專利名稱：人造納米結(jié)構(gòu)的治療用途的制作方法
AJt納米結(jié)構(gòu)的治療用途5 本申請(qǐng)要求保護(hù)美國(guó)專利60/706.072的權(quán)益，其申請(qǐng)日為2005年8月8日，所述內(nèi)容以參考文獻(xiàn)形式在本申請(qǐng)中完整引用。申請(qǐng)中被完整引用以更全面描述本發(fā)明相關(guān)工藝。
技術(shù)背景io 本發(fā)明旨在制造細(xì)胞或微生物內(nèi)的人造胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)。這種人造納米結(jié)構(gòu)能夠但不局限于選擇性地控制細(xì)胞或微生物的生死以治療 由病原細(xì)胞或病原微生物引起的疾病。同時(shí)，也可以用相同方法生產(chǎn) 組織或器官內(nèi)/間的人造納米結(jié)構(gòu)用于治療。自裝配，在所有級(jí)別水平(分子、細(xì)胞器、細(xì)胞等)上都是基本過(guò)15 程，在生物學(xué)中擔(dān)任著重要的角色，同時(shí)對(duì)設(shè)計(jì)和裝配功能性物質(zhì)也 起著重要的導(dǎo)向作用。尤其是自裝配可以提供具有吸引力和實(shí)用的制 造人造納米結(jié)構(gòu)的方法，而納米結(jié)構(gòu)在日益興起的納米科學(xué)領(lǐng)域中有 著廣泛的影響和應(yīng)用，例如，自裝配的納米顆?？捎糜诋a(chǎn)生新的光學(xué) 材料和高密度磁性記錄介質(zhì)，自裝配單(分子或細(xì)胞)層可在各種底物20 上形成納米厚度的有機(jī)薄膜從而才莫擬可以控制細(xì)胞命運(yùn)的生物表面、 建立分子電子裝置、發(fā)展納米造影術(shù)、產(chǎn)生生物醫(yī)學(xué)診斷學(xué)納米結(jié)構(gòu) 等。寡肽和其它有機(jī)分子自裝配而成的納米纖維是水凝膠的功能基 質(zhì)，而水凝膠在組織工程、抑制劑篩選和創(chuàng)傷愈合中的應(yīng)用十分廣泛。 雖然以上的成果都表明自裝配納米結(jié)構(gòu)在胞外環(huán)境或非生物體系中25 有了令人興奮和重要的發(fā)展，但胞內(nèi)生產(chǎn)人造納米結(jié)構(gòu)仍未被開(kāi)發(fā)， 其生物效應(yīng)還不為人知，盡管其有著重要的意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。 研究胞內(nèi)人造納米結(jié)構(gòu)的重要意義有以下幾點(diǎn)首先，自裝配納 米結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜、核酸鏈、肌動(dòng)蛋白纖絲在活細(xì)胞內(nèi)數(shù)目眾多，對(duì)于細(xì)胞的重要功能是不可或缺的(即，保持細(xì)胞完整性的結(jié)構(gòu)模塊、 保存遺傳信息的有效貯存、作為調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程的激活裝置)，因 此，胞內(nèi)人造納米結(jié)構(gòu)是擾亂細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)而控制細(xì)胞行為的強(qiáng)大而有 效的手段。第二，許多疾病都與細(xì)胞納米結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)(即，堿基 5 對(duì)的錯(cuò)配、(3-淀粉狀蛋白的形成，蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊)，因此，胞內(nèi)人 造納米結(jié)構(gòu)為仿生、模型建立以及了解疾病機(jī)理等多個(gè)方面提供了平 臺(tái)，促進(jìn)了治療學(xué)的發(fā)展。第三，過(guò)去的五十年分子細(xì)胞生物學(xué)的驚 人發(fā)展，例如生物過(guò)程的分子水平研究，已引起了對(duì)生命形式進(jìn)化新 的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)在，我們需要一種與生物過(guò)程相關(guān)且在分子水平之上的方10 法去系統(tǒng)了解結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)(例如，系統(tǒng)生物學(xué))。自裝配的納米級(jí)胞 內(nèi)人造結(jié)構(gòu)增加了 一種檢測(cè)細(xì)胞和有機(jī)體功能的動(dòng)力學(xué)的方法并允 許在新的復(fù)雜水平理解之前并不相關(guān)的知識(shí)領(lǐng)域。本發(fā)明也報(bào)道了 一種控制人造納米結(jié)構(gòu)狀態(tài)的通用方法，這種人 造納米結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)經(jīng)酶促轉(zhuǎn)換(switch )的水凝膠化和活體內(nèi)的水15 凝膠化。作為藥物傳遞、創(chuàng)傷愈合、組織工程中最有應(yīng)用價(jià)值的生物 材料之一 ，水凝膠通常用天然的或合成的高分子作為凝膠因子(gelator)2。很大程度上是由于對(duì)低分子量有機(jī)凝膠因子3的研究以及 自裝配寡肽形成的水凝膠被證明成為組織工程的骨架，"在過(guò)去的十 年中水凝膠因子的范圍已經(jīng)迅速擴(kuò)展到小分子，這些小分子使超分子 20水凝膠成為可能。"水凝膠因子的自裝配在超分子水凝膠納米結(jié)構(gòu)的形成中起著關(guān)鍵的作用。7因此，觸發(fā)及調(diào)節(jié)水凝膠因子的自裝配成為控制超分子水凝膠性質(zhì)和狀態(tài)的 一個(gè)基本步驟，通常通過(guò)化學(xué)或物理干擾來(lái)實(shí)現(xiàn)(即，pH、溫度、離子強(qiáng)度和超聲攪拌)該過(guò)程。在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中，酶催化、原位包括胞夕卜(組織或器官內(nèi)/間)和胞內(nèi)可逆25 自裝配和水凝膠因子凝膠化都是有利的，1()因?yàn)樗梢允顾z對(duì)某些組織、器官、疾病中特定的酶的表達(dá)做出應(yīng)答。盡管已使用酶來(lái)交 聯(lián)聚合物以誘發(fā)水凝膠化11并報(bào)導(dǎo)了酶觸發(fā)超分子水凝膠的形成9, 但仍需要研究使用酶調(diào)控超分子水凝膠(即可逆調(diào)控水凝膠因子的自裝配)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)的酶促反應(yīng)基本上都是不可逆的，所以單個(gè)的酶幾乎 不可能控制水凝膠的可逆反應(yīng)。大自然使用 一對(duì)具有相反活性的酶來(lái) 轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)功能從而解決了這一進(jìn)退兩難的局面。1本發(fā)明模擬天然 狀態(tài)，用激酶/磷酸酶轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)超分子水凝膠。方案1:^~如方案1所示，兩種類型的酶促反應(yīng)促成水凝膠因子(IV)的形成 (A)酶催化的鍵斷裂恢復(fù)了水凝膠因子疏水性和親水性的平衡，(B)酶o 催化的鍵形成使水凝膠因子上的疏水性和親水性達(dá)到平衡。在酶促形 成后，水凝膠因子(W)將在水中自裝配成超分子聚合物，該聚合物繼 續(xù)聚集形成納米纖維網(wǎng)作為所生成水凝膠的基質(zhì)。另外，在生物體系 中，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性最常見(jiàn)的機(jī)制之一就是酶促"轉(zhuǎn)換"，該過(guò)程中有 兩個(gè)具有相反活性的酶(即，其中一個(gè)酶催化某鍵的形成，另一個(gè)催15 化該鍵的斷裂)。 一種上述酶促轉(zhuǎn)換還能夠調(diào)節(jié)小分子水凝膠因子的 水凝膠化過(guò)程并形成可對(duì)生物環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答的水凝膠。該內(nèi)容的詳細(xì) 闡述見(jiàn)以下部分。方案2:如方案2所示，合成了一個(gè)五肽水凝膠因子Nap-FFGEY(l),該 物質(zhì)在0.6 wt。/。時(shí)通過(guò)1的自裝配會(huì)形成水凝膠。在三磷酸腺普(ATP) 存在的條件下，向水凝膠中加入激酶可磷酸化1給出相應(yīng)的磷酸(2)， 5 因此，破壞自裝配以誘導(dǎo)凝膠-溶膠之間的相轉(zhuǎn)變；用磷酸酶處理形 成的溶液可以使2脫去磷酸形成1，因此，恢復(fù)了自裝配形成水凝膠。 此外，給小鼠皮下注射2，能夠在體內(nèi)形成超分子水凝膠。除第一個(gè)示例中的酶-轉(zhuǎn)換-調(diào)控的超分子水凝膠以及通過(guò)酶促反 應(yīng)在體內(nèi)形成超分子水凝膠外，激酶/磷酸酶轉(zhuǎn)換與超分子水凝膠組 io 合使用也為生物材料的制造和應(yīng)用提供一個(gè)新的方法，因?yàn)樽鳛橐粋€(gè) 常見(jiàn)但重要的生物反應(yīng)，磷酸化和去磷酸化存在于許多有機(jī)體中。許 多疾病，例如癌癥12、糖尿病13、 Alzheimer癥14、多發(fā)性硬化癥15, 都與磷酸酶和/或激酶16的異?；钚韵嚓P(guān)，與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)過(guò)程 相比，酶-轉(zhuǎn)換-調(diào)控的水凝膠化的作用應(yīng)該更加強(qiáng)大，因?yàn)樗诿傅?15表達(dá)水平上增強(qiáng)了水凝膠的生物特異性反應(yīng)。此外，對(duì)水凝膠因子的酶-轉(zhuǎn)換-調(diào)控的自裝配的研究有助于了解 超分子水凝膠在多酶體系生物環(huán)境中的功能。發(fā)明概述本發(fā)明包括以下內(nèi)容(l)在細(xì)胞或微生物中設(shè)計(jì)和應(yīng)用一個(gè)制造人造納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下幾個(gè)步驟(i)在允許前體進(jìn)入細(xì)胞或 微生物的條件下，利用所述細(xì)胞或微生物構(gòu)建一個(gè)合適的設(shè)計(jì)前體，該前體在細(xì)胞外不能夠自裝配；(ii)使細(xì)胞或微生物處于可使前體變 為納米結(jié)構(gòu)的條件下；(2)在組織或器官內(nèi)/間設(shè)計(jì)和應(yīng)用 一種生產(chǎn)人5 工納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下步驟將一個(gè)設(shè)計(jì)好的前體注射入組 織或器官中，用 一個(gè)酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)變?yōu)樾纬扇斯ぜ{米結(jié)構(gòu)的水凝 膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化；(3)在組織或器官內(nèi)/間設(shè)計(jì)和應(yīng)用一種生 產(chǎn)人工納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下步驟，將設(shè)計(jì)好的前體及其它治 療藥物注射入組織或器官中，用 一個(gè)酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)化為形成人造io 納米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化，在疾病狀態(tài)下，另一種酶 將水凝膠因子轉(zhuǎn)化回前體以誘發(fā)凝膠-溶膠之間的相轉(zhuǎn)化來(lái)釋放藥 物。本發(fā)明提供了通過(guò)一個(gè)酶促反應(yīng)或者一系列酶促反應(yīng)而形成胞 內(nèi)納米結(jié)構(gòu)來(lái)控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或微生物命運(yùn)的通用方法。胞內(nèi)納米15 結(jié)構(gòu)的形成，例如，納米纖維或者納米物質(zhì)的聚集物，都是通過(guò)分子 或者納米物質(zhì)的胞內(nèi)自裝配完成的。細(xì)胞內(nèi)的自裝配是通過(guò)酶促反應(yīng) 將適當(dāng)?shù)那绑w如分子或納米物質(zhì)轉(zhuǎn)變成為另一個(gè)在細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)或 器官內(nèi)聚集的分子或納米物質(zhì)而觸發(fā)的。這種胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)能夠使細(xì) 胞內(nèi)的水分凝膠化或者阻斷內(nèi)源性細(xì)胞活性，這樣可以改變細(xì)胞、微20 生物或生物體的行為。例如，這種胞內(nèi)的納米結(jié)構(gòu)能夠觸發(fā)細(xì)胞、微 生物或有機(jī)體的死亡、停止包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞分化、抑制微生物 或有機(jī)體的生長(zhǎng)和改變包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞或有機(jī)體分化行為。本 發(fā)明中的胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)的形成能夠特異地作用于致病細(xì)胞或者微生 物，因此，本發(fā)明的方法可用于治療由于細(xì)胞機(jī)能障礙或微生物或有25 才幾體感染而引起的疾病。另外，在組織或器官內(nèi)/間，用酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)化成可形成人造納米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子并誘發(fā)水凝膠化；或者在疾病狀態(tài)下，另一 個(gè)酶將水凝膠因子轉(zhuǎn)變回前體引起凝膠-溶膠之間的相轉(zhuǎn)變以釋放藥物。本方法提供了一種控制藥物釋i丈、形成新治療藥物和原位形成水 凝膠治療慢性疾病如骨關(guān)節(jié)炎的新方法。


圖1 (A)胞內(nèi)納米纖維的形成導(dǎo)致水凝膠化及細(xì)胞死亡的概略圖。 5 (B)前體分子(la)及其相對(duì)應(yīng)的水凝膠因子(2a)的化學(xué)構(gòu)造和圖解。圖2 (A)含有8 mM (0.5 wt%)la和0.2 mg酶溶液pH = 8.0(37 。C) 的溶液的振蕩流變學(xué)。(B)在水中通過(guò)酶凝膠化la形成水凝膠(插圖 光學(xué)圖像)的TEM圖(濃度=0.5 wt%， pH = 8.0); (C)細(xì)胞培養(yǎng)基 (DMEM)，圖2B中的凝膠，用la培養(yǎng)前及培養(yǎng)后的HeLa細(xì)胞的紫 io 外光譜；(D)用la培養(yǎng)三天后死亡的HeLa細(xì)胞形成的水凝膠TEM圖 (插圖光學(xué)圖像)(箭頭表明由h形成納米纖維)。圖3在含有0.02、 0.04和0.O8wt。/。la的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、 1、 2 和3天的HeLa細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的光學(xué)圖像(x100)。顯微鏡的焦 平面對(duì)準(zhǔn)培養(yǎng)皿的底部，表面細(xì)胞的形狀改變和細(xì)胞數(shù)量減少表明細(xì) 15 胞死亡。圖4(A)凝膠I; (B)向凝膠I加入添激酶后得到的溶液和(C)凝 膠II的光學(xué)圖像及相應(yīng)的高效液相圖譜。組圖(A, C)右邊為水凝膠， 從瓶的底部觀察。1和2的配比為近1: 1的溶液在傾斜的瓶(組圖B) 中形成一個(gè)彎月面。 20 圖5 (A)凝膠I的動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描圖，頻率1.0rad/s; (B)凝膠I在應(yīng)變?yōu)?.8%時(shí)的動(dòng)態(tài)頻率掃描圖；(C)含有0.3wt。/。的1、 0.3wt。/。的2 及400 U/mL堿性磷酸酶的緩沖溶液在應(yīng)變?yōu)?.8%及頻率為1 rad/s 時(shí)的動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描圖。圖6凍干(A)凝膠I; (B)凝膠II; (C)含1 (0.3 wt %)的緩沖溶液； 25及(D)含1 (0.32 wt %)和2 (0.28 wt %)的緩沖溶液的TEM圖。圖7(A)凝膠I和II的圓二色i普?qǐng)D(B)凝膠I、凝膠II及溶液 1的熒光光i普(、x = 272 nm)。圖8 1在凝膠II的納米管中一種可能的分子排布由于氫鍵而形成P-折疊(A); 1沿著(B)和與納米管交叉(C)的分子結(jié)構(gòu)；整個(gè)分 子堆積在納米管中(D)。圖9 1和2處理HeLa細(xì)胞的MTT法分析。圖10(A)給小鼠注射2后1小時(shí)皮下形成水凝膠的光學(xué)圖像；(B) 5給小鼠注射2后1小時(shí)的腹腔光學(xué)圖像；(C)圖IOA為水凝膠的HPLC 圖譜；(D)注射2后1小時(shí)腹液的HPLC圖譜。圖11皮下(A)和腹膜內(nèi)(B)注射0.5 mL濃度為0.8 wt。/o的2后小鼠 的體重增加(n = 6，初始體重=20 ± 2g)。生理鹽水溶液(0.5ml)作 為兩種注射類型的對(duì)照。 io 發(fā)明詳述本發(fā)明包括以下內(nèi)容(l)在細(xì)胞或微生物中設(shè)計(jì)和應(yīng)用 一種制造 人造納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下幾個(gè)步驟(i)構(gòu)建一個(gè)合適的前體， 該前體在細(xì)胞外不能夠自裝配；(ii)在允許前體進(jìn)入細(xì)胞或^i:生物的 條件下使所述前體與所述細(xì)胞或纟鼓生物接觸；(iii)使細(xì)胞或微生物處 15 于可使前體變?yōu)榧{米結(jié)構(gòu)的條件下；(2)在組織或器官內(nèi)/間設(shè)計(jì)和應(yīng) 用一種生產(chǎn)人工納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下步驟將一個(gè)設(shè)計(jì)好的 前體注射入組織或器官中，用一個(gè)酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)變?yōu)樾纬扇斯ぜ{ 米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化；(3)在組織或器官內(nèi)/間設(shè)計(jì) 和應(yīng)用一種生產(chǎn)人工納米結(jié)構(gòu)的新方法，包括以下步驟，將設(shè)計(jì)好的 20 前體及其它治療藥物注射入組織或器官中，用一個(gè)酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn) 化為形成人造納米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化，在疾病狀態(tài) 下，另 一種酶將水凝膠因子轉(zhuǎn)化為前體以誘發(fā)凝膠-溶膠之間的相轉(zhuǎn) 化來(lái)釋放藥物。本發(fā)明旨在制造組織或器官內(nèi)或組織或器官間的胞內(nèi)人造納米 25結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)但不限于酶促反應(yīng)觸發(fā)超分子水凝膠化特 異性作用于病原細(xì)胞或孩t生物，該凝膠化過(guò)程包括以下步驟(1)構(gòu) 建一個(gè)合適的在胞外不能自裝配的設(shè)計(jì)前體，該前體進(jìn)入細(xì)胞的方式 不限于簡(jiǎn)單擴(kuò)散；(2)在細(xì)胞中表達(dá)的一種可將前體轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蜃匝b配成為納米纖維水凝膠因子的酶，該納米纖維是一種簡(jiǎn)單的納米結(jié)構(gòu)；(3)納米纖維的形成引起水凝膠化，水凝膠壓迫細(xì)胞、促使細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞轉(zhuǎn)變很容易觀察。這種在細(xì)胞內(nèi)或組織或器官內(nèi)/間產(chǎn)生的納米結(jié)構(gòu)也可用于終止胞在內(nèi)的細(xì)胞或有機(jī)體的分化行為。本發(fā)明的方法可用于治療由細(xì)胞功能障礙或微生物感染引起的 動(dòng)物及人類疾病，因?yàn)檫@種在細(xì)胞內(nèi)或組織或器官內(nèi)/間生成的人造 納米結(jié)構(gòu)能夠特異性作用于致病細(xì)胞或微生物。io 有效量的本發(fā)明前體可用于治療癌癥、糖尿病、Alzheimer癥以及多發(fā)性硬化癥等疾病。酶促水凝膠化前體的基本結(jié)構(gòu)是(1) 一個(gè)疏水基(即萘基、芳香 基、烴鏈(hydrocarbontai1)—直鏈或支鏈；(2)—個(gè)親水基(即溶于水的 二-、三-、四-、五-或寡肽、羧酸、氨基糖苷類、抗生素及其它的水15 溶性治療藥物)；(3) —個(gè)可斷裂的基團(tuán)(即磷酸(包括鹽和酯 (phosphate))、 丁酸、硫酸(包括鹽和酯(sulphate))、銨、乙二醇)。本發(fā)明的方法包括一個(gè)設(shè)計(jì)合適的在細(xì)胞外不能自裝配的前體， 由三個(gè)不同的模塊合成(1)能提供疏水力來(lái)增強(qiáng)其在水環(huán)境中自裝 配的基團(tuán)，包括萘基(C10H7CHr)、烷基(CnH2n+l， n = 4-30)和芳族20 基；(2)分子或納米級(jí)片段(即單個(gè)的氨基酸殘基、二肽、苯丙氨酰 基-苯丙氨酸(phe-phe)或X-Y(X、 Y都代表氨基酸殘基)、三肽、四肽、 五肽、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、二膦酸鹽類、抗生素、抗瘤劑、抗 真菌劑、抗寄生物分子、鐵氧化物納米顆粒(5到50nm)等)，這些片 段除了作為與水相互作用的氫鍵受體和供體外還是自裝配的主要構(gòu)25 建模塊，(3) —個(gè)可斷裂的基團(tuán)(即丁二酸、二膦酸鹽、磷酸、糖類 等)，該基團(tuán)能夠通過(guò)化學(xué)鍵(共價(jià)的或非共價(jià)的)與片段共價(jià)連接，酶 或酶促轉(zhuǎn)換能夠破壞該鍵來(lái)調(diào)節(jié)疏水作用和親水作用的平衡并在沒(méi) 有酶促反應(yīng)發(fā)生時(shí)阻止水凝膠化。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在組織或器官內(nèi)或組織或器官間設(shè)計(jì)和應(yīng)用制造人造納米結(jié)構(gòu)的新方法，由以下步驟組成將一個(gè)合適的設(shè) 計(jì)前體注射到組織或器官內(nèi)，酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)化為一個(gè)能形成人工 納米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化；在疾病狀態(tài)，另一種酶將 5水凝膠因子轉(zhuǎn)變會(huì)前體卩I起凝膠-;容膠之間的相轉(zhuǎn)變以釋放藥物。在組織或器官內(nèi)/間，用酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)變?yōu)樗z因子以形 成人工納米結(jié)構(gòu)并誘發(fā)水凝膠化，在疾病狀態(tài)，另一種酶將水凝膠因 子轉(zhuǎn)變回前體同時(shí)誘發(fā)凝膠-溶膠的相轉(zhuǎn)變并釋放出藥物。該方法提 供了 一種控制藥物釋放、形成新治療藥物和原位形成水凝膠治療慢性 io 疾病如骨關(guān)節(jié)炎的新方法。本發(fā)明也提供了一種治療癌癥、糖尿病、Alzheimer癥以及多發(fā) 性硬化癥，慢性疾病如骨關(guān)節(jié)炎的方法，包括給予受試者有效劑量的 前體，該前體在胞內(nèi)或組織或器官內(nèi)/間能形成納米結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員可以理解本發(fā)明可以用于治療或預(yù)防其他疾病。在一個(gè) 15實(shí)施方案中，所述前體是一種nap-FFGEY型前體。在本發(fā)明中，受試者包括哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中受試者為 動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中受試者是人。本發(fā)明也4是供了用所構(gòu)建前體治療和預(yù)防疾病的不同用途。最 后，本發(fā)明提供了包括之前所述前體的試劑盒。20 通過(guò)參考下面的實(shí)施例可以更好的理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解這些例子僅用于說(shuō)明，并不限制本發(fā)明，實(shí)施例后的 權(quán)利要求界定了本發(fā)明范圍。 實(shí)驗(yàn)方案詳述實(shí)施例l:胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)的形成構(gòu)的基本概念?？梢允褂貌煌姆椒ㄐ纬砂麅?nèi)納米結(jié)構(gòu)，這些方法具有以下基本 特征(i)構(gòu)建模塊必須能夠自裝配以形成納米結(jié)構(gòu)；(ii)自裝配納米結(jié)構(gòu)應(yīng)只能在細(xì)胞內(nèi)形成；(iii)自裝配應(yīng)由某一胞內(nèi)過(guò)程引起或與其偶 聯(lián)；(iv)納米結(jié)構(gòu)的形成可？ 1起可只見(jiàn)察的現(xiàn)象或細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而易于筌 另寸。如圖11A所示， 一種合適的在胞外不能夠自裝配的設(shè)計(jì)前體通 過(guò)但不限于簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞； 一旦前體進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 5 —種酶將前體轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N能自動(dòng)裝配成納米纖維的水凝膠因子 (hydrogelator)，該納米纖維是一種簡(jiǎn)單的納米結(jié)構(gòu)；納米纖維的形成 導(dǎo)致水凝膠化，水凝膠化壓迫細(xì)胞并引起細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞轉(zhuǎn)變很 容易觀察。為了滿足圖1A所描述的概念，設(shè)計(jì)并合成了一種由三個(gè)不同模 io 塊組成的前體(la,圖1B): —個(gè)能提供疏水力以增強(qiáng)其在水環(huán)境中 自裝配的基團(tuán)，包括萘基(C10H7CHr)、烷基(CnH2n+l， n = 4-30)和 芳族基；(即單個(gè)的氨基酸殘基、二肽、苯丙氨酰基-苯丙氨酸或X-Y(X, Y都代表氨基酸殘基)、三肽、四肽、五肽、氨基糖苷類、氟喹諾酮 類、二膦酸鹽類、抗生素、抗瘤藥、抗真菌劑、抗寄生物分子、鐵氧 15 化物納米顆粒(5到50nm)等)，除了作為與水相互作用的氫鍵受體和 供體外，還是自裝配的主要構(gòu)造模塊；(3)—個(gè)可斷裂的基團(tuán)(例如二 丁酸、二膦酸鹽、磷酸、糖類等)，該基團(tuán)能夠通過(guò)化學(xué)鍵(共價(jià)的或 非共價(jià)的)與片段共價(jià)連接，酶或酶促轉(zhuǎn)換能夠破壞該鍵來(lái)調(diào)節(jié)疏水 作用和親水作用的平衡并在沒(méi)有酶促反應(yīng)發(fā)生時(shí)阻止la水凝膠化。20 為了鑒定la的性質(zhì)，已證實(shí)一種酯酶可將la轉(zhuǎn)變?yōu)?a、促使納米纖維的形成并誘發(fā)水凝M/f匕。在pH~8.0時(shí)，在0.9 mL la (0.5 mg) 溶液中加入0.1 mL酯酶(1 mL蒸餾水中含有7 U酯酶，調(diào)節(jié)pH到 8.0),將該溶液置于37。C約6分鐘可促^f吏水凝膠形成，即使加熱到近 100。C仍可保持穩(wěn)定。流變學(xué)試驗(yàn)(圖2A)表明水凝膠在IO分鐘內(nèi)開(kāi)25 始形成，存儲(chǔ)模量(G')大于損耗模量(G")也表明這一點(diǎn)。存儲(chǔ)模量(G') 達(dá)到平臺(tái)表明，這種酶催化的水凝膠化反應(yīng)在100分鐘內(nèi)完成。]H NMR表明在這一階段68%的la轉(zhuǎn)化成2a。 2a形成的水凝膠是透 明的(插圖，圖2B),這表明在水凝膠中沒(méi)有微晶體聚集物散射可見(jiàn)光，這與水凝膠的傳導(dǎo)電子顯微鏡照片(TEM)—致(圖2B)。此外，TEM表 明通過(guò)2a自裝配形成的納米纖維的大小是 10nm，盡管納米纖維束 的大小能夠達(dá)到 60nm寬。在證實(shí)了酯酶可以將la轉(zhuǎn)變?yōu)?a并使2a水凝膠化后，監(jiān)測(cè)培5養(yǎng)液和Hela細(xì)胞中萘基的特征吸收峰來(lái)確定細(xì)胞吸收前體的數(shù)量。 在與Hela細(xì)胞一起培養(yǎng)3天后(培養(yǎng)液中l(wèi)a的初始濃度為0.08 wt%),培養(yǎng)液中萘基的吸收降低了 32%(支持信息)。與此同時(shí)，Hela 細(xì)胞中出現(xiàn)了萘基吸收峰。吸收峰的形狀和位置與通過(guò)酯酶將la轉(zhuǎn) 變?yōu)?a形成的水凝膠的吸收峰是一致的，這表明細(xì)胞內(nèi)水凝膠化。io 此外，因?yàn)榧?xì)胞的體積不到培養(yǎng)基體積的1°/。，細(xì)胞內(nèi)la的濃度很容 易超過(guò)2a的mgc。 一旦la分子通過(guò)內(nèi)源性的酯酶轉(zhuǎn)變成2a,將會(huì)自 裝配為納米纖維。為了證實(shí)這一推斷，收集與培養(yǎng)液表面脫離的死亡 Hela細(xì)胞。離心去掉細(xì)胞外的水份后破壞細(xì)胞并觀察其中水凝膠的形 成(插圖，圖2D)。透射電子顯微圖(圖2D)顯示了 25nm寬納米纖15 維的形成，其形態(tài)與單獨(dú)通過(guò)2a形成的納米纖維相似。收集黏附在 培養(yǎng)皿表面的活Hela細(xì)胞，超聲石皮碎后，在透射電子顯微鏡下觀察， 細(xì)胞碎片既不形成水凝膠也沒(méi)有長(zhǎng)納米纖維出現(xiàn)。這些結(jié)果證實(shí)了細(xì) 胞的死亡與胞內(nèi)納米纖維的形成和水凝膠化有關(guān)。在證實(shí)了水凝膠化能夠如細(xì)胞內(nèi)設(shè)計(jì)的進(jìn)行后，檢測(cè) 一 系列濃度20的前體la以確定引起細(xì)胞死亡所需要的有效濃度(圖3)。當(dāng)[la]= 0.02wt。/。時(shí)，細(xì)胞正常生長(zhǎng)。在[la] = 0.04 wt。/。時(shí)，盡管第一天細(xì)胞 數(shù)量增長(zhǎng)，但第二天細(xì)胞就開(kāi)始死亡，培一底部黏附的細(xì)胞減少可 以證明這一點(diǎn)；第三天幾乎沒(méi)有活細(xì)胞存在。當(dāng)[la]-0.08wt。/。時(shí)， 第一天細(xì)胞數(shù)量降j氐；第二天與[la] = 0.04 wt。/。相比更少的細(xì)胞黏附25 在培養(yǎng)皿表面；第三天幾乎所有的細(xì)胞都變圓(rounds up)并脫離培養(yǎng) 皿表面，表示細(xì)胞已經(jīng)死亡。細(xì)胞的逐漸死亡與2a濃度增加是一致 的，這對(duì)于納米纖維的形成和水凝膠化是必要的。這種現(xiàn)象也表明 2a的靶點(diǎn)就是胞質(zhì)水。為了進(jìn)一步證實(shí)酯酶對(duì)Hela細(xì)胞的選擇性，la與纖維母細(xì)胞(MH3T3)—fe培養(yǎng)。如圖3所示，當(dāng)[la] = 0.04 wt% 時(shí)細(xì)胞持續(xù)增長(zhǎng)，這證明la對(duì)于正常細(xì)胞林沒(méi)有毒害作用。實(shí)施例2:設(shè)計(jì)并合成一種激酶/磷酸酶轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)超分子水凝膠并 在體內(nèi)形成超分子水凝膠5 將Nap-FFGEY(l，方案2)設(shè)計(jì)成既是激酶的底物又是水凝膠因子，這是由于(i) FF易于自裝配，17 (ii) Nap-FF能有效的將水凝膠化 (濃度為0.8 wt %18) ; (iii) Glu-Tyr (EY)殘基在酪氨酸激酶存在時(shí)可用萘(Nap)而不用N-(芴基-曱氧羰基)(FMOC)的一個(gè)原因是萘的 io生物相容性更好，這一點(diǎn)已被含有萘基模塊的臨床藥物所證實(shí)(即普 萘洛爾、萘唑啉、萘呋胺酯)。用甘氨酸(G)連接Nap-FF和EY是因 為甘氨酸是最簡(jiǎn)單的氨基酸。與其他的五肽不同，4ffgey不是任何 蛋白的已知抗原表位，但是它具有作為酪氨酸激酶底物所需的基本結(jié) 構(gòu)。在通過(guò)固相合成獲得1后2()檢測(cè)1凝膠化的能力。通過(guò)略微調(diào)節(jié) 15pH (從7.8到7.5)， 1在濃度為0.6 wt %時(shí)在水中形成了一種透明的 水凝膠。2G 1成功的水凝膠化暗示著Nap-FF也可以作為一個(gè)與其他 氨基酸殘基結(jié)合的可用模塊來(lái)構(gòu)建水凝膠。 實(shí)施例3:酶的轉(zhuǎn)換調(diào)控水凝膠的相轉(zhuǎn)變?cè)谧C實(shí)了 1確實(shí)是一種有效的水凝膠因子后，檢測(cè)用激酶/磷酸 20 酶轉(zhuǎn)換調(diào)控水凝膠的相轉(zhuǎn)變。在緩沖液中(0.5 mL，包含10 mM的ATP) 加入l(3mg)可在5分鐘內(nèi)生成透明的水凝膠(凝膠I，圖4A)。然后， 在凝膠I的頂端加入3 U (50 ^L)酪氨酸激酶使1開(kāi)始磷酸化。24小 時(shí)之后，凝膠I轉(zhuǎn)變成為透明的溶液(圖4B)。用HPLC檢測(cè)溶液表 明 46%的1已經(jīng)轉(zhuǎn)變成為了 2。由于2的磷酸基之間的相互排斥作用 25 減弱了納米纖維的自裝配，這樣使2的親水性較溶液1強(qiáng)得多，產(chǎn)生 凝膠-溶膠相轉(zhuǎn)變。在該溶液中加入 200 U的堿性磷酸酶(IO pL)可使 水凝膠(凝膠II，圖4C)在1小時(shí)內(nèi)復(fù)原。4小時(shí)后，HPLC分析表明 99.1%的2又重新轉(zhuǎn)變?yōu)?。由于在該實(shí)驗(yàn)中所用的磷酸酶的催化活性比激酶高出大約1000倍，凝膠-溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)變這一循環(huán)才得以 完成。如果想要使這種轉(zhuǎn)化循環(huán)多次，需要調(diào)節(jié)具有相似活性的一對(duì) 酶的相對(duì)含量。而且，結(jié)果表朋通過(guò)酶促轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)超分子水凝膠是有 效的。此外，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的最新研究表明一種刺激通過(guò)同時(shí)5活激PKs并使PPs失活觸發(fā)蛋白激酶(PK) /蛋白磷^M (PP)的平衡。膠的相轉(zhuǎn)循環(huán)變得更加容易，這有可能形成對(duì)組織生物活性產(chǎn)生應(yīng)答 的給藥體系。實(shí)施例4:流變學(xué)研究10 為了評(píng)價(jià)凝膠的粘彈性，首先用動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描法去確定凝膠I的動(dòng)態(tài)頻率掃描的合適條件。如圖5A，所示，存儲(chǔ);漠量(G')和損耗模 量(G")數(shù)值在0.1%到1.0。/。應(yīng)變力時(shí)表現(xiàn)出較弱的依存性((G')大 于(G"))，這表明樣品就是水凝膠。在設(shè)置了應(yīng)變振幅為0.8%后(在 應(yīng)變振幅的線性響應(yīng)內(nèi))，用動(dòng)態(tài)頻率掃描研究凝膠I。圖5B表明，15 隨著頻率從O.l增加到100rad/sG'和G"均有緩慢增加。在整個(gè)頻 率范圍內(nèi)(0.1-100 rad/s)G'值大約是G"值的5倍，這表明凝膠I對(duì)外 部壓力有一定的耐受力。為了研究凝膠II的酶促形成,選擇動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描模型檢測(cè)加入磷 酸酶時(shí)含有1和2的配比是1: 1的溶液的粘彈性的變化。在含0.3 wt%20 的1和0.3 wt。/。的2的溶液中加入石威性磷酸酶(400U/mL)用于流變學(xué)檢 測(cè)。如圖5C所示，在剛加入酶的時(shí)候，混合物G'和G"的量都非常 小，這表明當(dāng)1和2等量時(shí)，1和2的混合液已表現(xiàn)出低黏性流體的 行為。此后，G'和G"都會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，加入磷酸酶大約 30分鐘后，G'值開(kāi)始超過(guò)G",這表明接近了凝膠點(diǎn)。1.5小時(shí)后，25G'的平臺(tái)值大約是G"的十倍，這表明在水凝膠中廣泛形成三維結(jié)構(gòu) 基質(zhì)?；旌蠘悠返竭_(dá)凝膠點(diǎn)所需的時(shí)間顯著小于單獨(dú)樣品(大約lh), 這可能是由于流變學(xué)的測(cè)量？ 1起的機(jī)械干擾加速了酶促脫磷酸反應(yīng)。 實(shí)施例5:形態(tài)學(xué)和光譜學(xué)研究由于凝膠I和凝膠II是通過(guò)不同過(guò)程形成的，它們可用于評(píng)價(jià)酶對(duì)自裝配的影響。跟據(jù)凝膠的crvo-TEM(圖6)圖象，1在凝膠I中 自裝配成不同大小的納米纖維(直徑28 ± 5nm)，在凝膠II中裝配成 均一的納米束(直徑18± 1.5 nm,壁的厚度為6 nm)，這表明酶轉(zhuǎn)換5 調(diào)節(jié)的自裝配過(guò)程能形成更好的納米纖維。可能有兩個(gè)因素影響纖維 形成的自裝配動(dòng)力學(xué)以形成圖6B中更好的纖維。首先，與圖6A中 凝膠I pH值的變化相比，磷酸酶對(duì)2的脫磷酸作用使得納米纖維的 形成更加緩慢，這就使得自裝配的納米結(jié)構(gòu)更加有序。第二，在形成 凝膠II時(shí)，成對(duì)的酶既催化磷酸化也催化脫磷酸化，這表明與規(guī)則區(qū)io域相比酪氨酸激酶更容易磷酸化納米纖維中的不規(guī)則區(qū)域。因此，激 酶通過(guò)將1轉(zhuǎn)化成2以助于去除不規(guī)則的部分，磷酸酶將2轉(zhuǎn)化為1 來(lái)實(shí)現(xiàn)重組裝。這種平衡有助于^吏納米纖維形成更加均勻的納米束。 也就是說(shuō)，酶轉(zhuǎn)換有助于去除在凝膠II中形成1納米束自裝配過(guò)程中 的缺陷。15 為了 了解1在最小凝膠化濃度以下和圖4B中所示階段的行為，用透射電子顯微鏡檢查凍干的溶液1(0.3 wt %)及含有1(0.3 wt %)和 2(0.28 wt。/。)的混合溶液的形態(tài)。如圖6C和3D所示，透射電子顯微 圖證實(shí)在兩種溶液中沒(méi)有廣泛地形成納米纖維，多數(shù)是無(wú)定型固體還 有少數(shù)的短纖維結(jié)構(gòu)，這表明以上兩種情況中的水凝膠因子的濃度過(guò)20 低以至于不能夠自裝配成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以形成水凝膠。這個(gè)結(jié)果 與以1: 1混合的1和2的溶液的流變學(xué)行為相一致。為了進(jìn)一步了解1的水凝膠的分子排布，檢測(cè)凝膠I和凝膠II 的圓二色譜和發(fā)射光譜。凝膠I和凝膠II的圓二色語(yǔ)(圖7A)基本上 是相同的，在196nm(兀兀"夭遷)附近都出現(xiàn)了陽(yáng)性帶，在215nm附25 近也都出現(xiàn)了陰性帶(rm*躍遷)，287 nm附近出現(xiàn)了陰性帶(萘基 芳香化合物的兀兀*躍遷)，與寡肽6納米纖維的圓二色譜一致，顯示出 (3-折疊特征。溶液l的焚光光譜(圖7B)在338nm處有一吸收峰，凝 膠I的不對(duì)稱吸收峰在340 nm處有最大吸收，凝膠II在342 nm處有最大吸收峰，2()表明為單體萘部分。雖然缺乏萘的明顯準(zhǔn)分子風(fēng)(大約在450 nm21)排除了凝膠I和II中的萘基團(tuán)強(qiáng)烈的7r-7r相互作用， 400nm以上的小寬肩峰表明苯基和萘基之間存在較弱的兀-ti相互作 用。這一結(jié)果與Nap-FF的晶體結(jié)構(gòu)相一致。2G 5 實(shí)施例6:分子排布基于水凝膠1的TEM、 CD、熒光光譜以及Nap-FF的X-射線衍 射結(jié)構(gòu)，本發(fā)明認(rèn)為納米束中l(wèi)的分子排列為氫鍵和疏水性相互作 用(圖8A)協(xié)同誘導(dǎo)1自裝配產(chǎn)生超分子聚合物，該聚合物的分子堆積 (圖8B)暴露出來(lái)源于Glu-Tyr片段(圖8C)的氬鍵供體和受體并促使它 io們進(jìn)一步聚合形成納米單位(圖8D)。盡管不可能完全排除其他模式的分子堆積，圖8中的高級(jí)結(jié)構(gòu)是 可能性最大的一種，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)與NAP-FF片^:的結(jié)構(gòu)相符、與水凝 膠中1的發(fā)射光i普和圓二色譜相一致，還使Glu-Tyr基團(tuán)更易受到酶 的作用。15 實(shí)施例7:活體內(nèi)水凝膠因子的生物相容性和酶促水凝膠化用MTT法來(lái)分析1或2存在時(shí)的細(xì)胞活性來(lái)說(shuō)明水凝膠因子的 生物相容性。將1和2與HeLa細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時(shí)后，125 一的 1和2中細(xì)胞的存活量分別為68°/。和46%。從圖9描述的結(jié)果可以 看出，1對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50為603 |iM， 2對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50為20 93 joM。雖然2在高濃度時(shí)表現(xiàn)出對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，但 是水凝膠因子(l)的生物相容性更高。當(dāng)水凝膠被用作為生物醫(yī)藥的原 料時(shí)，1的生物相容性具有重要作用。在初步細(xì)胞毒試-驗(yàn)^i正實(shí)1具有細(xì)胞相容性之后，給小鼠注射溶液 2以評(píng)價(jià)活體內(nèi)1的超分子水凝膠的形成。給各小鼠皮下注射(即皮膚25 下)和腹膜內(nèi)注射(即注射入腹腔)化合物2 (0.5 mL, 0.8 wt %)。 1 h 后，在皮下注射的位置有水凝膠形成(圖IOA)。水凝膠的HPLC分析 表明80.5(1.2%的2轉(zhuǎn)變成了 1 (圖IOC))，這對(duì)于水凝膠化的意義重 大。盡管在腹腔中沒(méi)有水凝膠形成，HPLC檢測(cè)腹部體液表明86.2%的2已經(jīng)轉(zhuǎn)變成1 (圖IOD)。比較圖10C, D與已知濃度1和2的 HPLC圖譜，注射部位保留的化合物的總量(包括1和2)與最初注射 的2的量有關(guān)。對(duì)于皮下注射，該數(shù)值大約為88.4%;對(duì)于腹膜內(nèi)注 射，該數(shù)值約為76.8%。這些結(jié)果表明限制組織或器官內(nèi)水凝膠因子5前體的擴(kuò)散可確?；铙w內(nèi)酶促凝月吏化。注射2后監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化以評(píng)價(jià)2在活體內(nèi)的細(xì)胞毒性。如 圖IIA所示，皮下注射2(0.5 mL, 0.8 wt %)的小鼠第一天體重降低(平 均K).55g,降低2.8%),對(duì)照組'卜鼠的體重也降低(平均-0.44g,降 低2.2%)。第二天后，兩組小鼠的體重均開(kāi)始增加。兩組小鼠體重的10 增加和降低在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是相同的，這表明在試驗(yàn)劑量下皮下注射2對(duì) 小鼠急性毒性很低。如圖IIB所示，腹腔注射2(0.5 mL, 0.8 wt %) 的小鼠第一天體重降低(平均二l.lg，降低5.5%),而對(duì)照組小鼠的體 重增力口(平均增加二0.50g, 2.5%)。 ^v第二天到第七天兩組小鼠的體重 幾乎得到了相同比率的增加(0.34 g/天)。這一結(jié)果表明盡管腹腔內(nèi)注15 射試驗(yàn)劑量的2在第一天引起了急性毒性，24小時(shí)后，2到1的轉(zhuǎn)變 使毒力顯著降低。注射部位的不同反應(yīng)與2從注射位點(diǎn)擴(kuò)散的數(shù)量及 1和2的體外細(xì)胞毒性相一致。由于皮下位點(diǎn)的限制，只有少量的2 能夠循環(huán)到血液中并分散到各器官和其他組織，因此，顯著降低了皮 下注射的細(xì)胞毒性。因?yàn)?最終能夠轉(zhuǎn)變?yōu)?，未觀察到腹腔注射水20 凝膠因子的長(zhǎng)期體內(nèi)毒性。 參考文獻(xiàn)1. Lodish, H. Molecular Cell Biology, 5th ed.; W. H. Freeman Co.: New York, 2003.2. Lee， K. Y.; Mooney, D. J. Chem. ReV. 2001, 101， 1869-79. 25Langer, R. Nature 1998, 392, 5-10. Tang, M. D.; Golden, A. P.; Tien， J. J.Am. Chem. Soc. 2003， 125, 12988-89.3. Terech, P.; Weiss, R. G. Chem. ReV. 1997, 97, 3133-59. de Loos, M,; van Esch, J.; Stokroos， I.; Kellogg, R. M.; Feringa, B. L J. Am.Chem. Soc. 1997, 119， 12675-76. Ostuni, E.; Kamaras, P.; Weiss, R. G. Angew. Chem.， Int. Ed. 1996, 35， 1324-26. Jung, J. H.; Ono, Y.; Hanabusa, K.; Shinkai, S. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122， 5008-09. Shirakawa, M.; Fujita, N.; Shinkai, S. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5 9902-03. Xing, B. G.; Choi, M. F.; Xu, B. Chem Commim. 2002, 362-63. Xing， B. G.; Choi, M. F.; Xu, B. Chem,Eur. J. 2002, 8, 5028-32.4. Silva, G. A.; Czeisler, C.; Niece, K. L.; Beniash, E.; Harrington, D.; Kessler, J. A.; Stupp, S. I. Science 2004, 303, 1352-55.5. Holmes, T. C.; de Lacalle， S.; Su, X.; Liu, G. S.; Rich, A.; Zhang, ioS. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000， 97, 6728-33. Zhang, S. G. Nat.Biotechnol. 2003, 21, 1171-78. Niece, K. L.; Hartgerink, J. D,; Dormers, J.; Stupp, S. I. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7146-47.6. Behanna, H. A.; Donners, J.丄J. M.; Gordon, A. C.; Stupp, S. I. J. Am.Chem. Soc. 2005, 127， 1193-200.〗5 7. Estroff， L A.; Hamilton, A. D. Chem. ReV. 2004， 104, 1201-17.de Loos, .M.; Feringa, B. L.; van Esch, J. H. Eur. J. Org. Chem. 2005, 3615-31.8. Sreenivasachary, N.; Lehn， J. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2005, 102, 5938-43. Yoshimura, I.; Miyahara， Y.; Kasagi， N.; Yamane， 20 H.; Ojida， A.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126， 12204-05. Hirst,A. R.; Smith, D. K. Chem,Eur. J. 2005, 11, 5496-508. Estroff, L. A.;Hamilton, A. D. Angew. Chem., Int. Ed. 2000， 39, 3447-50. Menger, F.M.; Caran, K. L. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11679-91. Kiyonaka, S.;Sugiyasu, K.; Shinkai, S.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124， 2510954-55. Bommel, V.; C.， K. J.; Stuart, M. C. A.; Feringa, B. L.; VanEsch, J. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2917-20. Kiyonaka， S.; Sada, K.;Yoshimura, I.; Shinkai， S.; Kato, N.; Hamachi, I. Nat. Mater. 2004, 3,58-64. Bhuniya, S.; Park, S. M.; Kim， B. H. Org. Lett. 2005, 7, 1741-44.Xing, B. G'.; Yu， C. W.; Chow, K. H.; Ho， P. L; Fu, D. G.; Xu, B. J. Am. Chem, Soc. 2002, 124, 14846-47, Zhang, Y.; Gu, H.; Yang, Z.; Xu, B. J. Am. Chem. Soc. 2003， 125, 13680-81. Zhang, Y.; Yang， Z. M.; Yuan, F.; Gu, H. W.; Gao， P.; Xu， B. J. Am. Chem. Soc. 2004， 126, 15028-29. 5 Yang, Z. M.; Gu, H.W.; Zhang, Y.; Wang, L; Xu, B. Chem. Commun. 2004， 208-09. Yang,Z. M.; Xu, K. M.; Wang, L.; Gu， H. W.; Wei, H.; Zhang, M. J.; Xu， B.Chem. Commun. 2005, 4414-16.9. Yang, Z. M.; Xu, B. Chem. Commun. 2004, 2424-25. Yang, Z. M.; Gu， H. W.; Fu, D. G.; Gao， P.; Lam, K. J. K.; Xu， B. AdV. Mater.io2004， 16， 1440-44.10. Molecular and cellular foundations of biomaterials; Peppas， N. A" Sefton, M. V.， Eds.; Elsevier/Academic Press: Amsterdam, 2004.11. Hu, B.-H.; Messersmith, P. B. J. Am. Chem. Soc, 2003, 125， 14298-99.15 12.Kikuchi, K.; Nakamura, K.; Shima, H. Curr. Top. Biochem. Res.1999， 1,75-87.13. Hutton, J. C.; Eisenbarth, G. S. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100， 8626-28.14. Eidenmueller, J.; Fath， T.; Hellwig, A.;'Reed, J.; Sontag, E.; 20Brandt, R.Biochemistry 2000, 39, 13166-75. Yuan, J.; Yankner, B. A.Nature 2000,407， 802-9.15. Auch， C. J.; Saha， R. N.; Sheikh, F. G.; Liu， X.; Jacobs, B. L.; Pahan, K. FEBS Lett. 2004, 563, 223-28.16. denHertog, J. EMBOR印.2003, 4, 1027-31.25 17.Kol, N.; Adler-Abramovich, L.; Barlam, D.; Shneck, R. Z.; Gazit,E.; Rousso, I. Nano Lett. 2005， 5, 1343-46. Reches, M.; Gazit， E. Science 2003， 300， 625-27.18.Yang, Z.; Xu, B. Unpublished results, 2005.19丄atour, S.; Veillette, A. Curr. Opin. Immunol. 2001, 13, 299-306. 20. Supporting Information2Ukeda, H.; Iidaka, Y.; Ueno, A. Org. Lett. 2003, 5, 1625-27. 22.衡tesides， G.M.and Grzybowski, B. Science 295， 2418 (2002). 5 23丄ehn， J. M. Science 295, 24O0 (2002).24.St卿，S. I. et al" Science 276, 384 (1997). 25丄ove, J. C. L. A. Estroff, J. K. Kriebel， R. G.26. Nuzzo and Whitesides, G. M., Chem. Rev. 105， 1103 (2005).27. Nam J. M., Thaxton C. S.，and Mirkin, C. A. Science 301, 1884 io (2003).28. Gu， H., Ho, P,L., Tsang, K. W., Wang， L.，and Xu, B., J. Am. Chem. Soc. 125， 15702 (2003).29. Hartgerink J. D., Beniash E., Stupp S. I., Science 294, 1684 (2001).15 30.Silva, G. A. et al., Science 303, 1352 (2004).31. Holmes, T. C. et al" P Natl Acad Sci USA 97, 6728 (2000).32. Kisiday, J. et al., P Natl Acad Sci USA 99, 9996 (2002).33. Zhang, S. G., Marini, D. M., Hwang, W. and Santoso， S. Curr Opin Chem Biol 6, 865 (2002).20 34.Kiyonaka, S.et al., Nat Mater 3, 58 (2004).35. Yoshim腦，I. et al" J Am Chem Soc 126, 12204 (2004).36. Yang, Z. M. and Xu, B. Chem Commun, 2424 (2004).37. Xing, B. G. et al., J Am Chem Soc 124, 14846 (2002).38. Yang, Z. M. et al., Adv Mater 16, 1440 (2004). 25 3 9.Gazit, E. Faseb J 16, 77 (2002).40.Reches， M. and Gazit, E. Science 300, 625 (2003)。
權(quán)利要求
1.一種在細(xì)胞或微生物內(nèi)生產(chǎn)胞內(nèi)人造納米結(jié)構(gòu)的方法，由以下幾個(gè)步驟組成a.在允許前體進(jìn)入所述細(xì)胞或微生物的條件下，將細(xì)胞外不能夠自裝配的合適的設(shè)計(jì)前體與所述細(xì)胞或微生物接觸；b.將細(xì)胞或微生物置于允許前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米結(jié)構(gòu)的條件下。
2. —種在組織或器官內(nèi)/間生產(chǎn)人造納米結(jié)構(gòu)的方法，由以下幾 個(gè)步驟組成)o a.將合適的設(shè)計(jì)前體導(dǎo)入組織或器官中；b.將組織和器官置于能夠使前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米結(jié)構(gòu)的條件下。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中合適的前體能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N可 在細(xì)胞內(nèi)或在組織或器官內(nèi)/間聚集的分子或納米物質(zhì)。
4. 權(quán)利要求1或2的胞內(nèi)人造納米結(jié)構(gòu)，其中它們可以抑制或殺 15 死所述細(xì)胞或有機(jī)體。
5. 權(quán)利要求1或2的胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)，其中通過(guò)它們?cè)诮M織或器官 內(nèi)/間的形成控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或纟鼓生物的命運(yùn)。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中細(xì)胞內(nèi)的水被引發(fā)水凝膠化。
7. 權(quán)利要求1或2的方法，其中內(nèi)源細(xì)胞活性被阻斷，使細(xì)胞或 20 微生物或有機(jī)體的行為發(fā)生改變。
8. 權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)胞或微生物或有機(jī)體的死亡是 -故觸發(fā)的。
9. 權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)胞分化被停止或微生物或有機(jī) 體的生長(zhǎng)受到抑制。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)胞、組織或器官的分化行為:故改變。
11.權(quán)利要求l的方法，其中選擇性抑制或殺死致病細(xì)胞或致病 ^f效生物以治療癌癥中的多重耐藥性或感染中的抗生素耐藥性。
12. 權(quán)利要求2的方法，其中在組織或器官內(nèi)/間生產(chǎn)人造納米結(jié) 構(gòu)可以控制藥物的釋放、形成新的治療藥物和原位形成水凝膠來(lái)治療 慢性疾病。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述慢性疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中在階^殳b,由酶促反應(yīng)產(chǎn)生人造納米結(jié)構(gòu)。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中酶促反應(yīng)是脫磷酸反應(yīng)或者水解反 應(yīng)或者是成鍵反應(yīng)。
16. 權(quán)利要求1或2的用于酶^足水凝膠化的一種合適的設(shè)計(jì)前體， io 其基本結(jié)構(gòu)的組成為a. 疏水基團(tuán)；b. 親水基團(tuán)；和c. 可斷裂的基團(tuán)。
17. 權(quán)利要求16的一種合適的設(shè)計(jì)前體，該前體在細(xì)胞外不能夠 15 自裝配并由三個(gè)不同的模塊合成a. 提供疏水力以增強(qiáng)在水環(huán)境中自裝配的萘基，b. 二肽片段，除了作為與水相互作用的氫鍵受體和供體外還是自 裝配的主要構(gòu)造模塊，c. 可斷裂的羧酸，它與羥基共價(jià)連接形成作為酶促轉(zhuǎn)換的酯鍵以 20調(diào)節(jié)疏水和親水相互作用的整體平衡，并在沒(méi)有酶促水解反應(yīng)發(fā)生時(shí)防止前體的水凝膠化。
18. 權(quán)利要求16的前體，其中疏水基團(tuán)可以是doH7CH2-、萘基、 芳香基、直鏈烴鏈或支鏈烴鏈。
19. 權(quán)利要求16的前體，其中所述親水基團(tuán)可以是苯丙氨?；?25苯丙氨酸、水溶性的二肽、三肽、四肽、五肽或寡肽、羧酸、氨基糖苷類、抗生素或者是其他水溶性的治療藥物。
20. 權(quán)利要求16的前體，其中可斷裂的基團(tuán)是丁二酸、磷酸、丁 酸、石克酸、銨或者乙二醇。
21. 由權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)前體以及合適的載體組成的組合物。
22. —種治療癌癥、糖尿病、AJzheimer癥、多發(fā)性力更化癥或骨關(guān) 節(jié)炎的方法，包括給予受試者有故劑量的前體，該前體能在細(xì)胞內(nèi)、 組織或器官內(nèi)/間形成納米結(jié)構(gòu)。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述前體是nap-FFGEY型前體。
24. 權(quán)利要求16的前體在疾病的不同治療和預(yù)防藥物制備中的 用途。
25. —種包含權(quán)利要求16所迷前體以及隔室的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)酶促反應(yīng)形成胞內(nèi)納米物質(zhì)來(lái)控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或微生物命運(yùn)的方法。這種酶促反應(yīng)能夠觸發(fā)胞內(nèi)自裝配，從而將合適的前體轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌肿踊蚣{米結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)聚集或在組織或器官內(nèi)/間聚集。此外，本發(fā)明還提供了一種在組織或器官內(nèi)/間生產(chǎn)人工納米結(jié)構(gòu)的方法將設(shè)計(jì)好的前體注射入組織或器官中，用酶促反應(yīng)將前體轉(zhuǎn)化為形成人造納米結(jié)構(gòu)的水凝膠因子同時(shí)誘發(fā)水凝膠化，在疾病狀態(tài)下，另一種酶將水凝膠因子轉(zhuǎn)化回前體以誘發(fā)凝膠-溶膠之間的轉(zhuǎn)化來(lái)釋放藥物。本發(fā)明適用于治療細(xì)胞功能紊亂或微生物感染引起的疾病，并提供了控制藥物釋放、形成新治療藥物及原位形成水凝膠以治療退行性疾病如骨關(guān)節(jié)炎的新方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101282739SQ200680037223
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者兵 徐, 徐克明, 楊志謀 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)