專利名稱：：王不留行有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物，具體地說涉及從王不留行中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。王不留行別名奶米、大麥牛、不母留、王母牛。來源為石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis(Nack.)Garcke的種子?；瘜W(xué)成分含王不留行皂甙(vacsegoside)、王不留行黃酮甙(vaccarin)等。性味性平，味苦。功能主治活血通經(jīng)，下乳消腫。用于乳汁不下、經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳癰腫痛。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一組中藥王不留行的有效組分。本發(fā)明的另一目的在于提供上述王不留行有效組分的制備方法。本發(fā)明還提供含有上述王不留行有效組分的制劑及該組分的用途。本發(fā)明的王不留行有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對王不留行進行提取，步驟2:藥渣用乙醇提取，得到提取液，步驟3:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液。步驟4:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液分別得到有效組分(或稱為B09，)。其中步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5，優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2，最優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇二l:l。所述步驟中，步驟l具體為取王不留行藥材，以乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，步驟2具體為藥渣用50-90%的乙醇提取，得到提取液，步驟3具體為以上提取液用5%乙醇溶解上樣，過0DS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，步驟4具體為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫，所述梯度洗脫程序如下表1梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明優(yōu)選的王不留行有效組分制備方法，包括下列步驟王不留行粉碎，加入6-10倍量乙酸乙酯:乙醇=1:1，加熱回流1-2小時，提取1-3次，藥渣加入6-10倍量50-90%乙醇，加熱回流，濾液合并得提取液，將提取液濃縮后，用5%乙醇溶解上樣，過ODS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，，用制備液相色譜繼續(xù)分離該洗脫液，分離條件色譜柱為Agilent制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下表2洗脫程序表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>流速為10ml/min,柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明最優(yōu)選的王不留行有效組分制備方法，包括下列步驟王不留行粉碎，加入8倍量乙酸乙酯:乙醇=1:1，加熱回流l小時，提取2次,藥渣加入8倍量70%乙醇，加熱回流1小時,提取2次,濾液合并得提取液，將提取液濃縮后，用5%乙醇溶解上樣，過0DS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，用制備液相色譜繼續(xù)分離該洗脫液，分離條件色譜柱為Agilent制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明36.0-40.0分鐘收集的有效組分成分如下表表3成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明還提供用本發(fā)明的中藥有效組分作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.卜99.鄉(xiāng)，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物，其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制齊IJ，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸齊U、散齊U、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。8適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、0—環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次l-20劑，如l-20袋或?；蚱?。本發(fā)明還提供本發(fā)明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。以下為藥理實驗的數(shù)據(jù)-1.藥理模型hl-60腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%混合培養(yǎng)HL60細胞，密度需低于106個/mL。計算需要細胞總量NT:pcel卜mL-1xVT(p:2x104個/mL)，其中VT二0.1m匕x孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加1(HJL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為:NL/4x104x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxV1。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，毎孔加入15(HjL。種板后選取4孔加入20(HjL培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入200pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案王不留行B09有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。在新的96孔板中加入220ijL/L的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50yL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法一加入20(HjL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，及陽性對照組(順鉑終濃度4pg/mL)。SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)100uL固定細胞，室溫放置5min，4。C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTris150uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物歸-空白歸x100%陰性對照組^值一空白組力值藥效結(jié)果見表4。根據(jù)HL-60腫瘤細胞抑制率結(jié)果，王不留行B09有效組分對抑制HL-60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)HepG2細胞。計算需要細胞總量NT二pcell'mL墨lxVT(p=2><103個/mL)，其中VT二0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(衡ad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案王不留行B09有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88nLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4嗎/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100HL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150nL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物隨-空白歸x観陰性對照組力值一空白組/i值藥效結(jié)果見表5。根據(jù)HepG2腫瘤細胞抑制率結(jié)果，王不留行B09有效組分對抑制HepG2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.藥理模型K562腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng):使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]卯％，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)K562細胞。計算需要細胞總量NT二pcellTiiL-lxVT(p二8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為:NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2二NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100nL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入10(HiLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案王不留行B09有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150nL。在新的96孔板中加入22(HiL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88nL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50嗎/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200nL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4嗎/mL)。SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70uL固定細胞，4。C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50liL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為4卯nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組難一空白組難x100%陰性對照組/f值一空白組力值藥效結(jié)果見表6。根據(jù)K562腫瘤細胞抑制率結(jié)果，王不留行B09有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%,非必需氨基酸(Gibco)l%混合培養(yǎng)MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT^pcell*mL-1—xVT(p=2xl03個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取l(HiL,加10jiL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2:NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100)nLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案王不留行B09有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50nL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法^加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88nLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4ng/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了反相硅膠柱，能有效地除去葉綠素等易在制備色譜柱上形成死吸附的雜質(zhì)，提高有效成分的含量，能快速準確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的王不留行有效組分化學(xué)成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的方法首次從王不留行藥材中得到含有組分B09的有效組分，并首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，由于成分確切，含量明確，制備工藝便捷，活性好，適宜開發(fā)成抗腫瘤中藥新藥。圖1為本發(fā)明王不留行有效組分1的HPLC分析圖。具體實施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例進一步詳細說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明并沒有限制。實施例1王不留行有效組分的制備250g王不留行粉碎，加入8倍量乙酸乙酯:乙醇=1:1，加熱回流l小時，提取2次,藥渣加入8倍量70%乙醇，加熱回流1小時,提取2次,濾液合并得提取液，將提取液濃縮后，用5%乙醇溶解上樣，過0DS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，用制備液相色譜繼續(xù)分離洗脫液，分離條件色譜柱為Agilent制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分(或稱為BIO，)。實施例2王不留行有效組分的分析對實施例1的王不留行有效組分的HPLC-ELSD聯(lián)用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmX150mm，5um);采用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2y。冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為70%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相8為30%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95。/。的0.2。/。冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL*min';檢測波長全波長；柱溫3(TC;ELSD條件漂移管溫度105°C;氮氣流速2.0L/min供試品溶液的制備稱取本發(fā)明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。實施例3王不留行有效組分制劑取實施例1的任何一種王不留行有效組分，0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8'C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例4王不留行有效組分制劑取實施例1的任何一種王不留行有效組分，0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。實施例5王不留行有效組分制劑取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實施例i的任何一種王不留行有效組分，0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。權(quán)利要求1、一種王不留行有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對王不留行進行提取，步驟2藥渣用乙醇提取，得到提取液，步驟3提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液。步驟4用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。2、權(quán)利要求1的提取物，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5。3、權(quán)利要求1的提取物，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2。4、權(quán)利要求1的提取物，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1:1。5、權(quán)利要求l的提取物，其特征在于，其制備過程包括以下步驟步驟2中所述藥渣用乙醇提取，所述乙醇為50-90%的乙醇，步驟3中所述經(jīng)過色譜柱層析是用5%乙醇溶解上樣，過ODS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，步驟4為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫。6、權(quán)利要求5的有效組分，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下Time(min)A(%)B(%)095549555450506059564595流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。7、含有權(quán)利要求l-6任何一項有效組分的藥物組合物。8、權(quán)利要求1的有效組分的制備方法，其特征在于，其制備過程包括以下步驟:步驟h用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對王不留行進行提取，賄2T育艦認TOrr^f!fMW，步驟3:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液。步驟4:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。9、權(quán)利要求8的有效組分的制備方法，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取王不留行藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，步驟2為所述藥渣用乙醇提取，所述乙醇為50-90%的乙醇，步驟3中所述經(jīng)過色譜柱層析是用5%乙醇溶解上樣，過ODS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，步驟4為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動相為水-A和乙腈-B，進行梯度洗脫，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段36.0-40.0分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。10、權(quán)利要求9的有效組分的制備方法，其特征在于，步驟如下王不留行粉碎，加入8倍量乙酸乙酯:乙醇=1:1，加熱回流l小時，提取2次,藥渣加入8倍量70%乙醇，加熱回流l小時，提取2次,濾液合并得提取液，將提取液濃縮后，用5%乙醇溶解上樣，過ODS-C18柱，首先，采用5%乙醇作為流動相，然后改換50%乙醇作為流動相，得洗脫液，用制備液相色譜繼續(xù)分離洗脫液，分離條件色譜柱為Agilent制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水A和乙腈B，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用50%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，柳,丁6^恥1分^*^乾，箭辭11^&^。全文摘要本發(fā)明公開了一種王不留行有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對王不留行進行提取，步驟2藥渣用乙醇提取，得到提取液，步驟3提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液。步驟4用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動相為水和乙腈，收集36.0-40.0分鐘洗脫液得到有效組分。本發(fā)明還公開了其制備方法、藥學(xué)上可接受的制劑，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61K36/36GK101433571SQ20071015015公開日2009年5月20日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日發(fā)明者靂劉,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽霍申請人:天津天士力制藥股份有限公司