專利名稱：一種含兩性霉素b的長效制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含膽甾醇通過小分子物以醚鍵接枝的聚乙二醇醚(簡稱PGC)的兩性霉 素B的穩(wěn)定的長效制劑。
背景技術(shù)：
兩性霉素B ( Amphotericin B)又叫兩性霉素乙；異性霉素，二性霉素，是由鏈霉菌 產(chǎn)生一種多烯類光譜抗真菌抗生素，與真菌細(xì)胞膜上的固醇類特別是麥角固醇有高親和力， 在細(xì)胞膜上形成小分子通道，造成細(xì)胞內(nèi)鉀例子，核苷酸，氨基酸等小分子外漏，破壞細(xì) 胞的正常代謝而起到抑菌作用。
兩性霉素B可與敏感真菌細(xì)胞膜上的甾醇結(jié)合，損傷膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物 質(zhì)如鉀離子、核苷酸和氨基酸等外漏，從而破壞了細(xì)胞的TH常代謝而抑制其生長。通常臨 床治療所達(dá)到的藥物濃度對(duì)真菌為抑菌作用，如藥物濃度達(dá)到人體可耐受范圍的高限時(shí)則 對(duì)真菌起殺菌作用。適用于下列真菌感染的治療隱球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠 菌病、球孢子菌病、組織胞漿菌病，由毛霉菌、酒曲菌屬、犁頭霉菌屬、內(nèi)胞霉屬和蛙糞 霉屬等所致的毛霉菌病，由申克孢子絲菌引起的孢子絲菌病，由煙曲菌所致的曲菌病等。 由于兩性霉素B的明顯毒性，故本品主要用于診斷己確立的深部真菌感染(如獲培養(yǎng)或組織 學(xué)檢查陽性則更佳)，且病情危重呈進(jìn)行性發(fā)展者。對(duì)臨床真菌感染征象不明顯，僅皮膚或 血清試驗(yàn)陽性的患者不宜選用.
市售的可溶性兩性霉素B含45y。兩性霉素B， 35%脫氧膽酸鈉和20%磷酸氫鈉，已經(jīng)上市 的產(chǎn)品中為可溶性兩性霉素B與去氧膽酸加適量磷酸鹽緩沖劑制成的無菌凍干粉針。檢索 到與本發(fā)明相關(guān)的專利申請(qǐng)?zhí)枮?2155190. l發(fā)明名稱兩性霉素B脂質(zhì)體及制備方法， 介紹了一種兩性霉素B脂質(zhì)體的制備方法，市售注射劑LD50約為2. 5 mg/kg，該專利中LD50 約為5.0mg/kg，我們研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明制備的兩性霉素B長效制劑，LD50約為15.0 mg/kg，分別是上市普通制劑的6倍，兩性霉素B脂質(zhì)體的3倍，具有更好的安全性，非常 具有開發(fā)價(jià)值。
兩性霉素B已經(jīng)成為臨床深度真菌感染危重病人不可缺少的治療藥物，增效減毒是制 劑研究的要點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量藥理 活性物質(zhì)，所述微油滴通過膽ffi醇通過小分子物以醚鍵接枝的聚乙二醇醚(PEG- (CH2) n-膽甾醇，其中n為整數(shù)，大小為2-10，以下簡稱PGC)將藥理活性物質(zhì)穩(wěn)定在油滴中，碳 鏈長度為2-10，小分二醇選自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二 醇、任二醇、癸二醇中的一種，通過化學(xué)反應(yīng)以醚鍵與膽甾醇和聚乙二醇相連，聚乙二醇 選自分子量為20()、 300、 400、 600和1000中的一種，比如PEG300- (CH》2 -膽甾醇、 PEG300- (CH2)廣膽M醇、PEG400- (QU 4 -膽甾醇、PEG600- (CH》 -膽甾醇、PEG1000-(CH2) fi -膽甾醇等，PEG- (CH》n -膽甾醇用量以重量計(jì)為0. 01%-5%。；所述微滴的平均 粒徑不大于1微米，所述乳液可以通過過濾除菌；所述乳液中可以加入凍干支持劑制成凍 干乳，凍干支持劑選自單糖、二糖、多糖或糖醇中的一種或兩鐘以上，具體包括麥芽糖、 乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一種或幾種的混 合物，更優(yōu)選二糖類，所述的用量以重量計(jì)為1%-40%。
本發(fā)明一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，其中藥理活性劑為兩性霉素B，兩 性霉素B在乳液中的用量以重量計(jì)為0.01%-0.5°/。；乳液中包括至少一種可注射的油、表面 活性劑和穩(wěn)定劑，其中
a) 可注射的油，可以是任何種類的植物油、動(dòng)物油、化學(xué)改性制造油的一種或其混合 物，其中植物油選自豆油、亞麻子油、茶油、紅花油、棉子油、玉米油、月見草油、花生 油、蓖麻油，動(dòng)物油選自魚油、鯡油、鮭魚油或金槍魚油，化學(xué)改性制造的油選自中鏈甘 油三酯、甘油單酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕櫚酸異丙酯、聚氧基氫化蓖麻油、長鏈或中 鏈脂肪酸或脂肪酸醇中的一種或兩種以上的混合物，可注射的油在乳液中的用量以重量計(jì) 為1%-20%。
b) 表面活性劑，選自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐溫、司盤、泊洛沙姆(poloxa鵬r)、 solutolHS15中的一種或幾種，其中磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷 脂酰絲胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000 —磷脂酰乙醇胺
(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇IOOO —磷脂酰膽堿，來源不同分為大豆磷脂和蛋黃卵磷脂， 優(yōu)選蛋黃磷脂，吐溫優(yōu)選吐溫80，泊洛沙姆優(yōu)選泊洛沙姆188;所述表面活性劑的用量以 重量計(jì)為0. 5%-10%。
c) 穩(wěn)定劑，選自甘油、油酸、亞油酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、硬脂酸單甘油酯、油酸 乙酯、霧油酸乙酯中的一種或幾種，以重量計(jì)為0. 20%。
本發(fā)明一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，進(jìn)一步包含抗氧化劑a -生育酚及 其衍生物(如a —生育酚琥珀酸酯)、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA) 、 二 丁基羥基甲苯(BHT)中的一種或幾種；還可以含有EDTA、三胺五乙酸和亞硫酸鹽中的一種，還可以含有PH值調(diào)節(jié)劑如鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、乳酸和檸檬酸中的一種。
本發(fā)明一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，其中兩性霉素B和PGC通過研磨 溶解在油性組分中，兩性霉素B和油性組分在水中形成穩(wěn)定的分散相；其中分散相的平均 粒徑《lum，其制備方法如下
a) 將兩性霉素B和PGC加入油性組分，充分研磨制成油相，表面活性劑、穩(wěn)定劑溶于 適量水中，于50 90'C高速攪拌制成水相，油水兩相混合于50 9(TC高速攪拌制成初乳劑， 調(diào)節(jié)PH值5. 0 7. 0。
b) 取上述(a)中初乳劑，注射用水定容至處方量，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳化 至乳滴平均粒徑《1微米。
C)取上述(b)的乳劑除菌過濾后分裝，熱壓滅菌既得。
本發(fā)明凍干乳其制備方法如下
a) 將兩性霉素B和PGC加入油性組分，充分研磨制成油相，表面活性劑、穩(wěn)定劑、凍 干支持劑溶于適量水中，于50 9(TC高速攪拌制成水相，油水兩相混合于50 90'C高速攪 拌制成初乳劑，調(diào)節(jié)PH值5.0 7.0。
b) 取上述(a)中初乳劑，注射用水定容至處方量，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳化 至乳滴平均粒徑《微米。
C)取上述(b)的乳劑除菌過濾后分裝，冷凍干燥后充氮?dú)鈮荷w既得。
凍干條件如下于零下40 — 5(TC預(yù)凍3—6h，升溫至零下30 —零下l(TC，真空減壓除 去大部分水分，再升溫至ox:，繼續(xù)真空減壓除去水分，繼續(xù)升溫除去水分，得干燥的凍干 乳劑。
本發(fā)明制備的乳劑可以用于靜脈給藥、肌肉給藥或局部給藥。
具體實(shí)施例
實(shí)施例一
兩性霉素BO. 01% 1.0%、 PEG300- (CH》,-膽甾醇0. 01% 2. 0%、生育酚0. 1% 1. 0%、 磷脂1.0°/。 6.0%、泊洛沙姆188 1.0% 6. 0%、植物油1% 10%、油酸1.0% 6. 0%，甘油2 %—6%，注射用水添至100ml。
稱取兩性霉素B 25mg、加入生育酚0.6g、 PEG300- (CH2) 4 -膽蹈醇0.2g、 10g注射用 大豆油、0.3g油酸，充分研磨制成油相；稱取蛋黃卵磷脂1.0g、泊洛沙姆188 2.0g、甘油 3g，加入處方量的水于5(TC 8(TC高速攪拌使充分分散，制成水相。油水兩相混合，于50 'C 8(TC高速攪拌制成初乳劑；取初乳劑，注射用水定容至處方量，調(diào)節(jié)PH值為5.0 7.0，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳化至乳滴平均粒徑《1微米，除菌過濾，充氮?dú)夤嘌b，滅菌既 得。
注整個(gè)生產(chǎn)過程需要充氮?dú)獗Ｗo(hù)。
實(shí)施例二
兩性霉素BO. 01% 1.0%、 PEG400- (CH》廣膽甾醇0. 01% 2. 0%、 a-生育酚琥珀酸酯 0.1% 1. 0%、磷脂1. 0% 6. 0%、去膽酸鈉0. 1% 1. 0%、植物油1% 10%、油酸1. 0% 6. 0%, 麥芽糖10g、蔗糖10g，注射用水添至100ml。
稱取兩性霉素B200mg、 PEG600- (CH》e -膽^醇0.4g、 a-生育酚琥珀酸酯0. 6g、加 入3g中鏈油、加入3g大豆油和0. 3g油酸充分研磨制成油相；稱取大豆卵磷脂2. Og、去膽 酸鈉0.2g、麥芽糖10g、蔗糖10g，加入處方量的水于5(TC 8(TC高速攪拌使充分分散， 制成水相；油水兩相混合，于5(TC 8(TC高速攪拌制成初乳劑，取初乳劑，注射用水定容 至處方量，調(diào)節(jié)PH值為5.0 7.0，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳化至乳滴平均粒徑《1微 米，除菌過濾，充氮?dú)夤嘌b，低溫冷凍干燥既得。
注整個(gè)生產(chǎn)過程需要充氮?dú)獗Ｗo(hù)。
實(shí)施例三
兩性霉素BO. 01% 1. 0%、 PEG300- (CH2).，-膽甾醇0. 01% 2. 0%、 PEG2000-DSPEO. 01% 1. 0%、生育酚0. 1% 1, 0%、磷脂1. 0% 6. 0%、泊洛沙姆188 1. 0% 6. 0%、植物油1% 10%、 中油酸1.0% 6. 0°/。，甘油2%—6%，注射用水添至100ml。
稱取兩性霉素B 100mg、加入生育酚0.6g、 PEG300- (CH2) 4 -膽甾醇0.2g、注射用大 豆油3g、中鏈油3g、 0.3g油酸，充分研磨制成油相；稱取蛋黃卵磷脂1.2g、泊洛沙姆188 2.4g、 PEG2000-DSPEO. lg、甘油3.6g，加入處方量的水于50。C 8(TC高速攪拌使充分分散， 制成水相；油水兩相混合，于5(TC 80'C高速攪拌制成初乳劑；取初乳劑，注射用水定容 至處方量，調(diào)節(jié)PH值為5.0 7.0，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳化至乳滴平均粒徑《1微 米，除菌過濾，充氮?dú)夤嘌b，滅菌既得。
注整個(gè)生產(chǎn)過程需要充氮?dú)獗Ｗo(hù)。實(shí)施例四(血管刺激性試驗(yàn))
試驗(yàn)藥物本發(fā)明兩性霉素B乳劑，北京金方華醫(yī)藥科技有限公司提供，兩性霉素B 注射液組，自制，試驗(yàn)時(shí)用0.9%氯化鈉注射液配制成5%溶液。
試驗(yàn)動(dòng)物健康家兔，體重2. 1 2.3kg。
試驗(yàn)方法取健康家兔10只，雌雄各半，按體重及性別分為0. 9%氯化鈉注射液對(duì)照組
和兩性霉素B劑組以及兩性霉素B注射液對(duì)照藥組，每組2只，兩性霉素B乳劑組和兩性 霉素B注射液組于家兔左耳耳緣按臨床給藥濃度靜脈滴注10ml/kg，滴注速度lml/分，每 日l次，連續(xù)7日。對(duì)照組同法靜脈滴注0.9%氯化鈉注射液。除每次給藥時(shí)及給藥后觀察 給藥局部表現(xiàn)外，于末次靜脈滴注后剪下藥側(cè)耳廓，常規(guī)固定后，在距靜脈滴注入針近心 端lcm處，每隔lcrn切取0. 5cm寬標(biāo)本，共取3塊標(biāo)本。切片染色，進(jìn)行鏡下病理觀察， 結(jié)果見下表
表l:血管刺激性試驗(yàn)
項(xiàng)目兔耳廓血管擴(kuò)張紅腫有無炎細(xì)胞浸潤
0. 9%氯化鈉注射液對(duì)照組—
兩性霉素B注射液+++++
兩性霉素B乳劑(實(shí)施例1)——一
兩性霉素B凍干乳劑(實(shí)施例2)一—
兩性霉素B乳劑(實(shí)施例3)——一—
備注"++"嚴(yán)重、"+ "少許、"—"無
前后粒徑無顯著變化。 實(shí)施例五(小鼠急性毒性試驗(yàn))
取清潔級(jí)小鼠40只，分成四組，尾靜脈注射，觀察動(dòng)物發(fā)應(yīng)情況，連續(xù)觀察七天，記 錄動(dòng)物毒性發(fā)應(yīng)情況和死亡動(dòng)物分布，計(jì)算出LD50值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下
表3:小鼠尾靜脈注射LD50值
實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3市售產(chǎn)品
LD50值15.20 mg/kg15. 20 rag/kg17.00 mg/kg2. 45mg/kg
結(jié)果表明本發(fā)明兩性霉素B凍干乳劑毒性較上市產(chǎn)品分別提高了5 — 7倍，具有市場
開發(fā)價(jià)值。實(shí)施例六(家兔藥動(dòng)力學(xué)比較)
試驗(yàn)藥物本發(fā)明兩性霉素B乳劑(按實(shí)施例三制備)，兩性霉素B注射液組，市售 制劑，試驗(yàn)時(shí)用0. 9%氯化鈉注射液配制成5%溶液。 試驗(yàn)動(dòng)物健康家兔，體重2. 1 2.3kg。
試驗(yàn)方法將6只家兔禁食過夜后，隨機(jī)分為兩組，分別交叉從耳緣靜脈注射兩性霉
素B或市售制劑，給藥劑量為lmg/kg。于給藥后即刻0.25、 0.5、 1、 2、 3、 5、 8、 12、 16、 24h、 36h從耳緣靜脈采取血樣2 3ml，置肝素抗凝管中，3000r/min離心10min后分離血 漿，按"血漿樣品的處理與測定"處理分析。
試驗(yàn)結(jié)果由血藥濃度的數(shù)據(jù)可知在0 36h范圍內(nèi)，兩性霉素B乳劑的血藥濃度均 高于相應(yīng)時(shí)間市售制劑的血藥濃度。兩性霉素B乳劑給藥后體內(nèi)血藥濃度峰值Cmax為 8.517mg/l，在給藥后3h降至4. 262 mg/1，然后緩慢地下降，在給藥后24h內(nèi)，兩性霉素 B乳劑的平均血藥濃度在8. 517 1. 221 mg/1范圍內(nèi)，在給藥后24-36h內(nèi)，兩性霉素B乳 劑的平均血藥濃度在1.221 0.251呢/1范圍內(nèi)，而市售制劑給藥后，24h內(nèi)的濃度在 2.558 0. 009mg/l范圍內(nèi)，只有在0 12h內(nèi)，血藥濃度為2. 408 0. 290mg/l才能高于有 效抑菌濃度(O.MOmg/l)，可見兩性霉素B乳劑體在體內(nèi)的抗菌作用要比市售制劑持久， 其抗菌療效也會(huì)更優(yōu)于市售注射劑。
權(quán)利要求
1、一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量藥理活性物質(zhì)，所述微油滴通過膽甾醇通過小分子物以醚鍵接枝的聚乙二醇醚(PEG-(CH2)n-膽甾醇，其中n為整數(shù)，大小為2-10)將藥理活性物質(zhì)穩(wěn)定在油滴中，碳鏈長度為2-10，小分二醇選自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、任二醇、癸二醇中的一種，通過化學(xué)反應(yīng)以醚鍵與膽甾醇和聚乙二醇相連，聚乙二醇選自分子量為200、300、400、600和1000中的一種，PEG-(CH2)n-膽甾醇用量以重量計(jì)為0.01％-5％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l中的乳液，所述乳液中可以加入凍干支持劑制成凍千乳，凍干支持 劑選自單糖、二糖、多糖或糖醇中的一種或兩鐘以上，具體包括麥芽糖、乳糖、蔗糖、 葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一種或幾種的混合物，更優(yōu) 選二糖類，所述的用量以重量計(jì)為1%-40%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l-3中的乳液，其中藥理活性劑為兩性霉素B，兩性霉素B在乳液中 的用量以重量計(jì)為0. 01%-0. 5%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的乳液，其中包括至少一種可注射的油、表面活性劑和穩(wěn)定劑， 其中a) 可注射的油，可以是任何種類的植物油、動(dòng)物油、化學(xué)改性制造油的一種或其 混合物，其中植物油選自豆油、亞麻子油、茶油、紅花油、棉子油、玉米油、月見草油、花生油、蓖麻油，動(dòng)物油選自魚油、鯡油、鮭魚油或金槍魚油，化學(xué)改性制造的油選自 中鏈甘油三酯、甘油單酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕櫚酸異丙酯、聚氧基氫化蓖麻油、 長鏈或中鏈脂肪酸或脂肪酸醇中的一種或兩種以上的混合物，可注射的油在乳液中的用 量以重量計(jì)為1%-20%。b) 表面活性劑，選自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐溫、司盤、泊洛沙姆(poloxamer)、 solutolHS15中的一種或幾種，其中磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、 磷脂酰絲胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000 —磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇IOOO—磷脂酰膽堿，來源不同分為大豆磷脂和蛋黃卵磷脂， 優(yōu)選蛋黃磷脂，吐溫優(yōu)選吐溫80，泊洛沙姆優(yōu)選泊洛沙姆188;所述表面活性劑的用量 以重量計(jì)為0. 5%-10%。c) 穩(wěn)定劑，選自甘油、油酸、亞油酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、硬脂酸單甘油酯、 油酸乙酯、亞油酸乙酯中的一種或幾種，以重量計(jì)為0. 1%-20%。
5、 據(jù)權(quán)利要求1一2中的乳液，其特征在于進(jìn)一步包含抗氧化劑a-生育酚及其衍生物 (如a —生育酚琥珀酸酯)、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(KiA)、 二丁基羥基甲苯QHT)中的一種或幾種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l一2中的乳液其特征在于還可以含有EDTA、三胺五乙酸和亞硫酸鹽 中的一種，還可以含有PH值調(diào)節(jié)劑如鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、乳酸和檸檬酸中的一 種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l中的乳液，其中兩性霉素B通過研磨溶解在油性載體中，兩性霉素 B和油性載體在水中形成穩(wěn)定的分散相；其中分散相的平均粒徑《luro。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-8中的乳液，其制備方法如下a) 將兩性霉素B和PEG- (CH2) n-膽甾醇加入油性組分，充分研磨制成油相，表 面活性劑、穩(wěn)定劑溶于適量水中，于50 9(TC高速攪拌制成水相，油水兩相混合于50 9(TC高速攪拌制成初乳劑，調(diào)節(jié)PH值5. 0 7. 0。b) 取上述(a)中初乳劑，注射用水定容至處方量，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳 化至乳滴平均粒徑《1微米。C)取上述(b)的乳劑除菌過濾后分裝，熱壓滅菌既得。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-8中的凍干乳，其制備方法如下a) 將兩性霉素B和PEG- (CH2) n -膽甾醇加入油性組分，充分研磨制成油相，表 面活性劑、穩(wěn)定劑、凍干支持劑溶于適量水中，于50 9(TC高速攪拌制成水相，油水 兩相混合于50 9(TC高速攪拌制成初乳劑，調(diào)節(jié)PH值5. 0 7. 0。b) 取上述(a)中初乳劑，注射用水定容至處方量，轉(zhuǎn)移至高壓乳勻機(jī)中，反復(fù)乳 化至乳滴平均粒徑《1微米。C)取上述(b)的乳劑除菌過濾后分裝，冷凍干燥后充氮?dú)鈮荷w既得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含微油滴于水性介質(zhì)中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量兩性霉素B藥理活性物質(zhì)，所述微油滴通過“膽甾醇通過小分子物以醚鍵接枝的聚乙二醇醚”(PEG-(CH₂)n-膽甾醇)將兩性霉素B穩(wěn)定在油滴中，可以制成穩(wěn)定的乳液和凍干乳劑，制成的乳劑與上市產(chǎn)品相比具有明顯的緩釋效果。
文檔編號(hào)A61K9/107GK101450039SQ20071019490
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日
發(fā)明者張文芳 申請(qǐng)人:張文芳