專利名稱：：一類抗凝血多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類抗凝血多肽及其用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：凝血是機(jī)體的重要生理防御過(guò)程，但病理性血栓嚴(yán)重危害人類健康。目前國(guó)內(nèi)外臨床使用的主要抗凝血藥物是普通肝素、低分子量肝素、華法林等，這些藥物存在導(dǎo)致血小板減少、出血等副作用或需要密切的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。而多肽類抗凝血藥物，如水蛭素、比伐盧定以及可口服的小分子類肽藥物(如希美加群等)等，具有起效快、副作用較小等突出優(yōu)點(diǎn)，是今后抗凝血藥的重點(diǎn)發(fā)展方向。凝血酶在血栓過(guò)程中起著中心作用(1)裂解纖維蛋白原成纖維蛋白；(2)激活因子V、V1及XI，這些因子反過(guò)來(lái)形成更多的凝血酶；(3)剌激血小板。此外，通過(guò)激活因子WI使纖維蛋白交聯(lián)穩(wěn)定栓塞。凝血酶具有三個(gè)結(jié)合區(qū)纖維蛋白結(jié)合區(qū)、底物催化(活性)區(qū)及肝素結(jié)合區(qū)。凝血酶由含36個(gè)氨基酸的A鏈及259個(gè)氨基酸的B鏈組成，A鏈與B鏈由二硫鍵連接，像其他絲氨酸蛋白酶一樣，它包括一個(gè)典型的催化三元體(Aspl02、His57及Serl95)，其Sl結(jié)合區(qū)象一個(gè)深的口袋，底部的Aspl89能與底物的氨基或胍基形成氫鍵或靜電相互作用，該區(qū)的疏水區(qū)可結(jié)合疏水基團(tuán)。與其他胰蛋白酶不同的是還有第二個(gè)疏水區(qū)(S2)，該區(qū)含有疏水的YPPW環(huán)。此外，酸性的Gkil92殘基處于口袋的入口處，對(duì)識(shí)別底物及抑制劑十分重要。凝血酶的纖維蛋白及肝素結(jié)合區(qū)主要由數(shù)個(gè)精氨酸及賴氨酸組成，可與電負(fù)性氨基酸及基團(tuán)結(jié)合。水蛭素是最早發(fā)現(xiàn)的多肽類凝血酶直接抑制劑，由65個(gè)氨基酸殘基組成，自然界中有多種水蛭素變異體，抗凝活性較強(qiáng)的主要有HV1、HV2及HV3等(SalzetM.CurrPharmDes，2002，8(7):493~503)。水蛭素可結(jié)合凝血酶的底物催化區(qū)和纖維蛋白結(jié)合區(qū)，與凝血酶形成1:1的復(fù)合物(結(jié)合常數(shù)Ki為高達(dá)20fM)(KrsttenanskyJL,etal.FEBSLett,1990，269:425~429)，阻止凝血酶將纖維蛋白原降解成為纖維蛋白單體，從而抑制纖維蛋白單體的凝結(jié)。水蛭素具有不能口服、體內(nèi)易降解等缺點(diǎn)，可通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾來(lái)克服。如用PEG分子或硬脂酸、油酸等親脂化合物修飾的水蛭素可獲得較長(zhǎng)的半衰期。RGD融合水蛭素則還具有抗血小板聚集功能。注射用的基因工程雙功能水蛭素(RGD-hirudin)己于2005年獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入臨床研究，臨床適應(yīng)癥為血管吻合術(shù)后的抗凝、防栓治療，并可用于治療心絞痛、深靜脈血栓等疾病。由水蛭素衍生出的小分子肽很多，有的只結(jié)合凝血酶催化區(qū)，有的只結(jié)合凝血酶的纖維蛋白結(jié)合區(qū)，活性不理想，有的活性雖然較高，但合成較難。比伐盧定(Bivalimdin，hirulog-l)是人工合成的水蛭素衍生物，含有20個(gè)氨基酸殘基，其氨基端能結(jié)合凝血酶的底物催化區(qū)，而其呈酸性的羧基端則能結(jié)合凝血酶的纖維蛋白結(jié)合區(qū)(BourdonP,et，al.FEBSLett,1991,293:163—166)，中間由4個(gè)Gly組成一個(gè)柔性的連接部分。比伐盧定比水蛭素有更寬的治療窗及安全性，但缺點(diǎn)是兩者都不能口服，體內(nèi)易降解，半衰期較短。小分子類肽抗凝劑主要有阿加曲班、希美加群、達(dá)比加群等。阿加曲班由N-a-苯磺?；?L-精氨酸甲酯改造而成，能可逆、選擇性地結(jié)合凝血酶催化位點(diǎn)(PrevilleP，etal.BioorgMedChemLett，1997，7(12):1563~1566)。近年來(lái)，一些阿加曲班類似物被合成(SalvagniniC,etal.EurJMedChem.2007,42(1):37-53.)，如將其強(qiáng)堿性的胍基替換成親脂性的側(cè)鏈，以提高其細(xì)胞通透性及口服利用度。美拉加群是D-Phe-Pro-Arg三肽序列的類似物，其中苯脒基代替精氨酸，azetidine-2-羧酸代替脯氨酸，D-型環(huán)己基甘氨酸代替D-苯丙氨酸，美拉加群能可逆地抑制凝血酶的催化位點(diǎn)(GustafssonD,et.al.JInternMed.2003，254(4):322~334)。將美拉加群的羧基上變成酯基，脒基加胺肟基，可轉(zhuǎn)化為口服的前藥一希美加群(BoosCJ，et.al.EurJInternMed,2005,16(4):267278)，希美加群是繼肝素發(fā)展50多年后，出現(xiàn)的第一個(gè)可口服的抗凝血藥，它受食物和其他藥物的干擾小，藥效可以預(yù)測(cè)，不需要抗凝血監(jiān)測(cè)，但由于其肝毒性，2006年2月Astrazeneca公司宣布將希美加群(ExantaTM)從市場(chǎng)上撤回。達(dá)比加群(dabigatran，BIBR953)包含三取代的苯并咪唑核心骨架，含有一個(gè)4-氨基的苯丙氨酸類似物，可結(jié)合凝血酶催化位點(diǎn)(BatesSM,et.al.BrJPharmacol.2005，144(8):10171028)，達(dá)比加群酯化后轉(zhuǎn)變成可口服的BIBR1048(dabigatranexexilate)。目前已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。理想的抗凝血藥物應(yīng)該具有如下特性抗凝活性良好，藥效可以預(yù)測(cè)，不需要實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，可口服，起效快，副作用小等。目前的抗凝藥還未能滿足這些要求。小肽及可口服的小分子類肽或化合物將是今后抗凝血藥物的重點(diǎn)研究方向，而小分子類肽凝血酶抑制劑已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，減少副作用是今后的努力方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一類新型抗凝血多肽，該類多肽與比伐盧定相比，其抗凝血活性更強(qiáng)。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這類抗凝血多肽在制藥領(lǐng)域的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案抗凝血多肽，一級(jí)結(jié)構(gòu)如通式所示(D^FPRP-XrXrXsUs-QGDFEPIPEDAYDE-NH2其中XI選自G、AEEA、K(steric)、R中任意一個(gè)；X2選自G、K(steric)、R中任意一個(gè)或空缺；X3選自G、K(steric)、D中任意一個(gè)或空缺X4選自G、K(steric)、W、D中任意一個(gè)；X5選自P、S中任意一個(gè)或空缺；其中A為丙氨酸；D為天冬氨酸；E為谷氨酸；F為苯丙氨酸；(D)-F為D型苯丙氨酸；G為甘氨酸；I為異亮氨酸；K(steric)為具有硬脂酸側(cè)鏈的賴氨酸；P為脯氨酸；Q為谷氨酰胺；R為精氨酸；S為絲氨酸；W為色氨酸；Y為酪氨酸，AEEA為2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸。通式I多肽分別是下列多肽，他們的序列分別如下多肽h(D)-FPRP-GGGG國(guó)QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽2:(D)-FPRP-AEEA-G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽3:(D)-FPRP-G陽(yáng)K(steric)GG-QGDFEPIPEDAYDE國(guó)NH2多肽4:(D)-FPRP-GG-K(steric)G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽5:(D)-FPRP-GGG-K(steric)-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽6:(D)-FPRP隱GRGDS-QGDFEPIPEDAYDE陽(yáng)NH2多肽7:(D)-FPRP-RGDWP-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽8:(D)隱FPRP國(guó)K(steric)GGG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2在上述多肽中，抗凝活性特別好的是多肽1、2、3及6。此外，我們還合成了下列多肽，他們的序列如下多肽9:(D)-FPRP-AEEA陽(yáng)G-NGDFEEIPEEYL多肽10:(D)-FPRP-PABA-G-NGDFEEIPEEYL多肽11:(D)-FPRP陽(yáng)PAMBA-G-NGDFEEIPEEYL多肽12:(D)-FPRP-GRGDWP-DFEEIPEEYL多肽13:(D)-FPRP-RGDWPG-DFEEIPEEYLPABA為對(duì)氨基苯甲酸，PAMBA為對(duì)氨甲基苯甲酸。本發(fā)明所提供的多肽能同時(shí)結(jié)合凝血酶的底物催化區(qū)和纖維蛋白結(jié)合區(qū)，并具有更強(qiáng)的抗凝血活性。其氨基端為疏水性的(D)-FPRP序列，能結(jié)合凝血酶的底物催化區(qū)，而凝血酶在與其結(jié)合后能緩慢切割R-P之間的酰胺鍵(WittingJI,et.al.BiochemJ,1992，283:737~743)，使其失活。其羧基端氨基酸序列整體呈電負(fù)性，能結(jié)合凝血酶的纖維蛋白結(jié)合區(qū)，我們用水蛭素變種III的羧基端序列(QGDFEPIPEDAYDE)替換了himlog-l的羧基端的十二個(gè)氨基酸殘基(NGDFEEIPEEYL)，替換后的羧基端具有更強(qiáng)的電負(fù)性，與凝血酶的親和力更強(qiáng)。而羧基端與氨基端之間則用柔性的氨基酸序列連接起來(lái)，我們用人工合成的有機(jī)化合物替換了柔性序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，另外，在序列終引入了帶有硬脂酸側(cè)鏈的賴氨酸，以期減緩凝血酶對(duì)多肽的降解，增強(qiáng)抗凝活性。本發(fā)明可以通過(guò)固相合成、液相合成、工程菌表達(dá)等方法進(jìn)行生產(chǎn)。例如，采用固相合成，在樹(shù)脂上逐個(gè)偶聯(lián)氨基酸序列，以形成本發(fā)明；合成或提取可以表達(dá)本發(fā)明的DNA序列，連接到某一載體上，并轉(zhuǎn)染到真核或者原核生物的細(xì)胞中，表達(dá)含有本發(fā)明所提供的多肽序列的蛋白質(zhì)或者多肽，經(jīng)提取和純化得到本發(fā)明的多肽。本發(fā)明提供的多肽可以在美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433型固相合成儀上合成，多肽的修飾手工完成。該合成使用的氨基酸以Fmoc保護(hù)(美國(guó)AdvancedChemtech公司產(chǎn)品)，使用的樹(shù)脂為Rink樹(shù)脂或Wang樹(shù)脂(美國(guó)AdvancedChemtech公司產(chǎn)品)。合成時(shí)使用l-羥基苯并三唑(HoBt)(美國(guó)AdvancedChemtech公司產(chǎn)品)溶解在N-甲基吡咯烷酮(薩P)(PE公司)中作為活化劑，使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(Acros公司)作為偶聯(lián)劑，使用哌啶(Piperidine)(上海吉爾生化)除去保護(hù)基。氨基酸均具有L-型化學(xué)結(jié)構(gòu)(Fmoc-D-Phe-0H除外)，它們被依次偶聯(lián)在Rink或Wang樹(shù)脂上。樹(shù)脂的使用量與Fmoc保護(hù)氨基酸的使用量按1:5進(jìn)行，保護(hù)氨基酸(美國(guó)AdvancedChemtech公司產(chǎn)品)如下Fmoc-D-Phe-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Asn(Trt)_0H、Fmoc-Asp(OtBu)_0H、Fmoc-Phe-0H、Fmoc-Glu(0tBu)-0H、Fmoc-Ile-0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-0H、而人工改造而成的Fmoc-Lys(steric)-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-PABA以及Fmoc-PAMBA為本實(shí)驗(yàn)室合成，氨基酸的偶聯(lián)按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行。上述合成后的肽樹(shù)脂用裂解液(組成二巰基蘇糖醇(DTT)0.5g，水0.5ml，三氟乙酸(TFA)8.8ml，和三異丙基硅烷(TIPS)0.2ml)裂解2.53.O小時(shí)，過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分三氟乙酸后，用預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，過(guò)濾得到初肽，用去離子水或稀氨水溶解固體，過(guò)濾，濾液凍干。上述凍干粗肽用反相HPLC進(jìn)行純化，純化柱為反相Cw半制備柱(Zorbax,300SB-C18,9.4mmx25cm)，梯度洗脫液為含有不同梯度的乙腈(含0.1%TFA)/水(含O.1%TFA)，收集目標(biāo)峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽。一類抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途。本發(fā)明的多肽可以用于手術(shù)后深靜脈血栓的預(yù)防及治療，用于行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)的不穩(wěn)定型心絞痛患者的抗凝治療，或者與血小板糖蛋白IIb/IIIa抑制劑聯(lián)合用于經(jīng)皮冠脈介入(PCI)治療的患者的抗凝治療，以及替代肝素用于需要抗凝治療的肝素引起的血小板減少癥的患者?？梢詫⒑斜景l(fā)明的多肽或其截?cái)辔?、衍生物及組合物的藥物直接給予病人，或者與適宜的載體或者賦型劑混合后給予病人。這里的載體材料包括水溶性載體材料，如聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，有機(jī)酸等；難溶性載體材料，如乙基纖維素，膽固醇硬脂酸酯等；腸溶性載體材料，如醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素等。使用這些材料，可以制成如下的劑型片劑、栓劑、溶液、膠囊、氣霧劑、泡騰片和滴劑等。使用上述劑型，本發(fā)明的所提供的多肽及其衍生物、截?cái)辔锖皖愃莆锛敖M合物可以經(jīng)注射給藥，包括靜脈注射、皮下注射、腔內(nèi)注射等；粘膜給藥，如鼻腔給藥，在局部起效或經(jīng)粘膜吸收全身發(fā)揮作用；腔道給藥，如經(jīng)直腸給藥，局部起效或者經(jīng)吸收全身發(fā)揮作用。上述給藥途徑優(yōu)選的是經(jīng)靜脈注射給藥。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明根據(jù)凝血酶和抗凝藥物比伐盧定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用方式，設(shè)計(jì)合成了了一類抗凝血多肽，他們不僅能高效、特異抑制凝血酶活性，而且其所具有的氨基酸個(gè)數(shù)與比伐盧定相當(dāng)，合成容易，抗凝活性更強(qiáng)。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為多肽1純化后的HPLC分析圖譜。圖2為多肽2純化后的HPLC分析圖譜。圖3為多肽3純化后的HPLC分析圖譜。圖4為多肽6純化后的HPLC分析圖譜。圖5為多肽7純化后的HPLC分析圖譜。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:多肽1的合成和純化一.合成稱取0.17gRink樹(shù)脂(0.l腿ol，取代率O.6g/mmo1)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmo1，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine，上海吉爾生化)脫保護(hù)，按美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433A型固相合成儀的操作說(shuō)明，適當(dāng)延長(zhǎng)偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)時(shí)間(20-30min)，合成肽-樹(shù)脂。取上述肽-樹(shù)脂，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2nd后，用100ml預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過(guò)濾得到初肽，用1%的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽，純度約為60%。二.純化取粗月太39.Omg用HPLC純化，色譜柱為反相C18半制備柱(Zorbax，300SB-C18,9.4mmx25cm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1%TFA);B，水(含0.1%TFA)。洗脫梯度為1-25min，15%-70%A，流速3ml/min，UV214nm檢測(cè)，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽19.2mg。多肽l的純度分析見(jiàn)圖l。多肽純化后的HPLC分析圖譜流速lml/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nm柱溫25°C梯度洗脫梯度為0-lmin，0-15M1-25min，150/0_70%A25-27min，80%_90%AA，乙腈(含O.1%TFA);B，水(含O.1%TFA)上樣量50pg分析柱Kromasil，C-18柱(北京分析儀器廠)，5ym,04.6mmx250mm實(shí)施例2:多肽2的合成和純化一.合成稱取0.17gRink樹(shù)脂(0.lmmol，取代率O.6g/mmo1)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmo1，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine，上海吉爾生化)脫保護(hù)，按美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433A型固相合成儀的操作說(shuō)明，適當(dāng)延長(zhǎng)偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)時(shí)間(20-30min)，合成肽-樹(shù)脂。取上述肽-樹(shù)脂，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2ml后，用100ml預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過(guò)濾得到初肽，用1%的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽，純度約為65%。二.純化取粗肽39.Omg用HPLC純化，色譜柱為反相Cw半制備柱(Zorbax，300SB-C18,9.4mmx25cm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1%TFA);B，水(含0.1%TFA)。洗脫梯度為l-25min，15%-70%A，流速3ml/min，UV214nm檢測(cè)，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽21.8mg。多肽2的純度分析見(jiàn)圖2。多肽純化后的HPLC分析圖譜流速lml/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nm柱溫25°C梯度洗脫梯度為0-lmin，0-15%A1-25min，15%-70%A25-27min，80%-90%AA，乙月青(含O.1%TFA);B，水(含O.1%TFA)上樣量50ug分析柱Kromasil，C-18柱(北京分析儀器廠)，5um,04.6mmx250mm實(shí)施例3:多肽3的合成和純化一.合成稱取0.17gRink樹(shù)脂(0.lmmol，取代率O.6g/mmo1)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmo1，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine，上海吉爾生化)脫保護(hù)，按美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433A型固相合成儀的操作說(shuō)明，適當(dāng)延長(zhǎng)偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)時(shí)間(20-30min)，合成肽-樹(shù)脂。取上述肽-樹(shù)脂，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2ml后，用100ml預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過(guò)濾得到初肽，用1%的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽，純度約為55%。二.純化取粗肽38.Omg用HPLC純化，色譜柱為反相Cw半制備柱(Zorbax,300SB-C18,9.4隱x25cm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1%TFA);B，水(含0,1%TFA)。洗脫梯度為1-25min，15%-70%A，流速3ml/min，UV214nm檢測(cè)，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽14.3mg。多肽3的純度分析見(jiàn)圖3。多肽純化后的HPLC分析圖譜流速lml/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nm柱溫25°C梯度洗脫梯度為0-lmin,0-45%A1-25min，45%-80%A25-27min，80%-90%AA，乙腈(含O.1%TFA);B，水(含O.1°/。TFA)上樣量50ug分析柱Kromasil，C-18柱(北京分析儀器廠)，5um，04.6mmx250mm實(shí)施例4:多肽6的合成和純化一.合成稱取0.17gRink樹(shù)脂(0.lmmol，取代率0.6g/mmo1)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmo1，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine，上海吉爾生化)脫保護(hù)，按美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433A型固相合成儀的操作說(shuō)明，適當(dāng)延長(zhǎng)偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)時(shí)間(20-30min)，合成肽-樹(shù)脂。取上述肽-樹(shù)脂，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2ml后，用100ml預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過(guò)濾得到初肽，用1%的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽，純度約為65%。二.純化取粗肽35.Omg用HPLC純化，色譜柱為反相ds半制備柱(Zorbax,300SB-C18,9.4mmx25cm)。流動(dòng)相A,乙腈(含0.1%TFA);B，水(含0.P/。TFA)。洗脫梯度為1-25min，15%-70%A，流速3ml/min，UV214nm檢測(cè)，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽16.5mg。多肽6的純度分析見(jiàn)圖4。多肽純化后的HPLC分析圖譜流速lml/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nra柱溫25。C梯度洗脫梯度為0-lmin，0-15%A1-25min，15%-70%A25-27min，80%-90%AA，乙腈(含O.1%TFA);B，水(含O.1%TFA)上樣量50ug分析柱Kromasil，C-18柱(北京分析儀器廠)，5um，①4.6mmx250mm實(shí)施例5:多肽7的合成和純化一.合成-稱取0.17gRink樹(shù)脂(0.lmmol,取代率0.6g/mmol)，各Fmoc保護(hù)氨基酸的用量為0.5mmo1，以1-羥基苯并三唑(HoBt)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，Acros公司)為縮合劑，哌啶(Piperidine，上海吉爾生化)脫保護(hù)，按美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物的ABI433A型固相合成儀的操作說(shuō)明，適當(dāng)延長(zhǎng)偶合時(shí)間(60-90min)及脫保護(hù)時(shí)間(20-30min),合成肽-樹(shù)脂。取上述肽-樹(shù)脂，放入10ml裂解液中(組成0.5g二巰基蘇糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三異丙基硅烷(TIPS))，裂解3.O小時(shí)，用G3玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去大部分濾液至殘余液體約2ml后，用100ml預(yù)冷的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置1小時(shí)，G4玻璃砂芯漏斗過(guò)濾得到初肽，用1%的稀氨水溶解固體，濾液凍干得粗肽，純度約為60%。二.純化取粗肽40.Omg用HPLC純化，色譜柱為反相ds半制備柱(Zorbax,300SB-C18,9.4mmx25cm)。流動(dòng)相A，乙腈(含0.1%TFA);B，水(含0.1%TFA)。洗脫梯度為1-25min，15%_70%A，流速3ml/min，UV214咖檢測(cè)，每次上樣5mg。收集目標(biāo)組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分乙腈，凍干得到純肽18.7mg。多肽7的純度分析見(jiàn)圖5。多肽純化后的HPLC分析圖譜流速lml/min檢測(cè)波長(zhǎng)214nm柱溫25。C梯度洗脫梯度為0-lmin，0-15%A1-25min，15%-70%A25-27min，80%-90%AA，乙腈(含O.1%TFA);B，水(含0.1。/。TFA)上樣量50ng分析柱Kromasil，C-18柱(北京分析儀器廠)，5um，①4.6mmx250mm實(shí)施例6:抗凝血活性的測(cè)定一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)定本發(fā)明所提供的多肽的抗凝血活性，評(píng)價(jià)其于對(duì)照肽hirulog-1相比抗凝活性的強(qiáng)弱。并測(cè)定本發(fā)明所提供的多肽相對(duì)于不同種屬(豬、牛及人)的凝血酶抗凝血活性的強(qiáng)弱。二.實(shí)驗(yàn)材料和方法(一)實(shí)驗(yàn)材料1.緩沖液含O.05mmol/LNaCl的0.05mol/L的Tris-HC1溶液，PH7.4。2.0.5%纖維蛋白原溶液(包括豬、牛及人的纖維蛋白原溶液)，用上述緩沖液配制。3.不同濃度梯度的凝血酶溶液(包括豬、牛及人的凝血酶溶液)濃度分別為20NIH/ml(為l個(gè)滴定體積，既IV，為0.1ATU)，40NIH/ml(2V)，100NIH/ml(5V)，200NIH/ml(10V)，400NIH/ml(20V),800NIH/ml(40V)及1000NIH/ral(50V)。4.各抗凝血多肽溶液分別稱取各多肽5mg,分別配制成2.5mmol/L的溶液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)各個(gè)多肽抗凝活性的強(qiáng)弱分別稀釋為合適濃度。5.Hirulog-l:購(gòu)自成都凱捷生物醫(yī)藥科技有限公司，稱取5mg，配制成2.5腿ol/L的溶液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中再稀釋為合適濃度。(二)方法1.抗凝血活性的測(cè)定采用凝血酶滴定法(MarkwardtF.MethodsEnzymol，1970,69:924-932.陳華友等，生物技術(shù)，2002,12(6):24-25)。具體操作步驟如下取幾支小試管(0.75*10cm)，分別加入200uL0.5%纖維蛋白原溶液及50wL待測(cè)多肽溶液，37。C溫育5min，取其一支，滴加5V的NIH/ml凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，若lmin內(nèi)凝固，說(shuō)明抗凝活性小于5V,則重新在另一支試管中加入1V的凝血酶溶液5uL，若lmin內(nèi)不凝，再加入IV的凝血酶溶液5uL，如此下去，直至lmin內(nèi)凝固為止。如果待測(cè)樣品在加入5V的凝血酶溶液5uL，lmin內(nèi)沒(méi)有凝固，則再加入20V的凝血酶溶液5^L，迅速搖勻，若lmin內(nèi)凝固，說(shuō)明活性在5V-25V之間，所以再取一支小試管，滴加入20V的凝血酶溶液5iiL，迅速搖勻，若lmin內(nèi)不凝固，則再取一支試管中加入1V的凝血酶溶液5^L，若lmin內(nèi)不凝，再加入lV的凝血酶溶液5wL，如此下去，直至lmin內(nèi)凝固為止。2.多肽3的活性測(cè)定過(guò)程如下(多肽3濃度為0.lmM，凝血酶為豬凝血酶)取5支小試管，分別加入200uL0.5。/。纖維蛋白原溶液及50uL待測(cè)多肽溶液，37。C溫育5min，取其一支，滴加5V的NIH/ml凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，lmin內(nèi)未凝固，再滴加入20V的凝血酶溶液L，迅速搖勻，lmin內(nèi)未凝固，再加入20V的凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，仍未凝，直至共加入5次20V的凝血酶溶液時(shí)，出現(xiàn)凝固，說(shuō)明活性再85V-105V之間，則另取一支小試管，加入40V的凝血酶溶液5"L，迅速搖勻，lmin內(nèi)未凝固，再加入40V的凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，lmin內(nèi)未凝固，再加入20V的凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，仍未凝，再加入1V的凝血酶溶液5uL，迅速搖勻，lmin內(nèi)出現(xiàn)凝固，說(shuō)明其抗凝血活性為IOIV，即10.1ATU，重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。其余多肽均如上述方法測(cè)定抗凝活性。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明所提供的部分多肽以及對(duì)照肽hirulog-l相對(duì)于不同種屬(豬、牛及人)凝血酶的抗凝活性，見(jiàn)表l。_表l:部分多肽的抗凝活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果_抗凝肽抗凝活性(ATU/mmo1)抗凝活性(ATU/mmo1)抗凝活性(ATU/mmo1)(豬thrombin)(牛thrombin)(人thrombin)hirulog-l5,20X1052,08X1061.24X107多肽i6.60X1051.76X1072.24X107多肽26.40X1056.16X1062.08X107多肽32.02X1061.28X1071.24X107多肽51.62X1068.80X1061.08X107多肽61.82X10B1.84X1071.84X107多肽74.40X1052.32X1061.24X107多肽82.20X1050,88X1060.48X107多肽94.20X1051.68X1061.04X107多肽100.40X1050.16X1060.16X106多肽111.20X1050,24X1060.32X107多肽122.20X1050.88X1060.24X107多肽134.20X1051.68X1060.84X107四.結(jié)論本發(fā)明所提供的多肽中有四個(gè)抗凝活性明顯高于對(duì)照肽hirulog-l(多肽1、多肽2、多肽3及多肽6):對(duì)豬凝血酶的抗凝血活性為對(duì)照肽3-4倍，對(duì)牛凝血酶的活性為對(duì)照肽的6-8倍，對(duì)人凝血酶則相等或近2倍。實(shí)施例7:抑制常數(shù)(Ki)的測(cè)定一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)分析生色底物ChromozymTH被凝血酶的降解，計(jì)算各多肽的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)其抗凝活性。二.實(shí)驗(yàn)材料和方法(一)實(shí)驗(yàn)材料1.緩沖液0.01MH印es/0.01MTris,0.1MNaCl，0.1%PEG6000，PH7.4。2.底物ChromozymTH(Tos-Gly-Pro-Arg-PNA，購(gòu)自羅氏公司)，分別配制成濃度為25uM、33uM、40uM、50uM、100uM、125uM、200uM、330uM、500liM、10003.牛凝血酶(購(gòu)自sigma公司)溶液配制成5NIH/ml.4.抗凝肽的濃度分別配制成0.05uM、0.IOuM、0.15uM.(二)方法采用生色底物法(CappielloM,et.al.Biochemical.BiochemicalPharmacology,1996,52:1141-1146.MaraganoreJM,et.al.Biochemistry,1990，29:7095-7101)，底物ChromozymTH(Tos-Gly-Pro-Arg-PNA)能被凝血酶切割產(chǎn)生對(duì)硝基苯胺，而后者在405nm波長(zhǎng)有很強(qiáng)的吸收，所以可以通過(guò)監(jiān)測(cè)對(duì)硝基苯胺的生成來(lái)確定抗凝肽對(duì)凝血酶的抑制活性。具體操作步驟如下將0.05ml牛凝血酶溶液和0.05ml抗凝肽溶液加入到0.35ml緩沖液(0.01MH印es/0.01MTris，0.1MNaCl，0.1%PEG6000,PH7.4)中，混勻，于2min內(nèi)加入0.05mlChromozymTH溶液(終濃度分別為2.5uM、3.3uM、4.OiiM、5.0uM、10.OnM、12.5uM、20.0uM、33.0uM、50.OuM、100.0uM)，室溫下反應(yīng)lOmin，BECKMANDU640分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)其于405nm波長(zhǎng)的吸光度變化。Km和Vmax通過(guò)雙倒數(shù)作圖法確定，Ki值通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程計(jì)算。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明所提供的部分多肽以及對(duì)照肽hirulog-1抑制牛凝血酶的抑制常數(shù)Ki值，見(jiàn)表2。表2:部分多肽的Ki值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>四.結(jié)論多肽1、3、6、7的Ki值均小于hirulog-l的，這說(shuō)明其抗凝活性均比hirulog-1的強(qiáng)。綜上所述，本發(fā)明提供了一類抑制凝血酶活性的抗凝血多肽。根據(jù)凝血酶和水蛭素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)理，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了可以同時(shí)結(jié)合凝血酶底物催化區(qū)和纖維蛋白結(jié)合區(qū)的新型抗凝多肽，并用人工合成的有機(jī)化合物替換天然氨基酸，在序列中引入硬脂酸側(cè)鏈等，獲得抗凝活性更強(qiáng)、代謝更好的多肽。用本發(fā)明所述多肽可以制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物。序歹U表<110〉中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120〉一類抗凝血多肽及其用途<130〉<160〉13〈170>Patentlnversion3.3〈210>1<211〉22<212>PRT<213〉人工合成〈400〉1PheProArgProGlyGlyGlyGlyGinGlyAspPheGluProliePro151015GluAspAlaTyrAspGlu20〈210〉2〈211〉20<212〉PRT<213〉人工合成〈220〉<221〉misc—feature<222〉(5)..(5)〈223〉Xaa為AEEA，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸<400〉2PheProArgProXaaGlyGinGlyAspPheGluProlieProGluAsp151015AlaTyrAspGlu20<210>3<211>22<212〉PRT〈213〉人工合成<400>3PheProArgProGlyLysGlyGlyGinGlyAspPheGluProliePro151015GluAspAlaTyrAspGlu20〈210〉4<211>22〈212〉PRT〈213〉人工合成〈400〉4PheProArgProGlyGlyLysGlyGinGlyAspPheGluProliePro151015GluAspAlaTyrAspGlu20〈210〉5<211>22〈212〉PRT<213>人工合成<400〉5PheProArgProGlyGlyGlyLysGinGlyAspPheGluProliePro151015GluAspAlaTyrAspGlu20<210>6〈211〉23〈212〉PRT〈213〉人工合成〈400〉6PheProArgProGlyArgGlyAspSerGinGlyAspPheGluProlie151015ProGluAspAlaTyrAspGlu20<210>7〈211〉23<212〉PRT〈213〉人工合成〈400>7PheProArgProArgGlyAspTrpProGinGlyAspPheGluProlie151015ProGluAspAlaTyrAspGlu20<210>8〈211〉22〈212〉PRT〈213〉人工合成〈400〉8PheProArgProLysGlyGlyGlyGinGlyAspPheGluProliePro151015GluAspAlaTyrAspGlu20〈210>9〈211>18〈212>PRT<213〉人工合成〈220〉<221>misc—feature<222〉(5)..(5)〈223〉Xaa為AEEA，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸〈400>9PheProArgProXaaGlyAsnGlyAspPheGluGlulieProGluGlu151015Tyrleu<210>10〈211〉18〈212〉PRT〈213>人工合成<220〉〈221>misc—feature〈222〉(5)..(5)〈223〉Xaa為PABA，對(duì)氨基苯甲酸〈400〉10PheProArgProXaaGlyAsnGlyAspPheGluGlulieProGluGlu151015TyrLeu<210>11〈211>18<212>PRT<213>人工合成〈220〉<221>misc—feature〈222〉(5)..(5)〈223〉Xaa為PAMBA，對(duì)氨甲基苯甲酸〈400〉11PheProArgProXaaGlyAsnGlyAspPheGluGlulieProGluGlu151015TyrLeu〈210〉12<211〉20<212>PRT〈213〉人工合成〈400>12PheProArgProGlyArgGlyAspTrpProAspPheGluGluliePro151015GluGluTyrLeu20〈210>13〈211〉20<212>PRT<213〉人工合成〈400〉13PheProArgProArgGlyAspTrpProGlyAspPheGluGluliePro151015GluGluTyrLeu20權(quán)利要求1.抗凝血多肽，一級(jí)結(jié)構(gòu)如通式所示(D)-FPRP-X1-X2-X3-X4-X5-QGDFEPIPEDAYDE-NH2其中X1選自G、AEEA、PABA、PAMBA、K(steric)、R中任意一個(gè)；X2選自G、K(steric)、R中任意一個(gè)或空缺；X3選自G、K(steric)、D中任意一個(gè)或空缺X4選自G、K(steric)、W、D中任意一個(gè)；X5選自P、S中任意一個(gè)或空缺；其中A為丙氨酸；D為天冬氨酸；E為谷氨酸；F為苯丙氨酸；(D)-F為D型苯丙氨酸；G為甘氨酸；I為異亮氨酸；K(steric)為具有硬脂酸側(cè)鏈的賴氨酸；P為脯氨酸；Q為谷氨酰胺；R為精氨酸；S為絲氨酸；W為色氨酸；Y為酪氨酸，AEEA為2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗凝血多肽，如下多肽1:(D)-FPRP-GGGG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽2:(D)-FPRP-AEEA-G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽3:(D)-FPRP-G-K(steric)GG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽4:(D)-FPRP-GG-K(steric)G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽5:(D)-FPRP-GGG-K(steric)-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽6:(D)-FPRP-GRGDS-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽7:(D)-FPRP-RGDWP-QGDFEPIPEDAYDE-NH2多肽8:(D)國(guó)FPRP隱K(steric)GGG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2。3.權(quán)利要求1至2中任何一項(xiàng)所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于將多肽或其衍生物或組合物作為活性成分直接或與藥用載體組合制成制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于所述制劑為片劑、栓劑、溶液、膠囊、氣霧劑、泡騰片或滴劑。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于所述藥用載體為水溶性載體材料、難溶性載體材料或腸溶性載體材料。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于所述水溶性載體材料為聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或有機(jī)酸。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于所述難溶性載體材料為乙基纖維素或膽固醇硬脂酸酯。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗凝血多肽用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物的用途，其特征在于所述腸溶性載體材料為醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一類抗凝血多肽，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域?？鼓嚯?，一級(jí)結(jié)構(gòu)如通式所示(D)-FPRP-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-QGDFEPIPEDAYDE-NH₂。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明根據(jù)凝血酶和抗凝藥物比伐盧定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用方式，設(shè)計(jì)合成了一類抗凝血多肽，他們不僅能高效、特異抑制凝血酶活性，而且其所具有的氨基酸個(gè)數(shù)與比伐盧定相當(dāng)，合成容易，抗凝活性更強(qiáng)。文檔編號(hào)A61K38/55GK101372512SQ20071012068公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2007年8月23日優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日發(fā)明者戴秋云,潔胡,董銘心,黃園園申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所