專利名稱：成像和治療中的施陶丁格反應及用于成像和治療的試劑盒的制作方法
成像和治療中的施陶丁格反應及用于成像和治療的試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于醫(yī)學成像和治療的新方法、試劑盒和化合物。本發(fā)明
還涉及用于預定位(pre-localized)成像和/或治療的新化合物和試劑盒及其制 備和使用方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學領(lǐng)域，在人或動物體內(nèi)的特定位置被激活的無活性化合物如前 藥和滅活顯像探針的使用是熟知的。而且已經(jīng)大量研究了活性劑如前藥和 顯像劑的耙向遞送。己經(jīng)為在靶位置和/或期望時刻實現(xiàn)釋藥選擇性的遞藥 系統(tǒng)付出了許多努力。 一種方法是通過局部和特異性的酶活性選擇性和特 異性地激活(全身)前藥。
然而，在許多情況下，相關(guān)靶位置缺少合適的過度表達的酶。本領(lǐng)域 中己提出的有希望的解決方法是通過稱為抗體導向酶前藥療法(ADEPT)的 技術(shù)將酶運輸?shù)桨薪M織。在這種方法中，通過與結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體 綴合使酶被靶向至腫瘤位置。在全身給藥該綴合物、其定位于靶及清除未 結(jié)合的綴合物后，全身給藥經(jīng)設(shè)計的前藥并使之局部激活。類似的技術(shù)稱 為聚合物導向酶前藥療法(PDEPT)、大分子導向酶前藥療法(MDEPT)、病毒 導向酶前藥療法(VDEPT)和基因?qū)蛎盖八幆煼?GDEPT)。在所有情況下都 將外源性酶遞送至靶組織或使之在靶組織內(nèi)表達，以局部激活(全身或靶向) 前藥。
已知的酶激活前藥技術(shù)具有各種缺點。在其中將酶遞送至靶位置的方 法中，需要催化決不能由內(nèi)源性酶實現(xiàn)的反應。符合這些要求的非哺乳動 物來源的酶可能是高度免疫原性的，這個事實使得重復給藥是不可能的。 為了抑制對酶-抗體綴合物的抗體反應，己使用免疫抑制劑環(huán)孢菌素。然而， 在癌癥中使用免疫抑制是不合意的，而且只有限地減輕免疫應答。
此外，在期望酶在胞內(nèi)空間發(fā)揮作用的情況下，它們卻有可能不能夠到達那里。在弱血管化和/或濃密的腫瘤中，大的酶-抗體綴合物的遞送受到 限制而不能到達所有細胞。
此外，這些大的綴合物具有低動力/靶向速度，并且從非耙組織的清除差。
類似的問題可能存在于用選擇性可激活探針進行分子成像的領(lǐng)域。缺 少合適的過度表達酶要求使用靶向外源性酶以局部激活前顯像探針。然而，
ADEPT概念在分子成像中的應用范圍會受到上述相同需要和缺點的阻礙。 本發(fā)明的目的是克服一個或多個上述缺點。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供前藥和前顯像探針、它們的試劑盒、制備和激活這樣的探 針和前藥的方法以及將探針和前藥應用于醫(yī)學成像和治療領(lǐng)域的方法。
在其最廣泛的方面，本發(fā)明涉及兩種成分，它們相互作用以觸發(fā)藥物 和/或顯像劑的釋放或激活。這些成分用于醫(yī)學成像和治療，更具體地說用 于耙向成像和治療，并用于其中使用預定位前藥/前顯像探針或活化劑的方 法中。
根據(jù)本發(fā)明，通過施陶丁格反應獲得所述觸發(fā)，且本發(fā)明的每種成分 都包含施陶丁格反應的反應配偶體，即分別為膦或疊氮化物基團。
在第一方面，本發(fā)明涉及用于制備和激活前藥或前顯像探針的方法，
所述方法包括如下步驟
a) 用至少一個疊氮化物和/或膦基團將藥物(x)或顯像探針(y)官能化，以
產(chǎn)生前藥或前顯像探針；
b) 通過施陶丁格反應使所述前藥或前顯像探針與成分(z)反應，所述成
分(z)包含至少一個疊氮化物和域膦基團作為所述施陶丁格反應中的反應配 偶體，
從而激活所述藥物或顯像探針。
在另一方面，本發(fā)明涉及適用于醫(yī)學成像或治療的試劑盒。 在另一方面，本發(fā)明涉及包含疊氮化物和/或膦基團的前藥或前顯像探 針作為耙向醫(yī)學成像中的工具的用途或在制備用于醫(yī)學成像的工具中的用 途，所述膦基團和域所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的合適的反應配偶體。
此外，本發(fā)明涉及用于制備藥物的本發(fā)明的前藥或前顯像探針。 附圖簡述


圖1顯示施陶丁格反應(A)和兩個實施方案中的施陶丁格配位(B、 C)。 圖2說明實施例1，其中將三苯基膦綴合物靶向至疾病位置并與含有多
個FRET染料的疊氮基觸發(fā)物官能化的級聯(lián)釋放樹枝狀聚合物反應，從而
激活并釋放所述染料。
圖3說明實施例2，其中將含有多個FRET染料的疊氮基觸發(fā)物官能化
的級聯(lián)釋放樹枝狀聚合物靶向至疾病位置。隨后的三苯基膦給藥導致激活
所述染料。
圖4說明實施例3，其中作為實施例2的替代方法，通過樹枝狀聚合物 的一個末端而非一個FRET染料將靶向部分綴合至樹枝狀聚合物。
圖5說明實施例4，其中在(A)中，用疊氮化物將MRI無活性Gd螯合 物官能化，并且使之于施陶丁格反應中與預定位的三苯基膦反應以釋放活 性Gd螯合物。在(B)中，具有懸掛的MRI無活性Gd螯合物的靶向和預定 位脂質(zhì)體在所述螯合物上的疊氮化物基團于施陶丁格反應中與全身三苯基 膦反應后被激活。在(C)中，將脂質(zhì)尾連接到這樣的位置，該位置允許在施 陶丁格反應后激活但不釋放MRI探針。
圖6說明實施例7，其中實施例A使用預定位的前熒光(profluorescent) 三苯基膦染料，該染料通過與疊氮化物前藥發(fā)生施陶丁格反應而被激活， 產(chǎn)生活性藥物分子并導致熒光探針的激活。在實施例B中，將疊氮化物前 藥靶向至疾病位置并通過前熒光三苯基膦染料激活之，同時實現(xiàn)所述染料 的激活。
圖7說明實施例8，其中分3步合成模型疊氮基前藥4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲酸酯(4)。
圖8說明實施例9，其中通過3-(二苯基膦基)苯磺酸鹽激活模型疊氮基 前藥4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲酸酯(4)。
圖9說明如實施例10所述的阿霉素前藥合成。
圖10-12說明阿霉素前藥(9)的激活，用HPLC禾卩LC-MS追蹤，其在實施例11中更詳細地描述。
圖13-15說明使用A431細胞的細胞增殖測定，其中通過三苯基膦原位 激活前藥9 (prQ-dox)，如實施例12中所述。
發(fā)明詳述
在本發(fā)明中，使用施陶丁格反應(Gololobov等，Tetrahedron 1981， vol 37， 437-472頁)。
為了避免任何可能的混淆，在本發(fā)明中，施陶丁格反應不同于施陶丁
格配位。施陶丁格反應發(fā)生在膦和疊氮化物之間，以產(chǎn)生氮立葉德
(aza-ylide)。在水存在下，該中間體自發(fā)水解，以生成伯胺和相應的氧化膦。
在施陶丁格配位中，通過在膦上引入親電子阱來阻止氮立葉德的水解，導
致產(chǎn)生兩個反應配偶體之間的穩(wěn)定的共價鍵。與這種配位相反，本發(fā)明涉
及施陶丁格反應，其中水解導致形成活性藥物或活性顯像探針。施陶丁格
配位描述于例如Lemieux等，J. Am. Chem. Soc. 2003， 125， 4708-4709和
Prescher等，Nature vol 430, 19 August 2004, 783-877中。施陶丁格配位與施
陶丁格反應之間的差別示于圖1中。通常在本發(fā)明中，在發(fā)生施陶丁格反
應前，藥物或探針為(部分)滅活的前藥或(部分)滅活的前顯像探針的形式。
藥物或顯像探針的(部分)滅活也稱為藥物或探針的"掩蔽"。
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于酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，使用兩種參與官能團，例如疊氮化物和膦，這 等于發(fā)生在許多生物學過程如酶-底物相互作用中的非共價識別事件的巨大 選擇性。根據(jù)本發(fā)明的一方面，選擇具有非常協(xié)調(diào)的反應性的兩種參與官 能團，從而避免共存官能團的干擾。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，選擇無生命 且只識別彼此而忽略它們的細胞/生理環(huán)境的活性配偶體，也就是說它們是 生物直交的。由生物學環(huán)境設(shè)定的對選擇性的要求排除了大多數(shù)其它常規(guī) 反應的使用。
本發(fā)明的試劑盒和方法特別適用于靶向遞送藥物和/或顯像探針。
而且，本發(fā)明特別適用于多模成像(multimodal imaging),任選地使用不 同顯像劑來顯現(xiàn)同一靶。
在用于本發(fā)明時，"主要靶"涉及要通過成像來檢測的靶或者治療靶。例如，主要靶可以是生物體、組織或細胞內(nèi)存在的任何分子。成像靶包括 細胞表面靶，例如受體、糖蛋白；結(jié)構(gòu)蛋白，例如淀粉樣蛋白斑；胞內(nèi)耙， 例如高爾基體的表面、線粒體的表面、RNA、 DNA、酶、細胞信號轉(zhuǎn)導途 徑的成分；和/或異物，例如病原體如病毒、細菌、真菌、酵母或其部分。 主要靶的實例包括化合物如蛋白質(zhì)，其存在或表達水平與某些組織或細胞 類型相關(guān)，或者其表達水平在某些病癥中被上調(diào)或下調(diào)。根據(jù)本發(fā)明的具 體實施方案，所述主要靶是蛋白質(zhì)如受體?；蛘?，所述主要靶可以是在疾 病如感染或癌癥的過程中被上調(diào)的代謝途徑，如DNA合成、蛋白質(zhì)合成、 膜合成和糖攝取。在患病組織中，上述標記可不同于健康組織，并為早期 檢測、特異性診斷和治療(尤其是靶向治療)提供獨特的可能性。
在用于本文時，"靶向探針"指與所述主要靶結(jié)合的探針。所述耙向 探針包括"主要耙向部分"和"施陶丁格反應配偶體"。
"施陶丁格反應配偶體"是選自可以于施陶丁格反應中與另一施陶丁 格反應配偶體反應的疊氮化物和膦的部分。在具體實施方案中，所述施陶 丁格反應配偶體會是一個或多個疊氮化物基團。然而，在其它具體實施方 案中，預期這樣的應用，其中所述施陶丁格反應配偶體會是一個或多個膦 基團。
在用于本發(fā)明時，"主要靶向部分"涉及靶向探針或前藥或前顯像探 針的與主要革S結(jié)合的部分。主要靶向部分的具體實例為與受體結(jié)合的肽或 蛋白質(zhì)。主要靶向部分的其它實例是與細胞化合物反應的抗體或其片段。 抗體可以為非蛋白質(zhì)化合物以及蛋白質(zhì)或肽。其它主要靶向部分可以由適 體、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及類肽(peptoid)和有機藥物化合物組成。主要 耙向部分優(yōu)選以高特異性、高親和力結(jié)合，而且與主要靶的結(jié)合優(yōu)選在體 內(nèi)是穩(wěn)定的。
"結(jié)構(gòu)單元"定義為參與細胞中的途徑如代謝途徑的分子。結(jié)構(gòu)單元 可以形成細胞內(nèi)存在的分子如糖、DNA、 RNA、肽、蛋白質(zhì)的一部分。代 謝示蹤劑和前體也被稱為結(jié)構(gòu)單元。結(jié)構(gòu)單元的實例為葡萄糖、核堿、氨 基酸、脂肪酸、乙酸酯和膽堿。
核堿是RNA和DNA的參與配對的部分。與核糖或脫氧核糖的l'碳共 價結(jié)合的核堿被稱為核苷，而在5'碳連接有一個或多個磷酸基的核苷被稱為核苷酸。核堿的實例是胸腺嘧啶、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶。 "顯像探針"包括可檢測標記，例如對比提供單元。 術(shù)語"前顯像探針"涉及包含適用于成像的可檢測標記且用疊氮化物
和/或膦基團官能化的成分。這種官能化可導致所述標記的部分或完全失活。 "活化劑"指與前顯像探針或前藥的包含施陶丁格反應的反應配偶體
的部分反應的化合物(Z)。在具體實施方案中，所述活化劑會包含一個或多
個膦基團。
在用于本文時，"可檢測標記"涉及例如當存在于細胞、組織或生物 體內(nèi)時，顯像探針的允許檢測所述探針的部分。在本發(fā)明中預期的一類可 檢測標記是對比提供劑。在本發(fā)明中預期并且在本文中描述了不同類型的 可檢測標記。
在用于本文時，"治療探針"指包含藥學活性化合物(例如但不限于治 療化合物)的探針。本文提供了藥學活性化合物的實例。治療探針還可以任 選包含可檢測標記。
術(shù)語"前藥"涉及包含治療或藥理活性部分的成分，其用疊氮化物和/ 或膦基團官能化。這種官能化可導致所述藥物的部分或完全失活。
在用于本文時，術(shù)語"分離的"指存在于體外或者細胞或細胞部分(例 如細胞溶解產(chǎn)物)之外的化合物。在本發(fā)明中，在描述分離的探針或組合的 探針如主要耙向探針、顯像探針或治療探針或其組合的具體特征時，這是 指探針存在于人或動物的身體、組織或細胞之外。它并非指在將綴合物的 組成成分連續(xù)添加到身體、組織或細胞之后，在所述身體、組織或細胞內(nèi) 形成的綴合物。
本發(fā)明的特定方面涉及定位成像或治療方法。這方面要求獨立使用本 發(fā)明的兩種成分，并且涉及包含靶向部分或者由于是特定反應的底物而確 保靶向的成分以及確保成像或治療效果的成分給藥于患者的時間上的分
離。兩種成分給藥之間的時間可以變化，但通常為約io分鐘至幾小時或者
甚至幾天。
將參考具體實施方案和某些附圖描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此，而
只受權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求中的任何符號(reference sign)都不應被理解 為限制本發(fā)明的范圍。所描述的附圖只是示意性的而非限制性的。在附圖中，為了說明的目的， 一些元素的尺寸可能被放大而不是按比例繪制。當 本說明書和權(quán)利要求書中使用術(shù)語"包括"或"包含"時，它不排除其它 元素或步驟。除非另有說明，當用不定冠詞或定冠詞如"一個"、"一種"、 "所述"修飾單數(shù)名詞時，這包括該名詞的復數(shù)。
還要注意，在用于說明書和權(quán)利要求書時，術(shù)語"包括"和"包含" 不應被解釋為限于其后所列的意義，它不排除其它元素或步驟。因此，表
述"包括手段A和B的裝置"的范圍不應限于僅由部件A和B組成的裝置。 在本發(fā)明中，它意味著所述裝置的唯一相關(guān)部件是A和B。
在第一方面，本發(fā)明涉及用于制備和激活前藥或前顯像探針的方法。 在本發(fā)明的方法的步驟(a)中，用至少一個疊氮化物和/或膦基團將藥物 (x)或顯像探針(y)官能化，以產(chǎn)生前藥或前顯像探針。
通常，所述前藥或前顯像探針包含至少一個疊氮化物和/或膦基團，但 它們可任選包含至少兩個或更多個、至少三個或更多個、至少四個或更多 個或者至少五個或更多個這些取代基。疊氮化物和/或膦取代基的數(shù)目優(yōu)選 為每個前藥或前顯像探針分子1至50個，更優(yōu)選1至30個，甚至更優(yōu)選2 至10個。
根據(jù)一個實施方案，將活性藥物或顯像探針的胺基轉(zhuǎn)化為疊氮化物。 這種修飾可能導致所述藥物或顯像探針官能團的(部分)失活。
根據(jù)另一實施方案，例如當藥物或顯像探針不包含能被轉(zhuǎn)化為疊氮化 物的合適的胺基時，則用疊氮化物官能化的觸發(fā)物連接基系統(tǒng)修飾這些分 子[Papot等，Curr. Med. Chem，畫Anti-cancer agents 2002, 2， 155-185〗。弓|入疊 氮化物基團的方法公開于例如WO-A-03/003806中。
還可用連接基系統(tǒng)修飾含有羥基部分的藥物和探針，以提供疊氮化物-觸發(fā)物。
疊氮化物或膦基團可為其施陶丁格對應部分的施陶丁格反應配偶體。 因此在第二步驟(b)中，通過與成分(z)的施陶丁格反應來激活所述前藥或前 顯像探針，所述成分(z)包含至少一個疊氮化物和/或膦基團作為所述施陶丁 格反應中的反應配偶體，從而激活所述藥物或顯像探針。
對于其中前藥或前顯像探針包含至少一個疊氮化物和至少一個膦基團 的實施方案，會理解，這些相應的反應基的配置或掩蔽優(yōu)選為使它們不過早地發(fā)生分子內(nèi)或分子間反應。
在一個實施方案中，當所述前藥或前顯像探針包含芳族疊氮化物部分 時，與三苯基膦的施陶丁格反應提供苯胺衍生物，所述苯胺衍生物引發(fā)消 除級聯(lián)，所述消除級聯(lián)釋放藥物或顯像探針，從而激活所述藥物或顯像探 針。
在優(yōu)選實施方案中，所述前藥或前顯像探針因步驟(a)中的修飾而基本 上失活。優(yōu)選步驟(b)的隨后的施陶丁格反應導致激活所述藥物或顯像探針。 因此本說明書中的成分(z)也被稱為活化劑。
在本發(fā)明中，步驟(b)中的激活由技術(shù)人員廣泛地理解。在本文中，即 使是活性的輕微改善也被認為是激活。在本文中，術(shù)語"激活"不只覆蓋 其中活性有一定量上升的實施方案，而且覆蓋僅僅釋放可能在所述釋放前 就已經(jīng)有活性的藥物或顯像探針。在本文中，"激活"的合適同義詞是"去 掩蔽"。在去掩蔽的實例中，激活將先前無毒的成分轉(zhuǎn)化為"局部"毒性 的成分。因此要理解，用作為施陶丁格反應配偶體的部分官能化的標記或 藥物也被稱為可激活標記或藥物，但所述標記/藥物在所述激活前可能處于 可檢測相應為活性的狀態(tài)。
任選地，將通過使用施陶丁格反應所致的上述激活與級聯(lián)釋放樹枝狀 聚合物組合，從而允許釋放并激活多種藥物或探針。
不希望受任何理論的約束，相信其中至少一個位于前藥或前顯像探針 上的疊氮化物和膦之間的施陶丁格反應觸發(fā)活性藥物或可檢測標記的釋 放。可以調(diào)整這種觸發(fā)，從而使所述釋放發(fā)生在期望的時刻和/或期望的位 置。
與所述前藥或前顯像探針上的疊氮化物和域膦官能團反應的成分(z)可 為任何合適的化合物，所述化合物具有可參與施陶丁格反應，從而導致激 活藥物和/或顯像探針的疊氮化物或膦基團。在優(yōu)選實施方案中，成分(z)是 包含主要靶向部分和施陶丁格反應配偶體的靶向探針。
成分(z)優(yōu)選包含至少一個疊氮化物和/或膦基團，但可任選包含至少兩 個或更多個、至少三個或更多個、至少四個或更多個或者至少五個或更多 個這些取代基。疊氮化物和/或膦取代基的數(shù)目優(yōu)選為每個成分(z)分子1至 50個，更優(yōu)選1至30個，甚至更優(yōu)選2至10個。
12高度優(yōu)選成分(Z)包含至少兩個或更多個疊氮化物和/或膦基團。
可以通過本領(lǐng)域中熟知的方式調(diào)整與前藥(x)、前顯像探針(y)或成分(z) 相連的膦部分(優(yōu)選三苯基膦部分)的性質(zhì)。例如，通過在三苯基膦部分的芳 環(huán)上引入適當?shù)墓倌軋F(例如S03)，可以影響溶解度、分布或反應性。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用P(R1， R2， R3)表示膦，其中R1、 R2 和R3各自與P相連。在優(yōu)選實施方案中，Rl、 R2和R3為包括取代的芳 基在內(nèi)的芳基，或者為環(huán)烷基，例如環(huán)己基。
Rl、 R2和R3可以相同或不同。
任選地，將R1、 R2和/或R3用作與藥物、顯像探針或成分(z)，或者主 要靶向部分的連接基，以形成本發(fā)明的前藥、前顯像探針或成分(z)。
在另一優(yōu)選實施方案中，將前藥和(前)顯像探針組合使用。在該實施方 案中，可通過所述顯像探針監(jiān)測藥物的給藥和存在/激活。
因此，將前藥任選連接至包含標記的顯像探針，所述前藥和所述顯像 探針單元中的至少一個包含膦和/或疊氮化物基團。
在另一實施方案中，前藥包含疊氮化物和/或膦基團，而顯像探針包含 施陶丁格反應的另一配偶體，即至少一個疊氮化物和/或膦基團。在該實施 方案中，成分(z)是任選的。
在該實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備和激活前藥和/或前顯像探針的 方法，其包括如下步驟-
a) 用至少一個疊氮化物和/或膦基團將藥物(x)官能化，以產(chǎn)生前藥；
b) 用至少一個疊氮化物和/或膦基團將顯像探針(y)官能化，以產(chǎn)生前顯 像探針，所述至少一個疊氮化物和/或膦基團是步驟(a)的前藥的疊氮化物和/ 或膦基團的施陶丁格反應中的配偶體；
c) 通過施陶丁格反應使所述前藥與前顯像探針反應，從而激活所述藥 物和/或顯像探針。
在另一方面，本發(fā)明涉及具有顯像探針或藥物的用于醫(yī)學成像或治療 的試劑盒，其包含-
-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前藥(x)和/或前顯像 探針(y);
-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的成分(z)，所述成分(z)能夠于施陶丁格反應中與所述前藥或前顯像探針反應，以形成所述藥物或顯像探針。 前藥、前顯像探針、成分(Z)及它們的應用的上述優(yōu)選實施方案同樣適
用于該試劑盒的組分。
優(yōu)選所述試劑盒包含至少一種前藥。
在甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒包含前藥和前顯像探針。這 使得能夠監(jiān)測藥物釋放/激活和藥物累積，并以此提供有用的藥物分布和活 性信息。
優(yōu)選所述前藥和所述前顯像探針包含膦基團。在該實施方案中，所述 成分(Z)包含可于施陶丁格反應中與所述膦基團反應的疊氮化物基團。
或者，所述前藥和所述前顯像探針各自包含選自膦和疊氮化物的不同 反應基。因此，根據(jù)該實施方案，所述前藥和所述前顯像探針于施陶丁格 反應中是配偶體。在該實施方案中，所述試劑盒優(yōu)選還包含關(guān)于所述前藥 和所述前顯像探針的順序給藥的說明書。在該實施方案中，成分(Z)的存在 是任選的。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及用于靶向醫(yī)學成像和/或治療的試劑盒， 其包含
-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前藥(X);
-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前顯像探針(y)，所述
疊氮化物和/或膦基團能夠于施陶丁格反應中與所述前藥反應，以形成藥物 和顯像探針。
本發(fā)明的包含疊氮化物或膦的靶向探針、顯像探針和治療探針是生物 相容的，并能夠以與目前用于醫(yī)學成像或治療中的常規(guī)分子相同或相似的 方式給藥。而且，所述顯像探針的可檢測標記是技術(shù)人員已知的，且只需 要常規(guī)方法和設(shè)備。
為了使藥物的靶向成為可能，顯像探針或成分(Z)、前藥(X)、前顯像探
針(y)或成分(z)優(yōu)選包含靶向部分，該部分被稱為"主要靶向部分"。該部
分適當?shù)亟Y(jié)合至作為要通過治療來治療的靶或者要通過成像來檢測的靶的
主要靶。任選x、 y、 z中至少兩個或者x、 y、 z每個都包含靶向部分。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明用于靶向成像或靶向治療。根據(jù)該實施方 案，通過主要靶向部分的特異性結(jié)合以及使用由施陶丁格反應激活的可檢測標記檢測該結(jié)合來實現(xiàn)特定主要靶的成像。
根據(jù)本發(fā)明，所述主要靶可以選自人或動物體內(nèi)或者病原體或寄生蟲 上的任何合適的靶，例如細胞如細胞膜和細胞壁、受體如細胞膜受體、胞
內(nèi)結(jié)構(gòu)如高爾基體或線粒體、酶、受體、DNA、 RNA、病毒或病毒顆粒、 抗體、蛋白質(zhì)、碳水化合物、單糖、多糖、細胞因子、激素、甾體、促生 長素抑制素受體、單胺氧化酶、蕈毒堿受體、心肌交感神經(jīng)系統(tǒng)、(例如白 細胞上的)白三烯受體、尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)、葉酸受體、凋 亡標記物、(抗)血管生成標記物、胃泌素受體、多巴胺能系統(tǒng)、血清素能系 統(tǒng)、GABA能(GABAergic)系統(tǒng)、腎上腺素能系統(tǒng)、膽堿能系統(tǒng)、類阿片(opoid) 受體、GPIIb/IIIa受體和其它血栓相關(guān)受體、纖維蛋白、降鈣素受體、促吞 噬素受體、整聯(lián)蛋白受體、VEGF/EGF受體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、 P/E/L-選擇蛋白受體、LDL受體、P-糖蛋白、神經(jīng)降壓肽受體、神經(jīng)肽受體、P 物質(zhì)受體、NK受體、CCK受體、cj受體、白介素受體、單純皰疹病毒酪氨 酸激酶、人酪氨酸激酶。
為了允許對以上列出的主要靶的特異性靶向，所述靶向部分可以包括 化合物，所述化合物包括但不限于抗體、抗體片段如Fab2、 Fab、 scFV、 VHH、蛋白質(zhì)、肽如奧曲肽和衍生物、VIP、 MSH、 LHRH、趨化肽、鈴蟾 肽、彈性蛋白、肽模擬物、碳水化合物、單糖、多糖、病毒、藥物、聚合 物、化療藥、受體激動劑和拮抗劑、細胞因子、激素、甾體。本發(fā)明中預 期的有機化合物的實例為或衍生自雌激素如雌二醇、雄激素、孕激素、皮 質(zhì)類固醇、甲氨喋呤、葉酸和膽固醇。在優(yōu)選實施方案中，所述主要靶向 部分為抗體。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述主要靶是受體，而合適的主要靶向 部分包括但不限于這樣的受體的配體或其仍結(jié)合所述受體的部分，例如在 受體結(jié)合蛋白配體的情況下為受體結(jié)合肽。
具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的主要靶向部分的其它實例包括干擾素如(x、 P和Y千 擾素、白介素以及蛋白生長因子如腫瘤生長因子如a、 p腫瘤生長因子、血 小板源生長因子(PDGF)、 uPAR靶向蛋白、載脂蛋白、LDL、膜聯(lián)蛋白V、 內(nèi)皮抑素(endostatin)和血管生成抑制素(angiostatin)。
主要靶向部分的其它實例包括例如與所述主要靶互補的DNA、 RNA、PNA禾口 LNA。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，使用可與胞內(nèi)主要靶結(jié)合的小的親脂性 主要靶向部分。
根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方案，選擇所述主要靶和主要靶向部分， 使得導致組織或疾病的特異性耙向或者靶向增加，所述組織或疾病如癌癥、 炎癥、感染、心血管疾病如血栓、動脈粥樣硬化損傷、缺氧部位例如中風、 腫瘤、心血管病癥、腦病癥、凋亡、血管發(fā)生、器官和報道基因/酶。通過 選擇具有組織特異性表達、細胞特異性表達或疾病特異性表達的主要靶可 以實現(xiàn)之。例如，膜葉酸受體介導葉酸及其類似物如甲氨喋呤的胞內(nèi)累積。 表達在正常組織內(nèi)是有限的，但受體在各種腫瘤細胞類型中過度表達。
根據(jù)一個實施方案，所述主要靶向部分和所述顯像探針和/或所述治療 探針或成分(z)可以是多聚化合物，其包含多個主要靶向部分和/或施陶丁格 反應配偶體和/或藥物/顯像探針，優(yōu)選多個主要靶向部分。這些多聚化合物 可以是聚合物、樹枝狀聚合物、脂質(zhì)體、聚合物顆?；蚱渌酆辖Y(jié)構(gòu)。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含疊氮化物和/或膦基團的前藥或前顯像探 針作為醫(yī)學成像中的工具的用途，優(yōu)選作為靶向醫(yī)學成像中的工具的用途， 所述膦基團和/或所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的合適的反應配偶體。
本發(fā)明還涉及包含疊氮化物和/或膦基團的前顯像探針在制備用于醫(yī)學 成像的工具中的用途，所述膦基團和域所述疊氮化物基團是施陶丁格反應 的合適的反應配偶體。
本發(fā)明還涉及包含疊氮化物和域膦基團和可檢測標記的前藥在制備用 于醫(yī)學成像的工具中的用途，所述膦和/或疊氮化物基團是施陶丁格反應的 合適的反應配偶體。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的化合物和方法用于成像，尤其 是醫(yī)學成像。使用包含一個或多個可檢測標記的顯像探針。所述顯像探針 的可檢測標記的具體實例是用于常規(guī)成像系統(tǒng)的造影劑如MRI可成像劑、 自旋標記、旋光標記、超聲響應齊U(ultrasound-responsive agent)、 X-射線響 應劑、放射性核素、(生物)發(fā)光和FRET型染料。本發(fā)明中預期的示例性可 檢測標記包括且不一定限于熒光分子如自身熒光分子、與試劑等接觸時發(fā) 出熒光的分子、放射性標記、包含順磁性金屬的MRI顯像劑、顯像試劑如美國專利4,741,900和5,326,856中所述的那些等。
所述MRI-可成像劑可以是順磁性離子或超順磁性粒子。所述順磁性離 子可以是選自下列的元素Gd、 Fe、 Mn、 Cr、 Co、 Ni、 Cu、 Pr、 Nd、 Yb、 Tb、 Dy、 Ho、 Er、 Sm、 Eu、 Ti、 Pa、 La、 Sc、 V、 Mo、 Ru、 Ce、 Dy、 Tl。
本發(fā)明的具體實施方案涉及使用"智能"或"響應性"MRI造影劑，如本 文下面更詳細描述的。
所述超聲響應劑可以包括殼包含磷脂的微泡，和/或(生物可降解)的聚 合物，和/或人血清白蛋白。所述微泡可以用氟化氣體或液體填充。
所述X-射線響應劑包括但不限于碘、鋇、硫酸鋇、泛影葡胺，或者可 以包括用碘化合物和/或硫酸鋇填充的囊泡、脂質(zhì)體或聚合物膠囊。
而且，本發(fā)明中預期的可檢測標記還包括能夠通過抗體結(jié)合(例如通過 可檢測標記抗體的結(jié)合或經(jīng)夾心型測定法檢測結(jié)合抗體)檢測的肽或多肽。
在一個實施方案中，所述可檢測標記是小尺寸的有機PET和SPECT標 記如"F、 "C或1231。由于它們的尺寸小，所以有機PET或SPECT標記理 想地適于監(jiān)測胞內(nèi)事件，因為它們通常不明顯影響靶向裝置的性質(zhì)，尤其 是其膜轉(zhuǎn)運。同樣，疊氮化物部分較小，也可以作為胞內(nèi)成像或治療的活 化劑。而且，施陶丁格反應的兩種成分都不排除穿越血腦屏障，因此允許 腦內(nèi)區(qū)域的成像或治療。
根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的化合物和方法用于靶向治療。通過使用 包含疊氮化物和/或膦部分和一種或多種藥學活性劑(如藥物)的前藥來實現(xiàn) 之。用于靶向遞藥的合適的藥物在本領(lǐng)域中是已知的。
在本發(fā)明的再一實施方案中，通過將于施陶丁格反應中是配偶體的疊 氮化物或膦基團選擇性引入靶細胞或組織內(nèi)來代替靶向部分的使用。通過 使用包含例如疊氮化物反應配偶體的結(jié)構(gòu)單元分子如代謝前體分子來實現(xiàn) 之，所述結(jié)構(gòu)單元分子可以通過細胞的代謝被截留或引入生物分子內(nèi)。以 這種方式靶向的途徑可以是為所有細胞共有的途徑如DNA合成、蛋白質(zhì)合 成和膜合成。任選地，它們是在疾病狀況如癌癥或炎癥/感染中上調(diào)的代謝 途徑?；蛘撸邢虻拇x途徑對于特定類型的細胞或組織是特異性的。 可以用于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)單元包括代謝前體分子，例如但不限于氨基酸和核 酸、糖、氨基糖、脂質(zhì)、脂肪酸和膽堿。將這些化合物如氨基酸成像可以
17反應氨基酸攝取和/或蛋白質(zhì)合成的差異。可以使用多種糖來標記碳水化合 物結(jié)構(gòu)。可以使用脂肪酸來標記例如細胞膜內(nèi)的脂質(zhì)。
而且，許多代謝前體的類似物在本領(lǐng)域中是已知的，它們用于本發(fā)明 可以提供特別的優(yōu)點。下面提供了可以用疊氮化物或膦標記的代謝途徑和 相應的代謝前體的實例的非限制性列表。其中一些暫時累積入細胞內(nèi)，而 其它被引入生物大分子內(nèi)。
在本發(fā)明的這方面的具體實施方案中，靶向在疾病如感染/炎癥或癌癥
過程中上調(diào)的代謝途徑?？赡茉诩膊顩r中上調(diào)的成分包括例如DNA、蛋 白質(zhì)、膜合成和糖攝取。標記這些元素的合適的結(jié)構(gòu)單元包括疊氮化物標 記的氨基酸、糖、核堿、膽堿和乙酸酯。具有高代謝或增殖的細胞具有這 些結(jié)構(gòu)單元的更高攝取。疊氮化物衍生物可以進入這些途徑并在細胞內(nèi)和/ 或細胞上累積。
因此，本發(fā)明還涉及使用藥物或顯像探針進行靶向醫(yī)學成像和/或治療
的試劑盒，其包含
-包含施陶丁格反應配偶體的至少一種結(jié)構(gòu)單元；和選自以下的至少一
種其它探針
-包含施陶丁格反應配偶體和標記的顯像探針；或 -包含施陶丁格反應配偶體和藥學活性化合物的治療探針， 其中所述結(jié)構(gòu)單元或者所述顯像或治療探針中的任一個包含作為施陶 丁格反應配偶體的至少一個疊氮化物基團，而所述結(jié)構(gòu)單元、顯像或治療 探針中的另一個包含至少一個膦基團，所述膦基團和所述疊氮化物基團是 施陶丁格反應的反應配偶體。
本發(fā)明的具體實施方案涉及使用報道基因探針，即由于它們參與細胞 過程而允許顯現(xiàn)過程或細胞類型的分子。這樣的探針可以使用細胞的內(nèi)源 機制，例如為其提供有底物的內(nèi)源酶。或者，這樣的探針通過稱為報道基 因的外源基因起作用。報道基因產(chǎn)物可以是將報道基因探針轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn) 物的酶，所述代謝產(chǎn)物被選擇性地截留在細胞內(nèi)。或者，報道基因可以編 碼受體或轉(zhuǎn)運蛋白或泵，其導致探針積累入細胞內(nèi)。
氟胸苷是由胸苷激酶-1 (TK1)磷酸化的胸苷類似物，其可以被用作導致 細胞截留的報道基因。在細胞培養(yǎng)物中，攝取與TK1活性和細胞增殖有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，所述報道基因探針是對應于細胞或組織 內(nèi)的特定環(huán)境的分子。組織缺氧對于心腦血管病、缺血性心臟病、外周血 管病和炎性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理是重要的。它還是惡性實體瘤生長的普遍特 征，其中其與腫瘤的侵入性正相關(guān)，并與對化療或放療的響應可能性負相 關(guān)。近來的工作已提示，在每個這些情境中對缺氧的響應存在共同的途徑。 2-硝基咪唑化合物被還原并截留在缺氧細胞內(nèi)，可以用作缺血性心肌和腫瘤 中的氧壓傳感器。實例包括氟米索硝唑、氟赤式硝基咪唑
(fluoroerythronitroimidazole)、硝基咪唑-阿拉伯糖苷、乙烯基米索硝唑、 RP-170 (l-[2-羥基-l-(羥甲基)-乙氧基]甲基-2-硝基咪唑)和SR 4554 (N-(2-羥 基-3，3，3-三氟丙基)-2-(2-硝基-l-咪唑基)乙酰胺)。HL91是具有腫瘤攝取的非 硝基咪唑化合物。另一種合適的化合物是二乙?；?雙(N4-甲基縮氨基硫脲)-銅(II)(ATSM)。
因此在另一方面，本發(fā)明涉及用于靶向醫(yī)學成像和/或治療的試劑盒， 其包含
-包含施陶丁格反應配偶體的至少一種報道基因探針；和選自以下的至 少一種其它探針
-包含施陶丁格反應配偶體和標記的顯像探針；或 -包含施陶丁格反應配偶體和藥學活性化合物的治療探針， 其中所述報道基因或者所述顯像或治療探針中的任一個包含作為施陶 丁格反應配偶體的至少一個疊氮化物基團，并且另一個探針包含至少一個 膦基團，所述膦基團和所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的反應配偶體。
任選地，所述主要靶向部分或結(jié)構(gòu)單元已經(jīng)包含可檢測標記。優(yōu)選地， 該標記不同于在施陶丁格反應中的下一步驟中引入的標記。給藥具有標記 如用疊氮化物官能化的FDG的結(jié)構(gòu)單元或主要靶向部分導致FDG樣圖像， 它可在第二步中被得自用標記的膦激活的步驟的圖像覆蓋。將兩種顯像標 記組合， 一種存在于所述結(jié)構(gòu)單元、報道基因探針或主要靶向部分內(nèi)，而 另一種存在于在其后給藥的膦內(nèi)，這具有潛在的優(yōu)點，即更好的靶定位、 人工消除、描繪非相關(guān)清除和其它藥代動力學途徑。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本文描述的化合物和方法體內(nèi)使用來成 像或檢測動物或人體組織或細胞類型。或者，它們同樣可以體外使用來檢查活組織檢査或其它身體樣本，或者檢査手術(shù)后已被摘除的組織。
如本文所述，根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，順序提供成分(Z)和前藥或
前顯像探針，任選通過結(jié)合成分(z)的靶部分并任選除去過量的成分(z)而定
位，然后提供標記/顯像或前藥化合物。這確保更高的圖像信噪比和/或更高 的治療效率，并且通常被稱為"預靶向"或"兩步"靶向。根據(jù)另一實施 方案，本發(fā)明的方法和化合物用于靶向信號放大和/或多價安置。在這里， 所述成分(Z)優(yōu)選綴合至含有多個三苯基膦部分的樹枝狀聚合物、聚合物或 脂質(zhì)體。在報道基因優(yōu)選通過主要耙向部分結(jié)合所述成分(Z)后，注射包含
綴合至一種或多種MRI造影劑(如Gd螯合劑)的疊氮化物的前顯像探針或前 藥。隨后的施陶丁格反應導致靶組織處的高濃度的活化MRI造影劑。而且， 靶位置處的多價會提高與疊氮化物報道基因綴合物(顯像探針)的反應動力 學，提供MRI造影劑的有效靶激活?；蛘?，所述疊氮化物還可以如上所述 被包含在所述成分(z)中，而三苯基膦綴合至所述前顯像探針或前藥。
本發(fā)明的探針和試劑盒用于醫(yī)學成像和治療，更具體地說用于"靶向" 成像和治療。術(shù)語"靶向"涉及這樣的事實，即所述前顯像探針或藥學活 性化合物(前藥)在給藥至患者后特異性地與靶分子相互作用或者被引入靶 分子內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明通過使用靶向部分或通過使用靶代謝底物可以實現(xiàn)之。 或者，可以通過提供組合的靶向探針和顯像或治療探針(即將這兩種成分作 為組合探針給藥)來實現(xiàn)之。該靶分子可以是特定類型的細胞或組織特有的， 或者可以是體內(nèi)所有細胞或組織共有的。
本發(fā)明的組合物可以通過不同途徑施用，包括靜脈內(nèi)注射、口服給藥、 直腸給藥和吸入。適合這些不同給藥類型的制劑是技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明的前藥或前顯像探針可以與藥學可接受的載體一起給藥。在用 于本文時，合適的藥用載體涉及適合醫(yī)學或獸醫(yī)目的沒有毒性也沒有在其 它方面不可接受的載體。這樣的載體在本領(lǐng)域中是熟知的，并包括鹽水、 緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及它們的組合。制劑應當適應給藥模 式。
因此在另一方面，本發(fā)明涉及包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的前 藥或前顯像探針，其用于制備藥物。
通過下列非限制性實施例說明本發(fā)明。實施例
1) 將三苯基膦綴合物靶向至疾病位置。在靶結(jié)合和從非靶組織清除后，
給藥含有多個FRET染料的疊氮基觸發(fā)物官能化的級聯(lián)釋放樹枝狀聚合物。 在用靶向膦分子于施陶丁格反應中局部激活后，所述樹枝狀聚合物分解并 釋放多個活化的FRET染料分子。參考圖2，其說明該實施例。
2) 將含有多個FRET染料的疊氮基觸發(fā)物官能化的級聯(lián)釋放樹枝狀聚 合物耙向至疾病位置。在靶結(jié)合和從非靶組織清除后，全身給藥三苯基膦。 在通過該膦分子局部激活后，所述樹枝狀聚合物分解并釋放多個活化的 FRET染料分子。參考圖3，其說明該實施例。
3) 作為實施例2的替代，可以通過樹枝狀聚合物的末端之一而非一個 FRET染料將耙向部分綴合至樹枝狀聚合物。參考圖4，其說明該實施例。
4) 可激活的MRI造影劑。兩個突出顯示的羧酸阻斷Gd螯合絡(luò)合物的 內(nèi)球中的兩個水配位位置，這導致結(jié)構(gòu)體的低馳豫性(relaxivity)(因此MRI 的低信號強度)。當疊氮化物基團與靶向三苯基膦部分反應時(A)，由所得胺 引發(fā)的消除級聯(lián)提供所懸掛的羧酸的消除。施陶丁格反應因此使兩個配位 位置對水而言可用，這導致局部信號增加。在B中，靶向顯像化合物而非 激活化合物。在通過A所述機理與全身三苯基膦反應后，具有懸掛的無活 性Gd螯合物的靶向脂質(zhì)體被激活。這導致釋放活化的絡(luò)合物。然而，在激 活后將Gd絡(luò)合物保持固定在感興趣的靶上是有益的。在C中，通過將脂質(zhì) 尾連接到未由疊氮基觸發(fā)物釋放的位置上來實現(xiàn)之?？杉せ钐结樀母拍羁?以與(耙向)級聯(lián)樹枝狀聚合物容易地聯(lián)用，這僅需將A的堿性結(jié)構(gòu)安裝到實 施例2和3的結(jié)構(gòu)體的末端而非FRET染料上。參考圖5，其說明該實施例。 而且，可以將大量這些結(jié)構(gòu)體懸掛到聚合物上用于前顯像探針的EPR靶向。 在這方面，還可以將大量激活分子(施陶丁格反應配偶體)懸掛到例如用于 EPR耙向的聚合物上，然后與全身給藥的可激活的MRI造影劑反應。
5) 在實施例1-3中，所釋放的物質(zhì)是活化的染料。然而，這樣的實施方案是可能的，其中所釋放的成分包括可激活的顯像探針(如FRET染料) 與一種或多種類型的藥物的混合物，從而允許藥物激活的成像。而且，還 可以用顯像劑(例如不同波長的染料，或者放射性核素)標記靶向部分本身和 /或顯像/治療探針和/或成分(z)，從而允許藥物遞送和激活的同時成像。
6) 也可以使用實施例(4)中描述的可激活的MRI造影劑而非其它可激 活的顯像探針(如FRET)或者與其它顯像探針聯(lián)用來進行實施例(5)中描述 的應用。
7) 涉及藥物激活的成像的另一實施方案使用由施陶丁格反應激活的前 熒光三苯基膦染料。在將該染料靶向至疾病位置后，給藥疊氮化物前藥(實 施例A)。然后在疾病位置選擇性地激活該前藥，導致釋放活性藥物分子以 及激活定位的熒光探針。
在實施例B中，將疊氮化物前藥靶向至疾病位置。然后給藥前熒光染 料，導致局部釋放活性藥物分子并激活染料。 參考圖6，其說明該實施例。
8) 描述了模型疊氮基-前藥4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲酸酯(4)的合成。
4-疊氮基芐醇(2):
將4-氨基芐醇1 (4.0 g， 32.5 mmol)在60 ml 5M鹽酸中的攪拌溶液冷卻 到4。C，并在30min內(nèi)滴加亞硝酸鈉(2.48g， 35.9 mmol)在20 ml水中的溶 液。在30 min內(nèi)，在劇烈攪拌下分小部分加入疊氮化鈉(8.50 g， 130.7 mmol)。 將反應溫度保持低于5'C。在4'C下攪拌1.5小時后，將反應混合物倒入冰 水中并堿化(NaHC03)至pH 8 (知道是酸-堿反應)。用EtOAc萃取水層并用 水(2x)洗滌。將EtOAc層干燥(MgS04)并蒸發(fā)。將輕質(zhì)石油苯(light petroleum benzene)倒在殘余物上，攪拌30 min并保持在(TC過夜，得到米色懸浮液。 在過濾后，用5 ml輕質(zhì)石油苯洗滌殘余物，獲得2 (3.93 g， 26.3 mmol， 81%)， 為米色粉末(感光性)。'HNMR，Sh(CDC13) 1.72(1H,s, OH), 4.67 (2H, s, CH2), 7.02(2H，d， J=8.48，芳族)，7.35 (2H， d， J=8.67,芳族)。4-疊氮基芐基4-硝基苯基碳酸酯(3):
將4-硝基苯基氯甲酸酯(5.32 g， 26.4 mmol)和吡啶(4.38 g， 55.4 mmol) 在150 ml THF中的溶液在0-4"C下攪拌，并在30 min內(nèi)滴加4-疊氮基芐醇 2 (3.93 g， 26.4 mmol)在50 ml THF中的溶液。將反應混合物在暗處在25°C 下攪拌70小時。蒸發(fā)THF并加入30 ml EtOAc。將EtOAc層用水(2x)洗滌， 干燥(MgS04)并蒸發(fā)。將殘余物從輕質(zhì)石油苯/EtOAc中重結(jié)晶，獲得3 (6.26 g， 19.9 mmol， 75%),為黃色粉末。！HNMR， 5H (CDC13) 5.19 (2H, s, CH2)， 7.00 (2H， d, J=8.48，疊氮基芐基芳烴)，7.31 (2H， d， J=9.23，硝基苯基芳烴)，7.37 (2H，d,J=8.67，疊氮基芐基芳烴)，8.21(2H,d，J-9.23，硝基苯基芳烴)。
4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲酸酯(4):
將4-疊氮基芐基4-硝基苯基碳酸酯3 (465 mg, 1.48 mmol)在5.5 ml THF 中的溶液冷卻到(TC，并在將芐胺(267mg， 2.49mmol)和吡啶(50mg， 0.63 mmol)加入到該攪拌溶液中后，使溶液溫熱到室溫并攪拌18小時。蒸發(fā)THF 并加入30mlDCM。用水(lx)、 0.1MHCl(lx)、水(lx)、 0.1MNaOH(lx) 和水(lx)洗滌有機層。將有機層干燥(MgS04)，過濾并蒸發(fā)溶劑。通過硅膠 色譜法進行純化，用DCM作為洗脫劑，獲得4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲 酸酯4 (347 mg， 0.123 mmol， 83 %)，為淡黃色固體。H NMR, SH (CDC13) 4.36 (2H, d, J=6.03， CH2芐基),5.08 (2H, s, CH2疊氮基芐基)，6.99 (2H， d, J=8.28， 疊氮基節(jié)基芳烴)，7.25-7.35 (7H, m，芳族).13C NMR, SH (CDC13)， 45.59, 66.64， 119.53,127.98， 129.12, 130.26。
參考圖7，其說明該實施例。
9)用3-(二苯基膦基)苯磺酸鹽(5)在兩種不同介質(zhì)中激活模型疊氮基-前藥4-疊氮基芐基N-芐基氨基甲酸酯(4)
在DMF/H20 (3.5/1)中將前藥4 (5.3 mg， 18.8 pmol)溶于952 jal DMF-d7 和275jxlD20中。加入膦5(12.1mg， 33.2 ^mo1)，并用'HNMR追蹤反應。 通過4.83 ppm處CH2疊氮基芐基信號的消失和4.64 ppm處相應的氨基芐醇 (7)的CH2信號的出現(xiàn)來判斷反應在14小時內(nèi)完成。
在THF/H20 (1/1)中將前藥4 (4.8 mg， 17.0 jjmol)溶于275 pi THF-d8 和275 ^ilD20中。向淡黃色溶液中加入膦5(11.3mg， 31.0 pmol)，然后觀
23察到氣體產(chǎn)生。用'HNMR追蹤反應，通過4.83ppm處CH2芐基信號的消 失和3.99 ppm處相應的游離芐胺(6)的CH2信號的出現(xiàn)來判斷在7小時后反 應完成50%。
參考圖8，其說明該實施例。
10) 阿霉素前藥9的合成
疊氮基氨基甲酸酯阿霉素9。在室溫和氮氣下，將4-疊氮基節(jié)基4-硝 基苯基碳酸酯3 (20.6 mg， 65.6 pmol)、 Et3N (9.6 pl， 69 ,ol)、阿霉素(40 mg， 69 pmol)在DMF (4.8 ml)中的溶液在暗處攪拌20 h。在加入更多Et3N (9.6 jal， 69,01)后，將溶液再攪拌24h。
向有機層中加入EtOAc/異丙醇10% (10ml)并用水(lx)洗滌有機層。將 紅色有機層干燥(MgS04)，過濾并減壓蒸發(fā)(水浴低于30°C)。收集紅色固體 (77 mg)并用制備TLC (DCM/MeOH 9/1)純化。用EtOAc萃取Rf 0.72處的收 集餾分。減壓蒸發(fā)有機層并加入ACN/水1/1進行凍干。在凍干后，收集紅 色固體(31.8mg， 67%)。 iHNMRSH(CDCl3)1.29(3H，d，J-6.6,C隱CH3)1.80-1.90 (2H, m， CH2碳水化合物)，2.17 (1H, dd, JA=14.8， JB=4.0， CH2)， 2.33 (1H, br dt， JA=14.7, JB=1.7, CH2), 3.02 (1H， d, J=19， CH2), 3.28 (1H, d, J=19, CH2)， 3.66 (1H, br s, CH碳水化合物)，3.86 (1H, m， CH碳水化合物)，4.09 (3H, s， OCH3)， 4.14 (1H, q， J=6.4， CH-CH3) 4.76 (2H, s, CH2-OH), 4.99 (2H, s, 012連 接基)，5.13 (1H， d, J=8.6，酰胺NH)， 5.29 (1H, br m, CH), 5.50 (IH， d， J=3.5, CH碳水化合物),6.97 (2H， d， J=8.3，芳族疊氮化物)，7.29 (2H， d, J=8.3，芳族 疊氮化物)，7.40 (1H, dd, JA=8.5, JB=0.75，芳族dox), 7.80 (1H, dd， JA=8.5， Jc=7.7，芳族dox)， 8.05 (1H， dd, JB=0.75, Jc=7.7，芳族dox). MALDITOF MS: m/z: 742 [M+Na]+。
參考圖9，其說明該實施例。
11) 用HPLC和LC-MS追蹤阿霉素前藥(9)的激活 以如下方式進行激活將前藥在水或生長培養(yǎng)基中的溶液與三苯基膦
-3，3'，3"-三磺酸三鈉鹽在水或生長培養(yǎng)基中的溶液混合。每2小時從反應混 合物(37"C)取樣并在HPLC或LCMS中測量。使用幾種不同濃度和比率的前藥/三苯基膦。用100 nM前藥和200 膦的濃度在水中完成第一激活實 驗，并用HPLC監(jiān)測。在8小時后，形成了15%阿霉素，并且反應在20小 時后完成(圖10)。
第二激活在低10倍的濃度下完成，前藥為10 |iM而膦為20 pM，并用 LCMS監(jiān)測。在24小時后，反應完成約30%(圖11)。
第三和最后激活在細胞生長培養(yǎng)基中用10 pM前藥完成。由于三苯基 膦在細胞生長培養(yǎng)基中緩慢氧化，所以調(diào)整了方案。在本實驗過程中，每 天兩次向混合物中加入新鮮部分(60pM)的三苯基膦。在8小時后，反應完 成85% (圖12)。
參考圖10-12，它們說明該實施例。
12)使用具有由三苯基膦原位激活的前藥9 (pro-dox)的A431細胞進行 細胞增殖測定
通過細胞毒性測定評價前藥9 (pro-dox)的體外抗癌活性。對于這些細胞 實驗，使用A431細胞系。該細胞系源自人陰門皮膚鱗狀細胞癌(SCC)。由 于通過施陶丁格反應釋放阿霉素，所以與加入pro-dox而不加入膦相比，加 入前藥和膦的組合應該導致增殖減少。
細胞和試劑
在青霉素和鏈霉素的存在下，將細胞保持在補充有10%熱滅活胎牛血 清和0.05% glutamax (InVitrogen)的37°C DMEM (InVitrogen)中。
在每次實驗前，以10 mM將阿霉素(Toronto Research Chemicals)和 pro-dox(9)新鮮溶于DMF,然后在預先溫熱的培養(yǎng)基中系列稀釋。以10mM 將三苯基膦-3，3',3"-三磺酸三鈉鹽(Sigma)溶于PBS，并在預先溫熱的培養(yǎng)基 中系列稀釋。按照制造商所述使用甲基噻唑基二苯基四唑鑰溴化物MTT (Sigma)。
增殖測定
以7500細胞/孔的密度將細胞鋪在96孔板(Nunc)上，第二天加入試劑。 在溫育72小時后，通過MTT測定評價細胞增殖。簡言之，以5mg/ml將 MTT溶于預先溫熱的培養(yǎng)基中，通過0.22拜過濾器并將50 pl加入到各孔中。在溫育120分鐘后，輕輕抽吸培養(yǎng)基。將形成的甲臘晶體溶于100 ^ DMSO中，并用讀板器(BMG)在560 nm處測量吸光度或光密度(O.D.)。通 過報道處理組(T)的O.D.和適當對照組(C)的aD.并表達為[(l-T/C) x 100%]
來確定增殖抑制。
如實施例ll中所述，膦在細胞生長培養(yǎng)基中緩慢氧化。因此，不在第 2天將前藥與單批三苯基膦一起加入到細胞培養(yǎng)物中，而是在第2到第4天 以固定間隔加入膦。研究了三種膦給藥方案5 x 10 pM、 5 x 30 |iM禾tl 5 x 60 HM。用于阿霉素藥物的濃度范圍為0 - 0.01 - 0.1 - 0.3 - 1.0 - 10 nM。圖13 和14中的結(jié)果顯示pro-dox的最低抗增殖活性，其順序為用10、30和60 膦重復劑量激活的pro-dox活性逐漸上升。發(fā)現(xiàn)阿霉素本身具有最高活性， 比其掩蔽的無活性pro-dox類似物高出兩個數(shù)量級。盡管pro-dox/膦組合的 活性不等同于母體藥物的活性，但用pro-dox和60 nM膦重復劑量處理細胞 仍然導致活性比單獨的pro-dox高出33倍。
在相同的膦總量下，將上述膦給藥方案與單批給藥方案進行比較。該 實驗的結(jié)果繪于圖15中。從該圖清晰可見，在相同的總膦量下，單劑量膦 在激活阿霉素前藥方面不如順序加入膦有效。
參考圖13-15，它們說明該實施例。
權(quán)利要求
1. 用于制備和激活前藥或前顯像探針的方法，其包括如下步驟a)用至少一個疊氮化物和/或膦基團將藥物(x)或顯像探針(y)官能化，以產(chǎn)生前藥或前顯像探針；b)通過施陶丁格反應使所述前藥或前顯像探針與成分(z)反應，所述成分(z)包含至少一個疊氮化物和/或膦基團作為所述施陶丁格反應中的反應配偶體，從而激活所述藥物或顯像探針。
2. 用于制備和激活前藥或前顯像探針的方法，其包括如下步驟a) 用至少一個疊氮化物和/或膦基團將藥物(x)官能化，以產(chǎn)生前藥；b) 用至少一個疊氮化物和/或膦基團將顯像探針(y)官能化，以產(chǎn)生前顯 像探針，所述至少一個疊氮化物和/或膦基團是步驟(a)的前藥的疊氮化物和/ 或膦基團的施陶丁格反應中的配偶體；c) 通過施陶丁格反應使所述前藥與前顯像探針反應， 從而激活所述藥物和/或顯像探針。
3. 用于醫(yī)學成像和/或治療的試劑盒，其包含-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前藥(x)和/或前顯像 探針(y);-包含至少一個疊氮化物和域膦基團的成分(z)，所述成分(z)能夠于施 陶丁格反應中與所述前藥或前顯像探針反應，以形成藥物或顯像探針。
4. 權(quán)利要求3的試劑盒，其包含至少一種前藥。
5. 權(quán)利要求3的試劑盒，其包含前藥和前顯像探針。
6. 權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述前藥和所述前顯像探針包含膦基團。
7. 權(quán)利要求3或4的試劑盒或者權(quán)利要求1的方法，其中所述前藥(x)、 前顯像探針(y)或成分(z)至少之一包含主要靶向部分。
8. 權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述靶向部分與受體結(jié)合。
9. 權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述靶向部分是抗體。
10. 包含疊氮化物和/或膦基團的前藥或前顯像探針作為醫(yī)學成像中的 工具的用途，所述膦基團和/或所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的合適的 反應配偶體。
11. 包含疊氮化物和/或膦基團的前顯像探針在制備用于醫(yī)學成像的工 具中的用途，所述膦基團和/或所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的合適的 反應配偶體。
12. 包含疊氮化物和/或膦基團和可檢測標記的前藥在制備用于醫(yī)學成 像的工具中的用途，所述膦和/或疊氮化物基團是施陶丁格反應的合適的反 應配偶體。
13. 用于耙向醫(yī)學成像和/或靶向治療的試劑盒，其包含-包含施陶丁格反應配偶體的至少一種結(jié)構(gòu)單元；和選自以下的至少一 種其它探針-包含施陶丁格反應配偶體和標記的顯像探針；或 -包含施陶丁格反應配偶體和藥學活性化合物的治療探針， 其特征在于分別作為施陶丁格反應配偶體和活化劑，所述結(jié)構(gòu)單元或 者所述顯像或治療探針中的任一個包含至少一個疊氮化物基團，而所述結(jié) 構(gòu)單元、顯像或治療探針中的另一個包含至少一個膦基團，所述膦基團和 所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的反應配偶體。
14. 用于耙向醫(yī)學成像和/或靶向治療的試劑盒，其包含-包含施陶丁格反應配偶體的至少一種報道基因探針；和選自以下的至少一種其它探針-包含施陶丁格反應配偶體和標記的顯像探針；或-包含施陶丁格反應配偶體和藥學活性化合物的治療探針，其特征在于所述報道基因或者所述顯像或治療探針中的任一個包含作為施陶丁格反應配偶體的至少一個疊氮化物基團，而另一個探針包含至少一個膦基團，所述膦基團和所述疊氮化物基團是施陶丁格反應的反應配偶體。
15. 用于耙向醫(yī)學成像和/或耙向治療的試劑盒，其包含-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前藥(x);-包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的至少一種前顯像探針(y)，所述疊氮化物和/或膦基團能夠于施陶丁格反應中與所述前藥反應，以形成藥物 和顯像探針。
16. 包含至少一個膦基團的前藥，其用于制備藥物。
17. 包含至少一個疊氮化物和/或膦基團的前顯像探針，其用于制備藥
全文摘要
施陶丁格反應可以用于激活前藥或前顯像(pro-imaging)探針。本發(fā)明涉及通過使用施陶丁格反應制備和激活前藥或前顯像探針的方法，并涉及用于醫(yī)學成像和/或治療的試劑盒，其包含至少一種前藥和/或前顯像探針，所述前藥和/或前顯像探針包含至少一個疊氮化物和/或膦基團。
文檔編號A61K51/02GK101437548SQ200680037203
公開日2009年5月20日 申請日期2006年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月4日
發(fā)明者H·格呂爾, M·S·羅比亞爾 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司