專利名稱：用于注射入動物的包括ndga化合物的兒茶酚丁烷配方的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求了提交于2005年1月27日的美國臨時專利申請60/647,495和60/647,648的優(yōu)先權(quán)，所述申請通過引用全部并入此處。本申請還和與本申請同時提交的國際專利申請相關(guān)，該國際申請的代理人案號為682714-9WO，名稱為“輸送包括NDGA化合物的兒茶酚丁烷(catecholic butanes)的口服配方”，該申請的公開內(nèi)容通過引用全文并入此處。
背景技術(shù)：
本申請涉及向諸如人類的動物給藥兒茶酚丁烷的包括注射配方的組合物和方法，所述兒茶酚丁烷包括NDGA化合物諸如NDGA衍生物，例如四-O-甲基NDGA，以用于疾病的治療，所述疾病例如癌癥、牛皮癬或其他增生或炎性疾病，諸如糖尿病的代謝病或包括諸如阿茲海默氏癥(Alzheimer’s disease)、中風、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、帕金森氏癥(Parkinson’s disease)的神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)元疾病。
已經(jīng)在某些實驗動物上測試了去甲二氫愈創(chuàng)木酸(“NDGA”)的治療應(yīng)用。例如，Jordan等人在美國專利5,008,294中記載了NDGA對人乳腺癌，MX-1的效果，該癌細胞在第0天皮下植入大鼠中(實施例2)。在第一天，對患腫瘤的大鼠以單次腫瘤內(nèi)注射的方式注射各種劑量的NDGA。在這個實施例中沒有公開NDGA的增溶劑。在另一個實施例中，用10-2M NDGA在4mLDMSO(即，二甲亞砜)中的備用液和6mL蒸餾水進行細胞體外測試(實施例5)。
Huang等人，如美國專利6,214,874中記載，測試了某些NDGA的衍生物(即NDGA衍生物)的治療應(yīng)用。在一個實施例中，NDGA衍生物被溶解在DMSO中(實施例5)。
使用DMSO向人體給藥是有爭議的。此外，使用DMSO可引起不希望的副作用，諸如鎮(zhèn)靜、頭痛、惡心、眩暈、發(fā)燒或眼痛及明顯的呼吸氣味。(例如，見Brobyn，R.D.“The human toxicology of dimethyl sulfoxide(二甲亞砜的人體毒性)”Ann.N.Y. Acad.Sci.243497-506，1975年1月27日)。如果兒茶酚丁烷，包括NDGA或NDGA衍生物(共稱為，“NDGA化合物”)有用于作為人或其他動物的治療劑，例如2004年12月29日出版的國際公開號為WO 04/112696的PCT/US2004/016117所述，非常需要開發(fā)不同于含DMSO的配方的新型配方，以溶解這些包括NDGA化合物諸如NDGA衍生物，例如，M4N的兒茶酚丁烷。此外，人們希望這些配方不僅安全而且穩(wěn)定，向動物給藥后具有最小的副作用。人們還希望為這些化合物開發(fā)一種配方，可使有效量的這些化合物輸送至所需的人或其他動物體內(nèi)的目標組織。本發(fā)明具有所需的優(yōu)點。


發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的之一是提供溶解此處包括NDGA化合物諸如NGGA衍生物的兒茶酚丁烷的一種或多種新型配方，其中此種配方不含DMSO并適于注射入動物。
本發(fā)明的另一目的是提供當向包括人的動物給藥時，安全并幾乎沒有副作用的如上配方。
本發(fā)明的另一目的是提供一種或多種的前述配方，所述配方具有商業(yè)上合理期限的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的又一目的是提供一種或多種的前述配方，所述配方可向動物腸胃外地給藥。
本發(fā)明的另一目的是提供一種或多種的前述配方，所述配方在向動物給藥后的循環(huán)中，具有商業(yè)上合理的半衰期。
根據(jù)前述的本發(fā)明的一個或多個目的，提供本發(fā)明的具體實施方式
如下 一種用于注射入動物的組合物，該組合物包括活性藥物成分和制藥上可接受的載體，其中所述活性藥物成分包括兒茶酚丁烷，所述載體包括選自由下述物質(zhì)組成的組的增溶劑和賦性劑中的至少一種(a)除二甲亞砜外的水溶性有機溶劑；假如當所述水溶性有機溶劑為丙二醇時，所述丙二醇不含白凡士林、不含黃原膠(也被稱為xantham gum和xanthumgum)且不含甘油或甘氨酸中的至少一種，當所述水溶性有機溶劑為聚乙二醇時，所述聚乙二醇在不含抗壞血酸或丁化羥基甲苯(butylatedhydroxytoluene)(“BHT”)下存在，以及當所述聚乙二醇為聚乙二醇400時，所述聚乙二醇400在不含聚乙二醇8000下存在；(b)環(huán)糊精；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑，假如當所述表面活性劑為非離子表面活性劑時，所述非離子表面活性劑在不含黃原膠下存在；(d)改性纖維素；(e)除蓖麻油外的水不溶性脂質(zhì)；以及所述載體(a)-(e)的任意組合。
本發(fā)明還包括治療受試者疾病的方法，包括(a)提供本發(fā)明的組合物；以及(b)通過將所述組合物注射入受試者而將所述組合物進行給藥，其中所述組合物包括有效量的所述活性藥物成分。
此外，本發(fā)明包括治療疾病的試劑盒，包括本發(fā)明的組合物及其使用說明。



當結(jié)合附圖閱讀時，可更好地理解前述發(fā)明內(nèi)容，以及隨后本發(fā)明的詳細描述。為了起到說明本發(fā)明的目的，在附圖中示出了目前優(yōu)選的實施方案。然而應(yīng)當理解的是，本發(fā)明不限于所示的實施方案。
在附圖中 圖1包括圖1A和圖1B，示出了在M4N治療后，對C-33A細胞系和HeLa細胞系進行的細胞增殖分析結(jié)果。圖1A是M4N處理后存在的細胞數(shù)量相對無M4N處理的細胞數(shù)量的比例的圖示，其中提供的M4N量在DMSO配方中從0μM至80μM變化。圖1B是M4N處理后存在的細胞數(shù)量相對無M4N處理的細胞數(shù)量的比例的圖示，其中提供的M4N量在HP-β-CD/PEG配方(“CPE”配方)中從0μM至80μM變化。
圖2包括圖2A和圖2B，是基于DMSO配方中(圖2A)或HP-β-CD/PEG配方中(圖2B)存在或不存在各種濃度的M4N時，C-33A細胞和HeLa細胞的死亡細胞的百分比的細胞死亡測量結(jié)果的圖示。M4N的濃度在0μM至80μM之間。
圖3包括圖3A和圖3B，是向狗一次IV給藥M4N后，在第1天內(nèi)狗血清中濃度隨時間的效果圖示，所述M4N在包括30％(w/v)羥丙基β-環(huán)糊精(“HP-β-CD”)和25％(v/v)PEG 300的配方中。圖3A采用非對數(shù)比例，圖3B采用濃度的對數(shù)比例。

具體實施例方式 本發(fā)明提供一種用于疾病治療的新型組合物，試劑盒及方法，所述疾病包括諸如癌癥和牛皮癬的增生疾病，高血壓，肥胖癥，I型或II型糖尿病，包括但不限于疼痛、阿茲海默氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、帕金森氏癥、癡呆、中風的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)變性疾病，以及炎癥，癌變前瘤形成(premalignant neoplasia)或發(fā)育異常，包括諸如人類免疫缺陷病毒(“HIV”)、人類嗜T淋巴細胞病毒(“HILV”)、人類乳突病毒(“HPV”)、單純皰疹病毒(“HSV”)、乙型肝炎病毒(“HBV”)、Epstein-Barr病毒(“EBV”)、水痘-帶狀皰疹病毒、腺病毒、細小病毒、Jakob Creutafeldt病毒(“JC病毒”)或其他病毒的病毒性感染的傳染性疾病。
本發(fā)明提供一種新型的組合物，所述組合物包括溶解在某些制藥上可接受的增溶劑中的含諸如NDGA衍生物，例如M4N的NDGA化合物的兒茶酚丁烷，所述兒茶酚丁烷與其他稀釋劑，賦性劑及類似成分(共稱為“載體”)組成適于向諸如人的受試者注射以治療疾病的配方。這種配方適于注射，例如靜脈注射。適合的制藥上可接受的載體包括選自下列的至少一種(a)除DMSO外的水溶性有機溶劑，如聚乙二醇(“PEG”)，例如PEG300、PEG400、或PEG400單月桂酸酯，丙二醇(“PG”)，聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)，乙醇，芐醇或二甲基乙酰胺；(b)環(huán)糊精或改性的環(huán)糊精，如羥丙基-β-環(huán)糊精(“HP-β-CD”)或磺丁醚-β-環(huán)糊精(“SBE-β-CD”)；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑，如為非離子表面活性劑的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(也被稱為聚山梨醇酯)，例如作為Tween20或Tween80可商業(yè)獲得的聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(d-alpha-tocopheryl polyethyleneglycol 1000 succinate)(“TPGS”)，單油酸甘油酯(也被稱為甘油單油酸酯)，以CremophorEL可商業(yè)獲得的、乙撐氧和蓖麻油以35∶1的摩爾比率的酯化脂肪酸或反應(yīng)產(chǎn)物；(d)改性的纖維素，如乙基纖維素(“EC”)，羥丙基甲基纖維素(“HPMC”)，甲基纖維素(“MC”)或羧基甲基纖維素(“CMC”)；以及(e)水不溶性脂質(zhì)，如油或脂肪乳狀液，例如Intralipid。優(yōu)選地，當使用PG時，其在不含白凡士林，不含黃原膠，以及不含甘油或甘氨酸中的至少一種的情況中使用。優(yōu)選地，當使用PEG時，其在不含抗壞血酸或BHT的情況中使用；當使用非離子表面活性劑時，其在不含黃原膠的情況中使用；以及所述油不是蓖麻油。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述化合物溶解在PEG300，PEG400或PEG400單月桂酸酯(“PEG”化合物)中。優(yōu)選地，當使用PEG400時，其在不含PEG8000下存在。在另一個實施方案中，所述化合物溶解在改性的環(huán)糊精中，如HP-β-CD中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解和稀釋在含一種或多種PEG化合物和HP-β-CD的結(jié)合配方中。在又一個實施方案中，在結(jié)合配方中所述PEG化合物可以改性的纖維素替代或與之結(jié)合。為了達到發(fā)明目的，本發(fā)明化合物的溶解可在室溫或經(jīng)加熱進行。當在溶解過程中使用加熱時，那些在冷卻后使本發(fā)明的化合物保持在溶液中的增溶劑尤其有用。
在本發(fā)明的又另一個實施方案中，所述兒茶酚丁烷或NDGA化合物溶解在改性的纖維素如EC或HPMC中。在使用前，可將EC稀釋在乙醇(“EtOH”)中。
本發(fā)明還提供水不溶性脂質(zhì)作為本發(fā)明化合物的增溶劑。所述水不溶性脂質(zhì)包括，例如油及混合的脂肪乳狀液組合物，如Intralipid(Pharmacia & Upjohn，現(xiàn)在為Pfizer)，根據(jù)制造商的建議使用。例如，推薦的成人劑量不超過2g脂肪/kg體重/天(分別為20mL，10mL及6.7mL/kg的Intralipid10％，20％及30％)。Intralipid10％被認為在1000mL中含有純化豆油100g，純化卵磷脂12g，無水甘油22g，注射用水補足1000mL。pH以氫氧化鈉調(diào)節(jié)至約pH8。Intralipid20％在1000mL中含有純化豆油200g，純化卵磷脂12g，無水甘油22g，注射用水補足1000mL。pH以氫氧化鈉調(diào)節(jié)至約pH8。Intralipid30％被認為在1000mL中含有純化豆油300g，純化卵磷脂12g，無水甘油16.7g，注射用水補足1000mL。pH以氫氧化鈉調(diào)節(jié)至約pH7.5。這些Intralipid產(chǎn)品被儲存在低于25℃的受控室溫下且不應(yīng)當冰凍。
在另一個實施方案中，本發(fā)明或單獨或與其他油結(jié)合或與任一種或多種PEG化合物和Tween20或Tween80結(jié)合提供玉米油，芝麻油，薄荷油，豆油，礦物油，甘油。
本發(fā)明還包括增溶劑材料，如丙二醇及前述物質(zhì)的任意組合。
此外，本發(fā)明包括將所述組合物注射或輸注入動物體內(nèi)的適合材料，例如靜脈(“IV”)管，其適于本發(fā)明配方的輸送。適合的管包括由諸如聚四氟乙烯(“PTFE”)的聚合物單獨或與諸如CHEM-Sure(Barnant公司)的氟橡膠、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(“FEP”)，Teflon及鉑處理硅橡膠(小尺寸)(Cole-Parmer)等等的結(jié)合的聚合物制成的管。
本發(fā)明根據(jù)下列定義可被更清楚地理解，所述定義與本文其他地方定義的術(shù)語一起使用 本文使用涉及濃度或劑量的術(shù)語“約”是指具體數(shù)值的至多±10％至20％。
本文使用的術(shù)語“活性藥物成分”，“API”或涉及“化合物”是指存在于本文所述藥物組合物中的任何式I的兒茶酚丁烷或NDAG化合物，諸如NDGA衍生物。
本文使用的“亞烴基二氧基(alkylene dioxy)”是指亞甲基二氧基(methylene dioxy)或取代的亞甲基二氧基，或者次乙基二氧基(ethylenedioxy)或取代的次乙基二氧基。
本文使用的涉及式I或式II中-R基之一的“未取代或取代的氨基酸殘基或其鹽”是指氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基，包括但不限于丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸、色氨酸，酪氨酸，纈氨酸，5-羥賴氨酸，4-羥脯氨酸，甲狀腺氨酸，3-甲基組氨酸，ε-N-甲基賴氨酸，ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，氨基己二酸，γ-羧基谷氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸，磷酸酪氨酸，N-甲基精氨酸，N-乙酰賴氨酸，以及N，N-二甲基取代的氨基酸殘基，或前述任一種的鹽，如氯鹽。
此處適于使用的“緩沖劑”包括在本領(lǐng)域中常規(guī)的任何緩沖劑，如，Tris，磷酸鹽，咪唑，及重碳酸鹽。
此處使用的“載體”是指無毒固體、半固體或液體填料、稀釋劑、賦形劑(vehicle)、賦形劑(excipient)、增溶劑、任何常規(guī)類型的膠囊材料或配方輔料，以及包括除所述活性藥物成分之外的所有組合物成分。所述載體可含另外的試劑，諸如潤濕或乳化劑，或pH緩沖劑。如果需要，可加入其他的材料，如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑，及類似的試劑。
此處使用的“兒茶酚丁烷”是指式I的化合物
其中R1和R2各自獨立地表示-H，低級烷基，低級?；?，亞烴基；或-R1O和-R2O各自獨立地表示未取代或取代的氨基酸殘基或其鹽；R3，R4，R5，R6，R10，R11，R12和R13各自獨立地表示-H或低級烷基；及R7，R8和R9各自獨立地表示-H，-OH，低級烷氧基，低級酰氧基，未取代或取代的氨基酸殘基或其鹽，或者合起來可為亞烴基二氧基的任何兩個相鄰的基團。
此處使用的“環(huán)糊精”是指未改性的環(huán)糊精或改性環(huán)糊精，包括且不限于α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精以及其上含修飾的任何改性的環(huán)糊精，諸如HP-β-CD或SEB-β-CD。環(huán)糊精通常具有6(α-環(huán)糊精)，7(β-環(huán)糊精)，和8(γ-環(huán)糊精)糖，每糖最多達3個取代基，因此可有0-24個初級取代基(初級取代基被定義為直接與環(huán)糊精環(huán)相連的取代基)。本發(fā)明使用的改性或未改性的環(huán)糊精可具有任意適合數(shù)量和定位的初級取代基或其他修飾。
此處使用的NDGA的“衍生物”是指“NDGA衍生物”(見下文)。
此處使用的“疾病”包括所有應(yīng)用本發(fā)明的組合物能產(chǎn)生治療效果的疾病、不適、感染、綜合病癥或紊亂。這些“疾病”包括但不限于癌癥、牛皮癬及其他增生疾病、炎癥性紊亂包括風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、動脈硬化癥、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)、高血壓、肥胖、糖尿病、疼痛、中風和/或其他神經(jīng)紊亂或神經(jīng)變性疾病或病癥，包括阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(“ALS”)及癌變前疾病諸如上皮內(nèi)瘤變或發(fā)育異常，以及感染性疾病。
此處使用的“G4N”或“四-N，N-二甲基甘胺酰NDGA”或“四-二甲基甘胺酰NDGA”是式II(見下)的NDGA衍生物，其中R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+(CH3)2·Cl-，以固體形式或在溶液中；以及R18和R19各自表示-CH3。
此處使用的“低級?；笔侵窩1-C6?；?，優(yōu)選地，C1-C3?；?br> 此處使用的“低級烷基”是指C1-C6烷基，優(yōu)選地，C1-C3烷基。
此處使用的“M4N”或“四-O-甲基NDGA”是式II(見下)的NDGA衍生物，其中R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-OCH3，以及R18和R19各自表示-CH3。
此處使用的“改性纖維素”是指在纖維素分子上含一個或多個的修飾基團的纖維素，包括，如，EC、HPMC、CMC和MC。
此處使用的“NDGA”是指去甲二氫愈創(chuàng)木酸并具有下式
此處使用的“NDGA化合物”是指單獨地或集合的NDGA和/或NDGA衍生物的任意一種或多種。
此處使用的“NDGA衍生物”是指式II的NDGA衍生物
其中R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-OH，低級烷氧基，低級酰氧基，或未取代或取代的氨基酸殘基或其藥物上可接受的鹽；以及R18和R19各自獨立地表示-H或低級烷基，其中R14，R15，R16和R17不同時為-OH。因此，該式包括NDGA的甲基化衍生物的化合物，如四-O-甲基NDGA(M4N)，三-O-甲基NDGA(M3N)，二-O-甲基NDGA(M2N)及單-O-甲基NDGA(M1N)?？蛇x地，NDGA衍生物可為NDGA的羥基或甲基上的一個或多個氫原子被取代的化合物，諸如，例如其中R14，R15，R16和R17各自獨立地表示低級烷氧基，低級酰氧基，或者氨基酸或取代的氨基酸或其鹽；以及R18和R19各自獨立地表示-H或烷基，如低級烷基。該術(shù)語包括，例如，一化合物，所述化合物的R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-OCH3或-O(C＝O)CH3或雙取代的氨基酸殘基，如N，N-雙甲基取代的氨基酸殘基，諸如-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+(CH3)2·Cl-；以及R18和R19各自獨立地表示-H或低級烷基，如-CH3或-CH2CH3。
此處使用的“百分比”，“百分數(shù)”或符號“％”是指組合物中所示的成分基于組合物中載體含量關(guān)于重量/重量(w/w)，重量/體積(w/v)或體積/體積(v/v)的百分比，相對于任何特定的組分，都基于組合物中存在的載體含量。因此，所示不同類型的載體存在的含量達100％，其并不排除API的存在，API的量表示為％或存在于組合物中幾毫克或存在于組合物中的幾mg/ml，其中％或mg/ml基于存在于組合物中的載體總量。某些類型的載體可結(jié)合存在達到100％的載體。
此處使用的“藥學上可接受的載體”在使用的劑量和濃度上對接受者無毒，并能與配方的其他成分相容。例如，用于含本發(fā)明的兒茶酚丁烷，NDGA化合物或NDGA衍生物的配方的載體優(yōu)選地不包括氧化劑和其他已知的對其不利的化合物。藥學上可接受的載體包括增溶劑。適合的藥學上可接受的載體包括但不限于水，右旋糖，甘油，鹽水，乙醇，緩沖劑，CremaphorEL，磷酸緩沖鹽水，PEG 300，PEG 400，改性環(huán)糊精，及其結(jié)合，所有物質(zhì)見前所述。
術(shù)語“藥學上可接受的賦性劑”，包括賦形劑，佐劑，或稀釋劑或其他輔料，如本領(lǐng)域中常規(guī)的，公眾可獲得，并且在使用的劑量和濃度上對接受者無毒，并能與配方的其他成分相容的這些。例如，藥學上可接受的輔料包括pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，浸透壓調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑等。
此處使用的術(shù)語“增溶劑”是指其中一種或多種兒茶酚丁烷或NDGA化合物，如NDGA衍生物溶解的組合物。增溶劑也可為載體或藥學上可接受的載體。
術(shù)語“受試者”，“宿主”和“患者”在此處可互換使用，是指用本發(fā)明的組合物進行治療的動物，包括但不限于猿、人類、貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛、豬、綿羊、山羊、哺乳耕畜、哺乳賽畜，及哺乳寵物。
此處用于給藥的涉及兒茶酚丁烷或NDGA化合物或衍生物“基本純的”化合物為基本不含不是兒茶酚丁烷、NDGA化合物或NDGA衍生物的物質(zhì)(以下稱為“非NDGA物質(zhì)”)的化合物?；静缓侵钢辽偌s50％不含非NDGA物質(zhì)，優(yōu)選地至少約70％，更加優(yōu)選地至少約80％，更加優(yōu)選地至少約90％及還更優(yōu)選地至少約95％不含非NDGA物質(zhì)。
此處使用的術(shù)語“治療(treatment)”，“處理(treating)”等是指獲得所需的藥理和/或生理效果。所述效果根據(jù)完全地或部分地預(yù)防病癥或疾病或其癥狀可為預(yù)防性的，和/或根據(jù)完全地或部分地治療病癥或疾病和/或病癥或疾病導(dǎo)致的有害影響可為治療性的。“治療”，因此，例如，包括哺乳動物尤其是人類的狀況或疾病的任何治療，其包括(a)預(yù)防病癥或疾病在受試者體內(nèi)發(fā)生，所述受試者易患所述病癥或疾病但還未診斷患??；(b)抑制所述病癥或疾病，諸如，阻止其發(fā)展；以及(c)解除、減輕或改善所述病癥或疾病，諸如使所述病癥或疾病消退。
在進一步闡述本發(fā)明之前，應(yīng)當理解的是本發(fā)明并不限于所述的特定實施例，因為這些實施例當然可以變化。還應(yīng)當理解的是此處使用的術(shù)語旨在描述特定的實施例而并不意在限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附的權(quán)利要求限制。
當提供值的范圍時，應(yīng)當理解的是各居間值，除文中清楚地另外指出，至較低限值的單位的十分之一，在該范圍較高和較低限值之間或在所述范圍中任何其他所述或居間值，被包括在本發(fā)明中。除了在所述范圍中明確排除的界限，這些更小范圍的較高和較低限值可獨立地包括在所述更小的范圍中，并也包含在本發(fā)明中。當所述范圍包括一種或多種所述界限，排除任一種或兩種那些被包括的界限的范圍也包括在本發(fā)明中。
必須注意的是，在此使用的單數(shù)形式“一(a)”，“一(an)”，和“該(the)”包括復(fù)數(shù)物，除非文中清楚表示不是。因此，例如，提到“一化合物”包括許多這種化合物，提到“該NDGA化合物”包括提到一種或多種NDGA化合物，諸如NDGA衍生物及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其等同物。
此處提及的所有出版物，包括專利、專利申請，及雜志文章通過引用整體并入此處，所述整體包括其中引用的參考文獻，所述參考文獻也通過整體引用并入此處。
此處討論的出版物僅提供在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_內(nèi)容。這并不應(yīng)當理解為本發(fā)明由于在先申請無資格先于這些出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于實際出版日期，其需要各自地確認。在本申請中文中提及的參考文獻的引文在權(quán)利要求之前詳細列在文獻目錄中。
對本發(fā)明的下列描述僅以實施例的方式給出，并不意指對本發(fā)明的任何限制。
兒茶酚丁烷的制備 本發(fā)明的兒茶酚丁烷可通過本領(lǐng)域中任何已知的方法進行制備。例如，如美國專利5,008,294所述制得的這些化合物。
NDGA衍生物的制備 NDGA可從任何可獲得的商業(yè)來源購買，諸如美國加利福尼亞州圣地亞哥的Alexis Biochemicals公司(目錄號LKT-N5669)，或美國加利福尼亞州圣地亞哥的A.G.Scientific公司(目錄號N1071)，或美國密歇根州安阿伯的Cayman Chemical公司(目錄號70300)。
NDGA衍生物及其配方可通過本領(lǐng)域中任何常規(guī)的方法進行制備。例如，NDGA衍生物可如美國專利5,008,294；美國專利6,291,524；Hwu，J.R.等人(1998)；或McDonald，R.W.等人(2001)所述進行制備。
在本發(fā)明的一個實施例中，一NDGA衍生物，四-O-甲基NDGA，還被稱為meso-1，4-雙(3，4-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷，或M4N，如下制得在反應(yīng)燒瓶中制備含NDGA和氫氧化鉀的甲醇溶液。然后，向該反應(yīng)燒瓶中加入硫酸二甲酯并允許反應(yīng)進行。最終用水驟冷反應(yīng)，使產(chǎn)物沉淀。通過過濾分離沉淀及在真空干燥箱中干燥。然后，該化合物在二氯甲烷和甲苯的溶液中溶解，并隨后通過氧化鋁層析柱進行純化。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，所述固體被重新懸浮在異丙醇中并通過過濾進行分離。濾餅在真空干燥箱中干燥。通過將所述濾餅在異丙醇中回流及通過過濾重新分離結(jié)晶而使所得的四-O-甲基NDGA(M4N)結(jié)晶。
在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明的某些NDGA衍生物，諸如G4N，也被稱為meso-1，4-雙[3，4-(二甲氨基乙酰氧基)苯基]-(2R，3S)-二甲基丁烷或四-二甲基甘胺酰NDGA，或者其氫氯酸鹽，及具有氨基酸取代基的類似化合物，也可通過常規(guī)的方法進行制備，如例如美國專利6,417,234所述。
治療組合物的制備 本發(fā)明提供包括藥物組合物的組合物，其包括含NDGA化合物諸如NDGA衍生物的作為活性藥物成分(“API”)的兒茶酚丁烷，以及藥學上可接受的載體或賦性劑。通常，本發(fā)明的組合物含小于約0.1％(w/v)至約99％(w/v)的活性藥物成分或API，即所述兒茶酚丁烷、包括此處的NDGA化合物和NDGA衍生物；可選地，本發(fā)明可含約2％(w/v)至約90％(w/v)的API。
本發(fā)明還提供組合物，在所述組合物中，所述兒茶酚丁烷，如NDGA衍生物，例如M4N存在的濃度為約1mg/ml至約200mg/ml，或者約10mg/ml至約175mg/ml，或者約20mg/ml至約150mg/ml，或者約30mg/ml至約125mg/ml，或者約40mg/ml至約100mg/ml，或者約50mg/ml至約75mg/ml。在一個實施方案中，此處NDGA化合物的濃度約1mg/ml，約2mg/ml，約2.5mg/ml，約5mg/ml，約10mg/ml，約15mg/ml，約20mg/ml，約25mg/ml，約30mg/ml，約35mg/ml，約40mg/ml，約45mg/ml，約50mg/ml，約55mg/ml，約60mg/ml，約75mg/ml，約80mg/ml，約90mg/ml，約100mg/ml，約120mg/ml，約125mg/ml，約150mg/ml，約175mg/ml或約200mg/ml。
可選地，本發(fā)明的其他實施方案的組合物可含小于約0.1mg至約200mg或更多的API，如約10mg，約20mg，約25mg，約30mg，約40mg，約50mg，約60mg，約75mg，約100mg或約200mg的API。
藥學上可接受的載體或賦性劑可含一種或多種增溶劑，所述API溶劑在所述增溶劑中。所述藥學上可接受的載體或賦性劑還可含稀釋劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種增溶劑，所述增溶劑含一種或多種除DMSO之外的水溶性有機溶劑。優(yōu)選地水溶性有機溶劑有乙醇，芐醇，二甲基乙酰胺，PVP，PG和諸如PEG 300，PEG 400，或PEG 400單月桂酸酯的PEG化合物。在本發(fā)明組合物中的PEG化合物提供的量為約5％至約100％，或約5％至約60％，或約10％至約90％，或約20％至約80％，或約30％至約70％，或約40％至約60％，所有的濃度為體積/體積(v/v)百分比。PG存在的濃度約2.5％至約100％(v/v)。
在本發(fā)明組合物中的PEG化合物的濃度可依據(jù)存在的其他增溶劑或稀釋劑或賦性劑而變化。例如，本發(fā)明的PEG 300，PEG 400或PEG 400單月桂酸酯濃度可在約5％，約10％，約12.5％，約15％，約20％，約25％，約30％，約35％，約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，約90％或約95％，給出的所有濃度為體積/體積(v/v)百分比。
本發(fā)明還提供兒茶酚丁烷或NDGA化合物在環(huán)糊精中的組合物，所述環(huán)糊精包括改性環(huán)糊精。例如，此處的環(huán)糊精可為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精，及改性環(huán)糊精包括HP-β-CD和SEB-β-CD。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物含有的改性環(huán)糊精的濃度為約5％至約80％，或約10％至約70％，或約20％至約60％，或約30％至約50％，給出的所有濃度為重量/體積(w/v)百分比。
在又另一個實施例中，改性的環(huán)糊精，諸如HP-β-CD，在組合物中存在的濃度為約12.5％，約15％，約20％，約25％，約30％，約35％，約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％或約75％，給出的所有濃度為重量/體積(w/v)百分比。
其中，可單獨或與本發(fā)明的組合物中其他物質(zhì)一起使用的其他藥學上可接受的載體或賦性劑為離子、非離子或兩性表面活性劑，如CremophorEL，為非離子表面活性劑的聚山梨醇酯例如作為Tween20或Tween80可商業(yè)獲得的聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，為兩性表面活性劑的TPGS。適合的表面活性劑的另外實例包括而不限于單油酸甘油酯及酯化的脂肪酸，諸如通常由植物油的酯交換反應(yīng)制成的這些，可以多種種類和等級獲得，如美國新澤西州，帕拉母斯，Gattefosse公司的Labrafil，Labrasol，及Gelucire。表面活性劑可以任何所需的有效量存在，如以濃度為約1％(v/v)至約100％(v/v)，優(yōu)選地為約9％(v/v)至約80％(v/v)，以及更加優(yōu)選地，約10％(v/v)至約50％(v/v)。在一個具體的實施例中，優(yōu)選的非離子表面活性劑的濃度為濃度為約9％(v/v)至約100％(v/v)的Tween20，及濃度為約33％(v/v)至約100％(v/v)的Tween80。所有表面活性劑的百分比為體積百分比(v/v)。
在本發(fā)明的組合物中單獨使用或配合使用的另一個制藥上可接受的載體或賦性劑是改性纖維素，諸如EC、HPMC、MC和CMC。改性纖維素可以任何所需的有效量存在，如濃度為約0.1％至約25％，或約0.5％至約7.5％，或約1.0％至約5％。在一個具體的實施例中，EC存在的濃度可為約5％至約20％；HPMC存在的濃度可為約0.5％至約1％；MC存在的濃度可為約1％至約3％；及CMC存在的濃度可為約1％至約4％。改性纖維素的百分比以重量每體積(w/v)計。
在本發(fā)明的組合物中單獨使用或配合使用的其他制藥上可接受的載體或賦性劑是水不溶性脂質(zhì)，諸如油或混和的脂肪乳劑。油的例子包括玉米油、芝麻油、薄荷油、大豆油、礦物油和甘油。混和的脂肪乳劑可如前所述獲得，如Intralipid乳劑。
所述水不溶性載體可與任何一種或多種水溶性載體結(jié)合使用，如PEG化合物和表面活性劑，如Tween20或Tween80。
所述水不溶性脂質(zhì)載體可以任何所需的有效量存在，如以濃度為約10％(v/v)至約100％(v/v)，或約15％(v/v)至約85％(v/v)，或約25％(v/v)至約75％(v/v)。油存在的濃度可為約9％(v/v)至約100％(v/v)?；旌椭救閯┐嬖诘臐舛瓤蔀榧s10％(w/v)至約30％(w/v)；及優(yōu)選約20％(w/v)。
如前所述，各種載體成分的結(jié)合可與API一起使用。目前優(yōu)選的一個非限制性實施例為10mg/ml M4N在25％(w/v)PEG 300，30％(w/v)HP-β-CD，余量的適于注射入動物的水(“WFI”，其在制藥工業(yè)中代表水的驗證級別)的載體中的組合物。在這個優(yōu)選的實施方案中，所述HP-β-CD具有6至8度的取代，但如前所述，在其他實施例中的其他取代也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
應(yīng)當理解的是，只要所述兒茶酚丁烷溶解和保存在溶液中，就可向所述溶液加入一種或多種所述增溶劑或稀釋劑或賦性劑，以最優(yōu)化該溶液向需要此種治療的患者的輸送。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種稀釋劑，所述稀釋劑為適于注射的鹽水或水。在本發(fā)明的一方面，當所述藥物組合物的同滲容摩較高時，使用注射用水作為稀釋劑。
適于此處使用的制藥上可接受的載體或稀釋劑已在多種出版物中描述。有用的載體或賦性劑的例子被描述在，例如Gennaro，A.R.(2003)；Ansel，H.C.等人(2004)；Rowe，R.C.等人(2003)；以及Garg，S.等人(2001)中。
液體形式的組合物可包括緩沖液，所述緩沖液根據(jù)兒茶酚丁烷或NDGA化合物，如NDGA衍生物的所需應(yīng)用進行選擇，且還可包括適于所需使用的其他物質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地選擇一種適于所需應(yīng)用的適當?shù)木彌_液，各種緩沖液被本領(lǐng)域所公知。
治療方法 人們發(fā)現(xiàn)，含兒茶酚丁烷，包括NDGA化合物的組合物在患有許多疾病、需要治療的患者上用作治療劑或用于治療，在這些治療中，可使用這些兒茶酚丁烷或NDGA化合物。
本發(fā)明提供用于疾病治療的方法和組合物，所述疾病包括，例如，增生疾病諸如良性和惡性腫瘤，牛皮癬及癌前疾病和瘤形成，諸如上皮內(nèi)瘤形成，或發(fā)育異常。本發(fā)明還提供糖尿病包括I型和II型糖尿病、肥胖和包括心臟血管的疾病、中風和高血壓的并發(fā)癥的治療。本發(fā)明進一步提供炎癥包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)和其他免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療。此外，本發(fā)明提供神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病如阿茲海默氏癥、癡呆、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和帕金森氏癥的治療。在另一個實施例中，本發(fā)明提供傳染性疾病，諸如包括需要Sp1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的病毒感染的治療。需要Sp1結(jié)合的病毒的例子包括HIV、HTLV、HPV、HSV、HBV、EBV、水痘-帶狀皰疹病毒、腺病毒、細小病毒和JC病毒。
根據(jù)本發(fā)明的方法可治療各種動物宿主，所述動物宿主包括人類或非人類動物。一般地，這些宿主為“哺乳類”或“哺乳動物”，被廣泛地用于描述屬于哺乳動物綱的生物體的這些術(shù)語包括食肉動物目(如狗和貓)、嚙齒類(例如豚鼠，和家鼠)，及其他哺乳動物，包括牛、山羊、馬、綿羊、兔、豬，及靈長類(例如，人類、黑猩猩及猴子)。在許多實施例中，所述宿主為人類。動物模型用于實驗研究，如提供治療人類疾病的模型。此外，本發(fā)明還可應(yīng)用于獸醫(yī)。
配方、劑量，及給藥途徑 在本發(fā)明的一個實施例中，將有效量的本發(fā)明組合物向宿主進行給藥，其中“有效量”是指足以產(chǎn)生所需結(jié)果的劑量。在一些實施例中，所需的結(jié)果至少為對瘤形成或發(fā)育異常進程的抑制。
給藥的合適劑量取決于被治療的宿主，諸如該宿主的健康情況、宿主的年齡、疾病或病癥的狀態(tài)、宿主的體重、腫瘤的大小。通常，對于兒童可以約0.1mg至約500mg或更少進行給藥，及對于成人可以約0.1mg至約5g或更少進行給藥。通常劑量在約10mg活性藥物成分每kg受試者體重至約600mg活性藥物成分每kg受試者體重的寬范圍中。所述活性劑可單獨或更通常以復(fù)合劑量進行給藥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過各種方法可容易地確定所給試劑的優(yōu)選劑量。通過用常規(guī)試驗建立的劑量響應(yīng)曲線，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定其他有效劑量。當然，試劑的量將隨具體使用的試劑而變化。
所述活性試劑的給藥頻率及劑量將由護理人員基于年齡、體重、疾病狀態(tài)、健康狀態(tài)和患者的應(yīng)答進行確定。因此，所述試劑可以每天、每周、每月一次或多次，或者如常規(guī)確定的適當次數(shù)進行給藥。所述試劑可以間歇地進行給藥，諸如進行幾天、幾周或幾月的給藥期，然后直到過一段時間如3或6個月再繼續(xù)，接著再進行幾天、幾周或幾月的給藥。
在藥物劑型中，所述活性試劑可單獨或與其他藥物活性劑或治療劑適當聯(lián)合，以及結(jié)合給藥，所述其他藥物活性劑或治療劑包括小分子、抗體或蛋白質(zhì)治療劑。下面的方法和實施例僅僅為示例而并非對本發(fā)明的限制。
此外，如果需要，所述載體或賦性劑可含少量的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑。制備所述藥劑形式的實際方法為公知，或者對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言現(xiàn)而易見。可參見，例如Remington’s Pharmaceutical Science，第20版，Mack PublishingCo.Rawlins EA，(1997)。用于給藥的組合物或配方在任何情況中含足以在治療宿主中取得所需狀態(tài)的API量。
用于注射或靜脈給藥的單位劑型可包括組合物中的API，如無菌水、生理鹽水或其他制藥上可接受的載體的溶液。
此處使用的術(shù)語“單位劑型”是指適于作為人或動物宿主的單一劑量的物理分散單位，各單位含預(yù)定量的本發(fā)明的API，所述預(yù)定量以足以結(jié)合制藥上可接受的稀釋劑、載體或賦性劑產(chǎn)生所需效果的量計算。本發(fā)明的新單位劑型的規(guī)格取決于所使用的特定化合物和要達到的效果，及與宿主中各化合物相關(guān)的藥效學。
本發(fā)明包括所述活性試劑的多或單劑量的試劑盒。在該試劑盒中，除了存放多或單劑量含兒茶酚丁烷如NDGA化合物的組合物的容器，有內(nèi)插說明書的資料包，所述說明書描述了在治療關(guān)心的疾病狀態(tài)中該藥物的使用和伴隨優(yōu)點?？蛇x地，本發(fā)明組合物的給藥器包括在各試劑盒中。
本發(fā)明的可注射的組合物可以以適于待治療的疾病和本領(lǐng)域常規(guī)的方式用非腸道給藥，包括靜脈地、動脈內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、皮下地和泡囊內(nèi)地(intravesicularly)給藥。盡管本發(fā)明的組合物規(guī)定為注射給藥，其也適于通過其他途徑給藥，例如通過局部的、鼻內(nèi)的、吸入或植入給藥。
下面列出的例子為示例性的，并不能解釋為對本發(fā)明的限制。
實施例1.含M4N的HP-β-CD和/或PEG 300配方 在這個實施例中，M4N如PCT/US2004/016117中的描述進行制備，并在增溶劑中溶解。所得溶液可選地與賦性劑和/或稀釋劑進行混合。所述增溶劑和賦性劑可互換地使用，或相互結(jié)合使用。使用的增溶劑或賦性劑之一為內(nèi)毒素控制的羥丙基-β-環(huán)糊精(“HP-β-CD”)，其獲得自Research Diagnostics公司(目錄號RDI-82004HPB，批號H3N188P)(佛蘭德斯，美國新澤西)。其他使用的增溶劑或賦性劑為PEG300，獲得自Spectrum Chemicals公司(目錄號P0108，批號TB1228)(加德納，美國加利福尼亞)。
在本發(fā)明的一個實施例中，HP-β-CD和PEG300以單配方存在。為了制得這個配方，首先將M4N溶解在PEG300中以形成M4N的PEG300溶液(“M4N/PEG 300”)。隨后，將M4N/PEG 300溶液加入至預(yù)制備的HP-β-CD溶液中，以形成PEG 300和HP-β-CD中的M4N溶液(此后稱為“CPE配方”)。
當制備所述HP-β-CD溶液時，必須考慮體積膨脹。例如，對于40％(w/v)HP-β-CD溶液，必須考慮0.7mL/g的體積膨脹(即，0.7mL的水置換了所加入的每克HP-β-CD)。
用作增溶劑和/或賦性劑的40％HP-β-CD的100mL溶液如下制備將65mLWFI置于含攪拌棒的玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約40g HP-β-CD緩慢地加入至攪拌中的WFI，使用刮勺將HP-β-CD導(dǎo)向燒杯的中央，以防止HP-β-CD結(jié)晶而粘在燒杯壁上。該HP-β-CD溶液被攪拌約24小時，或者直到目視觀察下HP-β-CD完全溶解。所得的溶液測得約93mL。將約7mL WFI加入至該所得溶液以獲得100mL，制得約40％HP-β-CD的最終溶液。將所述最終溶液攪拌約1小時，在室溫下儲存，并避免陽光。這個制備改性環(huán)糊精溶液的方法可被按比例放大或縮小以獲得所需的體積或濃度。其他濃度或其他改性環(huán)糊精溶液可類似地制得，例如，通過將HP-β-CD替代為其他改性環(huán)糊精，在上述的方法中調(diào)節(jié)至適當?shù)臐舛取?br> 40％HP-β-CD中約10mg/mL濃度的10mL M4N溶液如下制備將約10mL的40％HP-β-CD溶液加入至含攪拌棒玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約10mg M4N緩慢地加入至40％HP-β-CD，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央。該M4N/40％HP-β-CD混合物被攪拌約2小時，或者直到所有的M4N均勻懸浮而不存在任何結(jié)塊。可選地，該M4N/40％HP-β-CD混合物可在80℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，100mL該M4N/HP-β-CD混合物在80℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景尋找是否存在顆粒，可觀察所述M4N/HP-β-CD混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/40％HP-β-CD溶液在室溫儲存，并避光保存。這個方法可按比例放大或縮小以獲得M4N的所需體積或濃度。含M4N的其他環(huán)糊精溶液的配方可類似地制備，例如，通過將上述方法中的HP-β-CD用其他環(huán)糊精取代。在表1中示出的結(jié)果說明，冷卻后在溶液中的M4N保持在40％HP-β-CD配方中的1mg/mL和10mg/mL的濃度大于7天。
PEG 300中約25mg/mL濃度的100mL M4N溶液如下制備將約100mL PEG 300加入至含攪拌棒玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約2.5g M4N緩慢地加入至PEG 300，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央。該M4N/PEG 300混合物被攪拌約24小時，或者直到所有的M4N均勻懸浮而不存在任何結(jié)塊。可選地，該M4N/PEG300混合物可在60℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/PEG 300混合物在60℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景，觀察微粒的存在，可觀察所述M4N/PEG 300混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。在觀察到所有的M4N溶解之后，所得的M4N/PEG300溶液立即使用或在48hr的有效期之前使用，否則可形成結(jié)晶或其他沉淀。如果結(jié)晶形成，M4N/PEG 300溶液可伴隨攪拌，在熱磁性臺上在60℃重新加熱1hr，直到所有的M4N溶解回溶液中。最終的M4N/PEG 300溶液在室溫儲存，并避光保存。這個方法可按比例放大或縮小以獲得M4N的所需體積或濃度。含M4N的其他PEGs溶液的配方可類似地制備，例如，通過將上述方法中的PEG 300用PEG 400或PEG 400單月桂酸酯取代。
通過向位于磁力臺上含攪拌棒的燒杯加入50mL40％預(yù)先制備的HP-β-CD溶液(如上制備)，伴隨攪拌棒以中速攪拌，及緩慢加入50ml預(yù)先制備的M4N/PEG 300溶液(如上制備)，例如以約10mL每分鐘的速度，制備含50％PEG 300(v/v)，20％HP-β-CD(w/v)和12.5mg M4N的100mL配方儲備溶液。通過使用吸液管，將M4N/PEG 300加入至燒杯的中央，從而避免其粘在燒杯的壁上并確保充分溶解。將M4N/PEG 300加入至HP-β-CD溶液開始表現(xiàn)為白色溶液，但在不斷攪拌下最終變?yōu)槌吻?。這個制法可被按比例放大或縮小，以適于產(chǎn)生所需體積或濃度的M4N/PEG 300和HP-β-CD。用0.22μm的PVDF膜對所述儲備溶液進行過濾除菌，諸如獲得自Millipore(目錄號SCGV T05 RE)(比爾里卡，美國馬薩諸塞州)的預(yù)除菌的真空驅(qū)動一次性瓶頂過濾膜。該過濾過程由真空力驅(qū)動，且濾液收集在預(yù)滅菌的250mL玻璃瓶中。隨后，該瓶被緊密地密封，在室溫并避光保存。HP-β-CD中的M4N/PEG 400或M4N/PEG 400單月桂酸酯的儲備溶液可通過在上述方法中用PEG 400或PEG 400單月桂酸酯替代PEG 300進行類似的制備。
用前述方法制備的M4N/PEG 300/HP-β-CD、M4N/PEG 400/HP-β-CD或M4N/PEG 400單月桂酸酯/HP-β-CD的儲備溶液可在體外使用或用于向動物給藥之前進行稀釋。如果稀釋是必須的，所述儲備溶液優(yōu)選地以WFI而非例如鹽水進行稀釋，以降低滲透壓。為了制備儲備溶液在WFI中1∶1稀釋的100mL溶液，將約50mL的儲備溶液加至玻璃瓶中。將約50mL的WFI加入至瓶中的50mL儲備溶液中以形成稀釋的溶液。將所述玻璃瓶密封，且通過搖晃和倒轉(zhuǎn)該玻璃瓶若干次使稀釋后的溶液充分混合。用0.22μm的PVDF膜對該稀釋溶液進行過濾除菌，諸如獲得自Millipore(目錄號SCGV T05 RE)(比爾里卡，美國馬薩諸塞州)的預(yù)除菌的真空驅(qū)動一次性瓶頂過濾膜。該過濾過程由真空力驅(qū)動，且濾液收集在預(yù)滅菌的250mL玻璃瓶中。隨后，該瓶被緊密地密封，在室溫并避光保存。這個方法可被按比例放大或縮小以獲得所需的體積或稀釋度，諸如1∶2或1∶4的稀釋度。
含50％PEG 300和20％HP-β-CD的適于用作安慰劑對照的配方可如下制備。為了制備100mL安慰劑或?qū)φ张浞?，將約50mL 40％HP-β-CD加入至位于磁力臺上含攪拌棒的燒杯中。設(shè)定該磁力臺以中速攪拌HP-β-CD溶液。通過移液至燒杯的中央，避免PEG 300粘在燒杯的壁上，將50mL PEG 300緩慢加入至玻璃燒杯中的50mL HP-β-CD中。該混合物被攪拌約1hr或直至混合完全。用真空力驅(qū)動的0.22μm的PVDF膜對安慰劑配方進行過濾除菌。濾液收集在預(yù)滅菌的250mL玻璃瓶中。該瓶被緊密地密封，在室溫并避光保存。這個方法可根據(jù)需要被按比例放大或縮小以產(chǎn)生所需的濃度和體積量。此外，根據(jù)需要，PEG 300可被替代為PEG 400或PEG 400單月桂酸酯。
根據(jù)前述或類似方法制得的含HP-β-CD和/或PEG 300、PEG 400的配方，及含HP-β-CD和丙二醇(“PG”)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或Tween80的配方中M4N的溶解度結(jié)果，以及所得配方的性質(zhì)在表1-5中示出，其中N表示“否”及Y表示“是”。
表1改性環(huán)糊精作為增溶劑和/或賦性劑 所有配方經(jīng)受在4℃放置24hr及以5000rpm離心5min，未形成可見沉淀。含50％PEG 300、20％HP-β-CD、12.5mg/mLM4N儲備溶液的配方在4℃能保持至少4個月。以1∶1或1∶2稀釋度對相同的儲備液制得的稀釋劑也可在4℃保持至少4個月。
表2M4N的PEG 300和HP-β-CD配方 表3M4N的PEG 400和HP-β-CD配方 表4M4N配方在PEG300中的穩(wěn)定性 表5M4N配方在PEG400中的穩(wěn)定性 類似地，M4N可溶解在其他增溶劑中，諸如水溶性的有機溶劑，包括乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙二醇或甘油。
實施例2.M4N的DMSO或PEG 300/HP-β-CD結(jié)合配方對培養(yǎng)中腫瘤細胞的增殖和死亡的影響 M4N在10％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中(以下稱為“CPE”配方)，M4N在30％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中(以下稱為“CPE25/30”配方)，以及M4N在27％(w/v)HP-β-CD和33％(v/v)PEG 300中(以下稱為“CPE 33/27”配方)，被用來測試對兩種不同腫瘤細胞系的細胞死亡和增殖的影響Hela，其為HPV-18陽性人宮頸癌細胞系，及C-33A，其為HPV-陰性人宮頸癌細胞系，M4N在DMSO中也被平行地測試。兩種腫瘤細胞系以遞增的M4N量進行處理0μM，20μM，40μM，60μM和80μM，以DMSO或CPE配方處理72hr。加入各配方達生長培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺的最低必需培養(yǎng)基，添加了10％胎牛血清，1mM丙酮酸鈉，1x非必須氨基酸溶液和1000IU/mL青霉素/1000μg/mL鏈霉素溶液)總量的1％。對照細胞在相同條件下培養(yǎng)，但不進行處理。在72hr的處理或非處理之后，通過使用臺盼藍排除法計數(shù)各樣品中細胞總數(shù)和活細胞數(shù)量。分析在各樣品中的細胞增殖率和死亡細胞的百分率。該實驗的結(jié)果在圖1、圖2和表6至12中示出。
圖1為經(jīng)處理的細胞數(shù)量/未處理的細胞數(shù)量的比率相對于用于處理C-33A細胞和Hela細胞的DMSO配方或CPE配方中不斷增加的M4N濃度作圖的表示圖。圖2為死亡細胞的百分比相對于用于處理在培養(yǎng)基中的兩種癌細胞系，C-33A細胞和Hela細胞的DMSO配方或CPE配方中不斷增加的M4N濃度作圖的表示圖。
結(jié)果顯示，相比于未處理的對照，在不含M4N時，以死亡細胞的％測量，單DMSO對于兩種被測試的腫瘤細胞系具有顯著的抗增殖效果及一些毒性作用。相反，當相比于未處理的對照，單CPE配方對于兩種腫瘤細胞系具有抗增殖效果且?guī)缀鯖]有毒性。
當與相同配方中非-M4N處理的對照(即，0μg/mL或0μM M4N)進行比較時，在以M4N的DMSO配方或CPE配方處理之后，在兩種細胞系中細胞增殖率下降。事實上，在CPE配方中，該抗增殖效果表現(xiàn)為M4N劑量依賴型。在CPE配方中，例如，約20μM或7.2μg/mL的M4N被發(fā)現(xiàn)足以對兩種腫瘤細胞型的細胞增殖造成約50％抑制。在CPE配方中，M4N濃度的進一步增加將對兩種細胞型在抗增殖效果上產(chǎn)生進一步的增加。
通常，在DMSO配方或CPE配方中的M4N劑量越高，誘導(dǎo)的兩種C-33A細胞和HeLa細胞的細胞死亡百分比越高。然而，M4N的DMSO配方比相應(yīng)濃度的M4N的CPE配方，對細胞的毒性更大。然而，DMSO配方中測試的M4N最大濃度(80μM或28.7μg/mL)在約40％的細胞群中引起細胞死亡，在這個實驗中，相同濃度的M4N的CPE配方在僅約20％的細胞群中引起細胞死亡。
這些結(jié)果在兩種細胞系中都是可重復(fù)的。從這個研究中獲得的數(shù)據(jù)說明，與DMSO配方中的M4N類似，CPE配方中的M4N能阻止細胞增殖，然而比DMSO配方引發(fā)更低的細胞毒性。
收集連續(xù)時間點的數(shù)據(jù)，以測試CPE配方隨時間的效力。這些數(shù)據(jù)顯示，在貯存在2-8℃十二個月后，CPE配方仍像新的那樣有效。細胞的存活率在CPE配方貯存的十二個月中保持相似。細胞死亡和增殖率保持在相同的范圍內(nèi)。
收集數(shù)據(jù)，比較原CPE配方和新CPE 25/30配方。研究在第0和3月進行，以測試配方隨時間的效力，以及測試新配方相比于舊配方的效果。數(shù)據(jù)顯示CPE 25/30配方在抑制腫瘤細胞的生長上與原CPE配方一樣有效。在使用CPE配方或CPE 25/30配方，以各種藥物濃度處理HeLa細胞中，細胞的存活率相似。細胞死亡和增殖甚至隨時間保持在相同的范圍內(nèi)。
收集信息，以比較原CPE配方和CPE 33/27配方在第0時間對HeLa細胞的作用。數(shù)據(jù)顯示，CPE 33/27在HeLa細胞的細胞存活率、死亡細胞的百分比和增殖率上具有相同的效果。
表6 M4N的DMSO或CPE配方對C-33A細胞的影響 表7 M4N的DMSO或CPE配方在第0時間時對HeLa細胞的影響 表8 M4N的DMSO或CPE配方在第9月時對HeLa細胞的影響 表9 M4N的DMSO或CPE配方在第12月時對HeLa細胞的影響 表10 CPE配方和CPE 25/30配方在HeLa細胞中的比較 表11 CPE配方和CPE 25/30配方第3月時在HeLa細胞中的比較 表12 CPE配方和CPE 33/27配方第0時間時在HeLa細胞中的比較 實施例3.可使用多種批次的M4N，并達到相同效果 對多種批次的M4N進行測試，以顯示不同批次藥物的效果。用CPE配方，以遞增的M4N量0μM、20μM、40μM、60μM和80μM對HeLa細胞進行處理72hr。加入各配方達培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺的最低必需培養(yǎng)基，添加了10％胎牛血清，1mM丙酮酸鈉，1x非必須氨基酸溶液和1000IU/mL青霉素/1000μg/mL鏈霉素溶液)總量的1％。對照細胞在相同條件下培養(yǎng)，但不進行處理。在72hr的處理或非處理之后，通過使用臺盼藍排除法計數(shù)各樣品中細胞總數(shù)和活細胞數(shù)量。分析在各樣品中的細胞增殖率和死亡細胞的百分率。該實驗的結(jié)果在表13和14中示出。這些結(jié)果顯示，無論使用何種M4N批次，藥物的效果保持一致。
表13 用各種批次的M4N處理HeLa細胞(EM1001批) 表14 用各種批次的M4N處理HeLa細胞(EM1002批) 實施例4.靜脈內(nèi)注射毒性試驗 這個試驗的目的是測定當通過靜脈注射向雄性和雌性小獵兔犬給藥時，四-O-甲基NDGA(M4N)的最大耐受劑量，其中小獵兔犬由ConvinceResearch Products(坎伯蘭，美國弗吉尼亞州)提供。兩條在第一次給藥時約6至9個月大的小獵兔犬，一雄一雌，在試驗天(“SD”)1給藥含20％(w/v)HP-β-CD和50％PEG 300的環(huán)糊精賦性劑，隨后以制備于環(huán)糊精賦性劑中的逐漸增大量的M4N(即，試驗藥物)給藥。預(yù)制成的環(huán)糊精賦性劑和試驗藥物在室溫保存。用作稀釋劑的無菌水從Baxter HealthCare公司(迪爾菲爾德，美國密歇根州)或Abbott Laboratories(北芝加哥，美國伊利諾斯州)獲得并在室溫保存。
該試驗藥物、環(huán)糊精賦性劑和稀釋劑被認為是配方用100％純品。通過用無菌注射器將適量的試驗藥物或環(huán)糊精賦性劑加入至玻璃容器中，在每一給藥天制備劑量配方。對各劑量而言，將等量的無菌水加入至M4N配方或環(huán)糊精賦性劑中，以形成50∶50(v/v)的稀釋。200mg/kg劑量不需稀釋。通過輕柔的倒置混合所有配方，以確保形成適當?shù)娜芤?。將配方裝入醫(yī)藥盒中，并在室溫下貯存直至需要使用。
在SD3，M4N以25mg/kg進行給藥，在SD5，M4N以50mg/kg進行給藥，以及在SD8，M4N以100mg/kg進行給藥。僅雌性動物接受全100mg/kg劑量；由于在輸注管中沉淀引起的機械事故，雄性狗接受約72mg/kg(即，72％)的原本劑量。另外兩條小獵兔犬以200mg/kg的劑量進行給藥；然而，機械事故相繼發(fā)生，且雄狗接受約180mg/kg(90％)的原本劑量，而雌狗接受的量不能測定。
在SD13，由于泵的機械故障，不能完成劑量給藥，該機械故障可能與12.5mg/mL的配方的粘度有關(guān)。將未使用的配方轉(zhuǎn)移入棕色試劑瓶中并在室溫保存，直到在SD15通過用無菌水50∶50(v/v)稀釋重新配成配方。然后，將6.25mg/mL稀釋液轉(zhuǎn)入醫(yī)藥盒中。
在第一劑量之前，使試驗的動物適應(yīng)實驗室條件至少7天，并由獸醫(yī)工作人員解除檢疫。在該期間，各動物由耳標進行識別，并在各籠標上記錄下臨時編號。以常規(guī)的方式，并根據(jù)USDA(美國農(nóng)業(yè)部)動物福利法案(Animal Welfare Act)，關(guān)于人道照顧和實驗室動物使用的PHS政策(the PHS Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals)，及美國部門間研究動物委員會關(guān)于使用和照顧研究動物的原則(U.S.Interagency Research Animal Committee Principles for the Utilization andCare of Research Animals)，對動物進行照料。
除特殊說明，食料和水無限制地供應(yīng)。在飲食和水中不存在可影響取得本試驗?zāi)康牡奈廴疚锼?。向動物提供良好的與人類的相互交流，諸如在給藥期間和當進行身體檢查時，進行撫摸、擦拭，及說話。由于靜脈血管導(dǎo)管插入術(shù)，外科操作后試驗狗不能出籠活動。在籠內(nèi)提供了Rubber Kong玩具或尼龍玩具。
使用無菌外科技術(shù)，將留置導(dǎo)管插入動物的頸靜脈中，并在外科手術(shù)當天對動物結(jié)合止痛劑和抗生素進行預(yù)防處理，及在外科手術(shù)之后用抗生素和/或鎮(zhèn)痛藥處理動物8天。研究結(jié)果總結(jié)列在表15、16和17中。
表15在毒性研究的PEG 300/HP-β-CD配方中向小獵兔犬給藥的M4N劑量 表16輸注M4N的小獵兔犬的個體體重(以kg計) SD＝試驗天 表17輸注不同劑量(以mg/kg計)后個體小獵兔犬體內(nèi)的M4N血清濃度(以mg/mL計) ND＝未檢測到；＜LLOQ＝低于定量下限 劑量1、2和3順利輸送。在第SD8天，在100mg/kg劑量期間，注射泵提前停止工作，僅原123.2mL劑量的88.6mL被輸入雄狗(No.10529)中。根據(jù)需要手動重新啟動泵，但僅雌狗(No.10530)接受了全劑量。
在第SD15天，以稀釋的測試物配方和8hr目標輸注時間，試圖將200mg/kg劑量輸入第10567號狗和第10568號狗體內(nèi)。在劑量給藥7hr45min后，雄狗的泵停止。因此，雄狗(第10567號)僅接受預(yù)期320mL劑量的289mL。在劑量給藥2hr12min后，發(fā)現(xiàn)輸注針從雌狗(第10568號)的輸注管線中脫離，劑量給藥終止。靜脈輸入雌狗體內(nèi)的M4N量不能測定。
在完成各靜脈輸注之后，以緩慢推注施用1mL無菌鹽水，從而將試驗材料從輸注管線中沖入動物體內(nèi)，隨后輸入肝素-鹽水溶液以填充輸注管線以保持開放。對動物進行觀察。籠側(cè)觀察包括死亡、病狀(morbundity)、綜合健康，及中毒跡象。臨床觀察包括皮膚和皮毛特性、外科操作位點、眼和粘膜、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，及體動力和行為方式的評價。采集血液，并將血液置于2.5mL血清分離管中，以進行血清M4N濃度分析。將這些管倒置數(shù)次，在濕冰上貯存，在4℃以約3000rpm離心約10min。將血清轉(zhuǎn)移至微離心管中并在-75±10℃下貯存。
在干冰中的樣品被運送至Genelogic的分析化學實驗室(Genelogic，美國馬里蘭州)進行測試物分析。該方法涉及用乙腈處理至少0.5mL的等份的狗血清，過濾，并將濾液注入帶串聯(lián)質(zhì)譜檢測的HPLC柱(LC-MS/MS)中。分析物用三唑安定作為內(nèi)標物的外標準曲線進行定量。
雄狗No.10529和雌狗No.10530分別在第SD9和17天從試驗中排除。在第SD17天對雄狗No.10567和雌狗No.10568進行安樂死和抽血。所有動物通過靜脈注射Nembutal進行安樂死。
在死亡后，盡可能快地對所有狗進行尸體解剖。進行了全面地尸體解剖，包括檢查身體的外表面、外科操作位點、所有開孔、頭蓋骨、胸及腹腔及其內(nèi)容物。由股骨髓制備骨髓涂片。將切片進行空氣干燥，用甲醇固定，并保存以用于進行進一步可能的評價。將組織保存在10％中性緩沖的福爾馬林(“NBF”)中。此外，收集與血管獲取端(“VAP”)相聯(lián)的輸送管道，在兩端打結(jié)，貯存在NBF中。腎、肺、膀胱及任何肉眼損害被包埋、切片、染色及由委員會認證的獸醫(yī)病理學家檢測。在被檢測的組織中，未發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的測試物質(zhì)。
結(jié)果顯示，以M4N進行治療對死亡率沒有影響。對體重沒有明顯地治療相關(guān)的臨床觀察或影響。無測試物質(zhì)相關(guān)的肉眼可見的病理學發(fā)現(xiàn)或顯微鏡可見的變化。M4N的血清濃度水平在緊接輸注期后為最高，在所有的測量時間間隔中，雌狗的M4N水平高于雄狗的。在輸注期之后16hr，M4N仍然可檢測，檢測量隨著劑量的增加而增加。
總之，在達約200mg/kg的劑量下，未觀察到治療相關(guān)的副作用。
實施例5 補充的靜脈輸注毒性試驗 A.在小獵兔犬中的M4N(CPE)7天靜脈輸注毒性研究 該研究是為了測定當作為單靜脈輸注劑量在小獵兔犬中連續(xù)給藥7天時，配制在30％HP-β-CD和25％PEG 300中的M4N的毒性動力學曲線。這個試驗構(gòu)成了M4N的該特定的配方在狗中的第一個研究，以評估毒性并比較稀釋劑(10mg/mL對5mg/mL)的耐受性。
以54分鐘(組2)或108分鐘(組1、3和4)的靜脈輸注，向總共12條小獵兔犬(8雄/4雌)給藥M4N。所有的動物接受7個劑量，每天一次，連續(xù)7天。
評價以下的參數(shù)臨床觀察和體重。試驗物分析在第試驗天1和7進行，在如下的時間點從各動物適當?shù)难懿杉獦?指標為2.0mL體積) 對組1和3的動物進行大致解剖，且所有注射位點為組織學而進行處理。詳細的臨床觀察揭示了如下發(fā)現(xiàn)在組2、3和4中觀察到短暫可逆的后肢不適。大部分這些觀察現(xiàn)象在組3和4中被觀測。在組1和3中觀察到變色的尿液。由于這些發(fā)現(xiàn)在賦形劑組中發(fā)現(xiàn)，因此這可能與賦形劑相關(guān)。在組1、2和3中觀測到三例前肢區(qū)域的腫大，始于第3天、終于第4天。該發(fā)現(xiàn)可能表示由于多個針頭插入相同劑量給藥區(qū)域(頭靜脈)引起的發(fā)炎。在組3雌性動物中觀察到為孤立事件的一例急促呼吸，且此后再未觀察到。最后，觀測到零星的腹瀉、嘔吐、黏液糞便和軟糞。這些觀測結(jié)果在小獵兔犬中較為普遍，被認為是由于壓力產(chǎn)生而非測試物相關(guān)的。
血清的分析顯示，測試物濃度的最低峰(標稱為18759ng/mL)在接受45mg/kg(5mg/mL)的組4動物中發(fā)現(xiàn)。較高峰濃度(標稱為33420ng/mL)在接受45mg/kg(10mg/mL)的組2動物中發(fā)現(xiàn)。與預(yù)期一樣，最高濃度(標稱為46704ng/mL)在接受90mg/mL(10mg/mL)的組3動物中發(fā)現(xiàn)。所有組的最大濃度的時間在輸注完成時(組2為0.9小時，組3和4為1.8小時)。在接受賦性劑的任何組1動物樣品中未觀測到測試物。一次給藥的濃度曲線在圖3A(非對數(shù)標度)和圖3B中(對數(shù)標度)中示出。
對組1和3的動物進行大致解剖。為進行組織學研究，收集注射位點并處理。組織學研究顯示，對照的注射位點比治療動物的這些受到更小的影響，當與對照進行比較時，治療動物的注射位點更厚和變色。這些暗示的是測試物比賦性劑具有更大的刺激性。在動物解剖中未觀測到其他目視發(fā)現(xiàn)。
B.在小獵兔犬中的M4N(CPE)帶28天恢復(fù)期的14天重復(fù)靜脈輸注毒性試驗 通過帶28天恢復(fù)期的14天靜脈輸注向雄性和雌性小獵兔犬給藥CPE(12.5mg/mL在20％HP-β-CD，50％PEG 300中)，以測定任何治療相關(guān)毒性的可逆性。最初，32條狗(16/性別)被隨機分成4組(組1和4中5/性別，組2和3中3/性別)，并以％22、45或90mg/kg劑量的50％PEG300中的20％HP-β-CD(安慰劑)或測試物(CPE)進行給藥。所有的動物通過靜脈輸注接受總共14次每天一次的劑量。在劑量給藥之后，3條狗/性別/組在第SD16天進行安樂死，組1和4中余下的2條狗/性別保持經(jīng)歷28天的恢復(fù)期。
本研究中評估的參數(shù)包括死亡率、臨床觀察結(jié)果、體重和體重變化、食物消耗、眼科學、心臟病學、臨床病理學、器官重量，及顯微鏡觀察的微觀病理學。
CPE治療對死亡率無影響；所有的動物都存活到按計劃終止時。對體重、體重變化或食物消耗無影響。未注意到治療相關(guān)的視覺影響。在90mg/kg的一條狗身上觀測到兩次可逆CNS活性(共濟失調(diào))的短暫證據(jù)。所有其他的臨床觀測結(jié)果被認為是孤立發(fā)生，與治療無關(guān)。
沒有測試物相關(guān)的心臟病學影響。在預(yù)劑量和第SD13天時，用安慰劑處理的一只雄性具有室性早搏，且在第SD1天，用45mg/kg CPE處理的一雌體具有未傳導(dǎo)至心室的心房搏動；這些發(fā)現(xiàn)都不認為是治療相關(guān)的。
在臨床病理學參數(shù)中未出現(xiàn)明顯的測試物相關(guān)的影響。第SD15天，在以22.5mg/kg CPE處理的雄性動物中發(fā)現(xiàn)顯著更低的絕對網(wǎng)狀細胞計數(shù)；然而該變化是最低限度的，與預(yù)劑量值類似，并不認為具有生物或毒理學顯著性。
在第SD16天，以22.5和45mg/kg CPE處理的雄性的絕對脾細胞重量具有統(tǒng)計學顯著性與對照組(安慰劑)中個體動物變化有關(guān)。在相關(guān)器官重量上沒有顯著區(qū)別。
在第SD16天解剖時在所有動物的輸注位點發(fā)現(xiàn)的損傷相比于靜脈輸注過程被認為是次要的，并與治療無關(guān)。在45mg/kg CPE組的一雌體中發(fā)現(xiàn)輸注位點變紅，相關(guān)地用顯微鏡觀察為多病灶的、輕微的、內(nèi)膜的、血管增厚，平滑肌細胞的多病灶、輕微的血管增生，及多病灶、輕微的、亞急性的皮下血管周炎，顯示了由劑量給藥技術(shù)產(chǎn)生的炎癥。在安慰劑和90mg/kg CPE組中選擇的雄性和雌性動物展示出由于安樂死的方式導(dǎo)致的擴散、輕度至中度的脾臟充血。在第SD16、42和43天的解剖中注意到了的所有其他肉眼可見的和顯微鏡可見的發(fā)現(xiàn)被認為是偶然的和非治療相關(guān)性的。
總之，在小獵兔犬中以達90mg/kg劑量的14天CPE靜脈輸注之后，沒有發(fā)現(xiàn)不利的治療相關(guān)影響。
C.在小獵兔犬中IV劑量范圍研究 單條雄狗通過IV輸注(10mL/kg/hr)給藥20％HP-β-CD/50％PEG 300中的M4N(12.5mg/mL)。發(fā)生了輸注管線內(nèi)壓力增加及試驗配方從注射器中泄漏。劑量給藥造成唾液分泌、瞳孔散大、紅尿、嚴重的共濟失調(diào)、戰(zhàn)栗和痙攣。由于觀察結(jié)果被認為很嚴重，動物被認為臨近死亡，并計劃進行安樂死。在安樂死之前，狗似乎在恢復(fù)；所有先前發(fā)現(xiàn)的臨床觀測結(jié)果在嚴重性上顯著下降。
在單條雌狗以5mL/kg/hr的輸注率進行相同劑量的嘗試，造成劑量給藥之后不協(xié)調(diào)的/不平衡的運動和頻繁的排尿。狗在1小時15分鐘內(nèi)恢復(fù)，并表現(xiàn)出無連續(xù)或另外的不良臨床跡象。
另外的雄和雌體以150mg/kg及隨后以125mg/kg進行劑量給藥。在劑量給藥期間，出現(xiàn)嚴重的共濟失調(diào)、眼球震顫、紅尿或糞、頻繁的排尿、發(fā)聲，在這些劑量水平出現(xiàn)呼吸困難、嘔吐，和/或分泌唾液。兩動物在劑量給藥的1hr內(nèi)恢復(fù)，且隨后未發(fā)現(xiàn)另外的重要臨床跡象。
在200、150和125mg/kg觀察的附帶的臨床、籠側(cè)、劑量給藥后，或不定期的觀察結(jié)果包括鼻子和/或耳朵的輕微的紅斑、排泄變化(軟和/或帶黏液的糞便)及各一例清鼻涕和紅色陰道排出物。這些發(fā)現(xiàn)不頻繁發(fā)生，并被認為是普通的實驗發(fā)現(xiàn)，與治療無關(guān)。在第SD43天，接受125mg/kg的雌體在劑量給藥期間發(fā)生一例行動蹣跚，其可歸因于劑量給藥吊帶的使用，也被認為與治療不相關(guān)。
另外兩條狗(自然的)被加入到試驗方案中，并以75mg/kg/天、輸注速率5mL/kg/hr進行劑量給藥，在13天的間隔中進行總12個劑量。唯一可注意到的劑量給藥后觀測結(jié)果是在第SD7天的雌性的紅棕色尿液的單次觀測結(jié)果；這個現(xiàn)象的意義未知。臨床的觀測結(jié)果包括在雄體中的軟糞和在雌體中起泡白色嘔吐物；這些發(fā)現(xiàn)為罕見或孤立事件，并不認為與治療相關(guān)。第SD2天，在雄體中發(fā)現(xiàn)了虛弱肢體的劑量給藥后觀測結(jié)果，這可歸因于使用了吊帶束縛。兩狗在劑量給藥1hr內(nèi)從任何所發(fā)現(xiàn)的臨床癥狀中恢復(fù)。以M4N進行治療對體重無影響，并在解剖時未發(fā)現(xiàn)肉眼能觀察到的損傷。未發(fā)現(xiàn)其他治療相關(guān)的觀測結(jié)果。
D.在Sprague-Dawley大鼠中進行的8天IV輸注毒性研究 以溶于在PEG 300中的10％HP-β-CD的M4N(6.25mg/mL)0、100、150，或200mg/kg的逐漸升高的劑量，每四天一次由IV輸注以8mL/kg/hr向雄和雌Sprague-Dawley大鼠(3/各性別)進行給藥。在最初的四次輸注之后，試驗擴展至包括持續(xù)4hr、達14天的每天輸注。未發(fā)生與M4N相關(guān)的明顯死亡率。在賦性劑給藥期間，發(fā)現(xiàn)一支雄鼠死于第一天劑量，在輸注100mg/kg的測試材料后，一支雌鼠被發(fā)現(xiàn)死于試驗的第5天。這些死亡并不認為與試驗物有關(guān)，因為一只鼠未給藥測試物(僅賦性劑)，而對于另一只鼠而言，在其他大鼠以200mg/kg/天劑量給藥多天下存活的事實下，這是單獨事件。
出現(xiàn)的臨床和解剖的觀測結(jié)果相對于端口和輸注管線是次要的。這些觀測結(jié)果包括頸部或腋窩的腫脹，及后肢的限制運動。在本研究的連續(xù)每天劑量給藥期間，在一雄和一雌大鼠上出現(xiàn)了戰(zhàn)栗。此外，在一雄和一雌大鼠上出現(xiàn)了上瞼下垂和多動癥狀。這些是僅有的與200mg/kg/天測試物劑量相關(guān)的臨床觀測結(jié)果。
雄性和雌性大鼠在整個試驗期間體重都增加。最高的體重增量出現(xiàn)在以賦性劑給藥后。以賦性劑或測試物給藥后，食物的消耗量是相似的。
基于在這個試驗中進行評價的大鼠的有限數(shù)量，以高達200mg/kg/天劑量的賦性劑或測試物給藥達連續(xù)8天，顯示大鼠可耐受的，每天劑量給藥后僅造成一些不利的臨床觀測結(jié)果。出現(xiàn)的大部分不利的臨床觀測結(jié)果和所有的解剖發(fā)現(xiàn)被認為與用于向大鼠劑量給藥的端口和管線相關(guān)。在處死時，所有的輸注管線或從頸靜脈中移出和/或在端口/管線定位處未發(fā)現(xiàn)專利物和物質(zhì)(假定為測試物)。
實施例6.M4N在改性纖維素中的溶解度 用作增溶劑和/或賦性劑的10m1 50％HP-β-CD(w/v)和0.5％羥丙基甲基纖維素(“HPMC”)(w/v)溶液如下進行制備將5.9mL適于向動物注射用水(“WFI”)置于含攪拌棒的玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將5g HP-β-CD緩慢地加入至不斷攪拌的WFI中，使用刮勺將HP-β-CD導(dǎo)向燒杯的中央。該HP-β-CD溶液被攪拌約24小時，或者直到肉眼觀察下HP-β-CD完全溶解。所得溶液測量為約9.4mL。將約0.6mL的WFI加入至所得溶液中使之達10mL，以生成50％HP-β-CD(w/v)溶液。將50mg HPMC加入至50％HP-β-CD溶液中，攪拌1hr或直到肉眼觀察下HPMC溶解。將最終的溶液攪拌約1hr，隨后在室溫避光保存。制備改性環(huán)糊精和改性纖維素的方法可按比例放大或縮小以獲得所需的體積或濃度的HP-β-CD/HPMC溶液。其他改性環(huán)糊精/改性纖維素溶液可類似制得，例如在上述方法中，將HP-β-CD替換為其他改性的環(huán)糊精，或?qū)PMC替換為其他改性的纖維素。
以約10mg/mL濃度在50％HP-β-CD/0.5％HPMC中的10mL M4N溶液如下制備將約10mL的50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加入至含攪拌棒玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約100mg M4N緩慢地加入至50％HP-β-CD/0.5％HPMC中，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央。該M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物被攪拌約24小時，或者直到所有的M4N均勻懸浮而不存在任何聚集。該M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物可在90℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物在90℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景觀察顆粒的存在與否，可觀察所述M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液在室溫儲存，并避光保存。當在90℃加熱時，M4N可以1mg/mL和10mg/mL溶解在這50％HP-β-CD/0.5％HPMC配方中，并在冷卻后仍保持在溶液中，室溫下的穩(wěn)定性大于7天。即使在90℃下，M4N不以50mg/mL的濃度溶于此相同配方中。
前述的方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N。在其他環(huán)糊精/纖維素溶液中含M4N的配方可類似制得，例如，通過在上述方法中將HP-β-CD替代為其他環(huán)糊精，或者將HPMC替代為其他改性纖維素。
用作增溶劑和/或賦性劑的10ml 5％(w/v)乙基纖維素(“EC”)乙醇溶液如下進行制備將10mL 100％乙醇(“EtOH”)置于含攪拌棒的玻璃燒杯中，蓋上圓形Teflon蓋子。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將五百(500)mg EC緩慢地加入至不斷攪拌的乙醇中，使用刮勺將EC導(dǎo)向燒杯的中央，以避免EC粉末粘附在燒杯壁上。該EC溶液被攪拌約2小時，或者直到肉眼觀察下EC完全溶解。將最終的溶液在室溫避光保存。
制備改性纖維素溶液的方法可按比例放大或縮小以獲得所需的體積或濃度。其他改性纖維素溶液可類似制得，例如在上述方法中，將EC替換為其他改性的纖維素。
以約20mg/mL濃度在5％EC(w/v)(“EC”配方)中的10mL M4N溶液如下制備將如上制備的約10mL的5％EC配方加入至含攪拌棒玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌，并蓋上圓形Teflon蓋子。將約200mg M4N緩慢地加入至5％EC配方中，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央，以避免M4N粘附在燒杯壁上。該M4N/EC混合物被攪拌約2小時，或者直到所有的M4N溶解或均勻懸浮而不存在任何聚集。該M4N/EC混合物可在60℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/EC混合物在60℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景尋找顆粒，可觀察所述M4N/EC混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/EC溶液在室溫避光保存。
前述的方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N，且可增大或降低加熱溫度以使得M4N溶解。在其他改性纖維素中含M4N的配方可類似制得，例如，HPMC，MC(甲基纖維素)，和CMC(羧甲基纖維素)。M4N在改性纖維素中的溶解度結(jié)果在表18中列出。
結(jié)果顯示，M4N可以以1mg/mL溶解于EC配方中而不用加熱，該溶液在室溫下穩(wěn)定性大于3天。M4N可以10mg/mL濃度在40℃下溶解，并在冷卻后仍保持在溶液中，該溶液在室溫下的穩(wěn)定性大于3天。M4N可以20mg/mL濃度在60℃下溶解于EC配方中，并在冷卻后仍保持在溶液中，該溶液在室溫下的穩(wěn)定性大于3天。M4N可以30mg/mL濃度在60℃下溶解于EC配方中，但冷卻后不能保持在溶液中。更高濃度的M4N，諸如50mg/mL或100mg/mL水平，在90℃可溶解在EC配方中，但在冷卻后不能保持在溶液中。
表18 M4N在含改性纖維的配方中的溶解性 實施例7 M4N在水溶性脂質(zhì)或水溶性有機溶劑中的溶解性 以約50mg/mL濃度在芝麻油中的10mL M4N溶液如下制備將約10mL芝麻油加入至含攪拌棒的玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約500mg M4N緩慢地加入至芝麻油中，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央，以避免M4N粘附在燒杯壁上。該M4N/芝麻油混合物被攪拌約24小時，或者直到所有的M4N溶解或均勻懸浮而不存在任何結(jié)塊。該M4N/芝麻油混合物可在60℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/芝麻油混合物在60℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景尋找顆粒，可觀察所述M4N/芝麻油混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。如果形成結(jié)晶，該M4N/芝麻油溶液可置于加熱磁力平臺上伴隨攪拌重新在60℃加熱約1hr，直到所有M4N溶回溶液中。最終的M4N/芝麻油溶液在室溫避光保存。
前述的方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N，且可升高或降低加熱溫度以使M4N溶解。在其他水溶性脂質(zhì)中含M4N的配方可類似制得，例如，通過在上述方法中將芝麻油替代為玉米油，橄欖油、大豆油、薄荷油，或其他增溶劑，及其結(jié)合。結(jié)果在表19中示出。
表19顯示，例如，在60℃，M4N可以1mg/mL至達100mg/mL的濃度范圍，除去100mg/mL水平，溶解在玉米油中，冷卻后仍保持在溶液中，在1和10mg/mL濃度下該溶液穩(wěn)定性大于3天，在20、40和50mg/mL水平下該溶液穩(wěn)定性小于3天，在60mg/mL水平下該溶液穩(wěn)定性小于1天。此外，在60℃，M4N以30mg/mL水平可溶解在橄欖油中，但冷卻后不能保持在溶液中。
在芝麻油中，M4N以10mg/mL水平在室溫，以20mg/mL、30mg/mL和50mg/mL的濃度在60℃可溶解，冷卻后仍保持在溶液中。10mg/mL和20mg/mL在室溫下的穩(wěn)定性大于3天、30mg/mL溶液在室溫下的穩(wěn)定性小于3天，以及50mg/mL溶液在室溫下的穩(wěn)定性小于1天。
以約60mg/mL濃度在85％芝麻油和15％Tween20中的10mL M4N溶液如下制備將約8.5mL芝麻油入至含攪拌棒玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約1.5mL的Tween20緩慢加入至燒杯的中央。將約600mg M4N緩慢地加入至芝麻油/Tween20的混合物中，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央，以避免M4N粘附在燒杯壁上。該M4N/芝麻油/Tween20混合物被攪拌約2小時，或者直到所有的M4N溶解或均勻懸浮而不存在任何聚集。該M4N/芝麻油/Tween20混合物可在60℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/芝麻油/Tween20混合物在60℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景，可觀察所述M4N/芝麻油/Tween20混合物是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/芝麻油/Tween20溶液在室溫避光保存。如果形成結(jié)晶，該M4N/芝麻油/Tween20溶液可置于加熱磁力平臺上伴隨攪拌在60℃重新加熱，直到所有M4N溶回溶液中。
此方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N，且可升高或降低加熱溫度以使M4N溶解。在其他水不溶性脂質(zhì)結(jié)合非離子表面活性劑、離子型表面活性劑或水溶性有機溶劑中含M4N的配方可類似制得，例如，通過在上述方法中將芝麻油或Tween20替代為玉米油，橄欖油、大豆油、薄荷油、Tween80、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(“TPGS”)、卵磷脂、PEG 300、PEG 400、PEG 400單月桂酸酯、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙二醇(“PG”)或其他增溶劑，及其結(jié)合。M4N在水不溶性脂質(zhì)中的溶解性結(jié)果在表19中示出。
表19顯示，例如，60mg/mL的M4N在55℃可溶解于含85％芝麻油和15％Tween20的配方中，以及40mg/mL的M4N在45℃可溶解于相同配方中，但冷卻后在這些配方中M4N不能保持在溶液中。相反，29mg/mL的M4N在60℃可溶解于含89％芝麻油和11％Tween20的稍微不同的配方中，且冷卻后仍能保持在溶液中，此溶液在室溫下穩(wěn)定性大于7天。
以約2.9mg/mL濃度在鹽水中的1mL M4N乳狀液如下制備將約0.9mL0.9％鹽水溶液置于1.5mL大小的聚丙烯管中。將約0.1mL以29mg/mL濃度存在于89％芝麻油、11％Tween20中的M4N溶液加入至該聚丙烯管中。該M4N/芝麻油/Tween20溶液或混合物的鹽水溶液被劇烈振蕩1min。乳狀液通過將該M4N/芝麻油/Tween20溶液超聲5分鐘制備，其中超聲的微端探頭的振幅調(diào)節(jié)至60％的最大探頭振幅。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景尋找是否存在顆粒，可觀察所述M4N/芝麻油/Tween20混合物是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/芝麻油/Tween20溶液在室溫避光保存。
此方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N。在其他脂質(zhì)結(jié)合其它表面活性劑，或水溶性有機溶劑中含M4N的配方可類似制得，例如，通過在上述方法中將芝麻油或Tween20替代為玉米油，橄欖油、大豆油、薄荷油、Tween80、TPGS、卵磷脂、PG、PEG 300、PEG400、PEG 400單月桂酸酯、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)或其他增溶劑，及其結(jié)合。
表19 M4N在水不溶性脂質(zhì)中的溶解性 表20示出了M4N在水溶性有機溶劑EtOH、PG、PEG 300、PEG 400、PEG 400單月桂酸酯、甘油、PVP及其某些結(jié)合中的溶解性結(jié)果。
表20 M4N在水溶性有機溶劑中的溶解性 實施例8 M4N在非離子表面活性劑中的溶解性 以約60mg/mL濃度在Tween20中的10mL M4N溶液如下制備將約10mL Tween20加入至含攪拌棒的玻璃燒杯中。將該燒杯置于磁力平臺，設(shè)置攪拌棒以中速攪拌。將約600mg M4N緩慢地加入至Tween20中，在刮勺的幫助下加入至燒杯的中央，以避免M4N粘附在燒杯壁上。該M4N/Tween20混合物被攪拌約2小時，或者直到所有的M4N溶解或均勻懸浮而不存在任何聚集。該M4N/Tween20混合物可在60℃加熱30min。(或者如果需要更大的溶液體積，更長時間，例如，500mL該M4N/Tween20混合物在60℃加熱1hr)，或需要確保M4N充分溶解的更長時間。通過將燒杯對著白色背景、之后對著黑色背景尋找是否存在顆粒，可觀察所述M4N/Tween20混合物是否存在任何未溶解的M4N。最終的M4N/Tween20溶液在室溫避光保存。在貯存期間如果形成結(jié)晶，該M4N/Tween20溶液可置于加熱磁力平臺上伴隨攪拌在60℃重新加熱約1hr，或者直到所有M4N溶回溶液中。
此方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N，且可升高或降低加熱溫度以使M4N溶解。在其他非離子表面活性劑、離子表面活性劑或兩性分子中含M4N的配方可類似制得，例如，通過在上述方法中將Tween20替代為Tween80，其他增溶劑，及其結(jié)合。M4N在Tween20、Tween80，以及Tween20和PEG 400的結(jié)合中的溶解性結(jié)果結(jié)果在表21中示出。
表21顯示，在室溫下，1mg/mL濃度的M4N可溶解于Tween20或Tween80中。Tween20溶液中的M4N(“M4N/Tween20”)在室溫下的穩(wěn)定性大于7天，而Tween80溶液中的M4N(“M4N/Tween80”)在室溫下的穩(wěn)定性觀察大于3天。在50℃，更高濃度的M4N可溶解于Tween20或Tween80中。此外，Tween20中達60mg/mL濃度或Tween80中達50mg/mL濃度時，冷卻后M4N仍然保持在溶液中，然而，Tween20中在80mg/mL和100mg/mL水平時，冷卻后為不溶。觀察到10mg/mL和20mg/mL的M4N/Tween20溶液在室溫下穩(wěn)定性大于7天。觀察到40mg/mL和80mg/mL的M4N/Tween20溶液在室溫下穩(wěn)定性小于3天。對于M4N/Tween80溶液，10mg/mL溶液觀察到在室溫下可穩(wěn)定大于3天，而50mg/mL溶液在室溫下穩(wěn)定性小于1天。
結(jié)果還顯示，當在65℃加熱時，M4N可溶解于50％Tween20和50％PEG 400的結(jié)合，M4N濃度達60mg/mL。冷卻后，M4N仍然保持在這些配方的溶液中，該溶液在室溫下穩(wěn)定性大于3天。
表22示出了M4N以μg/mL的濃度及其以μM量計的相應(yīng)濃度。
表21 M4N在非離子表面活性劑中的溶解性 表22 M4N的濃度轉(zhuǎn)換表 實施例9含M4N的HP-β-CD的凍干配方 HP-β-CD中M4N濃度為約185mg/g(w/w)的120mg凍干粉如下進行制備。使用等摩爾量的HP-β-CD和M4N來增加HP-β-CD和M4N之間的絡(luò)合比率。將約98mg的HP-β-CD和約22.2mg的M4N在1.5mL大小的聚丙烯管中混合。將約0.2mLWFI加入至含HP-β-CD/M4N粉末混合物的聚丙烯管中的混合物中，并震動1min以產(chǎn)生HP-β-CD/M4N的水懸浮液。該HP-β-CD/M4N懸浮液在-20℃冰凍24hr。隨后，將HP-β-CD/M4N懸浮液以1400rpm、真空下、60℃離心約2hr，以將所有的水從懸浮液中除去。HP-β-CD/M4N復(fù)合物的干粉重約120mg。隨后，將HP-β-CD/M4N粉末復(fù)合物在水或其他增溶劑中溶解或重新懸浮。最終的M4N/HP-β-CD粉末復(fù)合物在室溫避光保存。此方法可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N。含M4N與其他環(huán)糊精的配方可類似制備，例如，在上述方法中，將HP-β-CD替換為其他環(huán)糊精。顯示在表1中的結(jié)果說明，冷凍干燥HP-β-CD/M4N懸浮液后獲得的HP-β-CD/M4N復(fù)合物粉末含約81.5％HP-β-CD和18.5％M4N。
HP-β-CD/HPMC中M4N濃度為約150mg/g(w/w)的400mg凍干粉如下進行制備。將如上制得的約1mL50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加入至1.5mL大小的聚丙烯管中。將約60mgM4N加入至含HP-β-CD/HPMC懸浮液的聚丙烯管中的混合物中，并震蕩1min以產(chǎn)生HP-β-CD/HPMC/M4N懸浮液。該HP-β-CD/HPMC/M4N懸浮液在-20℃冰凍24hr。隨后，將HP-β-CD/HPMC/M4N懸浮液以1400rpm、真空下、60℃離心約5hr，以將所有的水從懸浮液中除去。HP-β-CD/HPMC/M4N復(fù)合物的干粉重約400mg。隨后，可將HP-β-CD/HPMC/M4N粉末復(fù)合物在水或其他增溶劑中溶解或重新懸浮。最終的M4N/HP-β-CD/HPMC粉末復(fù)合物在室溫避光保存。此發(fā)明可按比例放大或縮小以獲得所需體積或濃度的M4N。含M4N與其他環(huán)糊精/纖維素溶液的配方可類似制備，例如，在上述方法中，將HP-β-CD替換為其他環(huán)糊精，或者將HPMC替代為其他改性纖維素。顯示在表18中的結(jié)果說明，冷凍干燥HP-β-CD/HPMC/M4N懸浮液后獲得的HP-β-CD/HPMC/M4N復(fù)合物粉末含約84％HP-β-CD，1％HPMC和15％M4N。
實施例10用于輸送M4N的IV管的測試 在這個試驗中，各種類型的輸液管被加以測試其相容性并優(yōu)化M4N的靜脈輸送。對相容性的試驗基于目測觀察和HPLC(高壓液相色譜)分析。
目測觀察如下進行將進行測試的約5mL的配方(“配方材料”)通過約20cm長的輸液管。在室溫下(25℃)，將該配方材料保持在管中約24hr。隨后，將該配方材料通過該輸液管循環(huán)多次(例如，約5次)，并收集在燒杯或收集管中。仔細檢查該配方材料看是否出現(xiàn)沉淀或微粒，包括將該燒杯或收集管對著白色背景，隨后對著黑色背景。
使用HPLC分析的相容性測試隨著被測試的輸液管、時間長度及輸液管的目的而在方法上發(fā)生變化。這個測試測量通過不同輸液管循環(huán)前后溶液中M4N的量。
決定相容性的臨界值為90％分析純，是指在與輸液管相互作用及試驗完成之后，如果約90％的M4N保持在溶液中，該材料可被認為是相容性的。低于90％臨界值的任何量被認為是不相容輸液管。結(jié)果總結(jié)在表23中。
這個試驗顯示，PTFE(聚四氟乙烯)和氟橡膠(Barnant公司，巴靈頓，美國依利諾斯州)、聚丙烯(Cole-Parmer，Vernon Hills，美國伊利諾斯州)、FEP(聚全氟乙丙烯)(Saint-Gobain，Mickleton，美國新澤西州)、PTFE(Cole-Parmer)、聚乙烯(Intramedic，Becton Dickinson，斯帕克斯，美國馬里蘭州)和鉑處理硅橡膠(小尺寸)(Cole-Parmer)對于輸送本文所述配方中的M4N都具有相容性。
表23用于輸送M4N的相容性管材 **不是優(yōu)選的，但具有某些相容性 實施例11 藥物組合物的內(nèi)胞膜中(intravesicular)給藥 一種或多種前述藥物組合物可用內(nèi)胞膜中給藥，諸如以800mg劑量每周進行6周，原位治療膀胱癌。該組合物含API，諸如NDGA化合物，例如M4N。所述API，例如M4N，以每5mL瓶200mg存在于組合物之中，并在2℃-8℃(36-46)下冰箱中儲存。在將所述組合物向受試者給藥之前，將藥瓶從冰箱中取出，并允許不加熱回到室溫?？赏ㄟ^加入800mg(20mL)至55mL的0.9％生理鹽水注射液，USP，將組合物進行稀釋。通過內(nèi)胞膜給藥API(當如上稀釋時，共75mL體積)進行膀胱灌洗，使得API保持2hr，隨后排空。使用如上所述的相容性輸液管。
如果膀胱被損傷、發(fā)炎或穿孔，建議醫(yī)生或患者不給予含API的組合物，因為喪失粘膜的完整性會發(fā)生系統(tǒng)性吸收。對于具有嚴重過敏膀胱癥狀的患者，應(yīng)小心使用該化合物，因為在灌入或保持期中API可造成膀胱過敏癥狀。患者被告知，約24hr內(nèi)尿液可為淡紅或淡粉紅色的。實施例12人體階段0，在8位健康男性受試者體內(nèi)的14C標記的M4N三交叉微劑量藥物動力學研究 當以亞治療劑量，或以餐后和空腹條件下的單口服劑量或單靜脈劑量(在表24中，分別為方式A-C)，向人體給藥時，這個試驗被設(shè)計用來評價M4N的吸收。這個試驗為在健康男性受試者目標人群中的三交叉試驗方案，并由持續(xù)約35小時的三個試驗階段構(gòu)成，各階段由劑量給藥之間的至少7天的最小期間間隔。在各試驗階段的過程中，在劑量給藥后，在特定時間點采集藥物動力學血樣，以及以預(yù)定的時間間隔收集尿液。在劑量給藥后24hr的試驗特定過程完成之后，受試者可離開臨床單位。
在這個研究中，M4N以100μg的量向人給藥。M4N被以14C少量標記(3.3kBq每100μg)，并向健康的志愿者給藥。各次口服給藥的M4N包括在尺寸0的凝膠膠囊中0.1mg的14C標記的M4N和376.8mg甘油單油酸酯。單靜脈輸注的M4N包括0.1mg/mL14C標記的M4N、30％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG，用水稀釋至1mL以用于推注注射。隨后從各受試者收集血樣和尿樣，使用加速器質(zhì)譜法(AMS)分析樣品的14C含量，以測定相比于M4N的IV劑量，M4N的口服劑量的在Tmax時出現(xiàn)的最大M4N濃度(Cmax)，相應(yīng)于在測試(AUC0-t)和總(AUC0-∞)時間的M4N的總吸收的曲線(AUC)下的總面積，各樣品的最終半衰期(T1/2)及各相對和總生物利用度(Fre1和F)。14C的藥物動力學參數(shù)的平均±SD值在表24中列出。M4N的基線水平對劑量給藥之間的期間后殘留在受試者中的任何殘余M4N進行校正，從而不影響任何隨后劑量給藥的M4N水平。
表24 14C的藥物動力學參數(shù)的平均值±SD值(基線校準) a中值 方式A在高脂早餐后，以100μg14C標記的M4N(3.3kBq)作為單口服劑量給藥。
方式B在隔夜空腹后，以100μg14C標記的M4N(3.3kBq)作為單口服劑量給藥。
方式C在隔夜空腹后，以100μg14C標記的M4N(3.3kBq)作為1mL推注靜脈溶液給藥。
對于口服劑量給藥而言，高脂早餐后的100μg14C標記的M4N口服給藥后的總14C的Cmax值(Cmax＝5.94±1.33pmol/L)低于隔夜空腹后的口服給藥后的總14C的Cmax值(Cmax＝9.29±1.40pmol/L)。Tmax在餐后受試者體內(nèi)趨向于較空腹受試者體內(nèi)出現(xiàn)的更遲。在餐后受試者中，Tmax，即Cmax的出現(xiàn)時間，高度可變且在劑量給藥后1.5至24hr范圍內(nèi)，在空腹受試者中，Tmax通常發(fā)生在劑量給藥后1hr(0.50至2.00hr范圍)。餐后受試者的AUC0-t值通常低于空腹受試者的值。
在靜脈劑量給藥后，正如所預(yù)期的，在10位受試者中的8位中，最大濃度(Cmax＝10.31±1.77pmol/L)出現(xiàn)在第一采樣時間(劑量給藥后0.08hr)。在2位受試者中，Tmax為劑量給藥后0.17hr。餐后受試者中單口服劑量給藥后的總14C血漿濃度的AUC0-t值稍低于靜脈劑量給藥的值。相反，空腹受試者中單口服劑量給藥后的相應(yīng)AUC0-t值稍高于靜脈劑量給藥的值。
研究配方在口服和靜脈給藥中都具有良好的耐受性。無嚴重或劇烈的不良癥狀，且受試者沒有因為試驗治療相關(guān)的不良癥狀而中斷試驗。在目測或ECG(心電圖)中未發(fā)現(xiàn)明顯的臨床變化。
關(guān)于這個研究總結(jié)如下，在餐后和空腹狀態(tài)口服給藥后的M4N表觀吸收非常高。在存在食物時，相比于空腹狀態(tài)，吸收的速率和程度較低，Cmax出現(xiàn)時間較空腹狀態(tài)延長。這些結(jié)論基于的假設(shè)是口服給藥劑量中14C標記的M4N在吸收前不被分解。
實施例13 M4N在水溶性有機溶劑中溶解度的補充研究 在表25中列出的M4N在水溶性有機溶劑的結(jié)合中的溶解度被評估達48hr。在室溫孵育2、24和48hr后，樣品通過反相-HPLC(“RP-HPLC”)進行分析，以定量M4N的溶解度。為制備M4N樣品，將溶解于丙酮中的200μL 100mg/mL的M4N置于1.5mL的聚丙烯微管中。將溶劑在室溫中蒸發(fā)48hr，直到樣品完全干燥。
在15mL聚丙烯離心管中制備水可混溶的有機溶劑配方。制備各10mL配方。各溶劑基于采用在25℃下各自的密度的重量被加入。在短暫混合后，各配方通過0.45μm不含表面活性劑的醋酸纖維素(“SFCA”)過濾器進行過濾，濾液收集在干凈的15mL管中。配方在室溫保存直至使用。
將400μL各配方的結(jié)合(表25，其中Benz＝苯甲醇；Crem＝CremophorEL；DMA＝二甲基乙酰胺；T80＝Tween80)加入至微管中，使得M4N的最大溶解度為50mg/mL。M4N的溶解度通過室溫孵育2、24和48hr時的RP-HPLC進行計算。在各時間點上，將樣品以13000rpm離心2min以沉淀任何固體M4N。如表25所示，一半以上的測試的配方條件能溶解M4N的濃度大于10mg/mL。在2和48hr時，M4N在甘油中的溶解度不能檢測到。
表25在可與水混溶的有機溶劑中達48hr的M4N的溶解度 實施例14 M4N在含水溶液中的溶解度 M4N在含羥丙基HP-β-CD或磺丁醚β-環(huán)糊精(SE-β-CD)(Captisol，CyDex公司，Lenexa，美國堪薩斯州)的含水溶液中的溶解度在上述實施例13中描述的室溫下評估達48小時。根據(jù)重量/體積比準備十份50％的HP-β-CD和SE-β-CD溶液。如實施例13所述制備用于樣品的M4N。在OHAUS分析Plus天平上在容量瓶中稱入1.0g和5.0g之間的每一種化合物。每一樣品用注射用水(WFI)定容至10mL。在40℃下孵育1小時后，將制備液通過0.45μm SFCA過濾器濾入干凈的15mL管。將制備液保存在室溫備用。
如表26所示，M4N在WFI，0.9％鹽水，5％葡萄糖(D5W)中的溶解度在此研究的整個過程中位于RP-HPLC方法的定量極限以下。注意增加的M4N溶解度是HP-β-CD和Captisol濃度和時間的函數(shù)。
表26.M4N在含水溶液中達48小時的溶解度 大于20種的使用水混溶的有機溶劑的配方條件能溶解M4N至大于10mg/mL的濃度。M4N在WFI，0.9％鹽水，5％D5W中的溶解度低于RP-HPLC方法的檢測極限。M4N溶解度的增加是HP-β-CD和Captisol濃度和時間的函數(shù)。
實施例15 M4N在羥丙基β-環(huán)糊精中的溶解度 M4N在不同濃度HP-β-CD中的水溶解度通過Higuchi和Connors(1965)所報道的方法進行計算。簡而言之，精確稱量M4N并以超過其水溶解度的量添加的M4N與濃度遞增(0-350mmol/L)的HP-β-CD水溶液，在室溫輕輕地一起旋轉(zhuǎn)(～12rpm)48hr。隨后，將M4N/HP-β-CD溶液通過0.45μm的SFCA過濾器進行過濾，并以RP-HPLC進行分析。
盡管大部分M4N/HP-β-CD復(fù)合物被認為是包合配合物，環(huán)糊精也已知能形成通過膠束狀結(jié)構(gòu)而能溶解藥物的非包合配合物和復(fù)合物集合體。該相-溶解度曲線并非驗證包合配合物的形成，而僅說明不斷升高的環(huán)糊精濃度如何影響藥物的溶解度。M4N/HP-β-CD復(fù)合物的形成是非線性的，但在這個實施例的試驗中并不研究精確的化學計量(以及穩(wěn)定性常數(shù))，但其可通過他其他方法如NMR或電勢測定法進行測定。
實施例16在HP-β-CD/PEG 300緩沖溶液中M4N的穩(wěn)定性 在60℃孵育后，計算10mg/mL M4N(以75∶25 40％HP-β-CD40mg/mLM4N PEG 300的比率制備)在15mM緩沖溶液中的穩(wěn)定性。
緩沖的40％HP-β-CD溶液基于重量比體積進行制備。在樣品中使用的M4N如實施例13中的描述進行制備。在OHAUS分析Plus天平上的5mL容量瓶中稱量2.0g HP-β-CD。將1mL 100mM的緩沖溶液加至各瓶中。以WFI將各樣品定容至5mL。在40℃孵育1hr之后，將制備液通過0.45μm的SFCA過濾器過濾至干凈的15mL管中。制備液在室溫保存直至使用。
750μL的40％HP-β-CD緩沖溶液被置于1.5mL聚丙烯微管中。將250μL的40mg/mLM4N PEG 300加入至各微管中，使得溶解度為10mg/mL M4N。在將試樣管輕輕翻轉(zhuǎn)之后，用Orion，420A型pH計測量各溶液的pH。取出一初始等份進行RP-HPLC分析。隨后，將測試樣品置于Precision 60℃培養(yǎng)箱中。通過RP-HPLC測定M4N的穩(wěn)定性。在各時間點，以13,000rpm將樣品離心2min，以沉淀任何固體M4N。
如表27所示，在60℃孵育14天后，觀測到各M4N溶液的濃度有輕微的下降。RP-HPLC數(shù)據(jù)未顯示樣品雜質(zhì)的升高，其可說明M4N濃度下降的程度。然而，在M4N的雜質(zhì)中觀測到依賴pH的變化，然而，這些雜質(zhì)占不到0.1％的總峰面積。在孵育期間，幾乎沒有觀測到表觀樣品pH的變化(表27)。
表27 60℃下在HP-β-CD/PEG溶液中達14天的M4N穩(wěn)定性 在60℃孵育14天后觀測到，無論何種表觀樣品pH或緩沖液，穩(wěn)定性都統(tǒng)一下降，如M4N回收的損失所示。
實施例17在11-14mg/mL PEG 300/HP-β-CD溶液中M4N的穩(wěn)定性 為支持制造的技術(shù)要求，這個試驗檢測了不同M4N目標濃度下PEG300/HP-β-CD的結(jié)合的24hr室溫穩(wěn)定性。M4N的備用樣品是在100％PEG300中，以33-56mg/mL藥物濃度，在60℃下如下制備。
采用在實施例13和16中描述的方法，將M4N散裝藥物在PEG 300中溶解至濃度為33、44、48、52、55和56mg/mL(w/w)，隨后在60℃中孵育至少2hr。在44mg/mL以上M4N的充分溶解需要劇烈振蕩和混合。將M4N備用溶液通過0.45μm的SFCA過濾器進行過濾，并在制備后的30min中內(nèi)使用。另外，在無菌WFI中制備40％HP-β-CD(w/v)溶液并過濾。40％HP-β-CD備用液和M4N/PEG 300備用液在1.5mL的聚丙烯微管中混合。在室溫孵育2和24hr時，用RP-HPLC測量M4N的穩(wěn)定性。
將所需量的M4N加至40％HP-β-CD中，以產(chǎn)生表28所列出的最終濃度的藥物和賦性劑。樣品在室溫下輕輕搖晃(～12rpm)。在孵育2和24hr時，樣品以13,000rpm離心2min，取出50μL等份樣進行RP-HPLC分析。無論何種目標M4N或配方，孵育24hr后，溶解度幾乎沒有觀測到任何變化(表28)。
表28在11-14mg/mL PEG 300/HP-β-CD溶液中M4N的穩(wěn)定性 含11-14mg/mL M4N的測試樣品在室溫孵育24hr后仍然穩(wěn)定，其中M4N配成25％PEG 300和30％HP-β-CD的最終濃度。
實施例18 40mg/mL M4N/PEG 300的穩(wěn)定性 測量溶解于100％PEG 300中的40mg/mL M4N在30℃、45℃和60℃下孵育達24hr的穩(wěn)定性。40mg/mL的M4N PEG 300備用液在60℃，依照實施例17中描述的方法進行制備。隨后，取出等份試樣，并在適當?shù)臏囟确跤Ｔ谡麄€孵育過程中，樣品以450rpm旋轉(zhuǎn)。試驗全程收集目測觀測結(jié)果和RP-HPLC數(shù)據(jù)。如表29所示，在30℃孵育6hr之后，在40mg/mL M4N/PEG 300配方中觀測到微小結(jié)晶，24hr后出現(xiàn)更多。結(jié)晶的形成與溶解的M4N的損失一致(表30)。由目測觀測結(jié)果和RP-HPLC分析驗證(表29和30)，在45℃和60℃下孵育的40mg/mL M4N/PEG 300樣品在24hr的孵育后保持穩(wěn)定。在任何孵育溫度下，未觀測到雜質(zhì)峰的量或類型的變化。
表29.40mg/mLM4N/PEG 300穩(wěn)定性樣品的目視外觀 表30.40mg/mL M4N/PEG 300穩(wěn)定性樣品RP-HPLC分析 在30℃孵育6hr后，在40mg/mL M4N/PEG 300配方中觀測到微小結(jié)晶。24小時后，觀測到更多結(jié)晶，以及觀測到RP-HPLC分析測定的溶解性M4N的損失＞5％。
如目測觀測結(jié)果和RP-HPLC分析驗證，在45℃和60℃孵育的40mg/mL M4N/PEG 300樣品在孵育24hr后保持穩(wěn)定。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當理解的是，可對上述具體實施例作出變化而不背離本發(fā)明的理念。因此，應(yīng)當理解的是，本發(fā)明并不限于所公開的具體實施例，而旨在覆蓋由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的主旨和范圍之內(nèi)的修改。
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權(quán)利要求
1.一種用于注射入動物的組合物，所述組合物包括活性藥物成分和制藥上可接受的載體，其中所述活性藥物成分包括兒茶酚丁烷，所述載體包括選自由下述物質(zhì)組成的組的增溶劑和賦性劑中的至少一種(a)除二甲亞砜外的水溶性有機溶劑；假如當所述水溶性有機溶劑為丙二醇時，所述丙二醇不含白凡士林、不含黃原膠且不含甘油或甘氨酸中的至少一種，當所述水溶性有機溶劑為聚乙二醇時，所述聚乙二醇在不含抗壞血酸或丁化羥基甲苯下存在，以及當所述聚乙二醇為聚乙二醇400時，所述聚乙二醇400在不含聚乙二醇8000下存在；(b)環(huán)糊精；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑，假如當所述表面活性劑為非離子表面活性劑時，所述非離子表面活性劑在不含黃原膠下存在；(d)改性纖維素；(e)除蓖麻油外的水不溶性脂質(zhì)；以及所述載體(a)-(e)的任意組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物可靜脈注射入動物內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括約0.1mg至約200mg的活性藥物成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括約10mg、約20mg、約25mg、約30mg、約40mg、約50mg、約60mg、約75mg、約100mg或約200mg的活性藥物成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述活性藥物成分存在的濃度為約1mg/mL至約200mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述兒茶酚丁烷存在的濃度為約1mg/mL、約2mg/mL、約2.5mg/mL、約5mg/mL、約10mg/mL、約12.5mg/mL、約15mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約30mg/mL、約40mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約75mg/mL、約100mg/mL、約125mg/mL、約150mg/mL或約175mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述水溶性有機溶劑選自由聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇、苯甲醇和二甲基乙酰胺組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括聚乙二醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述聚乙二醇為PEG300、PEG 400或PEG單月桂酸酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述聚乙二醇存在的濃度為約5％(v/v)至約100％(v/v)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述聚乙二醇為PEG 300。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述PEG 300存在的濃度為約10％(v/v)、約20％(v/v)、約30％(v/v)、約40％(v/v)或約50％(v/v)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述聚乙二醇為PEG 400。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述PEG 400存在的濃度為約10％(v/v)、約20％(v/v)、約30％(v/v)、約40％(v/v)或約50％(v/v)。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述聚乙二醇為PEG 400單月桂酸酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述PEG 400單月桂酸酯存在的濃度為約20％(v/v)至約50％(v/v)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的組合物，其特征在于，所述載體包括未改性的環(huán)糊精或改性的環(huán)糊精。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述改性的環(huán)糊精選自由羥丙基-β-環(huán)糊精和磺丁醚-β-環(huán)糊精組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，改性的環(huán)糊精存在的濃度為約5％(w/v)至約80％(w/v)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，改性的環(huán)糊精存在的濃度為約15％(w/v)、約20％(w/v)、約25％(w/v)、約30％(w/v)、約35％(w/v)、約40(w/v)或約50％(w/v)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括丙二醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括甘油。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括選自由聚山梨醇酯、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯，以及乙撐氧和蓖麻油以35∶1的摩爾比的反應(yīng)產(chǎn)物組成的組的表面活性劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑選自由聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80組成的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑存在的濃度為約5％(v/v)至約100％(v/v)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括改性纖維素。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述改性纖維素選自由乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素和羧甲基纖維素組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述改性纖維素存在的濃度為約0.1％(w/v)至約10％(w/v)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述載體包括水不溶性脂質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述水不溶性脂質(zhì)包括脂肪乳狀液。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述脂肪乳狀液存在的濃度為約10％(w/v)至約30％(w/v)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述脂肪乳狀液存在的濃度為約20％(w/v)。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述水不溶性脂質(zhì)為油。
34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于，所述油為至少一種選自下列物質(zhì)組成的組的油玉米油、橄欖油、薄荷油、大豆油、芝麻油、礦物油和甘油。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述水不溶性脂質(zhì)為酯化的脂肪酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述兒茶酚丁烷具有式I的結(jié)構(gòu)式
其中R1和R2各自獨立地表示-H，低級烷基，低級酰基，亞烴基；或者
-R1O和R2O各自獨立地表示未取代或取代的氨基酸殘基或其鹽；R3，R4，R5，R6，R10，R11，R12和R13各自獨立地表示-H或低級烷基；R7，R8和R9各自獨立地表示-H，-OH，低級烷氧基，低級酰氧基，未取代或取代的氨基酸殘基或其鹽，或者合起來可為亞烴基二氧基的任何兩個相鄰的基團。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述兒茶酚丁烷為NDGA化合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述NDGA化合物具有式II的結(jié)構(gòu)式
其中R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-OH，低級烷氧基，低級酰氧基，或未取代或取代的氨基酸殘基或其藥物上可接受的鹽；以及R18和R19各自獨立地表示-H或低級烷基。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示低級烷氧基。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-OCH3。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示低級酰氧基。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示-O(C＝O)CH3。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示被取代的氨基酸殘基。
44.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示N，N-二甲基-取代的氨基酸殘基。
45.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示被取代的氨基酸殘基的鹽。
46.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示被取代的氨基酸殘基的氯鹽。
47.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17各自獨立地表示被取代的氨基酸殘基或其鹽，所述被取代的氨基酸殘基或鹽為-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+(CH3)2·Cl-。
48.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，R18和R19各自獨立地表示低級烷基。
49.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，R18和R19各自獨立地表示-CH3。
50.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述R14，R15，R16和R17不各同時為-OH。
51.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述NDGA化合物為NDGA的甲基化衍生物。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其特征在于，所述NDGA化合物選自由四-O-甲基NDGA(M4N)，三-O-甲基NDGA(M3N)，二-O-甲基NDGA(M2N)及單-O-甲基NDGA(M1N)組成的組。
53.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述活性藥物成分為四-O-甲基NDGA。
54.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物在室溫或在4℃的穩(wěn)定性大于1天。
55.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物在室溫或在4℃的穩(wěn)定性大于3天。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物在室溫或在4℃的穩(wěn)定性大于7天。
57.一種治療受試者疾病的方法，包括(a)提供權(quán)利要求1所述的組合物；以及(b)通過將所述組合物向受試者注射而將所述組合物進行給藥，其中所述組合物包括有效量的所述活性藥物成分。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述組合物為腸道外地給藥。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述組合物由選自下述途徑組成的組的途徑進行給藥靜脈地、動脈內(nèi)地和腹膜內(nèi)地。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述組合物被靜脈地給藥。
61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為增生疾病。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述增生疾病為癌癥。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述增生疾病為牛皮癬。
64.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為高血壓。
65.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為肥胖。
66.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為糖尿病。
67.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病選自由中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)變性疾病組成的組。
68.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為疼痛。
69.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病選自由阿茲海默氏癥、癡呆、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和帕金森氏癥組成的組。
70.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為中風。
71.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為炎性疾病。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，炎性疾病選自由風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、動脈硬化、慢性阻塞性肺疾病和多發(fā)性硬化組成的組。
73.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病選自由癌變前瘤形成和發(fā)育異常組成的組。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于，所述疾病為上皮內(nèi)瘤變。
75.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述疾病為傳染病。
76.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述傳染病為病毒性傳染病。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述病毒選自由HIV、HTLV、HPV、HSV、HBV、EBV、水痘-帶狀皰疹病毒、腺病毒、細小病毒和JC病毒組成的組。
78.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述組合物以約10mg活性藥物成分每kg受試者體重至約600mg活性藥物成分每kg受試者體重的劑量進行給藥。
79.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述組合物每星期給藥一次或多次。
80.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述組合物每月給藥一次或多次。
81.一種治療疾病的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的組合物及其使用說明。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療疾病的組合物、試劑盒和方法，其中所述組合物含至少一種兒茶酚丁烷，包括NDGA化合物和衍生物，以及制藥上可接受的載體，所述載體可包括增溶劑或賦性劑，其中所述組合物適用于注射入動物內(nèi)。
文檔編號A61K47/10GK101150956SQ200680009982
公開日2008年3月26日 申請日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者羅西奧·亞里杭德雷·洛佩斯, 杰西卡·安德烈婭·洛杜卡·布隆貝格, 梅利莎·克萊爾·羅茲, 喬納森·丹尼爾·赫勒 申請人:埃里莫斯醫(yī)藥品有限公司