專利名稱：：白英總皂苷提取物及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥，具體涉及一種中藥的提取物及其制備方法與在制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、銀屑病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：中藥白英始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。也有別稱白毛藤、蜀羊泉、排風(fēng)藤等。白英己收載于《中華人民共和國藥典》1977年版一部中。白英為茄科植物，資源豐富，其味甘、苦，性寒。有清熱、解毒、祛風(fēng)、利濕、化瘀等功效。用于治療濕熱黃疸、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、白帶過多、水腫、淋病、丹毒、疔瘡、癌瘤?，F(xiàn)代研究表明，白英中的主要化學(xué)成分為甾體皂苷和生物堿苷類。其水提取物具有抗腫瘤作用，從其同屬植物歐白英中提取得到的中性甾體皂苷則有抗真菌的作用。CN1634295A公布了一種具有消炎作用的白英總生物堿甾體的制備方法，CN1943676A公布了一種白英凝膠劑的制法及其在在治療濕疹和真菌性皮膚病方面的應(yīng)用。但是，關(guān)于白英總皂苷及其在制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌、銀屑病的藥物的用途，目前并無相關(guān)記載或報(bào)道。胃炎包括多種胃粘膜炎癥，可以分為急性胃炎和慢性胃炎，慢性胃炎可分為淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生和典型增生。胃炎可能演變?yōu)槲赴?，尤其是萎縮性胃炎、腸化生和典型增生階段。胃炎主要采用對癥治療方法，包括根除幽門螺桿菌、保護(hù)胃粘膜等。消化性潰瘍主要指發(fā)生于胃和十二指腸的慢性潰瘍，主要釆用抑酸、保護(hù)胃粘膜和抗幽門螺桿菌治療。銀屑病是一種以表皮過度增殖、伴角化不全及真皮淋巴細(xì)胞浸潤為特征的慢性皮膚病，涉及到天然免疫、血管新生、T細(xì)胞激活和外溢至皮膚、角質(zhì)形成細(xì)胞增生等多個(gè)環(huán)節(jié)，主要治療藥物有皮質(zhì)激素類、維甲酸類、維生素D衍生物等，雖然顯示一定短期療效，但不能達(dá)到治愈效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于研究一種白英總苷提取物及其制備方法，以及它在制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌、銀屑病的藥物的用途本發(fā)明提供了一種白英總苷提取物，其含有重量百分比為10%90%白英總皂苷，更優(yōu)選的是其含有重量百分比為35%90%的白英總皂苷。本發(fā)明所述的白英總皂苷，含有一種或幾種以下結(jié)構(gòu)的甾體皂苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>R=3_<"arhamnopyranosyl-(1—2)-[P-D-glucopyranosyl-(1—3)]-P_D-glucuronopyranoside蜀羊泉苷CR二3-(9"P_D-Glucopyranosyl-(1—3)_0-D-galactopyranosideS-苦茄堿R=3——L—Rhamnopyranosyl—(1—2)—a—L—rhamnopyranosyl—(1—4)-p-D-glucopyranoside薯蕷皂苷。本發(fā)明的另一目的是提供了上述白英總皂苷的制備方法，該方法包括下列步驟1、提取將原藥材經(jīng)過粉碎后，用水、甲醇或乙醇，或含水醇類，用量為藥材重量的4-10倍，室溫或加熱(包括回流)提取13小時(shí)，可重復(fù)提取13次，然后濾去藥渣，濾液在常壓或減壓下濃縮至無醇味，得到濃縮液，靜置備用；其中，提取用溶劑以50%95%乙醇為佳，乙醇用量為藥材量的410倍，6倍為佳。2、分離上述提取液通過分離制備得到白英總皂苷，分離方法可采用以下兩種方法之(1)正丁醇萃取法其制備步驟為濃縮液以正丁醇0.5倍量至3倍量萃取1-6次(V/V)，萃取后，蒸干，得浸膏，所得浸膏再加1-6倍量的石油醚洗滌，棄去洗滌液，固體干燥得白英總皂苷提取物；(2)大孔樹脂層析法其制備步驟為濃縮液以石油醚0.5倍量至3倍量萃取l-6次(V/V)脫脂，所得水層上樹脂柱，以水及稀醇(醇濃度<30%)洗滌，再用50-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，濃縮液干燥即得白英總皂苷；上述方法制得的白英總皂苷提取物，可進(jìn)一步精制純化以提高總皂苷含量。如上述b中所述濃縮液以正丁醇0.5倍量至3倍量萃取1-6次(V/V)，正丁醇萃取液再以酸(0.1%-1%的鹽酸溶液)，堿(0.1%-1%的氫氧化鈉或碳酸鈉溶液)洗滌，并以水洗至中性，濃縮，干燥，可得到含量更高得白英總皂苷提取物。通過上述方法制備的白英總皂苷，為黑色或黃色固體，以紫外分光光度法可以測定其總苷含量為10%90%，優(yōu)選的是其總苷含量為35%90%。本發(fā)明的又一目的是提供了上述白英總苷提取物在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明將用上述方法制得的白英總苷提取物進(jìn)行了一系列的藥理活性篩選評價(jià)，結(jié)果顯示其有顯著的抗炎、保護(hù)胃粘膜、抑制幽門螺桿菌、抗胃癌細(xì)胞增殖、抗角質(zhì)形成細(xì)胞增殖等藥理作用。1.白英總苷對大鼠胃粘膜的保護(hù)作用材料Wistar大鼠50只，體重160-180g，雄性，購自中科院上海試驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(滬)2003-0003。受試樣品按實(shí)施例方法制備；西咪替丁(Cimetidine)，批號050801，購自上海衡山藥業(yè)有限公司方法動物根據(jù)體重隨機(jī)分組，白英總苷或陽性對照西咪替丁均用0.MC混懸，口服灌胃給藥，連續(xù)3天，空白對照給予相同體積空白介質(zhì)(0.5%CMC)。最后一次給藥前禁食24小時(shí)，給藥后1個(gè)小時(shí)給每只動物灌服(p.o)無水乙醇lml,l小時(shí)后處死動物，解剖取全胃以游標(biāo)卡尺測量潰瘍指數(shù)。結(jié)果:白英總苷對乙醇致大鼠急性胃損傷模型的作用劑量動物數(shù)始/終給藥途徑潰瘍指數(shù)(mm)IR(%)空白對照2ml/只10/10p.0175.54±41.83西咪替丁300mg/kgX38/8p.042.81±19.08**75.62白英總苷200mg/kgX38/8p.011.59±10.76**93.40100mg/kgX38/8p.060.96土27.14**65.2850mg/kgX38/8p.089.91±58.20**48.78**:與Vehicle組相比，P<0.01結(jié)果顯示給大鼠灌服乙醇可導(dǎo)致急性糜爛性炎癥，表現(xiàn)為粘膜潰瘍、出血等損傷癥狀。白英總苷對乙醇所致大鼠胃粘膜損傷具有明顯保護(hù)作用。2.白英總苷對小鼠胃粘膜的保護(hù)作用材料ICR雄性小鼠32只，20-22g，中科院上海試驗(yàn)動物中心提供；白英總苷樣品按實(shí)施例方法制備。方法動物適應(yīng)l-2天。根據(jù)體重隨機(jī)分組，禁食48小時(shí)后灌胃給予白英總苷或西咪替丁，空白對照給予等體積溶媒(0.5%CMC)，給藥后l個(gè)小時(shí)給每只動物P.o無水乙醇O.lml，l小時(shí)后處死動物，解剖取全胃以福爾馬林固定，計(jì)數(shù)出血點(diǎn)為潰瘍指數(shù)。結(jié)果白英總苷對乙醇致小鼠急性胃損傷模型的作用劑量動物數(shù)始/終給藥途徑潰瘍指數(shù)抑制率(%)空白對照0.2ml/只8/8p.034.63±18.08西咪替丁450mg/kgXl8/8p.09.00±6.39**74.01白英總苷300mg/kgXl8/8p.08.00±5.37**76.90150mg/kgXl8/8p.011.50±11.17林66.79**:與Vehicle組相比，P〈0.01;結(jié)果顯示白英總苷對乙醇所致小鼠胃粘膜損傷(急性糜爛性炎癥)具有明顯抑制作用。3.白英總苷對幽門螺桿菌的抑制作用采用平板法，考察了白英總苷對幽門螺桿菌(H.Pylori)的抑制作用，結(jié)果顯示模型MICtoATCC43504(ug/ml)甲硝唑H.Pylori128白英總苷H.Pylori256結(jié)果顯示白英總苷對幽門螺桿菌有顯著抑制作用，最小抑菌濃度胃256yg/ml。4.白英總苷對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的抑制作用材料SD大鼠40只，雄性，體重130-150g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有限公司提供，合格證SCXK(滬)2003-0003。受試樣品按實(shí)施例方法制備。方法動物隨機(jī)分成4組，即模型對照、陽性對照、受試樣品給藥高劑量組、低劑量組，受試樣品用0.5%CMC混懸，口服給藥。陽性對照-地塞米松為注射給藥。各組動物均每天給藥一次，連續(xù)4天，末次給藥后1小時(shí)，注射1%角叉菜膠致炎，致炎前先用排水法測各組大鼠右后足跖的體積一次，然后在大鼠右后足跖中部皮下注射1%角叉菜膠0.lml致炎，以后每隔一小時(shí)測定足跖體積一次，大鼠致炎前及致炎后不同時(shí)間右后足跖體積的差直即為腫脹值，計(jì)算腫脹率及抑制率，以t檢驗(yàn)法與模型對照組比較。結(jié)果10受試樣品對角叉菜膠致大鼠炎癥的影響(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01與模型對照組比較，"0"表示致炎前測量結(jié)果，()內(nèi)為腫脹率(％)，[]內(nèi)為抑制率。.結(jié)果顯示白英總苷對角叉菜膠所致大鼠足腫脹具有顯著抑制作用，表明白英總苷具有抗炎作用。5.藥物對鼠尾表皮顆粒細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)的影響材料ICR小鼠，26只，雌雄各半，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號SCXK(滬)2003-0003;全反式維甲酸(ATRA):鎮(zhèn)江市瑞達(dá)化工有限公司產(chǎn)品，批號070429;白英總苷按實(shí)施例方法制備；配制受試藥物及陽性對照ATRA均用少量DMSO溶解后，用乙醇稀釋制成搽劑，濃度為0.5%;采用外涂鼠尾給藥方式，每日一次，療程為14天。方法將小鼠隨機(jī)分組，雌雄各半。各組動物分別用相應(yīng)藥物涂抹尾部，空白對照組(Vehicle)給予同等容量的空白溶媒，每天1次，連續(xù)涂藥14天后，次日處死小鼠。取距尾根部1.8-4cm處表皮，以10%甲酸固定后，進(jìn)行組織切片及HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。觀察指標(biāo)①凡兩個(gè)毛囊口之間的鱗片表皮有排列成行的顆粒層者計(jì)為有顆粒層形成的鱗片，計(jì)數(shù)每100個(gè)鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)；②計(jì)數(shù)鼠尾表皮100個(gè)鱗片中顆粒細(xì)胞數(shù)，顆粒細(xì)胞為表皮中扁平或菱形細(xì)胞所組成，胞漿內(nèi)充滿深嗜堿性，粗大，HE染色呈深藍(lán)色透明的角質(zhì)顆粒。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果受試藥物對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成及顆粒細(xì)胞數(shù)的影響J±s)有顆粒層的鱗片數(shù)~~顆粒細(xì)胞數(shù)/100個(gè)組別濃度動物數(shù)/100個(gè)鱗片_鱗片Vehicle/1013.2±2.015.7±1.5ATRA0.5%817.5±2.0**23.1±2.0**白英總苷0.5%816.5±3.0*23.8±2.4**注:與Vehicle組相比,*為p〈0.05,料為pO.Ol6、白英總皂苷對人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞的抗增殖作用材料和方法HACAT細(xì)胞購自中科院細(xì)胞生化研究所。全反式維甲酸(ATRA):鎮(zhèn)江市瑞達(dá)化工有限公司產(chǎn)品，批號070429;白英總苷按實(shí)施例方法制備；將處于對數(shù)生長期的HACAT細(xì)胞以3XlOVml接種于含10%胎牛血清(GIBCO);lxl()SU丄-l青霉素，lxlCfug丄-l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37°C、5%(302條件下培養(yǎng)72小時(shí)，SRB法檢測受試藥物及對照藥物對細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果白英總皂苷對HACAT細(xì)胞增殖的抑制作用藥物IC50(ug/ml)ATRA9.07白英總苷24.01角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生是銀屑病的主要病理學(xué)變化之一，研究結(jié)果顯示白英皂苷對角質(zhì)形成細(xì)胞(HACAT)具有顯著抑制活性，提示可用于銀屑病的治療。7.白英總皂苷對胃癌細(xì)胞的抗增殖作用材料和方法BGC-823細(xì)胞購自中科院細(xì)胞生化研究所。白英總苷按實(shí)施例方法制備；將處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞以3XlOVml接種于含10%胎牛血清(GIBCO);1><10511丄-1青霉素，lxlQSug丄-l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37'C、5%(302條件下培養(yǎng)72小時(shí)，SRB法檢測受試藥物對細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果白英總皂苷對BGC-823細(xì)胞體外增殖具有明顯抑制作用，IC50:18.84ng/ml。上述研究表明白英總苷具有顯著的抗炎、保護(hù)胃粘膜、抑制幽門螺桿菌、抗胃癌細(xì)胞增殖、抗角質(zhì)形成細(xì)胞增殖等藥理活性，可用于制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌、銀屑病的藥物。該白英總苷作為有效組分，通過與藥用輔料按常規(guī)方法制成口服或非口服制劑，用于胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌、銀屑病的治療。特別優(yōu)選為口服固體制劑，可按常規(guī)方法與輔料制成片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑等各種劑型。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例h白英1000g，加入75。/。乙醇6L，加熱回流提取l小時(shí)，濾渣再以75%乙醇提取兩次，每次6L，加熱回流l小時(shí)，過濾，合并濾液。濾液濃縮到一定程度，以正丁醇萃取(500mlX4)，正丁醇以水洗后濃縮干燥，所得固體以石油醚洗滌，過濾，回收固體，得白英總苷，得率為3.6%,測得其總苷含量為49.4%實(shí)施例2:白英1500g，加入50。/。乙醇7L，加熱回流提取l小時(shí)，濾渣再以50%乙醇提取兩次，每次5L，加熱回流l小時(shí)，過濾，合并濾液。濾液濃縮到一定程度，以石油醚萃取，萃取后，水相上D101大孔樹脂，依次用水、20%乙醇洗滌，而后用50%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥，得白英總苷，測得其總苷含量為65.3%實(shí)施例3:白英1500g，加入純水7L，加熱回流提取l小時(shí)，濾渣再以純水提取兩次，每次5L，加熱回流l小時(shí)，過濾，合并濾液。濾液濃縮到一定程度，以石油醚萃取，萃取后，水相上D101大孔樹脂，依次以水-20%乙醇-50%乙醇-95%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，濃縮至無醇味，濃縮、干燥，即得白英總皂苷提取物，測得其總苷含量為59%。權(quán)利要求1、一種白英總皂苷提取物，其特征在于該提取物含有重量百分比為10％～90％的白英總皂苷，優(yōu)選為35％-90％的總皂苷。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的白英總皂苷提取物，其特征在于該提取物具有以下結(jié)構(gòu)的甾體皂苷中的一種或多種5-苦茄堿薯蕷皂苷3、一種如權(quán)利要求l所述的白英總皂苷提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)提取將原藥材經(jīng)過粉碎后，用水、甲醇或乙醇，或含水醇，室溫或加熱或回流提取13小時(shí)，可重復(fù)提取13次，然后濾去藥渣，濾液在常壓或減壓下濃縮至無醇味，得到濃縮液，靜置備用。(2)分離a，正丁醇萃取法其制備步驟為濃縮液以正丁醇0.5倍量至3倍量V/V萃取1-6次，萃取后，蒸干，得浸膏，所得浸膏再加1-6倍量的石油醚V/V洗滌，棄去洗滌液，固體干燥得白英總皂苷提取物；或b，大孔樹脂層析法其制備步驟為濃縮液以石油醚0.5倍量至3倍量V/V萃取卜6次脫脂，所得水層上樹脂柱，以水及稀醇醇濃度<30%洗滌，再用50-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，濃縮液干燥即得白英總皂苷。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的白英總皂苷提取物的制備方法，其特征在于該方法步驟(1)提取中所述溶劑為水、甲醇或乙醇或含水醇；優(yōu)選50%95%乙醇；溶劑用量為藥材重量的410倍，優(yōu)選6倍。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的白英總皂苷提取物的制備方法，其特征在于該方法步驟(2)所述樹脂柱為D101大孔樹脂柱、AB-8或HPD100大孔吸附樹脂。6、一種如權(quán)利要求l所述白英總皂苷提取物在制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌或銀屑病藥物中的用途。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述白英總皂苷提取物在制藥中的用途，其特征在于所述藥物為白英總皂苷提取物與藥用敷料制成的口服、注射或經(jīng)皮給藥制劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種白英總皂苷提取物，該提取物含有重量百分比為10％～90％的白英總皂苷。它是從中藥白英通過提取、分離和精制等步驟得到的總甾體皂苷。經(jīng)動物試驗(yàn)表明該提取物具有顯著抗炎、抗腫瘤、抑制幽門螺桿菌、保護(hù)胃粘膜和抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖等藥效作用，可用于制備治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃癌、銀屑病的藥物。文檔編號A61K36/81GK101450144SQ200710171900公開日2009年6月10日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者劍左,王作鵬,王曉川,斌胡,娜陳申請人:卡南吉醫(yī)藥科技(上海)有限公司