專利名稱：人rtn4b蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及人蛋白R(shí)TN4B在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RTN家族是一個(gè)近年來所發(fā)現(xiàn)的新的基因家族。其中神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被統(tǒng)一命名為RTN1，是該家族的第一個(gè)成員。根據(jù)NSP基因組序列、cDNA序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫比較，發(fā)現(xiàn)了另外三個(gè)人RTN家族成員(NSP類基因I，II，III)。其中兩個(gè)(NSP-like基因I，II)相繼被克隆，并被命名為RTN2和RTN3。RTN2同樣有三個(gè)C-末端相同的異構(gòu)體。但RTN3至今沒有發(fā)現(xiàn)變異剪接本。值得注意的是，RTN2和RTN3的C-末端也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的穿膜區(qū)域，這被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聯(lián)系相關(guān)。
RTN4是人RTN家族中新近發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)成員。它類似于RTN1和RTN2，同樣有C-末端相同的三個(gè)異構(gòu)體(即RTN4A，4B，4C)。RTN4異構(gòu)體與RTN1/NSP，RTN2，RTN3異構(gòu)體一樣有著共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。這預(yù)示著它如RTN1一樣，在聯(lián)系蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中扮演了重要的角色。RTN4與人其他RTN的N-端無明顯的同源性(＜40％)，但是這些區(qū)域具有與RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)富含堿性氨基酸殘基，脯氨酸和絲氨酸。此外，在這些區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白磷酸化位點(diǎn)。并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)體內(nèi)RTN1A和RTN1B確實(shí)是被磷酸化的。RTN4A，4B，4C的理論等電點(diǎn)分別是4.43，4.71和9.32，這與RTN1，RTN2預(yù)計(jì)的等電點(diǎn)基本相似。
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號(hào)″殺手″，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾年來，國外醫(yī)學(xué)界對(duì)于腫瘤疾病的發(fā)病機(jī)理在細(xì)胞基礎(chǔ)上又有了新的認(rèn)識(shí)?；趯?duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有效地殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無毒性的藥物。目前，對(duì)于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩者雖對(duì)腫瘤的治療取得了相當(dāng)?shù)寞熜?，但由于缺乏?duì)腫瘤細(xì)胞的特異性因而具有較大的毒副作用以及某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了它們?cè)谂R床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無毒負(fù)作用的藥物，人們對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞，分子水平上的研究予以高度重視和巨額投資。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人蛋白R(shí)TN4B的新用途。
本發(fā)明提供了人蛋白R(shí)TN4B在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的人蛋白R(shí)TN4B在裸鼠體內(nèi)過表達(dá)后，裸鼠就會(huì)長出腫瘤，而且腫瘤體積隨著時(shí)間的推移日益增長。抑制了RTN4B的表達(dá)后，裸鼠的腫瘤生長就明顯受到抑制。
可見，RTN4B(NCBI登陸號(hào)-AF148538)可以促進(jìn)腫瘤生長，因此，削減RTN4B的表達(dá)就意味著抑制腫瘤生長。
本發(fā)明中，術(shù)語“RTN4B蛋白”指可促進(jìn)腫瘤生長的、序列與(NCBI登陸號(hào)-AAG12177)所示多肽序列至少70％同源性的RTN4B多肽及其變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人RTN4B DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人RTN4B多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供人RTN4B蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人RTN4B多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的具有代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的RTN4B蛋白可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可將RTN4B基因表達(dá)為蛋白而得。
本發(fā)明的RTN4B基因可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的RTN4B基因序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明的RTN4B核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RTN4B基因”指編碼具有RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列號(hào)為(NCBI登陸號(hào)AF148538)的序列及其簡并序列。該簡并序列是指該核酸序列開放閱讀框中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與該核酸序列開放閱讀框序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出神經(jīng)元分化相關(guān)基因RTN4B的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與AF148538開放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與AF148538開放閱讀框序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼序列號(hào)為AAG12177氨基酸序列的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
獲得了RTN4B基因序列后，就可以將RTN4B基因序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。一旦獲得了含有RTN4B基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，就可將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人RTN4B DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人RTN4B基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人RTN4B基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人RTN4B蛋白的分子，也包括那些并不影響人RTN4B蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人RTN4B基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人RTN4B基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人RTN4B或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人RTN4B功能的抗體以及不影響人RTN4B功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人RTN4B基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人RTN4B基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人RTN4B核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch Medical Library在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與RTN4B發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人RTN4B蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人RTN4B蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人RTN4B蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的RTN4B可以作為靶標(biāo)，篩選抑制RTN4B活力的物質(zhì)或者方法。篩選方法包括以下步驟A選擇候選化合物；B提供檢測(cè)RTN4B表達(dá)量或者活性的體系；C用RTN4B的檢測(cè)體系選擇候選化合物；D確定RTN4B表達(dá)量或者活性在候選化合物的影響下的改變。
本發(fā)明中，可將候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合，候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的活性部位(N端)緊密結(jié)合的，該候選化合物即為抗腫瘤藥物的活性成分。
本發(fā)明中，將得到的候選化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測(cè)該化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)RTN4B蛋白表達(dá)的影響?；蛘邔⒌玫降暮蜻x化合物加入含有RTN4B蛋白的溶液中，然后，檢測(cè)RTN4B蛋白與其受體的結(jié)合活性。RTN4B蛋白的表達(dá)量或者與受體結(jié)合活性下降的候選化合物為抗腫瘤藥物的活性成分。
本發(fā)明中，計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合后，可以將得到的候選化合物轉(zhuǎn)入腫瘤中，導(dǎo)致腫瘤生長減慢的候選化合物為抗腫瘤藥物的活性成分。
所述候選化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反義寡核苷酸、核酶或者與RTN4B核苷酸序列互補(bǔ)的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗體、互作蛋白等；小分子化合物則包括天然和人工的合成的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過檢測(cè)RTN4B表達(dá)水平，篩選到RTN4B的一個(gè)抑制劑——RTN4BSR6。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，該抑制劑RTN4BSR6可以明顯抑制腫瘤生長。
作為靶標(biāo)的除了RTN4B蛋白，還可以是RTN4B基因、RTN4B的mRNA、RTN4B的表達(dá)產(chǎn)物及其前述三者的特異性片斷。所述“特異性片斷”是指可以區(qū)別本發(fā)明的RTN4B與其它基因的片斷。
本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是將RTN4B蛋白抵制劑與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。
本發(fā)明中，所述的藥物是片劑、針劑、粉劑、口服液或者注射劑。
本發(fā)明中，所述的藥物中RTN4B蛋白抵制劑的用量可以是每天1微克/千克至10毫克/千克體重。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)RTN4B的細(xì)胞，尤其是過量表達(dá)RTN4B的細(xì)胞。在本發(fā)明中被稱為b6細(xì)胞。該細(xì)胞可以通過在細(xì)胞，例如L02細(xì)胞，QGY細(xì)胞，293細(xì)胞等，中轉(zhuǎn)入RTN4B基因而得。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所用的b6細(xì)胞。在篩選抗腫瘤藥物的時(shí)候，可以將候選化合物加入這種過表達(dá)RTN4B的細(xì)胞，用以觀察候選化合物的作用。如果候選化合物可以抑制RTN4B的表達(dá)量或者抑制RTN4B的活性，則該候選化合物可以作為抗腫瘤藥物的活性成分。也可以將該細(xì)胞植入宿主體內(nèi)，使宿主生長腫瘤，然后再加入候選化合物。如果候選化合物可以抑制RTN4B的表達(dá)量或者抑制RTN4B的活性，則該候選化合物可以作為抗腫瘤藥物的活性成分。
本發(fā)明還提供了一種用于篩選抗腫瘤藥物的試劑盒，該試劑盒中包括RTN4B蛋白。該試劑盒還可含有使用說明、分子標(biāo)記、緩沖液等。
本發(fā)明的試劑盒在使用時(shí)，可以將抑制RTN4B蛋白表達(dá)量或者活性的候選化合物作為抗腫瘤的候選藥物。
本發(fā)明還提供了一種生物芯片，該生物芯片的載體上含有RTN4B蛋白?？梢詫⒁种芌TN4B蛋白的表達(dá)量或者活性的候選化合物即作為抗腫瘤的候選藥物。該生物芯片在制備的時(shí)候，可以將RTN4B蛋白直接點(diǎn)樣在適當(dāng)?shù)纳镄酒d體上，例如硝酸纖維膜。然后，檢測(cè)候選化合物是否可以與RTN4B蛋白互作并影響RTN4B蛋白的活性。


圖1為注射RTN4B后，裸鼠左側(cè)腋下長瘤情況圖。pcDNA3.1Myc-His空載體細(xì)胞株接種裸鼠為陰性對(duì)照。接種細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)。接種約2周后，接種的裸鼠長出細(xì)胞瘤。
圖2為注射RTN4 B后，裸鼠左側(cè)腋下長瘤情況圖。pcDNA3.1Myc-His空載體細(xì)胞株接種裸鼠為陰性對(duì)照。接種細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)。接種約2周后，接種的裸鼠長出細(xì)胞瘤。裸鼠順序同圖1。
圖3為圖1和圖2和瘤體剝離后的結(jié)果圖。其中，b6是在QGY、L02、293T等細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTN4B的細(xì)胞株，a6則是在相應(yīng)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株。上排為左側(cè)a6細(xì)胞株的瘤體，下排為同一只裸鼠右側(cè)b6細(xì)胞株的瘤體。瘤體排列順序與圖1和圖2裸鼠排列順序一致。
圖4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTN4B及pcDNA3.1Myc-His空載體細(xì)胞株接種裸鼠后，所致瘤的體積與重量分析圖。EF分別為接種a6和b6的結(jié)果，b6是在QGY、L02、293T等細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTN4B的細(xì)胞株，a6則是在相應(yīng)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株。體積計(jì)算公式體積＝0.5*長徑*短徑2。穩(wěn)定表達(dá)外源RTN4B的細(xì)胞株所致的瘤在體積和重量上都明顯大于和重于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株所致的瘤，**表示成對(duì)T檢驗(yàn)P＜0.01，差異顯著。
圖5為內(nèi)源篩選RTN4BSR6片段蛋白電泳圖。其中，NS為陰性對(duì)照。
圖6為RTN4BSR6對(duì)RTN4B基因表達(dá)的消減作用的細(xì)胞水平驗(yàn)證圖。其中，NS為陰性對(duì)照。
圖7為裸鼠瘤體中注射含有RTN4BSR6的Lentivirus后瘤體生長情況圖?？梢奟TN4BSR6可明顯抑制腫瘤生長。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1RTN4B使裸鼠生長腫瘤實(shí)驗(yàn)1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTN4B的細(xì)胞株SMMC-7721和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)2)用胰酶消化細(xì)胞，離心1000rpm×5min3)PBS洗兩遍，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)4)用PBS稀釋細(xì)胞懸液至2×106細(xì)胞/200微升5)在裸鼠(上海中國科學(xué)院藥物所動(dòng)物中心，BALB/c)腋下進(jìn)行皮下接種，一次注射200μl細(xì)胞懸液。同一只裸鼠左邊腋下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的穩(wěn)定細(xì)胞株，右邊注射穩(wěn)定表達(dá)外源RTN4B的細(xì)胞株。
6)約3-4周后，接種的裸鼠長出細(xì)胞瘤，經(jīng)頸椎處死后取出瘤體，測(cè)量瘤體長短徑和重量。
結(jié)果顯示，右側(cè)的腫瘤生長明顯快于左側(cè)的右邊，這表明過表達(dá)RTN4B可以促進(jìn)腫瘤生長。
實(shí)施例2瘤體冷凍切片分析1)裸鼠長出的細(xì)胞瘤切成小塊浸沒在包埋液中，在液氮里快速冷凍后切片，所有載玻片經(jīng)多聚賴氨酸防脫片處理2)切片在冰的(-20℃)丙酮內(nèi)固定20S，然后在37℃烘片(可12h)。片子在-20℃可放置1～2年3)片子在PBS里洗2遍，5min/time4)封閉15～30min(封閉液5％BSA，5％Goat serum)5)PBS洗3遍，5min/time6)一抗(CD3 1)0.5％BSA中37℃1.5h或4℃過夜(背景少)，體積20～30μl7)PBS洗3遍，5min/time8)二抗0.5％BSA(背景高的話可用1％BSA，1％Goat serum)37℃30min9)PBS洗3遍，5min/time10)滴加熱過的80％甘油封片11)20倍熒光顯微鏡下檢測(cè)拍照12)記數(shù)血管數(shù)，統(tǒng)計(jì)左右兩側(cè)細(xì)胞瘤內(nèi)的血管數(shù)差異結(jié)果顯示，接種b6(穩(wěn)定表達(dá)RTN4B的細(xì)胞株)生成的肝細(xì)胞瘤的切片中，血管數(shù)比接種a6(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株)生成的肝細(xì)胞瘤切片中的血管數(shù)明顯增加許多。
實(shí)施例3內(nèi)源篩選RTN4B抑制劑按照RTN4B的序列，設(shè)計(jì)序列為5’-GGCACAGAUAGAUCAUUAUdTdT-3’和3’-dTdTCCGUGUCUAUCUAGUAAUA-5’的核苷酸分子作為RTN4B候選抑制劑。稱為RTN4BSR6。
1.種293T細(xì)胞于24孔板中，種板密度2*104/孔2.于種板后24h(小時(shí))、72h、120h重復(fù)轉(zhuǎn)染RTN4BSR6片段，以O(shè)pti-MEM(Opti-MEM I Reduced Serum Medium，invitrogen公司，31985-070)為溶劑，使終濃度達(dá)到40nM。轉(zhuǎn)染試劑使用lipofectamin2000(11668-027，invitrogene公司)。
3.于第一次轉(zhuǎn)染后24h、72h、120h消化細(xì)胞，收取72h和120h部分(約105個(gè))細(xì)胞樣品。Western檢測(cè)，抗體用Nogo(N-18)SC-11027(santa cruz公司)RTN4B內(nèi)源蛋白表達(dá)水平的變化。
結(jié)論與siRNA陰性片段NS(5’-UUCUCCGAACGUCACGUdTdT-3’)比較，RTN4BSR6轉(zhuǎn)染后72h即可見RTN4B蛋白表達(dá)水平下調(diào)約50％。
實(shí)施例4對(duì)RTN4B基因表達(dá)的消減作用的細(xì)胞水平篩選實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟1.種293T細(xì)胞于96孔板中，種板密度0.8*104/孔2.24h后將攜帶RTN4BSR6的lentivirus(慢病毒，吉?jiǎng)P公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞。Lentivirus滴度為106TU/ul，取MOI為100，即每孔加入80ul病毒液。具體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法如下給每孔細(xì)胞換上50ul新鮮培養(yǎng)基(PH7.0)，加入適量病毒液，7-8h后每孔補(bǔ)加50ul培養(yǎng)基。24h后換液。48-72h觀察GFP(綠色熒光)熒光，檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
3.將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行GFP綠色熒光分選，篩選出病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)陽性細(xì)胞，并檢測(cè)其陽性率。
4.Western檢測(cè)陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的RTN4B內(nèi)源蛋白表達(dá)水平的變化。
結(jié)論A.48h觀察GFP熒光，陽性率為50％，說明病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法正確。
B.流式細(xì)胞術(shù)分選轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，陽性組的轉(zhuǎn)導(dǎo)率94％。陰性組的(含有陰性片段NS的細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)率97％(流式細(xì)胞儀顯示數(shù)據(jù))。
C.Western檢測(cè)陽性細(xì)胞RTN4B蛋白表達(dá)水平較陰性細(xì)胞降低90％。
實(shí)施例5 RTN4B抑制劑抑制裸鼠腫瘤生長實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1.裸鼠上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司2.Lentivirus vector(慢病毒載體)上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司二、實(shí)驗(yàn)步驟1.將裸鼠放入SPF級(jí)動(dòng)物房(無特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房)，使其適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境約一個(gè)星期。
2.用DMEM(Dulbecco’s Medified Eagle Medium，invitrogene公司，12800-82)+10％FBS培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞(也可以采用b6細(xì)胞)。
3.將SMMC-7721細(xì)胞用胰酶消化后離心，去上清，用無血清的DMEM重懸，然后去上清，加入適量PBS，制成每毫升約4×107個(gè)細(xì)胞的懸液。
4.向4-6周齡的裸鼠的腋下注射0.2ml約含有8×106個(gè)單位的細(xì)胞的PBS懸液。
5.待瘤體直徑達(dá)到3-5mm(毫米)時(shí)，按瘤體積大小將相同的2只分別歸為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并給這2組的每只小鼠都剪耳朵編號(hào)，記錄此時(shí)的每只小鼠瘤體的長徑短徑和體重。
6.向2組小鼠的瘤體內(nèi)分別直接注射0.1ml(毫升)的病毒和病毒空載體，以注射病毒空載體為對(duì)照。每4天重復(fù)注射一次，共注射三次。
7.從第一次注射病毒之日開始，每3天測(cè)量并記錄每只小鼠的瘤體的長徑短徑和體重，瘤體的體積v＝ab2/2(a長徑長度，b短徑長度)。約4個(gè)星期后取瘤。
結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射病毒(含有RTN4BSR6)的裸鼠瘤體生長明顯減慢。
權(quán)利要求
1.RTN4B在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，RTN4B是篩選和制備抗腫瘤藥物的藥靶。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征是，將候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合，候選化合物的計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)與RTN4B蛋白的活性部位緊密結(jié)合的，該候選化合物即為抗腫瘤藥物的活性成分。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征是，將得到的候選化合物加入含有RTN4B蛋白的溶液中，然后，檢測(cè)RTN4B蛋白的表達(dá)量或者活性，RTN4B蛋白的表達(dá)量或者活性下降的候選化合物為抗腫瘤藥物的活性成分。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征是，計(jì)算機(jī)模擬三維結(jié)構(gòu)結(jié)合后，再將得到的候選化合物轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞中，導(dǎo)致癌細(xì)胞數(shù)量減少的候選化合物為抗腫瘤藥物的活性成分。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是，所述的抗腫瘤藥物是將RTN4B蛋白抑制劑與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物是片劑、針劑、粉劑、口服液或者注射劑。
8.一種細(xì)胞，其特征是，該細(xì)胞表達(dá)RTN4B蛋白。
9.一種用于篩選抗腫瘤藥物的試劑盒，其特征是，該試劑盒中包括RTN4B蛋白。
10.一種生物芯片，其特征是，該生物芯片的載體上連接有RTN4B蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及人蛋白R(shí)TN4B在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號(hào)“殺手”，嚴(yán)重威脅著人類的健康。本發(fā)明中，RTN4B可以促進(jìn)腫瘤生長，即RTN4B的抑制劑可以抑制腫瘤生長。因此可以將RTN4B作為藥靶，篩選和制備RTN4B的抑制劑，即抗腫瘤藥物。該抗腫瘤藥物是將RTN4B蛋白抵制劑與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。本發(fā)明還提供了篩選抗腫瘤藥物的試劑盒和生物芯片。
文檔編號(hào)A61J3/00GK101017166SQ200710036590
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日
發(fā)明者余龍, 季國慶, 吳燕華, 韓丁丁, 唐麗莎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)