專利名稱：王不留行中抑制血管生成的一種低毒的有效部位的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
王不留行中抑制血管生成的有效部位的制備工藝和應(yīng)用。本發(fā)明涉及從中藥王不 留行中提取、分離得到的一種低毒有效部位，具有抑制血管生成的活性。闡明了其制備方 法，及其在醫(yī)藥、食品、化妝品方面的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤直徑大于1毫米呈腫瘤轉(zhuǎn)移趨勢(shì)時(shí)，必需先形成新的腫瘤血管。抑制腫 瘤內(nèi)部和周圍新血管形成便可有效減少，甚至消除腫瘤。近年來，腫瘤血管生成已成為腫 瘤治療中一個(gè)很有吸引力的熱點(diǎn)。目前開發(fā)出許多血管生成抑制劑在進(jìn)行I III期臨 床試驗(yàn)研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、內(nèi)皮抑素(Endostatin)、煙曲霉素類似物 及金屬蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多種。美國 Genentech 公司以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)為靴 標(biāo)的抗新生血管形成藥Avastin近年用于治療晚期轉(zhuǎn)移的直腸癌和乳腺癌等，延長(zhǎng)病人生 命4-6個(gè)月。2007年Avastin的年銷售量已超過24. 5億美元，2009年銷售額達(dá)到59億美 元。Avasitin成為近年抗癌新藥的一枝獨(dú)秀。此外，幾種針對(duì)不同靶標(biāo)的抗新生血管形成 的藥物已進(jìn)入 II、III 期臨床試驗(yàn)[1. Ellis L M, HicklinD J. VEGF-targeted therapy mechanisms of anti-tumour activity. Nat Rev Cancer. 2008,8 :579_591]。但目前上市的抑制腫瘤血管新生的藥物只能靜脈給藥，且用藥劑量較大、治療時(shí) 間長(zhǎng)。因此開發(fā)口服、高效低毒、價(jià)廉的血管生成抑制劑成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”是中藥治療疾病的特點(diǎn)，發(fā)揮祖國醫(yī)學(xué)特色，從多途徑、 多層次、多環(huán)節(jié)，研究中藥直接地或間接地影響血管新生，有著重要的臨床意義和應(yīng)用前 景。通過建立體內(nèi)、體外血管生成篩選模型，尋找到目的中藥王不留行等，并對(duì)其進(jìn)行提取 分離，獲得若干有效部位。進(jìn)一步通過藥效與毒性評(píng)價(jià)，得到一高效低毒有效部位。王不留行為麥藍(lán)菜[Vaccaria segetalis (Neck. ) Garcke]的干燥成熟種子。它的 異名為不留行，王不流行，禁宮花，剪金花，金剪刀草，金盞銀臺(tái)，麥藍(lán)子。它資源豐富，主產(chǎn) 于河北、山東、遼寧、黑龍江等地，以河北產(chǎn)量最大。[2.國家藥典委員會(huì).中華人民共和國 藥典[S]. —部.北京中國醫(yī)藥科技出版社，2010:藥材及飲片49-50]。王不留行中主要含 有三萜皂苷，黃酮苷，環(huán)肽，類脂和脂肪酸，單糖等。該植物苦，平；入肝，胃經(jīng)。對(duì)行血通經(jīng)， 催生下乳，消腫斂瘡；婦女閉經(jīng)，乳汁不通，難產(chǎn)，血淋，癰腫，金瘡出血等有很大效用[3.桑 圣民，勞愛娜，王洪誠.王不留行成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10:1]。王 不留行水提物有抑制血管生成的作用，經(jīng)分離純化的有效組分有抑制HMEC-I增殖、遷移、 粘附的作用[4.夏明星，張蓮芬，王一君，等.王不留行提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及其黏 附的作用評(píng)價(jià)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25 (6) 817-8195.夏明星，馮磊，張蓮芬，等.王 不留行中抗人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有效組分的分離和純化[J].生物技術(shù)通報(bào).2009，2 93-97]。CN 102068481 A
說明書
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從王不留行中提取分離得到的低毒的有效部位，具有抑 制血管生成的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案一種用于抑制血管生成的低毒的王不留行有效部位。所述有效部位的制備方法，用75%乙醇對(duì)王不留行加熱提取，并將提取液過濾、濃 縮成浸膏。所得的浸膏依次經(jīng)石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取后用水飽和正丁醇萃取，收 集正丁醇萃取相，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。所述有效部位，體內(nèi)、體外均有抑制血管生成的作用。所述有效部位經(jīng)Molish反應(yīng)、Libermann-Buchard反應(yīng)、三氯化銻反應(yīng)均呈陽性， 說明上述這些有效部位均含有至少一種以上苷類成分。所述王不留行有效部位在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，其特征是該抑制血管 生成藥物中含有幾種有效劑量的王不留行有效部位，以及常規(guī)藥用載體和/或賦形劑。所述王不留行有效部位在制成抑制血管生成藥物時(shí)，可以加入一種或多種藥學(xué)上 可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑，賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩 解齊 、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑，必要時(shí)還可以加 入香味劑、甜味劑等。所述王不留行有效部位在制成抑制血管生成藥物時(shí)，可以按常規(guī)的制劑工藝，單 獨(dú)使用或與其它藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，例如注射液、 片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┗蛉閯┑榷喾N形式。所述的應(yīng)用，為所述有效部位是用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾 病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早 熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體合纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生 成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀 屑病，毛細(xì)管擴(kuò)張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動(dòng)脈粥樣硬化，脂溢性皮炎和痤 瘡。所述的應(yīng)用，為所述有效部位有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治 療、預(yù)防的用途。所述的應(yīng)用，為所述有效部位還有用于腫瘤化療和/或輔助化療的用途。所述有效部位在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用，是上述有效部位用于抑 制血管生成的保健食品組合物。所述有效部位在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用，是上述有效部位用于抑制 血管生成的化妝品組合物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以血管生成作為治療疾病的靶點(diǎn)，首次明確王不留行中具有抑制血管生成 活性的低毒有效部位的制備工藝方法，并將其作為用于腫瘤血管生成及其它與血管生成有 關(guān)的疾病預(yù)防、治療的藥物，其特點(diǎn)是療效高，副作用小。且以血管生成理論為研究背景，為 今后闡述中藥有效部位的作用機(jī)制，發(fā)展中醫(yī)藥理論新的方向，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)提供重要的科學(xué)依據(jù)。


圖1王不留行有效部位對(duì)HMEC細(xì)胞體外增殖的抑制作用圖2王不留行有效部位對(duì)體外HMEC細(xì)胞遷移的抑制作用圖3王不留行有效部位對(duì)小鼠H22體內(nèi)腫瘤的抑制作用圖4王不留行有效部位對(duì)小鼠H22實(shí)體瘤的病理改變圖5致毒劑量王不留行有效部位對(duì)小鼠主要臟器的損傷 圖注A、C、Ε、G、I分別為對(duì)照組的腦，肺，肝，心，腎
B、D、F、H、J分別為給藥組的腦，肺，肝，心，腎
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 王不留行的有效部位提取分離工藝與理化性質(zhì)的鑒定王不留行50g，10倍量75%乙醇加熱連續(xù)回流提取2次，合并提取液，減壓回收溶 劑，冷凍干燥后得總提取物。取乙醇回流提取物500mg加水混懸依次用石油醚部分、二氯甲 烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。所得正丁醇組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，水復(fù)溶，冷凍干燥， 得率為原藥材的1. 26%。有效部位的Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermarm-Buchard反應(yīng)呈紫 紅色，三氯化銻顯色為紅色。此結(jié)果說明這一有效部位含有至少一種以上苷類化合物。實(shí)施例2 王不留行的有效部位對(duì)HMEC細(xì)胞增殖的抑制作用將HMEC用含lmmol/L谷氨酰胺、lmg/L氫化可的松、10 μ g/L EGF和150mL/L小牛 血清的MCDB-131培養(yǎng)液，于37°C，50mL/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMEC細(xì) 胞，按每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，放置于37°C、50mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加 入不同濃度藥物作用時(shí)間48h，以不加藥組為陰性對(duì)照組，每組同時(shí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每批樣品 重復(fù)3次試驗(yàn)。加藥后培養(yǎng)至72h，去上清液，每孔輕輕加入100g/L三氯醋酸100 μ L固定， 靜置5min后移到4°C再放置至40min，傾掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥。每孔加 入4g/L SRB 10(^1^室溫放置3011^11，用10111171醋酸液洗5遍，加入15(^1^ l(kimol/L Tris 堿液(pH 10.5)溶解，用MK3型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A54tl處測(cè)定每孔A值。計(jì)算抑制率(％)，求 出半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(IC5(I)。抑制率=[(對(duì)照組的A值-藥物組的A值)/(對(duì)照組的A 值-空白組的A值)]X 100%。根據(jù)所得的結(jié)果計(jì)算，對(duì)HEMC細(xì)胞半數(shù)抑制量IC5tl為6. 44士0.2 μ g/mL。圖1所示。實(shí)施例3 王不留行的有效部位對(duì)體外HMEC遷移的抑制作用用劃線灼傷法研究細(xì)胞遷移[6.喬洪旺，康鵬程，田墨涵等.血管生成抑素對(duì)胃癌 細(xì)胞的影響[J]·解剖科學(xué)進(jìn)展，2010，16 (34) :315-318]，將常規(guī)培養(yǎng)的HMEC細(xì)胞消化懸 浮，以每孔IOXlO4個(gè)/mL細(xì)胞加到24孔板中，每孔ImL,置37°C,5% CO2及飽和濕度的培 養(yǎng)箱中孵育24h，待細(xì)胞貼壁后用移液塑料槍頭于每孔中心位置劃一條約Imm寬的灼傷帶， 然后用PBS洗去脫落細(xì)胞，并加入10 μ g/mL藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的完 全培養(yǎng)基。然后在100X顯微鏡下拍照，此刻為Oh細(xì)胞遷移圖，培養(yǎng)12、24h時(shí)分別于同一 視野處拍，所得圖片用Image-pro plus 6軟件測(cè)量灼傷帶距離，每個(gè)視野隨機(jī)取6個(gè)位點(diǎn)，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果見圖2。實(shí)施例4 王不留行的有效部位對(duì)小鼠體內(nèi)H22實(shí)體瘤的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22細(xì)胞，消化，用0. 9%生理鹽水稀釋調(diào)整濃度至鏡下瘤細(xì)胞 1 X IO7個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液置于冰上，用ImL無菌注射器分別于每只小鼠右腋皮下接種 0.2mL，整個(gè)過程在半小時(shí)內(nèi)完成。動(dòng)物造模右前肢腋下接種作為實(shí)體瘤小鼠。接種后的 實(shí)體瘤小鼠隨機(jī)分為四組，模型組及給藥高劑量組5mg/kg、中劑量組2. 5mg/kg、低劑量組 1.25mg/kg三個(gè)劑量組，每組各10只。于24小時(shí)后準(zhǔn)時(shí)給藥，灌胃1次/日，連續(xù)10大。 結(jié)果表明各劑量組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率在30-70%之間，有明顯的量效關(guān)系。HE染色病理 鏡下觀治療組新生血管密度減少，有不同程度的壞死區(qū)。圖3、4所示。實(shí)施例5 王不留行有效部位小鼠急性毒性ICR小鼠，雌雄各半，體重18_25g。禁食4h后一次性灌胃給藥，給藥后再禁食2h， 連續(xù)觀察14d。5. 1近似致死量和最小致毒量的探究以臨床人用原藥的最大劑量為依據(jù)，折算有效部位含量，折算合相當(dāng)于小鼠用量 2mg/kg，并以此量(2mg/kg)高于其 10 倍(20mg/kg)、20 倍(40mg/kg)、40 倍(80mg/kg)、50 倍(100mg/kg)、100 倍(200mg/kg)、500 倍(1000mg/kg)、1000 倍(2000mg/kg)劑量分組給 藥，每組動(dòng)物3只，同時(shí)發(fā)生理鹽水對(duì)照組。隨劑量增至100mg/kg時(shí)，出現(xiàn)毒性反應(yīng)。其一 般表現(xiàn)為輕度飲食減少、體重減輕。病理報(bào)告肝、腎均有輕度變性樣損傷。2000mg/kg時(shí) 出現(xiàn)小鼠死亡，尸解情況心、肺、肝、脾均有明顯淤血征，心肌松弛，肺片狀出血，肝質(zhì)脆、邊 緣變鈍、表面顆粒粗大，胃內(nèi)少量軟食糜，膀胱無充盈，其余肉眼觀無明顯異常。病理報(bào)告 心肌大片變性壞死灶，肝彌漫性損傷，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，部分腸粘膜脫落。5. 2重要臟器形態(tài)學(xué)觀察小鼠灌胃14天時(shí)，脫頸致死，速取心、腦、肺、肝、脾、腎新鮮組織，于10%福爾馬林 固定，常規(guī)浸蠟包埋，5 μ m切片。切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosir^HE)染 色。腦組織出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，膠質(zhì)結(jié)節(jié)，血管有壞死跡象。肺泡壁明顯增厚，甚至出現(xiàn)區(qū)域 實(shí)變。肝細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，中央靜脈內(nèi)壁不完整。心肌臟組織細(xì)胞疏松僅剩殘留肌膜。腎 小管異常，腎小球未見顯著變化。圖5所示。本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能領(lǐng)會(huì)在公開的實(shí)施例中作許多改變也可獲得相同或類似的結(jié)果，而不超出本 發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說，顯然有些化學(xué)和生理性的相關(guān)試劑可替代本文所公 開的試劑而得到相同或類似的結(jié)果。所有類似的取代和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然 都認(rèn)為是本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的，即所有上述這些等價(jià)形式都同 樣落于本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種權(quán)利要求王不留行中具有抑制血管生成作用的一種低毒有效部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效部位，其特征是所述有效部位來源于王不留行Vaccaria segetalis0
3.權(quán)利要求1或2所述有效部位的提取方法，其特征是，用有機(jī)溶劑、含水有機(jī)溶劑或 水來提取王不留行的種子，并將提取液過濾、濃縮成浸膏。
4.權(quán)利要求1或2所述有效部位的制備方法，其特征是將權(quán)利要求3所得的浸膏經(jīng)水 飽和正丁醇萃取，收集有效部位，同收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。
5.一種權(quán)利要求3，4所述的有效部位在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，其特征是該 抑制血管生成藥物中含有有效劑量的幾種王不留行有效部位和/或有效成分，以及常規(guī)藥 用載體和/或賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物被制成注射液、片劑、粉劑、顆粒 劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┗蛉閯┑葎┬汀?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是用于預(yù)防和/或治療至少一 種選自下述之一的疾病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖 尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆 粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性 及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細(xì)管擴(kuò)張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動(dòng)脈粥樣硬 化，脂溢性皮炎和痤瘡。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是該藥物有抗腫瘤新生血管生成及其它與血管 生成有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是該藥用組合物還有用于腫瘤化療和/或輔助 化療的用途。
10.一種權(quán)利要求3，4所述的一種有效部位體在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng) 用，其特征是該有效部位用于抑制血管生成的保健食品組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及王不留行中抑制血管生成的有效部位的制備方法及應(yīng)用。其制備方法用75％乙醇對(duì)王不留行加熱提取，提取物依次經(jīng)石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到王不留行中抑制血管生成的有效部位。本發(fā)明以血管生成作為治療疾病的靶點(diǎn)，研究并闡明王不留行有效部位的藥用療效和機(jī)制，為其新用途開發(fā)和發(fā)現(xiàn)藥物作用新的靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)和重要信息。本發(fā)明的有效部位可與藥學(xué)上適用載體混合制成各種制劑。它可用于治療或預(yù)防與血管生成相關(guān)的疾病，還可用于腫瘤化療和/或輔助化療方面的治療。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102068481SQ20101057782
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者馮磊, 杜芳芳, 邱麗穎, 金堅(jiān), 高越穎 申請(qǐng)人:江南大學(xué)