2和化合物No.3。o.0.84C2HF302化合物No2.1.38C2HF302化合物No.3式(I)的化合物和它們的藥學上可接受的鹽和N-氧化物和立體化學異構形式可以以常規(guī)方式制備。起始物質和一些中間體是已知的化合物并且是市場上可買到的，或者可以根據(jù)通常本領域已知的常規(guī)反應步驟或如專利申請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述的反應步驟制備。一些制備方法將在下文中更詳細地進行描述。獲得最終式(I)化合物的其它方法在實施例中描述。式(I)的異羥坊酸，其中W是鞋基，在此稱為式(I-a)的化合物，可以通過式(II)的中間體與合適的酸例如三氟乙酸反應制備。所述反應在合適的溶劑例如曱醇或二氯曱烷中進行。式(I)的化合物，其中W是式(a-l)的基團以及119是-,2,在此稱為式(I-b)的化合物，可以通過式(III)的中間體其中M代表氫或鈉或鋰或堿金屬陽離子如鈉，在此稱為式(III-a)的化合物，與式(IV)的中間體在合適的試劑例如苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷基)構六氟磷酸鹽(PyBOP)存在下反應進4亍制備。該反應可以在石咸如三乙胺存在下、在合適的溶劑如二氯甲烷和四氫呋喃的混合物中進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(I-b)的化合物還可以通過式(V)的中間體與合適的酸例如三氟乙酸反應制備。所述反應在合適的溶劑例如曱醇或二氯曱烷中進行。式(I)的化合物，其中W是式(a-l)的基團以及W是羥基，在此稱為式(I-c)的化合物，可以通過式(VI)的中間體與氟化四丁基銨在合適的溶劑如四氫呋喃中反應制備。在式(VI)的中間體中的TBDMS是指叔丁基(二甲基)硅烷基。式(II)的中間體可以通過式(III)的中間體與式(VII)的中間體在合適的試劑如N'-(乙基羰基亞氨基)"^,^[-二甲基-1,3-丙二胺，一氬氯化物(EDC)和l-羥基-lH-苯并三唑(HOBT)存在下反應制備。該反應可以在堿如三乙胺存在下、在合適的溶劑如二氯甲烷和四氫吹喃的混合物中進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式(V)的中間體可以通過式(III)的中間體與式(VIII)的合適的叔丁氧羰基(Boc)保護的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二甲氨基)锜六氟磷酸鹽(BOP)和氫化鈉存在下反應制備。所述反應可以在合適的溶劑如p比咬中進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式(VI)的中間體可以通過式(III)的中間體與式(IX)的合適的叔丁基(二曱基)硅烷基(TBDMS)保護的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二曱氨基)錛六氟磷酸鹽(BOP)和三乙胺存在下反應制備。所述反應在合適的溶劑如N,N-二曱基甲酰胺中進行。式(III)的中間體可以通過式(X)的中間體與合適的酸溶液如鹽酸或》咸溶液如氫氧化鋰或氬氧化鈉在合適的溶劑如醇，例如乙醇或丙醇或二嗯烷中反應制備。式(X)的中間體其中RS除氪以外如上所定義，可以通過相應的式(X)的化合物其中R3是氫與合適的用來引入合適的W基團的功能性試劑反應制備。例如，當RS是d—6烷基、C3.7環(huán)烷基、羥基d—6烷基或d-6烷氧基d-6烷基時，那么該試劑是合適的烷基化試劑例如合適的烷基卣化物，如氯化物，該反應在石咸性條件如l吏用三乙胺下在合適的溶劑如二曱基甲酰胺中進行。當RS是Q-6烷氧基羰基或CL6烷基氨基羰基時，那么該試劑是合適的酰化劑例如合適的?；u，例如氯化物，該反應在石咸性條件如使用三乙胺下在合適的溶劑如二氯甲烷中進行。式(X)的中間體其中RS是氳，在此稱為式(X-a)的中間體，可以通過式(XI)的中間體與式(XII)的中間體在合適的試劑如NaBH(OAc)3和Ti(OEt)4存在下在合適的溶劑如二氯乙烷或曱醇中反應制備?；蛘撸摲磻梢允褂肂H3CN在酸性條件例如使用乙酸下在合適的溶劑如曱醇中或在氬化條件使用鈀-碳催化劑下在合適的溶劑如甲醇中進行。o(ch2)n=N廠|、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>式(X)的中間體其中n是1，112和113是橋連的，虛線表示亞甲基、亞乙基或亞丙基橋連基和n是1,在此稱為式(X-b)的中間體，可以通4存在下在合適的溶劑如二氯乙烷中反應制備?；蛘?，該反應可以使用BH3CN在酸性條件例如使用乙酸下在合適的溶劑如甲醇中或在氫化條件使用鈀-碳催化劑下在合適的溶劑如甲醇中進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>本發(fā)明還涉及式(II)、(III)、(X)、(X-a)和(X-b)的中間體，在此共同稱為式(A)的化合物，其中Q是Cw烷氧羰基、羥基羰基或四氬吡喃氧基氨基羰基，以及n、m、p、X、Y、Z、R2、R3、R4和115如式(1)所定義，及其N-氧化物形式、藥學上可接受的加成鹽和立體化學異構體形式。對于上述中間體，可以根據(jù)對式(I)化合物所定義的組，定義感興趣的、優(yōu)選的、更優(yōu)選的和最優(yōu)選的4匕合物的組。式(I)的化合物和一些中間體在它們的結構中可以具有至少一個立體異構中心。此立體異構中心可以以R或S構型存在。合物，其可以根據(jù)本領域已知的拆分方法相互分開。通過與合適的手性酸反應，式(I)的外消旋化合物可以轉化為相應的非對映體鹽形式。所述非對映體鹽形式隨后例如通過選擇性或分步結晶分離，該對映異構體通過堿從其中釋放。分離式(I)化合物的對映異構體形式的另一方法包括使用手性固定相的液相色譜。所述純的立體化學異構體形式還可以源自于合適的起始物質的相應純的立體化學異構形式，條件是該反應立體異構專一性地進行。優(yōu)選地，如果需要專一性的立體異構體，所述化合物將通過立體專一性制備方法進行合成。這些方法將有利地使用對映體純的起始物質。式(I)的化合物、其藥學上可接受的酸加成鹽和立體異構形式具有有價值的藥理學性質，因為它們具有組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制作用。通過給予有效量的本發(fā)明化合物，本發(fā)明提供一種抑制細胞(包括變異細胞)異常生長的方法。細胞異常生長是指細胞生長與正常的調(diào)節(jié)機制無關(例如接觸性抑制喪失)。這包括直接引起癌細胞生長停滯、終末分化和/或調(diào)亡以及間接抑制腫瘤新血管形成的腫瘤生長抑制。本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤生長的方法，通過給予有效量的本發(fā)明的化合物給需要這種治療的受試者，例如哺乳動物(更特別是人)。特別地，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤生長的方法，通過給予有效量的本發(fā)明的化合物?？梢员灰种频碾狭龅膶嵗?，但不局限于，肺癌(例如腺癌和包括非小細胞肺癌)，胰腺癌(例如胰腺癌癥如外分泌胰腺癌癥)，結腸癌(例如結腸癌，例如結腸腺癌和結腸腺瘤)，前列腺癌包括晚期疾病，淋巴系統(tǒng)的造血胂瘤(例如急性淋巴細胞性白血病，B細胞淋巴瘤，伯基特氏胂瘤)，骨髓性白血病(例如急性髓性白血病(AML))，甲狀腺濾泡狀癌，骨髓發(fā)育異常綜合征(MDS),間質來源的胂瘤(例如纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)，黑色素瘤，畸胎癌，成神經(jīng)細胞瘤，膠質瘤，皮膚的良性腫瘤(例如角化棘皮瘤)，乳腺癌(例如晚期乳腺癌)，腎癌，卵巢癌，膀胱癌和表皮癌。本發(fā)明的化合物可以用于其它治療目的，例如a)通過在對治療癌癥的腫瘤進行輻射之前、期間或之后給予本發(fā)明的化合物，寧:化;改射治療的腫瘤；b)治療關節(jié)病和骨病例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、少年關節(jié)炎、痛風、多關節(jié)炎、牛皮辮關節(jié)炎、強直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；c)抑制平滑肌細胞增殖包括血管增殖性疾病、動脈粥樣硬化和再狹窄；d)治療炎性病癥和皮膚病癥例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病、過敏性鼻炎、移植物抗宿主病、結膜炎、哮喘、ARDS、貝切特氏病、移植排斥、蕁麻滲、過敏性皮炎、局限性脫發(fā)、硬皮病、皮滲、濕滲、皮肌炎、粉刺、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、川畸(氏)病、多發(fā)性硬化、肺氣肝、嚢性纖維化和慢性支氣管炎；e)治療子宮內(nèi)膜異位、子宮平滑肌瘤、功能障礙性子宮出血和子宮內(nèi)膜增生；f)治療眼睛血管形成，包括影響視網(wǎng)膜與脈絡膜血管的血管病變；g)治療心功能障礙；h)抑制免疫抑制性病癥，如治療HIV感染；i)治療腎功能障礙；j)抑制內(nèi)分泌病變；k)抑制生糖作用異常的功能障礙；l)治療神經(jīng)病變，例如帕金森氏癥或造成^人知異常的神經(jīng)病變，例如阿茲海默氏癥或與聚谷酰胺病變相關的神經(jīng)性疾??；m)治療精神錯亂例如精神分裂癥、雙相性精神障礙、抑郁癥、焦慮和并青神?。籲)抑制神經(jīng)肌肉病變，例如肌萎縮性側硬化；o)治療脊柱月幾肉萎縮；p)治療其它通過加強基因表達而可治療的其它病變；q)加強基因療法；r)抑制脂肪形成；s)治療寄生蟲病例如瘧疾。因此，本發(fā)明公開了用作藥品的式(I)化合物，以及式(I)的這些化合物在制備用于治療一種或多種上述病癥的藥物的用途。式(I)的化合物、其藥學上可接受的酸加成鹽和立體異構形式可以具有有價值的診斷性質，因為它們在包括沖企測或測定在標記化合物和HDAC間形成絡合物的生物樣品中可用于才企測或識別HDAC。該檢測或識別法可使用由標記試劑如方文射性同位素、酶、熒光物質、發(fā)光物質等等標記的化合物。放射性同位素的實例包括1251、1311、3H與"C。酶通常通過適當?shù)孜锏墓曹椂蓹z測，其進而催化可檢測的反應。其實例包括例如p-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化酶與蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選辣根過氧化酶。發(fā)光物質包括例如魯米諾、魯米諾衍生物、熒光素、多管水母素(aequorin)與熒光素酶。生物才羊品可定義為體組織或體液。體液的實例為腦脊ft液、血液、血漿、血清、尿液、痰、唾液等等。就其實用的藥物性質而言，本發(fā)明化合物可配制成用于給藥目的的不同的藥物形式。為了制備本發(fā)明的藥物組合物，將作為活性成分的有效量的堿或酸加成鹽型特定化合物與藥學上可接受的載體密切混合，該載體可呈多種不同形式，取決于所需給藥制劑型式。這些藥物組合物最好呈適合優(yōu)選用于經(jīng)口、直腸、經(jīng)皮膚給藥或胃腸外注射用的單位劑型。例如，制備口服劑型組合物時，可使用任何常用的藥物介質，如在口服液體制劑，如懸浮液、糖漿、酏劑和溶液的情況中可^f吏用例如水、二醇、油類、醇類等等；或在制備粉劑、丸劑、膠嚢和片劑的情況中可使用固態(tài)載體如淀粉、糖類、高嶺土、潤滑劑、結合劑、崩解劑等等。由于片劑與膠嚢方便給藥，因此代表最有利的口服單位劑型，在這種情況下當然使用固態(tài)藥物載體。對于胃腸外組合物，載體通常包括無菌水，至少占絕大部分，但也可包含其它成份，例如有助于溶解度。例如，可制備可注射液，其中載體包括鹽水溶液、葡萄糖溶液或鹽水與葡萄糖溶液的混合物。也可制備注射用懸浮液，在這種情況下可使用適當液態(tài)載體、懸浮劑等等。在適合經(jīng)皮膚給藥的組合物中，載體任選包含滲透加強劑及/或合適的濕化劑，任選與任何性質的少量合適添加劑組合，該添加劑不對皮膚引起顯著的不良效應。這些添加劑可促進給藥至皮膚及/或可能有助于制備所需組合物。這些組合物可依多種方法給藥，例如作為透皮式貼布、滴劑或軟膏。特別有利的是以方便給藥且劑量均一的單位劑型配制上述藥物組合物。本說明書與權利要求中所使用的單位劑型指物理性分離的適合作為單一劑量的單位，各單位包含經(jīng)計算可產(chǎn)生所需治療效果的預定量活性成分，與所需的藥物載體組合。這些單位劑型實例為片劑(包括有劃痕或有包衣的片劑)、膠嚢、丸劑、散劑包、扁嚢片、注射用溶液或懸浮液、茶匙劑、湯匙劑等等，及其離散多重劑型。本領域技術人員很容易由下文出示的試驗結果決定有效量。通常，考慮治療有效量為每公斤體重0.005亳克至100毫克，尤其是每公斤體重0.005毫克至10毫克。可以在一天內(nèi)以適當時間間隔將所需劑量分成2、3、4或更多個亞劑量給藥。該小劑量可配制成單位劑型，例如每單位劑型包含0.5至500毫克，尤其是10至500毫克活性成分。本發(fā)明另一方面提出一種HDAC-抑制劑與另一種抗癌劑的組合，尤其用于藥物，更具體地，用于治療癌癥或相關疾病。治療上述病癥時，本發(fā)明化合物可以有利地用于與一種或多種其它藥劑組合，更尤其是，與其它抗癌劑組合?？拱﹦┑膶嵗秊?柏配^立^:合物例如順柏、卡輛或奧沙利4白(oxalyplatin);-紫杉烷化合物例如紫杉醇或紫杉萜；-拓樸異構酶I抑制劑例如喜樹堿化合物例如伊立替康或托泊替康；-拓樸異構酶II抑制劑例如抗腫瘤鬼臼霉素衍生物例如依托泊苷或替尼泊苷；-抗肺瘤長春花生物堿例如長春花堿、長春新堿或長春瑞濱；-抗胂瘤核苦衍生物例如5-氟尿嘧咬、吉西他濱或卡培他濱；畫烷基化試劑例如氮芥或亞硝基脲例如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、亞硝脲氮芥或環(huán)己亞硝脲；-抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素衍生物例如柔紅霉素、多柔比星、伊達比星或米托蒽醌；-HER2抗體例如曲妥單抗；-雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟維司群(faslodex)或雷洛昔芬；-芳香酶抑制劑例如依西美坦、阿那曲唑、來曲唑和Y犬氯唑；-分化劑例如類視色素、維生素D和維曱酸代謝阻滯劑(RAMBA)例如異維甲酸；-DNA甲基轉移酶抑制劑例如氮胞苷；-激酶抑制劑例如flavoperidol、伊馬替尼曱磺酸酯或吉非替尼；-法尼基轉移酶抑制劑；-其它HDAC抑制劑；國泛激素-蛋白酶體途徑抑制劑例如Velcade;或-Yondelis。在此使用的術語"鈿配位化合物"表示提供離子形式鉑的任何胂瘤細胞生長抑制鉑配位化合物。術語"紫杉烷化合物，，表示具有紫杉烷環(huán)體系的一類化合物，并且與某些物種的紫杉(Taxus)樹的提取物相關或來源于其中。術語"拓樸異構酶抑制劑"用來表示在真核細胞中能夠改變DNA拓樸結構的酶。它們對重要的細胞功能和細胞增殖是關鍵的。在真核細胞中存在兩種類型的拓樸異構酶，即類型I和類型II。拓樸異構酶I是約100,000分子量的單體酶。該酶結合DNA,引進一個暫時性單鏈裂口，打開雙螺旋(或使之解開)，然后先使裂口封合后，再自DAN股上解離。拓樸異構酶II的作用機理類似，其涉及誘導DNA股開裂或形成游離基。術語"喜樹堿化合物"用來表示與母體喜樹堿化合物相關或由其所衍生的化合物，它是書f生自中國樹種Camptothecinacuminata及印度樹種Nothapodytesfoetida的不可溶于7Jc的才直物石咸。術語"鬼臼毒素化合物，，用來表示與自剝度比爾謨(mandrake)植物萃取出的母體鬼臼毒素化合物相關或由其所衍生的化合物。術語"抗胂瘤長春花石咸"用來表示與來自長春花(Vincarosea)植物的萃取物相關或由其所衍生的化合物。術語"烷化劑"包括一類共同特點為在生理條件下有能力提供烷基給具有生物活性的大分子如DNA的化學劑。對于大多數(shù)較重要試劑如氮芥及亞硝基脲，活性烷化部分在體內(nèi)在復雜的降解反應(其中有些為酶反應)之后產(chǎn)生。烷化劑的最重要藥物作用為特別在DNA合成與細胞分裂過程中干擾與細胞增殖相關的基本機理。烷化劑在快速增殖組織中干擾DNA功能與整體性的能力提供了其醫(yī)療用途及其多種毒性的基礎。術語"抗肺瘤蒽環(huán)素衍生物"包括得自真菌波賽鏈球菌(Strep,peuticusvar.caesius)的抗生素及其書亍生物，其特征在于具有一個四環(huán)素環(huán)結構，利用糖苷鍵連接一種罕見糖道諾糖胺。已知原發(fā)性乳癌瘤中人類上皮生長因子受體2蛋白質(HER2)的擴增作用與某些患者的臨床預后結果不佳有相關性。曲妥單抗為一種高度純化的重組體DNA-衍生的擬人化單克隆IgGl-K抗體，其與HER2受體的細胞外區(qū)域具有高的親和性和專一性。許多乳腺癌有雌激素受體，且這些腫瘤的生長可受到雌激素刺激。術語"雌激素受體拮抗劑"和"選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑"用來表示與雌激素受體(ER)結合的雌二醇的竟爭性抑制劑。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑與ER結合時，會誘發(fā)受體的三維空間形狀改變，調(diào)節(jié)其與DNA上雌激素反應元素(ERE)的結合。在停經(jīng)后婦女中，循環(huán)雌激素的主要來源為腎上腺與卵巢雄激素(雄烯二醇與睪固酮)經(jīng)由周邊組織中芳香酶轉化成雌激素(雌固酮與雌二醇)。經(jīng)由芳香酶抑制或去活化作用消耗雌激素可有效且選擇性治療某些患有與激素相關的乳癌的停經(jīng)后患者。在此使用的術語"抗雌激素劑"不僅包括雌激素受體拮抗劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，而且包括如上所述的芳香酶抑制劑。術語"分化劑"包括可依不同方式抑制細胞增殖及誘發(fā)分化的化合物。已知維生素D和類視黃素在調(diào)節(jié)多種正常和惡性細胞型態(tài)的生長與分化上扮演重要角色。視黃酸代謝作用阻斷劑(RAMBA's)通過抑制細胞色素P450-所介導的視黃酸分解代謝作用而提高內(nèi)因性視黃酸含量。DNA的甲基化變化為人體贅生瘤最常見的異?，F(xiàn)象。特定基因的發(fā)動子中的過度甲基化通常與所涉及的基因失活有關。術語"DNA甲基轉化酶抑制劑"用來表示通過DNA甲基轉化酶的藥物抑制作用而發(fā)揮作用及使腫瘤抑制基因表達再活化的化合物。術語"激酶抑制劑"包括涉及細胞循環(huán)發(fā)展及計劃性細胞死亡(細胞凋亡)的激酶的強力抑制劑。術語"法呢基轉化酶抑制劑"用來表示設計用于防止Ras及其它細胞內(nèi)蛋白質的法呢基化反應的化合物。已知其可影響惡性細胞增殖與存活。術語"其它HDAC抑制劑"包括但不局限于-羧酸酯例如丁酸酯、肉桂酸、4-苯基丁酸酯或丙戊酸；畫異羥肟酸例如辛二?；桨樊惲u肟酸(SAHA),含有哌嗪的SAHA類似物，二芳基異羥肟酸鹽A-161906及其吵唑基醚-,四氫吡啶-和四氫萘酮-類似物，雙環(huán)芳基-N-羥基羧酰胺，pyroxamide，CG-1521，PXD-101,磺酰胺異羥lt酸，LAQ-824,LBH-589，曲古抑菌素A(TSA)，oxamflatin,scriptaid，與scriptaid相關的三環(huán)分子，間羧基肉桂酸二異羥肟酸(CBHA),CBHA-類異羥肟酸，trapoxin-異羥肟酸類似物，CRA-024781,R306465和相關的苯甲?；?和雜芳基-異羥肟酸，氨基辛二酸酯和丙二?；０罚徽b環(huán);j犬四肽例》口trapoxin，apidicin,縮酚酸肽，spiruchostatin有關的化合物，RedFK-228,含巰基環(huán)狀四肽(SCOPs)，含異羥肟酸環(huán)狀四肽(CHAPs),TAN-174s和azumamides;-苯甲酰胺類例如MS-275或CI-994,或-depudecin。術語"泛激素-蛋白酶體途徑抑制劑"用來識別化合物，所述化合物在蛋白酶體包括細胞周期調(diào)節(jié)蛋白中抑制細胞蛋白的目標破壞。對于癌癥的治療，本發(fā)明化合物可以連同輻射一起給予如上所述的患者。輻射是指電離輻射，特別是指Y輻射，尤其是由直線加速器或現(xiàn)在通用的放射性核素發(fā)射的那種。由放射性核素進行的腫瘤輻射可以是外部的或內(nèi)部的。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗癌劑和本發(fā)明的HDAC抑制劑的組合。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合在藥物治療中的用途，例如用于抑制腫瘤細力包生長。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合用于抑制腫瘤細胞生長。本發(fā)明還涉及在人類受試者中抑制腫瘤細胞生長的方法，其包括給予該受試者有效量的本發(fā)明的組合。本發(fā)明還提供抑制細胞(包括變異細胞)異常生長的方法，通過給予有效量的本發(fā)明的組合。其它藥物試劑和HDAC抑制劑可以同時(例如單獨或整體組合物)或以任何順序依次給藥。在后者情況中，該兩種化合物將在一個時間段內(nèi)和以足以確保達到有利的或協(xié)同作用的數(shù)量和方式給藥?？梢岳斫?，優(yōu)選的給藥方法和順序以及該組合的每一組分的各個劑量和方案將取決于所給予的具體的其它藥物試劑和HDAC抑制劑、它們的給藥途徑、所治療的具體腫瘤和所治療的具體宿主。給藥的最佳方法和順序以及劑量數(shù)量和方案可以容易地由本領域技術人員使用常規(guī)方法并鑒于在此所述的信息組來確定。鉑配位化合物的有利給藥劑量為每平方米體表面積1至500毫克(mg/m2),例如50至400mg/m2，尤其是每個療程的順鉑劑量為約75mg/m2，卡鉑劑量為約300mg/m2。紫杉烷化合物的有利給藥劑量為每平方米體表面積50至400毫克(mg/m2),例如75至250mg/m2,尤其是每個療程的紫杉醇劑量為約175至250mg/m2,及紫杉辟的劑量為約75至150mg/m2。喜樹堿化合物的有利給藥劑量為每平方米體表面積0.1至400毫克(mg/m2),例如1至300mg/m2,尤其是每個療程的依立替康劑量為約100至350mg/m2,托泊替康劑量為約1至2mg/m2?？鼓[瘤鬼臼毒素衍生物的有利給藥劑量為每平方米體表面積30至300毫克(mg/m2),例如50至250mg/m2,尤其是每個療程的依托泊甙劑量為約35至100mg/m2，登尼泊甙劑量為約50至250mg/m2。抗腫瘤長春花堿的有利給藥劑量為每平方米體表面積2至30毫克(mg/m2),尤其是每個療程的長春花堿劑量為約3至12mg/m2,長春新石咸劑量為約1至2mg/m2,長春瑞賓劑量為約10至30mg/m2?？闺狭龊讼阊苌锏挠欣o藥劑量為每平方米體表面積200至2500毫克(mg/m2),例如700至1500mg/m2,尤其是每個療程的5-FU劑量為200至500mg/m2,吉西他濱劑量為約800至1200mg/m2，卡培他濱劑量為約1000至2500mg/m2。烷化劑，如氮芥或亞硝基脲的有利給藥劑量為每平方米體表面積100至500毫克(mg/m2)，例如120至200mg/m2,尤其是每個療程的環(huán)石粦酰胺劑量為約100至500mg/m2,苯丁酸氮芥劑量為約0.1至0.2mg/m2,卡莫司汀劑量為約150至200mg/m2,洛莫司汀劑量為約100至150mg/m2?？鼓[瘤蒽環(huán)素衍生物的有利給藥劑量為每平方米體表面積10至75毫克(mg/m2),例如15至60mg/m2,尤其是每個療程的柔紅霉素劑量為約40至75mg/m2，阿霉素劑量為約25至45mg/m2,伊達比星劑量為約10至15mg/m2。曲妥單抗的有利給藥劑量為每平方米體表面積1至5毫克(mg/m2),尤其是每個療程劑量為2至4mg/m2?？勾萍に貏┑挠欣o藥劑量為每天約1至100毫克，依特定藥劑及所治療病癥而定。它莫西芬的有利口服劑量為一天服用兩次5至50毫克，優(yōu)選為10至20毫克，持續(xù)治療一段足夠時間，以達成及維持治療效果。托瑞米芬的有利口服劑量為一天服用一次約60毫克，持續(xù)治療一段足夠時間，以達成及維持治療效果。阿納托唑的有利口服劑量為一天服用一次約1毫克。屈洛昔芬的有利口服劑量為一天服用一次約20-100毫克。雷洛昔芬的有利口服劑量為一天服用一次約60毫克。依西美坦的有利口服劑量為一天服用一次約25毫克。這些劑量可以每個療程給藥例如一次、兩次或多次，可以每7、14、21或28天重復一次。就其有用的藥物性質而言，根據(jù)本發(fā)明的組合中的組分(即其它藥劑與HDAC抑制劑)可配制成各種不同給藥目的的藥物型式。各組分可于分開的藥物組合物中分開配制，或于同時含有兩種組分的單一藥物組合物中配制。因此，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含另一個藥劑和HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體。本發(fā)明還涉及一種以藥物組合物形式的本發(fā)明的組合，其包含抗癌劑和本發(fā)明的HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體。組合物中的用途。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)品，其含有作為第一活性成分的本發(fā)明的HDAC抑制劑以及作為第二活性成分的抗癌劑，作為混合制劑用于同時、單獨或依次用途用于治療患有癌癥的患者。實驗部分下列實施例舉例說明本發(fā)明。在下文中，"EDC，，定義為N'-(乙基羰基亞氨基)^,]^二曱基-1,3-丙二胺，一氳氯化物，"DCM"定義為二氯甲烷，"DMSO"定義為二甲亞砜，"EtOAc，，定義為乙酸乙酯，"EtOH，，定義為乙醇，"HOBt，，定義為l-羥基-lH-苯并三唑，"MeOH"定義為甲醇，"TFA，，定義為三氟乙酸以及"THF，，定義為四氬呋喃。A.中間體化合物的制備實施例Al.^)...±.間..體.丄的.制.務在室溫下，在N2流中，將乙醇鈥(IV)(0.017mol)加入到2-[4-(氨基曱基)-l-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0083mol)和l-(I畫曱基國IH-吲咮-3-基)-乙酮(O.Olmol)在l，2-二氯-乙烷(150ml)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌4天。加入三(乙酸根合-a-O)硼氫化物(l-)鈉(0.017mol)。將混合物在室溫下攪拌3天，倒入到石友酸鉀10%中。加入DCM。將混合物在室溫下攪拌1小時，然后在石圭藻土(celite)中過濾。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(5g)用硅膠柱色譜提純(15-40|um)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH97/3/1)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到1.9g(54。/。)中間體l。D...i且體....的.制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>將中間體1(0.0045mol)和氬氧化鈉(0.018mol)在EtOH(190ml)中的混合物攪拌并回流4小時，然后冷卻至室溫，蒸發(fā)至干。將殘余物吸收到乙醚中。濾出沉淀并千燥，得到1.6g(86%)中間體2，熔點>260°C。.P.丄..中..間..體.l.的.制.務<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>在N2流中，將EDC(0.0117mol)和HOBT(0.0117mol)加入到中間體2(0.0039mol)在THF(160ml)和DCM(160ml)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌30分鐘。加入O-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0117mol)。將混合物在室溫下攪拌3天，倒入到水水中，接著用DCM萃取。分離有才幾層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(3g)用硅月交柱色譜提純(15-40|um)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH93/7/0.5)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到1.55g(82%)中間體3。實施例A2.^)....中..亂體丄的.制.務<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>在N2流中，將氰基硼氫化鈉(0.0034mol)和乙酸(0.037mol)在室溫下加入到中間體8(0.0038mol)和1-甲基-3-(3-吡咯烷基)-1H-。引咮(0.0034mol)在MeOH(70ml)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌48小時，倒入到碳酸鉀10%中，接著用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(L6g)用硅膠柱色譜提純(5|um)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.05-94/6/0.3)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到0.38g(26。/。)中間體4。D...中..間.體.l.的制..備.將中間體4(0.0096mol)和氳氧化鈉(0.038mol)在EtOH(450ml)中的混合物攪拌并回流4小時，然后冷卻至室溫并吸收到乙醚中。濾出沉淀，干燥，得到3.8g(900/。)中間體5，熔點〉260。C。丄.中..亂體.々..的.制.務在N2流中，在室溫下，將EDC(0.0172mol)和HOBT(0.0172mol)加入到中間體5(0.0086mol)在THF(400ml)和DCM(400ml)中的溶液中。將混合物攪拌45分鐘。加入O-(四氬-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0172mol)。將混合物在室溫下攪拌24小時，倒入到冰水中，并用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(6.8g)用硅膠柱色譜提純(15-40|um)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.1)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到3g(68。/。)中間體6，熔點8(TC。實施例A3i)....中.河體....的.制.備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>在l(TC下，在N2流中，將2-(甲基磺?；?-5-嘧啶甲酸乙酯(0.094mol)在乙腈(40ml)中的溶液加入到4-哌啶曱醇(0.086mol)和碳酸鉀(0.172mol)在乙腈(200ml)中的懸浮液中。將混合物恢復至室溫，然后攪拌4小時，倒入到水中并用EtOAc萃取。分離有機層，干燥(MgS04)，過濾，并蒸除溶劑。殘余物(23g)用CH3CN/乙醚結晶。將沉淀濾出并干燥，得到7.8g(340/。)中間體7。殘余物用硅膠柱色譜提純(20-45|dm)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.1)。收集純的餾分，蒸除溶劑，得到4.6g(200/())中間體7，熔點129。C。t丄.t.間.體.l.的.制..備.O在畫78。C,在N2流中，將DMSO(0.127mol)加入到草酰氯(0.061mol)在DCM(110ml)中的溶液中。將混合物攪拌15分鐘。加入中間體7(0.051mol)在DCM(200ml)中的溶液?；旌衔镌?78。C攪拌1.5小時。滴加三乙胺(0.26mol)。將混合物在-78。C攪拌15分鐘，然后冷卻至室溫2.5小時。加入水?；旌衔镉肈CM萃取。分離有機層，干燥(MgSOj,過濾，并蒸除溶劑。殘余物(14g)用硅膠柱色譜提純(20-45fim)(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc70/30)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到7.6g(57%)中間體8。.Q.)....中.N.體.義的.勉務O在N2流中，將乙醇鈦(IV)(0.0019mol)在室溫下加入到中間體8(0.0014mol)和l-曱基國3畫(3-哌啶基)-IH國巧I哚(0.0012mol)在1,2-二氯-乙烷(25ml)中的溶液中。將混合物在60。C下攪拌24小時，然后冷卻至5°C。在N2流中，加入三(乙酸根合-a-O)硼氫化(l-)鈉(0.0036mol)。將混合物在室溫下4覺拌48小時，倒入到^友酸鉀10°/。中。加入DCM。將混合物在硅藻土上過濾。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(1g)用硅膠柱色譜提純(0.15-40pm)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.1)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到0.36g(44%)中間體9。.H.i.間.體丄Q..的.制.務將中間體9(0.0008mol)和氬氧化鈉(0.0032mol)在EtOH(40ml)中的混合物攪拌并回流4.5小時，然后冷卻至室溫，蒸發(fā)至干。將殘余物吸收到乙醚中。將沉淀濾出并干燥，得到0.36g(100%)中間體IO,熔點〉260。C。.l..中..亂體j丄.的.制.務.在N2流中，在室溫下，將EDC(0.0024mol)和HOBT(0.0024mol)加入到中間體10(0.0008mol)在THF(40ml)和DCM(40ml)中的溶液中。將混合物攪拌15分鐘。加入O-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0024mol)。將混合物在室溫下攪拌4天，倒入到水中，接著用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgSOj,過濾，并蒸除溶劑。殘余物(0.49g)用kromasil柱色"i普提純(5)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH98/2/0.2-93/7/0.7)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到0.26g(61%)中間體11。實施例A4"...中..間..體.丄...的.制.務在N2流中，將乙醇，鈦(4+)鹽(0.0172mol)在室溫下加入到中間體8(0.0104mol)和l-甲基誦3國(3-吡咯烷基)-IH誦舊(0.0115mol)在1,2-二氯乙烷(50ml)中的溶液中?；旌衔镌?0。C下攪拌3小時，然后在室溫下攪拌過夜。分批加入三(乙酸根合-ot-O)硼氬化(l-)鈉(0.0345mol)。將混合物在室溫下攪拌過夜，接著倒入到水水中。加入DCM。將混合物在硅藻土上過濾。濾液用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，并蒸除溶劑。殘余物(3.2g)用硅膠柱色譜提純(0.15-40ium)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH96/4/0.2)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到0.55g(lP/。)中間體12。L)...中..間.體丄..的.制.務將中間體12(0.0012mol)和氪氧化鈉(0.0024mol)在EtOH(40ml)中的混合物在6(TC下攪拌8小時，然后冷卻至室溫。過濾沉淀，用EtOH洗滌，然后用乙醚洗滌并干燥，得到0.6g(100%)中間體13,作為鈉鹽形式被分離。.d...中..間..體..M..的.制.務.在室溫下，將HOBt(0.0024mol)和EDC(0.0024mol)加入到中間體13(0.0016mol)和三乙胺(0.0048mol)在DCM/THF(20ml)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入(四氫-2H-吡喃國2誦基)-羥胺(0.0032mol)。將混合物在室溫下攪拌48小時，倒入到水中，接著用DCM萃取。分離有機層，千燥(MgS04)，過濾，并蒸除溶劑。殘余物(0.6g)用kromasil柱色鐠提純(10|iim)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.3)。收集純的餾分，并蒸除溶劑，得到0.046g(6%)中間體14。B.最終化合物的制備實施例Bl.佐.全物.丄的.制.備.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>將中間體3(0.003mol)在TFA(7.5ml)和MeOH(150ml)中的混合物在室溫下攪拌24小時，然后在3(TC下進行蒸發(fā)。殘余物用氨基涂敷的珪膠柱色譜提純(25-40)(洗脫液DCM/MeOH/水80/20/2)。收集純的餾分，蒸除溶劑。殘余物(0.453g,37%)用MeOH/CH3CN/乙醚結晶。將沉淀濾出并干燥，得到0.255g(18%)化合物1,熔點296°C。實施例B2佐.會.教義.的.制.備..0.32C2HF3021.24H20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>將中間體6(0.0003mol)在TFA(0.9ml)和MeOH(18ml)中的混合物在室溫下攪拌24小時，然后蒸發(fā)至干。殘余物用氨基涂敷的硅膠柱色譜提純(25-40jam)(洗脫液DCM/MeOH/水90/10/1)。收集純的餾分，蒸除溶劑。殘余物(0.195g)用乙醚吸收若干次。將混合物蒸發(fā)并干燥，得到0.122g(66%)化合物2，熔點231。C。實施例B3佐.金鮑.1.的.制.備.將中間體11(0.0005mol)在TFA(1.5ml)和MeOH(30ml)中的混合物在室溫下攪拌24小時，然后在3(TC蒸發(fā)。殘余物用CH3CN/MeOH/乙醚結晶。沉淀濾出并干燥，得到0.17g(56%)化合物3,熔點224。C。實施例B4化.全鮑.4..的.制.務.將中間體14(0.00009mol)在TFA(0.2ml)和MeOH(2ml)中的混合物在室溫下攪拌24小時，然后蒸發(fā)至干。殘余物(0.05g)用氨基涂l丈的硅月交柱色i普提純(25-40|um)(洗脫液DCM/MeOH/水85/15/1)。收集純的餾分，蒸除溶劑，得到0.022g(56%)化合物4，熔點70°C。實施例B5.佐.金物j..的.制.備.在室溫下，將三乙胺(0.0027mol)加入到中間體13(0.0006mol)、1,2-苯二胺(0.0016mol)和苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷酮)錛六氟磷酸鹽(0.0014mol)在DCM(5ml)和THF(5ml)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌72小時，倒入到水中，并用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgSOj,過濾，并蒸除溶劑。殘余物(0.8g)用kromasil柱色譜提純(3.5|im)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.3-92/8/0.3)。收集純的餾分，蒸除溶劑，得到0.014g(4%)化合物5，熔點9CTC。表F-l列出了根據(jù)上述實施例之一制得的化合物。表F-1<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>C.藥理學實施例組蛋白脫乙酰酶抑制作用的體外分析法(參見實施例C.1)測定采用式(I)化合物所得的抑制HDAC酶活性。式(I)化合物的細胞活性在A2780腫瘤細l包上，采用測試細l包毒性或存活性的比色測定法測定(MosmammTim,JournalofImmunologicalMethods65:55-63,1983)(參見實施例C.2)?；衔锏娜芙舛葴y定化合物保留在溶液中的能力。在第一種方法中，測定稀釋時化合物保留在水溶液中的能力(參見實施例C.3.a)。DMSO儲備液使用單一含水緩沖溶劑在不同的連續(xù)步驟中稀釋。然后，在BDGentest溶解度掃描儀中掃描混合物檢測沉淀的出現(xiàn)。在第二種方法中，化合物在不同pH下的溶解度可以使用化學發(fā)光氮氣檢測器(參見實施例C.3.b)進行測定。藥物的通透性表示其由一種介質移動至或通過另一種介質的能力。具體地說，其移動通過腸膜進入血流與/或從血流進入目標中的能力。通透性(參見實施例C.4)可以通過測定過濾器固定化的人工膜^f岸脂雙層的形成進行測定。在過濾器固定化的人工膜分析法中，由96孔微滴定板和96孔過濾板形成"夾心"，使得每個復合孔中被分隔成兩個隔間，底層為供體溶液，上層為受體溶液，中間以涂覆2%(重量/體積)二油?；字；?膽堿的十二碳烷溶液的125jam微過濾片(0.45iluti孔徑)分隔，處于當該系統(tǒng)接觸到含水緩沖液時，過濾器通道內(nèi)形成多層膜的雙層物的條件下。以厘米/秒測定通過此人工膜的化合物的通透性。其目的為檢視藥物在兩種不同pH:4.0與7.4下通過平行人工膜的通透性。采用UV-分光光度計于250至500nm之間的最適當波長下檢測化合物。藥物的代謝作用表示該脂溶性異種生物化合物或生物內(nèi)生化合物經(jīng)酶轉化成極性、水溶性且可排泄的代謝物(群)。藥物代謝作用的主要器官為肝臟。代謝產(chǎn)物的活性通常低于母體化合物或無活性。然而，有些代謝物可能加強活性或毒性效果。因此，藥物代謝作用可包括"去毒化"與"毒化"過程。決定生物體處理藥物與化學物能力的主要酶系統(tǒng)之一由細胞色素P450單氧化酶代表，該酶是依賴NADPH的酶。化合物的代謝穩(wěn)定性可于體外使用亞細胞人類組織測定(參見實施例C.5)。本文中化合物的代謝穩(wěn)定性由這些化合物與微粒體培養(yǎng)15分鐘后的藥物代謝％表示。4乜合物的數(shù)量用LC-MS分碎斤法測定?，F(xiàn)已表明，多種抗腫瘤劑激活p21蛋白，包括DNA損傷劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑。DNA損傷劑通過腫瘤抑制基因p53激活p21基因，而組蛋白脫乙酰酶抑制劑通過轉錄因子Spl轉錄激活p21基因。因此，DNA損傷劑通過p53應答元件激活p21啟動子，而組蛋白脫乙酰酶抑制劑通過spl部位激活p21啟動子(相對于TATA盒位于-60bp-+40bp區(qū)域)，這二者都引起p21蛋白表達增加。當細胞中的p21啟動子由不包含p53應答元件的p211300bp啟動子片l殳組成時，它因此對DNA損傷劑是非應答的。化合物誘導p21的能力可以通過試驗化合物誘導p21的能力進而在細胞水平引起HDAC抑制進行評價。與對照組水平相比，該細月包可以穩(wěn)定地用含不包含p53應答元件并且其中報道基因表達增加的p211300bp啟動子片段的表達載體轉染，確定化合物具有p21誘導能力。該報道基因是一種熒光蛋白，該報道基因的表達以所發(fā)射熒光的數(shù)量進行測定(參見實施例C.6.a)。最后的方法是一種體內(nèi)方法，其中小鼠用于篩選化合物的藥物活性。上述穩(wěn)定變異的腫瘤細胞可以以足以產(chǎn)生腫瘤的數(shù)量給予小鼠。在肺瘤細胞在足夠的時間內(nèi)形成腫瘤后，可以將潛在活性化合物給予該動物，所述化合物對腫瘤細胞的作用通過測定報道基因的表達進行評價。與對照組水平相比，與藥物活性化合物一起培養(yǎng)將導致報道基因表達增加(參見實施例C.6.b.)專一性HDAC抑制劑不應抑制其它酶，例如大量存在的CYPP450蛋白質。CYPP450(大腸桿菌表達的)蛋白質3A4、2D6en2C9將其專一性底物轉化成熒光分子。CYP3A4蛋白質可使7-苯甲氧基-三氟曱基香豆素(BFC)轉化成7-羥基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白質轉化3-[2-(N，N-二乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-曱氧基-4-甲基香豆素(AMMC)形成3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]-7-羥基-4-曱基香豆素鹽酸鹽，CYP2C9蛋白質轉化7-曱氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)形成7-羥基-4-三氟曱基香豆素。抑制這種酶反應的化合物將導致熒光訊號降低(參見實施例C.7)。實施例C.1:組蛋白脫乙酰酶的抑制作用的體外分析法使用Biomol的HDAC熒光活性分析/藥物發(fā)現(xiàn)試劑盒(cat.No:AK-500-0001)。該HDAC熒光活性分析基于FluordeLys(熒光組蛋白脫乙酰酶賴氨?；?Fl麗ogenicHistonedeAcetylaseLvsvl))底物和顯影劑組合。該FluordeLys底物，包含乙酰化的賴氨酸側鏈。該底物的脫乙酰作用4t丈化該底物，^使得在第二步中，用FluordeLys顯影劑處理產(chǎn)生熒光基團。HeLa核萃取物(供應商Biomol)以60iug/ml與75iuM底物一起進行培養(yǎng)。將該FluordeLys底物加入到含有25mMTris，137mMNaCl,2.7mMKCl和lmMMgCl2.6H20在pH7.4的緩沖液中。30min后,加入l體積的顯影劑。該熒光基團用355nm燈激發(fā)，在熒光板讀數(shù)器上檢測發(fā)射光(450nm)。對于每一實驗，平行運行對照組(含HeLa核萃取物和緩沖液)，空白培養(yǎng)物(含緩沖液，但沒有HeLa核萃取物)和樣品(含溶于DMSO中的化合物并且進一步在緩沖液和HeLa核萃取物中稀釋)。在第一實例中，化合物在1(^M濃度進行測試。當化合物在1(^M表現(xiàn)出活性時，產(chǎn)生濃度-反應曲線，其中該化合物在10^M和10一M之間的濃度范圍內(nèi)進行試^r。所有樣品試驗4次。在每一試^r中，空白值從對照組和樣品值中扣除。對照樣品表示100%的底物脫乙?；?。對于每一樣品，熒光用對照組平均值的百分比來表示。當合適時，釆用分級數(shù)據(jù)的概率分析法計算IC5o值(將代謝物的數(shù)量減少到對照組的50%所需的藥物濃度)。本文中測試化合物的效果用pIC50來表示(IC5o值的負log值)(參見表F國2)。實施例C.2:在A2780細J包上測定抗增殖活性所有試驗化合物均溶于DMSO中，并進一步在培養(yǎng)基中稀釋。細胞增殖分析法中的最終DMSO濃度從未超過O.1%(v/v)。對照組含有A2780細胞及不含化合物的DMSO,而空白組則含有DMSO,但不含細胞。將MTT以5mg/ml溶于PBS中。制備甘氨酸緩沖液，其包含0.1M甘氨酸和0.1MNaCl,通過NaOH(1N)緩沖至pH10.5(所有試劑均來自Merck)。取人類A2780卵巢癌瘤細胞(美國賓州FoxChase癌癥中心T.C.Hamilton博士的熱心捐贈)于補充2mML-谷酰胺、50貼/ml慶大霉素與10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞照例以單層培養(yǎng)物保持在37°C的潮濕5%C02氣氛中。每周使用胰蛋白酶/EDTA溶液傳代細胞一次，分割比例為l:40。所有培養(yǎng)基與補充物均得自LifeTechnologies。采用Gen-Probe霉?jié){菌組織培養(yǎng)試劑盒(供應商BioM6rieux)測得細胞中不含霉?jié){菌污染物。將細胞接種在NUNCTM96孔培養(yǎng)板中(供應商LifeTechnologies),使之附著在塑膠板上過夜。用于鋪板的密度為每孔1500個細胞，總體積為200pl培養(yǎng)基。細胞附著在培養(yǎng)板上后，更換培養(yǎng)基，添加藥物與/溶劑至最終體積200|Lil。培養(yǎng)4天后，以200pl新鮮培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，采用以MTT為基礎的分析法分析細胞密度與活力。每孔中添加25|LilMTT溶液，細胞再于37。C下培養(yǎng)2小時。然后，小心吸出培養(yǎng)基，依序添加25inl甘氨酸緩沖液及100iulDMSO,使藍色MTT-甲臘產(chǎn)物溶解。微試驗板于微板振蕩器上振蕩10分鐘，使用Emax96孔分光光度計(供應商Sopachem)測定540nm的吸光度。實驗中，各實驗條件的結果均為3個重復孔的平均值。出于初次篩選的目的，化合物在單一固定濃度10《M下測試。對于活性化合物，則重復試-瞼，以建立完整的濃度-響應曲線。對于每次實馬全，對照組(不含藥物)及空白培養(yǎng)組(不含細胞或藥物)均平行進行。所有對照組與樣品組數(shù)值均扣除空白組數(shù)值。對于每個樣品，細胞生長平均值(以吸光度為單位)均以相對于對照組細胞生長平均值的百分比表示。當適當時，采用分級數(shù)據(jù)的概率分析法計算IC50值(使細胞生長下降至對照組的50%時所需藥物濃度)(Finney,D.J.,ProbitAnalyses,第2版，第IO章,GradedResponse,CambridgeUniversityPress,Cambridge,1962)。本文中以pICso(ICso值的負對數(shù)值)表示測試化合物的效果(參見表F-2)。實施例C.3:溶解度/穩(wěn)定性.^^...在.盒杰介質.中..的.動.左.學婆.解.度.5000-9.8jxM(1/2稀釋)的DMSO-儲備液在DMSO中在96孔儲備液板(200ml每孔)中制備。每次稀釋后，將所述樣品混合。然后，將這些DMSO溶液(2)的等分試樣轉移到2個其它96孔緩沖板中，含有200|iil每孔含水緩沖液。每一緩沖板含有含水緩沖液pH7.4或含水緩沖液pH4.0。上次稀釋后，將緩沖板混合，樣品在室溫下穩(wěn)定0.5小時。每一化合物稀釋一式兩份以排除隨機誤差。然后，在BDGentest溶解度掃描儀中掃描混合物檢測沉淀的出現(xiàn)?；诨旌衔镏胁淮嬖?存在沉淀，通過內(nèi)插法計算動力學溶解度。評級分為3類。高溶解度化合物得到3分，其具有大于或等于50pM的溶解度。中等溶解度的化合物得到2分，其具有大于10)LiM小于50pM的溶解度。低溶解度的化合物得到l分，這些化合物的溶解度小于或等于lO]uM。(參見表F-2)。不同pH化合物的溶解度還可以使用化學發(fā)光氮氣檢測器進行測定(參見表F-2)。實施例C.4:平行人工膜通透性分析法在含2ml含水緩沖液系統(tǒng)pH4或pH7.4(PSR4系統(tǒng)溶液濃縮物(pION))的深孔或預混合板中稀釋儲備液樣品(10|ul于100%DMSO中的5mM儲備液的等分試樣)。在添加樣品至參考玲反中之前，先添加150iul緩沖液至孔中，測定空白UV值。之后，棄置i爰沖液，并將該板用作參考板。所有測定均在耐UV的板子上進行(供應商Coaster或Grcinsr)。在測定參考板的空白值后，添加150pl稀釋的樣品至參考板中，添加200iul稀釋樣品至供體板1中。使用4iul人工膜形成溶液(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-膽堿磷酸于含0.1%2,6-二-叔丁基-4-曱基苯酚的十二碳烷中)涂覆受體過濾板l(供應商Millipore,MAIPN45型)，置于供體板l上方，形成"夾心，，。添加緩沖液(200|iil)至上方的受體孔中。此"夾心"加蓋，保存在室溫與黑暗中18小時。在添加150jal緩沖液至孔中后，測定UV值，測定受體板2的空白值。在受體板2測定空白值后，棄置緩沖液，從受體過濾板1中取出150ili1受體溶液移至受體板2中。然后自夾心中取出受體過濾板l。在測定供體板2的空白值(如上述)后，自供體板l中取出150pl供體溶液移至供體板2中。掃描供體板2、受體板2及參考板的孔中UV光譜(SpectraMAX190)。所有光譜均經(jīng)PSR4p控制軟件計算通透性。所有化合物均進行三次重復。每次實驗均使用卡馬西平、灰黃霉素、無環(huán)烏苷、阿替洛爾、呋塞米和氯噻溱作為標準物?；衔锓殖扇惖屯ㄍ感?平均值O.5xl0—、m/s;得分l),中通透性(lxl(T6cm/s〉平均值^0.5x10—6cm/s;得分2)或高通透性(2lxl(T6cm/s;得分3)。實施例C.5:代謝穩(wěn)定性依據(jù)Gorrod等人(Xenobiotica5:453-462,1975)通過在使組織經(jīng)過機械性均質化后離心分離制備亞細胞組織制劑。肝組織于水冷O.lMTns-HCl(pH7.4)緩沖液中漂洗，以洗除過量血液。隨后吸干組織，稱重，使用手術用剪刀粗略剪斷。組織碎片于3倍體積水冷的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，使用裝有特氟隆搗杵的Potter-S(意大利Bmun公司)或SorvallOmni-Mix均質器均質化7xl0秒。在兩種情況下，在均質化期間，容器均保持在水中/上。組織均質液于4。C下，4吏用Sorvall離心才幾或Beckmann超離心才幾，于9000xg下離心20分鐘。所得上清液保存在-80。C下，稱為"S9"。此S9部分可4吏用Beckmann超離心才幾于100,000xg下再離心60分鐘(4°C)。小心吸出所得上清液，等分并稱為"胞液，，。將沉淀再懸浮于0.1M石舞酸鹽i爰沖液中(pH7.4),每0.5克原始組織重的i冬體積為1ml,稱為"微粒體"。所有亞細胞組織部分被等分后，立即于液氮中冷凍，保存在-8(TC下，直到使用時為止。對于測試樣品，培養(yǎng)混合物含有PBS(0.1M)、化合物(5jiM)、微粒體(1mg/ml)與NADPH-發(fā)生系統(tǒng)(0.8mM葡萄糖-6-磷酸、0.8mM氯化鎂及0.8單位葡萄糖-6-磷酸去氫酶)。對照組樣品含有相同材料，但微粒體被熱去活(95。C下10分鐘)的微粒體替代。對照組樣品中化合物的回收率總是100%。混合物于37。C下預培養(yǎng)5分鐘。添加0.8mMNADP在零時間點(t=0)開始反應，并將樣品培養(yǎng)15分鐘(t=15)。添加2倍體積DMSO停止反應。樣品隨后于900xg下離心IO分鐘，分析前上清液在室溫下保存不超過24小時。所有培養(yǎng)均進行二次重復。采用LC-MS分析法分析上清液。所有培養(yǎng)均進行二次。采用LC-MS分析法分析上清液。在XterraMSC18(50x4.6mm，5]um，美國Waters乂〉司)上洗脫樣品。采用Alliance2790(供應商美國Waters公司)HPLC系統(tǒng)。洗脫劑為緩沖液A(在&0/乙腈(95/5)中的25mM乙酸銨(pH5.2)),溶劑B為乙腈，且溶劑C為曱醇，流速為2.4ml/min。所使用的梯度為在5分鐘內(nèi)，以線性方式，使有機相濃度由0%逐漸提高至50%B與50%C，于1分鐘內(nèi)至100%B,然后保持有機相濃度固定另外1.5分鐘。樣品注射總體積為25iliI。采用附有ESI光源的Quattro(供應商英國曼徹斯特市Micromass公司)三重四級質譜儀作為檢測器。光源與去溶劑化溫度分別設定在120與350°C,使用氮氣作為氣霧劑及干燥氣體。以正掃描沖莫式取得數(shù)據(jù)(單離子反應)。錐管電壓設定在10V,停留時間為l秒。代謝穩(wěn)定性以化合物于活性微粒體(E(act))的存在下培養(yǎng)15分鐘后的代謝％表示(代謝％=100%-((E(act)于t為15時的總離子電流(TIC)/E(act)于t為0時的TIC)xioo)。代謝百分比小于20%的化合物則定義為是高度代謝穩(wěn)定的。代謝百分比在20與70%之間的化合物則定義為是中度穩(wěn)定的，而代謝百分比高于70%的化合物則定義為是低度代謝穩(wěn)定的。當進行代謝穩(wěn)定性掃描時，總是包含3種參考化合物。包含維拉帕米作為低度代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝％=73%)。包含西沙比利作為中度代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝％=45%),并且包含丙醇作為中度至高度代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝％=25%)。使用這些參考化合物確認代謝穩(wěn)定性分析法的有效性。測試化合物2和3，并分別發(fā)現(xiàn)它們是高代謝穩(wěn)定的和中等代謝穩(wěn)定的。實施例C.6:P21誘導能力.實.燕.對.d終.:.....紳.胞方.法A2780細胞(ATCC)在補充有10。/。FCS,2mML-谷氨酰胺和慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中在37"在濕潤的培養(yǎng)箱中與5%C02—起培養(yǎng)。所有細胞培養(yǎng)溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它物質由Nunc提供。基因組DNA從增殖A2780細胞提取并用作p21啟動子的嵌套式PCR分離的模板。首次擴增在55。C的退火溫度下使用低聚核苷酸對作為模板進行20周期。相對于TATA盒含-4551至+88片段的所得4.5kb片段用低聚核普酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和周期，產(chǎn)生4.5kb片段并隨后用低聚核苷酸對TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和期，產(chǎn)生相對于TATA盒含-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苷酸(下劃線序列)的限制性位點XhoI和KpnI用于亞克隆。所述熒光素酶指針從pGL3-堿基中除去并在Kpnl和Xbal限制性位點用ZsGreen指針代替(來自pZsGreenl-Nl質粒)。pGL3-堿基-ZsGreen-1300通過將上述人p21啟動子區(qū)域的1.3kb片段插入到XhoI和KpnI位點的pGL3-石咸基-ZsGreen進行構造。所有限制酶由BoehringerManheim(德國)提供。將A2780細胞以2xlOS細胞密度平鋪到6孔板中，培養(yǎng)24小時，并用2ug的pGL3-堿基-ZsGreen-1300和0.2ug的pSV2neo載體通過使用Lipofectamine2000(Invitrogen,布魯塞爾，比利時)4姿照廠商描述進行轉染。該轉染后的細胞用G418(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)選擇IO天，并使單細胞懸浮液進行生長。三周后，獲得單克隆。擴展A2780選擇的克隆并以10000細胞每孔接種到96孔板中。接種24小時后，細胞用化合物(在鄰近p21啟動子區(qū)域中影響spl部位)處理另外24小時。接著，細胞用4。/oPFA固定30，并用Hoechst染料對比染色。引起ZsGreen產(chǎn)生并由此產(chǎn)生熒光的p21啟動子激活，通過AscentFluoroskan(ThermoLabsystems,布魯塞爾，比利時)進行監(jiān)測。對于每一實驗，平行進行對照組(不含藥物)和空白培養(yǎng)(不含細胞或藥物)。從所有對照組和樣品值中扣除空白值。對于每一樣品，p21誘導值用存在于對照組中的p21百分比值來表示。誘導百分比高于130%定義為顯著誘導。測試化合物l、2和3,并且其在100nM濃度下表現(xiàn)出顯著誘導。.實.掩創(chuàng)..d.!,.;....體.改方.漆.將選擇的克隆皮下注射(107細胞/200到棵鼠側腹中，12天后獲得可用卡尺測量的腫瘤。從第12天起，對動物口服或靜脈內(nèi)每日給藥6天，給予溶劑和20-40mpk化合物(4-10只動物每組)。通過內(nèi)部發(fā)展自動全身成像系統(tǒng)(裝備有GFP過濾器并與CCD攝像機型JAI⑧CV-M卯耦合的熒光立體顯微鏡型OlympusSZX12,通過基于NationalInstruments的IMAQ視覺軟件軟件包控制)的熒光評價肺瘤。測試化合物2并與對照組相比，其表現(xiàn)出增加的熒光。實施例C.7:P450抑制能力所有試l全化合物均溶于DMSO(5mM)中，再于乙腈中稀釋至5xl(T4M。使用分析緩沖液(0.1MNaK磷酸鹽緩沖液pH7.4)進一步稀釋，最終溶劑濃度從未超過2%。CYP3A4蛋白質的分析法包括每孔中含15pmolP450/mg蛋白質(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15。/。KCl中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(含3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸去氫酶、1.3mMNADP與3.3mMMgCl2.6H20的分析緩沖液)及化合物，總分析體積為100微升。于37。C下預培養(yǎng)5分鐘后，添加150]uM含熒光探針底物BFC的分析緩沖液開始酶反應。于室溫下培養(yǎng)30分鐘后，添加2倍體積乙腈中止反應。在激發(fā)波長405nm及發(fā)射波長535nm下測定熒光。其中包含酮基康唑(ketoconazole)(IC5。值=3《1(T8M)作為此實'瞼的參考化合物。CYP2D6蛋白質的分析法包括每孔中含6pmolP450/mg蛋白質(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15y。KCl中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(含0.41mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸去氫酶、0.0082mMNADP與0.41mMMgCl2'6H2〇的分析緩沖液)及化合物，總分析體積為100微升。在37。C下預培養(yǎng)5分鐘后，添加3|LiM含熒光探針底物AMMC的分析緩沖液開始酶反應。于室溫下培養(yǎng)45分鐘后，添加2倍體積乙腈中止反應。在激發(fā)波長405nm及發(fā)射波長460nm下測定熒光。其中包含喹尼定(quinidine)(IC5C^l<5xlO-8M)作為此實馬全的參考化合物。CYP2C9蛋白質的分析法包括每孔中含15pmolP450/mg蛋白質(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15。/oKCl中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(含3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸去氬酶、1.3mMNADP與3.3mMMgCl2.6H20的分析緩沖液)及化合物，總分析體積為100微升。在37t:下預培養(yǎng)5分鐘后，添加200iLiM含熒光探針底物MFC的分析緩沖液開始酶反應。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，添加2倍體積乙腈中止反應。在激發(fā)波長405nm及發(fā)射波長535nm下測定熒光。其中包含速吩唑(sulfaphenazole)(IC5(^i=6.8xlO-7M)作為此實驗的參考化合物。出于初次篩選的目的，化合物在lxlO-SM的單一固定濃度下測試。對于活性化合物，重復實驗以建立完整的濃度-響應曲線。對于每次實驗，均平行進行對照組(不含藥物)與空白培養(yǎng)組(不含酶或藥物)。所有化合物均分析四次。所有對照組與樣品組數(shù)值均扣除空白組數(shù)值。對于各樣品，樣品的P450活性平均值(以相對熒光單位表示)以相對于對照組中P450活性平均值的百分比表示。抑制作用百分比以100%減去樣品中P450活性平均值表示。若適當時，計算IC5o值(使P450活性下降至對照組的50%時所需藥物濃度)。表F-2:列舉了根據(jù)實施例C.l、C.2、C.3.a.和C.3.b試驗的化合物的結果。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula>D.組合物實施例薄膜衣片劑.片.刑.核.的..制.備.將100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，其后用5g十二烷基石危酸鈉和10g聚乙烯-p比咯烷酮在約200ml水中的溶液濕潤。將該濕4分末混合物過篩，干燥并再次過篩。然后，加入100g微晶纖維素和15g氫化植物油。將整個充分混合并壓制成片劑，得到10.000片，每片包含10mg式(I)化合物。向10g曱基纖維素在75ml變性乙醇中的溶液中加入5g乙基纖維素在150ml二氯甲烷中的溶液。然后，加入75ml二氯甲烷和2.5ml1,2,3-丙三醇。將10g聚乙二醇熔融并溶于75ml二氯甲烷中。將后者溶液加入到前者中，然后加入2.5g十八烷酸^t美、5g聚乙烯-p比咯烷酮和30ml濃縮色素懸浮液，接著將整個均化。該片劑核用由此獲得的混合物在包衣裝置中包衣。權利要求1.式(I)的化合物其N-氧化物形式、藥學上可接受的加成鹽和立體化學異構形式，其中n是0或1，以及當n是0時，那么是指直接鍵；m是0、1或2，以及當n是0時，那么是指直接鍵；p是0或1，以及當n是0時，那么是指直接鍵；每個X獨立地是N或CH；每個Y獨立地是O、NH、N-C1-6烷基、CH或CH2，以及當Y是CH時，那么所述取代基與環(huán)結構的Y原子相連；R1是羥基或式(a-1)的基團其中R9是羥基或-NH2；R10是氫、噻吩基、呋喃基或苯基，并且每個噻吩基、呋喃基或苯基可以任選被鹵素、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷氧基、苯基C1-6烷氧基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基、多鹵代C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷基磺?；⒘u基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、異噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基取代；R6、R7和R8每個獨立地是氫、-NH2、硝基、呋喃基、鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R11；其中R11是氫、C1-6烷基、羥基、氨基或C1-6烷氧基；R2是C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、C1-6烷基氨基羰基或C1-6烷氧基羰基；R3是氫、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基或C1-6烷基氨基羰基；或R2和R3可以與亞甲基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連(即形成環(huán)狀的環(huán)體系)；R4是氫、C1-6烷基、-C(＝O)-CHR12R13或-S(＝O)2-N(CH3)2；其中每個R12和R13獨立地是氫、氨基、C1-6烷基或氨基C1-6烷基；和R5是氫、羥基、氨基、鹵素、C1-6烷基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或單-或二(C1-6烷基)氨基。2.權利要求1的化合物，其中n是l;p是0;每個Y是CH;R"是氫；R6、117和118每個獨立地是氫，RS是d—6烷基以及I^是氫或者I^和RS可以與亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連；W是C"烷基；以及RS是氫。3.權利要求1和2的化合物，其中n是l;m是l或2;p是0;每個X是N;每個Y是CH;112和113與亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基橋連；W是Cw烷基；以及W是氫。4.權利要求l、2和3的化合物，其中所述化合物是化合物No.2和化合物No.3。<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>5.藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的治療有效量的權利要求1-4所述的化合物。6.制備權利要求5所述的藥物組合物的方法，其中將所述的藥學上可接受的載體和權利要求1-4所述的化合物密切混合。7.權利要求l-4任一項的化合物，作為藥品。8.權利要求1-4任一項的化合物制備用于治療增殖性疾病的藥物的用途。9.抗癌劑和權利要求l-4任一項所述的HDAC抑制劑的組合。10.制備權利要求1所述的化合物的方法，其特征在于a)使式(II)中間體與合適的酸反應，得到式(I)的異羥肟酸，其中Ri是羥基，在此稱為式(I-a)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I-a)b)使式(III)的中間體，其中M代表氫或鈉或鋰或堿金屬陽離子，與式(IV)的中間體在合適的試劑存在下和在合適的溶劑中反應，生成式(I)的化合物，其中W是式(a-1)的基團以及RS是-NH2，在此稱為式(I-b)的化合物，R6IO^,II/=N/\(CH2>nR4廠l、-N\_7R5(I-b)c)使式(V)的中間體與合適的酸在合適的溶劑中反應，生成式(I-b)的化合物，或d)使式(VI)的中間體，其中TBDMS是指叔丁基(二曱基)硅烷基,與氟化四丁基銨在合適的溶劑中反應，生成式(I)的化合物，其中R]是式(a-1)的基團以及W是羥基，在此稱為式(I-c)的化合物。11.式(A)的化合物，其中Q是d.2烷氧羰基、羥基羰基或四氫p比喃氧基氨基羰基以及n、m、p、X、Y、Z、R2、R3、114和115如式(I)所定義，及其N-氧化物形式、藥學上可接受的加成鹽和立體化學異構形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>12.制備權利要求11所述的化合物的方法，其特征在于a)使式(III-a)的中間體與式(VII)的中間體反應，生成式(A)的化合物，其中Q是四氫吡喃氧基氨基羰基，由式(II)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>b)使式(X)的中間體與合適的酸性溶液反應，生成式(A)的化合物，其中Q是羥基羰基，在此稱為式(III)的化合物，c)使式(XI)的中間體與式(XII)的中間體反應，形成式(A)的化合物，其中Q是d.2烷氧羰基以及R^是氫，在此稱為式(X-a)的化合物，或d)使式(XIII)的中間體與式(XIV)的中間體反應，形成式(A)的化合物，其中Q是d.2烷氧羰基以及I^和RS是橋連的，所述的虛線代表亞曱基、亞乙基或亞丙基橋連基以及n是1，在此稱為式(X-b)的中間體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>全文摘要本發(fā)明包含新的式(I)的化合物，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、X和Y具有所定義的含義，具有組蛋白脫乙酰酶抑制酶活性；它們的制備方法、含有它們的組合物以及它們用作藥品的用途。文檔編號A61K31/506GK101370803SQ200780002579公開日2009年2月18日申請日期2007年1月16日優(yōu)先權日2006年1月19日發(fā)明者I·N·C·皮拉特,P·R·安基鮑德申請人:詹森藥業(yè)有限公司