專利名稱：?；膅lp-1化合物的制作方法
?；腉LP-l化合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療性肽領(lǐng)域，即涉及新的長效GLP-1化合物。 發(fā)明背景一系列不同方法已經(jīng)用于修飾胰高血糖素樣肽l (GLP-1 )化合物 的結(jié)構(gòu)以便提供體內(nèi)更長的作用持續(xù)時間。W0 96/29342公開了其中親本肽激素已經(jīng)通過在C-端氨基酸殘基 或在N-端氨基酸殘基引入親脂性取代物而修飾的肽激素衍生物。W0 98/08871公開了其中親本肽的至少一個氨基酸殘基連接有親 脂性取代物的GLP- l衍生物。WO 99/43708公開了具有連接至C-端氨基酸殘基的親脂性取代物 的GLP-1 (7-35)和GLP-1 (7-36)衍生物。WO 00/34331^S開了酰化的GLP-1類似物。WO 00/69911公開了用于注射進患者中的活化的促胰島素肽，據(jù) 認為在患者中它們與血液成分反應形成綴合物，從而據(jù)說提供體內(nèi)更 長的作用持續(xù)時間。WO 02/46227公開了融合至人血清白蛋白以便延長體內(nèi)半衰期的 GLP-l和毒蜥外泌肽-4類似物。許多糖尿病患者尤其是2型糖尿病患者患有所謂的"針-恐怖癥"， 即十分恐懼他們自己注射。在2型糖尿病患者中，多數(shù)患者使用口服 降血糖藥治療，并且自從期望GLP-1化合物是這些患者將施用的首選注 射產(chǎn)品，對注射的恐懼可能會成為廣泛使用這種臨床上非常有希望的 GLP-1化合物的嚴重障礙。因此，需要開發(fā)能夠每天施用少于一次， 例如每兩天或每三天一次優(yōu)選為每周一次，同時保持可接受的臨床特 性的新的GLP-l化合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了相對于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1 )在位置 7和/或8具有至少一個非-蛋白質(zhì)源性(non-proteogenic )氨基酸殘基 修飾的GLP-1類似物，其在位置26的賴氨酸殘基處用一個部分酰化，并 且其中所述的部分包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團在末端 連接。本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物組合物，以及提供 了根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備治療疾病的藥物的用途。本發(fā)明提供了用于增加GLP-1類似物在患者中的作用時間的方 法，其特征在于在所述GLP-1類似物的位置26的賴氨酸殘基上，用如在 任意先前的權(quán)利要求中公開的B-U，部分?；龅腉LP-1類似物。發(fā)明描述在本說明書中，下列術(shù)語具有指定的含義 如此處使用的，術(shù)語"多肽"和"肽"表示由至少5個通過肽 鍵連接的組成氨基酸組成的化合物。組成氨基酸可以來自由遺傳密碼 編碼的氨基酸并且它們可以是不通過遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以 及合成的氨基酸。不通過遺傳密碼編碼的天然氨基酸是例如Y _羧基 谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸 包括通過化學合成產(chǎn)生的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異 構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氡酸、Aib ( cc-氨基異丁酸)、Abu ( a- 氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘氨酸)、P-丙氨酸、3-氨曱基苯曱酸、 鄰氨基苯曱酸。22種蛋白質(zhì)源性氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷 氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 賴氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、 酪氨酸、纈氨酸。因此，非蛋白質(zhì)源性氨基酸是可以通過肽鍵整合進肽的部分，但 不是蛋白質(zhì)源性氨基酸。實例是Y-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨 酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非蛋白質(zhì)源性氨基 酸包括通過化學合成產(chǎn)生的氨基酸，即通過遺傳密碼編碼的氨基酸的 D-異構(gòu)體例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib( a-氨基異丁酸)、Abu( a -氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘氨酸)、3-氨甲基苯甲酸、鄰氨基苯甲 酸、脫氨基-組氨酸、氨基酸的P類似物例如p-丙氨酸等、D-組氨酸、 脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、p-幾基-組氨酸、高組氨酸 (homohistidine) 、 N"-乙酰基-組氨酸、oc-氟甲基-組氨酸、a-甲基 -組氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸、(l-氨基環(huán) 丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；如此處使用的，涉及多肽的術(shù)語"類似物，，表示經(jīng)修飾的肽，其 中所述肽的一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)由其它氨基酸殘基取代和/或 其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)從肽中刪減和/或其中一個或多個氨 基酸殘基已經(jīng)從肽中刪減和或其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)加入至 肽中。這種氨基酸殘基的加入或缺失可以在肽的N-端和/或肽的C-端發(fā)生。通常用 一 個簡單的系統(tǒng)來描述類似物 例如 [Arg"]GLP-l(7-37)Lys指其中在位置34天然存在的賴氨酸已經(jīng)由精 氨酸取代并且其中一個賴氨酸已經(jīng)加入至末端氨基酸殘基，即加至 Gly"的GLP-1 (7-37)類似物。旋光異構(gòu)體未說明的所有氨基酸應 該理解為表示L-異構(gòu)體。在本發(fā)明的實施方案中，最多17個氨基酸
已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多15個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多io個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多8個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實 施方案中，最多7個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中， 最多6個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多5個氨 基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多4個氨基酸已經(jīng)受 到修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最多3個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在 本發(fā)明的實施方案中，最多2個氨基酸已經(jīng)受到修飾。在本發(fā)明的實 施方案中，l個氨基酸受到修飾。如此處使用的，有關(guān)肽的術(shù)語"衍生物，，表示經(jīng)化學修飾的肽或 其類似物，其中至少一個取代基不存在于未經(jīng)修飾的肽或其類似物中， 即表示已經(jīng)經(jīng)共價修飾的肽。典型的修飾是酰胺、糖類、烷基、?；?、 酯等。GLP-1(7-37)衍生物的實例是Ns"- ( (4S) -4-(十六烷?；?氨基)-羧基-丁?；?[Arg"， Lys"]GLP-1-(7-37)。如此處使用的，術(shù)語"GLP-1肽，，表示GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1)、 GLP-1(7-37)類似物、GLP-1 (7-37)衍生物或GLP-1 (7-37)類似 物的衍生物。在一個實施方案中，GLP-1肽是促胰島素劑。如此處使用的，術(shù)語"促胰島素劑，，表示是人GLP-1受體激動劑 的化合物，即刺激cAMP在含有人GLP-1受體的合適培養(yǎng)基(在下文中 公開一種這樣的培養(yǎng)基)中形成的化合物。促胰島素劑的效力通過從 如下面描述的劑量-反應曲線計算ECs。值測定。將表達克隆的人GLP-1受體的幼倉鼠腎(BHK)細胞(BHK-467-12A)在加入IOO IU/mL青霉素、100 jug/mL鏈霉素、5 %胎牛血 清、0. 5 mg/mL遺傳霉素G-418 (Life Technologies)的DMEM培養(yǎng)基 中生長。在磷酸鹽緩沖液中洗滌細胞兩次并用Versene收獲。在緩 沖液1 ( 20 raM HEPES-Na， lOmMEDTA， pH7. 4)中通過用Ultraturrax 均化從細胞制備質(zhì)膜。在4 。C下以48，00Q x g離心勾漿15分鐘。 通過均化使沉淀物懸浮于緩沖液2 (20 mM HEPES-Na， 0.1 mM EDTA， pH 7.4)中，隨后在4 。C下以48, 000 x g離心15分鐘。再次重復洗 滌步驟。將最終的沉淀物懸浮于緩沖液2中并直接用于檢測或在-80 'C下儲存。功能性受體測定法通過測量作為對促胰島素劑刺激的反應的環(huán) 磷腺苷(cAMP)來完成。形成的cAMP通過AlphaScreenTM cAMP Kit(Perkin Elmer Life Sciences)定量。孵育在半?yún)^(qū)(half-area) 96-孔微量滴定板中在50 juL總體積的緩沖液3 ( 50mMTris-HCl， 5 mM HEPES， 10 mM MgCl" pH 7.4)中完成并加入1 mM ATP、 1 jaM GTP、 0. 5 mM 3-異丁基-l-甲基黃噪呤(IBMX ) 、 0. 01 %吐溫20、 0. 1 % BSA、 6 pg膜制備物、15 iagAnL受體微珠、用6 nM生物素基-cAMP預孵育 的20 ^g/mL供體微珠。將要檢測激動劑活性的化合物溶解并稀釋于 緩沖液3中。對每個試驗新鮮制備GTP。將平板在室溫下于黑暗中緩 慢攪動孵育3小時，隨后將其在FusionTM儀(Perkin Elmer Life Sciences)中計數(shù)。使用Prism v. 4. 0用4參數(shù)logistic模型(GraphPad, Carlsbad, CA )繪制每種化合物的濃度-反應曲線并估計 ECs。值。如此處使用的，涉及多肽的術(shù)語"DPP-IV保護"指這樣一種多 肽，該多肽已經(jīng)經(jīng)化學修飾以便使所述化合物能夠抗血漿肽酶二肽氨 基肽酶-4 (DPP-IV)。 已知血漿中的DPP-IV酶參與多種肽激素如 GLP-1、 GLP-2、毒蜥外泌肽-4等的降解。因此，正在做出相當大的努 力來開發(fā)易受DPP-IV介導的水解作用影響的多肽的類似物和衍生物 以便減小DPP-IV降解速率。在一個實施方案中，DPP-IV保護的肽比 GLP-1 (7-37)或毒蜥外泌肽-4 (1-39)更能抗DPP-IV。肽對二肽氨基肽酶IV降解的抗性可通過下面的降解測定法測定 在37 。C下于100 nL、 0. 1 M pH 7. 4的三乙胺-HCl緩沖液中，將 肽的等分樣品(5 nmol)用相當于5 mU酶活性的l jnL純化的二肽氨基 肽酶IV孵育10-180分鐘。通過加入5 pLlO %的三氟乙酸終止酶促反 應，并使用HPLC分析法分離和定量肽降解產(chǎn)物。用于實施該分析的一 種方法是 根據(jù)Siegel等Regul.Pept. 1999 ; 79: 93-102和 Mentlein等.Eur. J. Biochem. 1993; 214: 829-35,將混合物上樣
至Vydac C18 widepore (30 nm小孑L， 5拜微粒)250 x 4. 6 mm柱并 使用O. 1 %三氟乙酸中的乙腈線性階式梯度(0 %的乙腈3分鐘，0-24 % 的乙腈17分鐘，24-48 %的乙腈1分鐘)以l ml/分鐘的流速將其洗脫。 肽和它們的降解產(chǎn)物可通過它們在220 nm (肽鍵)或280 nm (芳香族 氨基酸)處的吸光度監(jiān)控，并通過它們相對于標準品的峰面積積分來 定量。在引起少于IO %的肽受到水解的孵育時間下估計二肽氨基肽酶 IV水解肽的速率。如此處使用的術(shù)語"Cw-烷基"指具有1-6個碳原子的飽和的、 分支的、直鏈或環(huán)烴基團。代表性實例包括，但不限于甲基、乙基、 正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、 新戊基、叔戊基、正己基、異己基、環(huán)己烷等。如此處使用的，術(shù)語"可藥用"指適合于正常的藥學應用，即在 患者中未產(chǎn)生有害事件等。如此處使用的，術(shù)語"賦形劑"指通常加入至藥物組合物的化合 物，例如緩沖劑、張度劑(tonicity agent)、防腐劑等。如此處使用的，術(shù)語"有效量"指與不治療相比對患者的治療足 夠有效的劑量。如此處使用的，術(shù)語"藥物組合物"指包含活性化合物或其鹽加 之藥物賦形劑(如緩沖劑、防腐劑和任選張度調(diào)節(jié)劑和/或穩(wěn)定劑)的 產(chǎn)品。因而，藥物組合物在本領(lǐng)域也稱為藥物制劑。如此處使用的，術(shù)語"疾病的治療"指治療和看護已經(jīng)患有疾病、 病癥或障礙的患者。治療目的是對抗疾病、病癥或障礙。治療包括 施用活性化合物以消除或控制疾病、病癥或障礙以及減輕與疾病、病 癥或障礙相關(guān)的癥狀或并發(fā)癥。在另一方面，本發(fā)明涉及同時結(jié)合白蛋白和GLP-1受體的酰化的 GLP-1類似物。
在另一方面，本發(fā)明涉及?；腉LP-1類似物，當存在非常低的 濃度(例如0. 005 %至0.2 %)的人白蛋白時的親和力與存在2 %的人 白蛋白時的親和力比較時，所述GLP-1類似物對GLP-1受體的親和力 只是部分地減小。在這些條件下親和力的改變小于50倍，優(yōu)選小于 30倍并更優(yōu)選小于10倍。如此處使用的，術(shù)語"白蛋白結(jié)合部分"表示非共價結(jié)合人血清 白蛋白的殘基。連接至治療性多肽的白蛋白結(jié)合殘基通常具有對人血 清白蛋白低于10 ^M的親和力并且優(yōu)選低于1 pM。 在末端具有酸性 基團的含有4-40個碳原子的直鏈和支鏈親脂性部分中已知了一系列 的白蛋白結(jié)合殘基。如此處使用的，術(shù)語"親水性連接物"表示分開肽和白蛋白結(jié)合 殘基的間隔物，所述的間隔物具有包含至少5個非氫原子且其中3 0-5 0 %的這些非氫原子是N或0的化學部分。如此處使用的，術(shù)語"酸性基團"表示在生理pH下完全或部分帶 負電荷的有機化學基團。這種基團的pKa值小于7，優(yōu)選小于5。這 包括但不限于羧酸、磺酸、磷酸或在生理學pH時完全或部分帶負電荷 的雜環(huán)體系。在下面的結(jié)構(gòu)式II中，U部分是可以以兩種不同方式連接末端基團B和肽中的賴氨酸的氨基的雙基(di-radical )。在本發(fā)明的實施方案中，式II中的U與烷基鏈一端的基團B和另一端的肽連接。在下面的式中，連接基團的端鍵應該認為是連接鍵并且不以亞甲基結(jié)尾，除非另外說明。在下面的式中、c CH3表示01^-1類似物的11^-^8-人^- N-端。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用含有至少兩個游離的酸性化
學基團的親脂性白蛋白結(jié)合部分?；腉LP-1類似物，所述的白蛋白結(jié) 合部分通過非天然的氨基酸連接物連接至位置26的賴氨酸殘基。在一個實施方案中，術(shù)語"游離的酸性化學基團"將理解為具有 與此處使用的"酸性基團"相同的含義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了酰化的GLP-l類似物，其中所 述的GLP-1類似物通過修飾相對于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的 位置7和8中的至少一個氨基酸殘基而對DPP-IV是穩(wěn)定的，并且其中所 述的?；溉芜x通過非天然氨基酸親水性連接物連接至位置26的賴氨 酸殘基上的二酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-1類似物在相對于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1)的位置7和/或8上具有至少一個非蛋白源性 氨基酸殘基的修飾，其在位置26的賴氨酸殘基處用一個部分酰化，并 且其中所述的部分包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團在末端 連接。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中在 位置26處連接的部分含有親水性連接物。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中親 水性連接物包含至少5個非氫原子，其中30-50 。/。的這些非氬原子是N 或0。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中在位置26處連接的部分含有通過親水性連接物與肽隔開的白蛋白 結(jié)合部分。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中白蛋 白結(jié)合部分是具有末端酸性基團的含有4-40個;f友原子的直鏈或支鏈親 脂性部分。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其中 ?；糠质荁-U，，其中U，選自<formula>formula see original document page 23</formula>m是0、1、 2、 3、 4、 5 & 6，n是1、2或3s是0、1、 2或3，t是0、1、 2、 3或4P是1、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、18、19、20、 21、 22或23;12、 13、 14、 15、 16.并且其中B是選自下列的酸性基團<formula>formula see original document page 23</formula>
其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20; 一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 是式I化合物(SEQ ID No. 2):Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-
o
H 11
Xaa^-Ala-Xaa^N^lJ~O(aa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
式i
其中
Xaa 是L-組氨酸、咪喳并丙?；?imidazopropionyl ) 、 a-鞋基-組
氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、p-羥基-組氨酸、
高組氨酸、Na-乙?；?組氨酸、fT-甲?；?組氨酸、ot-氟曱基-組氨
酸、a-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸；
Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Thr、 Ser、 Lys、 Aib、 (l一氨基環(huán)
丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(l-氨
基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；
Xaai6是Val或Leu;
Xaai8是Ser、 Lys或Arg;
Xaai9是Tyr或Glir,
Xaa20是Leu或Met;
Xaa"是Gly、 Glu或Aib;
Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg;
Xaa"是Ala或Val;
Xaa27是Leu或Gluj
Xaa3o是Ala、 Glu或Arg;
Xaa33是Val或Lys;
Xaa"是Lys、 Glu、 Asn或Arg;
Xaa"是Gly或Aibj
Xaa〗6是Arg、 Gly或Lys， 或缺失；
Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失；
并且B和U， 一起是?；糠?，其中U，選自O、N' H、MoM 、NT H、0一O0、vOH、NT H 0o-N0。 C)、。^VoOH1、 2、 3、 4、 5或6， 2或3 1、 2或3，1、 2、 3或42、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、m是0、 n是1、 s是0、 t是0、 P是1、17、 18、 19、 20、 21、 22或23;12、 13、 14、 15、 16.并且其中B是選自下列的酸性基團其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20;在一個實施方案中，本發(fā)明提供了是式II化合物(SEQ IDNo. 3) 的化合物<formula>formula see original document page 26</formula>式ii式II與如上面實施方案中說明的式I 一樣，其中B-U部分代替了 B-U，。 不同的只是，相對于U, U，整合有羧基，而U沒有連接的羧 基。在式II中，每個Xaa，具有下列含義 Xaa,是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、P-羥 基-組氨酸、高組氨酸、Na-乙酰基-組氨酸、a-氟甲基-組氨酸、ot-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸； Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys、 Aib、 (l-氨基環(huán)丙基)羧酸、 (l-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(l-氨基環(huán)己基)羧 酸、(l-氨基環(huán)庚基)羧酸或(l-氨基環(huán)辛基)羧酸； Xaai6是Val或Leu; Xaa)8是Ser、 Lys或Argj Xaa"是Tyr或Gln; Xaa20是Leu或Met; Xaau是Gly、 Glu或Aib; Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg; Xaa25是Ala或Val; Xaa27是Leu或Glu'， Xaa3。是Ala、 Glu或Arg; Xaa"是Val或Lysj Xaa34是Lys、 Glu、 Asn或Arg;Xaa35是Gly或Aib; Xaa〗6是Arg、 Gly或Lys，或缺失； Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失； XaaM是Lys、 Ser、酰胺或缺失； 并且其中U是間隔物，其選自<formula>formula see original document page 27</formula>其中n是12、 13、 14、 15、 16、 17或18 1是12、 13、 14、 15、 16、 17或18， m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6， s是0、 1、 2或3，p是3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是選自下列的酸性基團<formula>formula see original document page 27</formula> 和 <formula>formula see original document page 27</formula>在下面的實施方案中，當涉及式I中的U，時，也應該理解為也 指式II和U，唯一的不同是羧基。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中U，<formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula>m是2、 3、 4或5，n是1或2;s是0、 1或2，t是0、 1、 2或3p是1、 2、 3、 4、 7、 11或23一個實施方案提供了根據(jù)上迷實施方案的GLP-l類似物，其中 B-U，-是其中1是14、 15、 16、 17、 18、 19或20; p是1、 2、 3、 4、 7、 8、 9、 10、 11或12。 s是0、 1或2， t是0或1;根據(jù)上述的實施方案，其中 其中1是14、 15、 16、 17或18 p是1、 2、 3、 4或11; s是0、 1或2; t是0或1;一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物 B-U，是其中<formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula>h o其中1是14、 15、 16、 p是1、 2、 3或4。 s是0、 1或2, n是0、 1或2<formula>formula see original document page 30</formula>
根據(jù)上述任意實施方案的實施方案是其中B是<formula>formula see original document page 30</formula>并且1是14、 16、 18或20;一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-l類似物，其 中B是并且1是14、 15或16。
一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中s是l。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中n是1。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中1是14、 15或16;在實施方案中，1是17、 18、 19或20。在實施 方案中，1是15、 16或17。在實施方案中，1是18、 19或20。在實 施方案中1是14。在實施方案中1是16。在實施方案中1是18。在 實施方案中1是20。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中P是l。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中P是2。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中P是3。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中P是4。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中B-U， 是<formula>formula see original document page 31</formula>
一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中B-U' 是一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中B-U' 是一個實施方案提供了根據(jù)上述式I的GLP-1類似物，其中 Xaa7是His或脫氨基-組氨酸； Xaa^是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys或Aibj Xaai6是Val; Xaau是Ser; Xaai9是Tyrj Xaa2o是Leu;Xaa22是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln或Glu;Xaa25是AlajXaa27是Glu5Xaa3。是Ala或Glu;Xaa33是Val;Xaa"是Lys或Arg;Xaa"是Gly或Aib5:化! Xaa36是Arg或Lys5 Xaaw是Gly、酰胺或缺失；一個實施方案提供了根據(jù)上述式I的GLP-1類似物，其中Xaa7是HisXaas是Gly或Aib;Xaa6是Val;Xaa"是Ser;Xaai9是TyrjXaa20是Leu;Xaa22是Glu或Aib'，Xaa23是Gln;Xaa25是Ala5Xaa27是Glu;Xaa3。是Ala;Xaa33是Val;Xaa34是Lys或Arg;Xaa"是Gly或Aib;Xaa^是ArgXaa〗7是Gly一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的GLP-1類似 物，其中GLP-l類似物在GLP-1(7-37)序列位置7的N-端L-組氨酸包含 修飾。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中所 述的GLP-1類似物包括咪唑并丙?；?、 a-羥基-組氨酸'或N-曱基-組氨 酸7、 D-組氨酸7、脫氨基-組氨酸7、 2-氨基-組氨酸7、 p-羥基-組氨酸 -組氨酸7、 ot-氟甲基-組氨酸7、 a-甲基-組 氨酸7、 3-吡啶丙氨酸7、 2-吡啶丙氨酸7或4_吡啶丙氨酸7。一個實施方案提供了根據(jù)上迷實施方案任意之一的GLP-1類似 物，其中所述的GLP-1類似物包含用另 一個氨基酸殘基對GLP-1 (7-37) 序列位置8的L-丙氨酸的取代。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中所 述的GLP-l類似物包含Aib8、 Gly8、 Val8、 Ile8、 Leu8、 Ser8、 Thr8、 (1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(l-氨基環(huán)己基)羧酸、(l-氨基環(huán)庚基)羧酸或(l-氨基環(huán)辛基)羧酸。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-l類似物，其 中所述的GLP-l類似物包含Ait)8;在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GLP-1類似物是 Aib8， Arg34-GLP-1 (7-37)或Aib8,22, Arg"-GLP-1 (7-37)。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中所述的GLP-1類似物與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比較包含不超 過15個已被交換、加入或缺失的氨基酸殘基。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中與 GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比較有不超過10個已被交換、加入或 缺失的氨基酸殘基。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的GLP-1類似物，其中所 述的GLP-1類似物與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比較包含不超過6 個已被交換、加入或缺失的氨基酸殘基。
一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-1類似物，其 中所述的GLP-1類似物包含不超過3個不是由遺傳密碼編碼的氨基酸 殘基。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-l類似物，其 中所述的GLP-l類似物僅包含一個賴氨酸殘基。一個實施方案提供了根據(jù)上述任意實施方案的GLP-l類似物，其為Aib8， Arg34-GLP-1 (7-37) Aib8'22, Arg34-GLP-1 (7-37)。 Arg34-GLP-1 (7-37)。[3- (4-咪唑基)丙?；?， Arg34] GLP-l- (7-37)肽Gly8, Arg34-GLP-1 (7-37)Aib8，Arg34，Pro37-GLP-l(7-37)Aib8'22'27'3°'35， Arg34， Pro"-GLP-l(7-37)酰胺，它們都在位置26由B-U，取代。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的GLP-1類似 物，其選自N-s26- (17-羧基十七烷?；?-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37)-肽,N-s26- (19-羧基十九烷?；?-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37) -肽，,-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA——^EF I AA/LVRGRG-c畫
N-s26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰基)氨基]甲基}苯 曱酰)[Arg34]GLP—1-(7-37)，—車h3c ch3， 。義N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰基氨基)-4 (S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽，<formula>formula see original document page 36</formula>H O-H A EGTFTSDVSSYLEGQA A-N^~E FIAWLVRG R G-圃O Q 0NHSDVSSYLEGQA A—N、HOO O 'O一個實施方案提供了用于增加GLP-1類似物在患者中的作用時間 的方法，其特征在于在所述GLP-1類似物的位置26處的賴氨酸殘基上， 用如在上述任意實施方案中公開的B-U部分?；龅腉LP-l類似物。 一個實施方案提供了用于增加GLP-1類似物在患者中的作用時間 達到多于約40個小時的方法，其特征在于修飾GLP-1 (7-37)肽或其類似 物位置7和8處的至少一個氨基酸殘基，并且在所述GLP-l類似物位置26 處的賴氨酸殘基上，用如上述任意實施方案中公開的B-U，-部分?；?所述GLP-1類似物。一個實施方案提供了藥物組合物，所述的藥物組合物包含根據(jù)上 述實施方案任意之一的化合物和可藥用賦形劑。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案的藥物組合物，其適合腸 胃外施用。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合物的用 途，用于制備藥物。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合物用于制 備藥物的用途，所述的藥物用于治療或預防高血糖癥、2型糖尿病、 葡萄糖耐量降低、l型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙 (dyslipidemia)、認知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和 其它心血管疾病、中風、炎性腸綜合征(inflammatory bowel syndrome)、消化不良和胃潰瘍。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合物的用 途，用于制備用于延緩或預防2型糖尿病的疾病發(fā)展的藥物。一個實施方案提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合物的用 途，用于制備用于降低食物攝取、降低P-細胞凋亡、增加p-細胞功 能和P _細胞量和/或恢復P -細胞的葡萄糖敏感性的藥物。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案的化合物，其中所述的GLP-1類似物是連接至連接物B-U ， 的 Aib8， Arg"-GLP-1 (7-37)或Aib822， Arg"-GLP-1 (7-37);在式II的一個實施方案中，B-U表示<formula>formula see original document page 39</formula>或在實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合 物，其中所述的二酸包括二羧酸。在實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案任意之一的化合物，其中?；鶊F包括直鏈或支鏈的烷烴a， (o-二羧酸。在實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案的化合物，其中 ?；鶊F包含結(jié)構(gòu)H00C-(CH丄C0-,其中n是12-20。在實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案的化合物，其 中?；鶊F包含選自H00C-(CH2) 14C0- 、 HOOC-(CH2)15CO-、 H00C- (CH2) 16C0-、 H00C- (CH2) 17C0-和HOOC- (CH2) 1800-的結(jié)構(gòu)。 在實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案的化合物，其中?；鶊F包含結(jié)構(gòu)H00C- (CH2) 16C0-。本發(fā)明的另 一 目標是提供含有根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥物制劑， 所述的化合物以0. 1 mg/ml至25 mg/ml的濃度存在，并且其中所述的 制劑具有3. O至9. 0的pH。該制劑可進一步包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、 張度劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中， 藥物制劑是含水制劑，即包含水的制劑。這種制劑通常是溶液或懸液。 在本發(fā)明的進一步實施方案中，該藥物制劑是含水溶液。術(shù)語"含水 制劑"定義為含有至少5 0 % w/w水的制劑。同樣，術(shù)語"含水溶液" 定義為含有至少50。/。w/w水的溶液，并且術(shù)語"含水懸液，，定義為含 有至少50 % w/w水的懸液。在另一個實施方案中，藥物制劑是一種凍千制劑，在使用前醫(yī)師 或患者加入溶劑和/或稀釋液至其中。在另一個實施方案中，藥物制劑是不需任何預先溶解的即用型干 燥制劑(例如冰冷干燥或噴霧千燥)。在另 一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的化合物的含水溶液以 及緩沖劑的藥物制劑，其中所述的化合物以0.1 mg/ml或0.1 mg/ml 以上的濃度存在，并且其中所述的制劑pH為約3. 0至約9. 0。在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑的pH為約7. O至約9.5。在 本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑的pH為約3. 0至約7. 0。 在本發(fā) 明的另一個實施方案中，制劑的pH為約5. 0至約7. 5。 在本發(fā)明的 另一個實施方案中，制劑的pH為約7. 5至約9. 0。 在本發(fā)明的另一 個實施方案中，制劑的pH為約7. 5至約8. 5。 在本發(fā)明的另一個實 施方案中，制劑的pH為約6. 0至約7. 5。 在本發(fā)明的另一個實施方 案中，制劑的pH為約6. 0至約7. 0。 在另一個實施方案中，藥物制 劑為8. 0至8. 5。在本發(fā)明的進一步實施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸 檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基曱烷、N-二(羥乙基) 甘氨酸、N-(羥曱基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富 馬酸、酒石酸、天門冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖劑的每一種構(gòu) 成本發(fā)明的一個備選實施方案。在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含可藥用防腐劑。 在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑選自苯酚、鄰曱酚、間甲酚、 對甲酚、對幾基苯甲酸甲酯、對羥基苯曱酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥 基苯曱酸丁酯、2-苯基乙醇、千醇、氯丁醇和硫柳汞(thiomerosal )、 溴硝丙二醇、苯曱酸、咪脲、氯己啶、脫氫醋酸鈉、氯曱酚、對羥苯 曱酸乙酯、千索氯銨、氯苯甘醚(3對-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或 其混合物。在一個實施方案中，防腐劑是苯酚或間曱酚。在本發(fā)明 的進一步實施方案中，防腐劑以O. 1 mg/ml至20 mg/ml的濃度存在。 在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以O. 1 mg/ral至5 mg/ml的濃 度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以5 mg/ml至10 mg/ml 的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以10 mg/ml至 20 mg/ml的濃度存在。這些特定防腐劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一 個備選實施方案。防腐劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。 為方便起見，可參考 Remington: r力e 5We/zce a/7d戶rac〃ce 19th edition, 1995。在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含等滲劑。在本發(fā) 明的進一步實施方案中，等滲劑選自鹽(如氯化鈉)、糖或糖醇、氨 基酸(如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天門冬 氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙 二醇)、1，3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(如PEG400 )或其混合 物。在一個實施方案中，等滲劑是丙二醇?？梢允褂萌魏翁抢鐔翁?、 二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、 山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支鏈淀粉、 糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧曱基纖維素鈉。在一個實施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的 C4-C8碳氫化合物并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi) 矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露 醇。上面提及的糖或糖醇可以獨立地或組合使用。使用劑量無限制， 只要糖或糖醇可溶解于液體制劑并且對使用本發(fā)明方法達到的穩(wěn)定效 應無不利影響。在一個實施方案中，糖或糖醇的濃度在約1 mg/ml 和約150 mg/ml之間。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑以1 mg/ml至50 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等 滲劑以1 mg/ml至7 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的實施方案中，等 滲劑以5mg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案 中，等滲劑以8 mg/ml至24 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步 實施方案中，等滲劑以25mg/ml至50rag/ml的濃度存在。這些特定 等滲劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個備選實施方案。等滲劑在藥物組 合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考Remington: 7T e 5We"ce尸rac〃ce o尸尸力ar則c7， 19th edition, 1995。在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含螯合劑。在本 發(fā)明的進一步實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬 酸和天門冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，螯 合劑以0. lmg/ml至5 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方 案中，螯合劑以0. lmg/ml至2 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一 步實施方案中，螯合劑以2mg/ral至5mg/ml的濃度存在。這些特定 的螯合劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個備選實施方案。螯合劑在藥物 組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考 Remington: r力e 5We/7ce a/2f/ /Va"/ce o尸戶力sr/z/ac/， 19th edition, 1995。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑 在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考Remington: r力e 5We/zce a/2^Z戶rac〃ce o/戶力ar則cy， 19th edition, 1995。更特別地，本發(fā)明組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，該液體藥物 組合物的治療活性成分包括在液體藥物制劑存儲過程中可能會顯示出 聚集體形成的多肽。"聚集體形成，，旨在指導致寡聚物形成的多肽分 子之間的物理相互作用，所述的寡聚物可保持可溶，或者是從溶液中 沉淀出的大的可見聚集體。"在存儲過程中"意指已經(jīng)制備的、未立 即施用給受試者的液體藥物組合物或制劑。而且，在制備后，將其以 液體形式、冰凍狀態(tài)或干燥形式包裝存儲用于隨后將其重構(gòu)為適合施 用于受試者的液體形式或其它形式。"干燥形式"意指液體藥物組合 物或制劑通過冷凍干燥(即，凍干法；見例如Williams和Polli( 1984 ) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59 )、噴霧干燥(見Masters (1991) Spray-Drying Handbook ( 5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K. ) , pp. 491-676; Broadhead等(1992 ) Drug Devel. Ind. Pharra. 18: 1169-1206;和M畫nthaler等(1994 ) Pharm. Res. 11: 12-20)或風干(Carpenter和Crowe ( 1988 ) Cryobiology 25: 459-470;和Roser (1991年)Biopharm. 4: 47-53 ) 而干燥。在液體藥物組合物存儲過程中多肽的聚集體形成可能會不利 地影響所述多肽的生物活性，導致藥物組合物的治療效果喪失。而且， 當釆用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時，聚集體形成可引起其 它問題例如輸液管、膜或泵阻塞。本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包含足夠用來減少在組合物存儲 過程中多肽聚集體形成的量的氨基酸堿。"氨基酸堿"意指氨基酸或 氨基酸組合，其中任何給定氨基酸是以其游離堿形式或其鹽形式存在。 如果使用氨基酸的組合，所有的氨基酸可以以它們的游離堿形式存在， 全部可以以它們的鹽形式存在，或者一些可以以它們的游離堿形式存 在而其它以它們的鹽形式存在。在一個實施方案中，制備本發(fā)明組合 物中使用的氨基酸是那些具有攜帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、 賴氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(如曱硫氨酸、組氨酸、 咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、 D或其混合物)或這些立體異構(gòu)體 的組合可存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要該特定氨基酸以其游離 堿形式或其鹽形式存在。在一個實施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本 發(fā)明組合物也可以使用這些氨基酸的類似物制備。 "氨基酸類似物" 意指天然存在的氨基酸的衍生物，所述的氨基酸衍生物引起減少在本 發(fā)明液體藥物組合物存儲過程中的多肽聚集體形成的期望效果。合適 的精氨酸類似物包括，例如氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合 適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine),以及 合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸一 樣，氨基酸類似物以它們的游離堿形式或它們的鹽形式整合進組合物。 在本發(fā)明的進一步實施方案中，氨基酸或氨基酸類似物以足以防止或 延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用。在本發(fā)明的進一步實施方案中，當作為治療劑的多肽包含至少一 種易于氧化的曱硫氨酸殘基時，可以加入曱硫氨酸(或其它含硫的氨制"意指隨著時間的過去曱硫氨酸氧化種類的最小限度的積聚。抑制 甲硫氨酸氧化導致多肽更多地保持以其正常的分子形式存在。可以使 用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(L或D)或其組合。加入的量應該是 足以抑制曱硫氨酸殘基氧化的量，這樣甲硫氨酸亞砜的量對管理機構(gòu) 是可接受的。通常，這意味著該組合物包含不多于約10 %-約30 % 的曱硫氨酸亞砜。通常，這可以通過加入甲石克氨酸而使得加入的曱硫 氨酸與甲硫氨酸殘基的比率為約1: 1-約1000: 1,例如10: 1-約100: 1來實現(xiàn)。在本發(fā)明的進一步實施方案中，所述的制劑進一步包含選自高分 子量聚合物或低分子量化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的進一步實施方案 中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(如PEG 3350 )、聚乙烯醇(PVA)、聚乙
烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(如HPC、 HPC-SL、 HPC-L 和HPMC)、環(huán)糊精、含硫的物質(zhì)如單硫代甘油(monothioglycerol )、 巰基乙酸和2-曱疏基乙醇以及不同的鹽(例如氯化鈉)。這些特定 穩(wěn)定劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個備選實施方案。藥物組合物還可以包含額外的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑進一步增強其中 的治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別重要的穩(wěn)定劑包括(但不限于) 使多肽免于曱硫氨酸氧化的曱硫氨酸和EDTA，以及使多肽免于與凍融 或機械剪切力相關(guān)的聚集的非離子型表面活性劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含表面活性劑。在 本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的藥物組合物包含兩種不同的表面 活性劑。如此處使用的，術(shù)語"表面活性劑"指由水溶性(親水性) 部分(頭部)和脂溶性(親脂性)部分組成的任何分子或離子。表面 活性劑優(yōu)選在界面處積聚，其親水性部分朝向水(親水相)而親脂部 分朝向油-或疏水相(即玻璃、空氣、油等)。表面活性劑開始形成 膠束時的濃度稱為臨界膠束濃度或CMC。 此外，表面活性劑降低了液 體的表面張力。表面活性劑也稱為兩親化合物。術(shù)語"去垢劑"通 常是表面活性劑的同義詞。陰離子表面活性劑可以選自鵝去氧膽酸、鵝去氧膽酸鈉鹽、膽 酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、脫氧膽酸甲酯、洋地黃皂甙、毛地黃毒苷 配基、N， N-二曱基十二烷胺N-氧化物、多庫酯鈉、甘氨鵝去氧膽酸 鈉、甘氨膽酸水合物、甘氨脫氧膽酸一水合物、甘氨脫氧膽酸鈉鹽、 甘氨脫氧膽酸鈉鹽、葡糖石膽酸3-硫酸二鈉鹽、葡糖石膽酸乙酯、N-十二烷酰肌氨酸鈉鹽、N-十二烷酰肌氨酸鈉鹽、N-十二烷酰肌氨酸、 N-十二烷酰肌氨酸、十二烷基硫酸鋰、Lugol、 1-辛烷磺酸鈉鹽、1-辛烷磺酸鈉鹽、1-丁烷磺酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、1-十二烷磺酸鈉、l-庚烷磺酸鈉、1-庚烷磺酸鈉、1-壬烷磺酸鈉、1-丙烷磺酸鈉一水合物、 2-溴乙烷磺酸鈉、膽酸鈉水合物、?；蜓蚰懼?、膽酸鈉水合物、絡膽 酸鈉鹽、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、己烷磺酸 鈉、辛基硫酸鈉、戊烷磺酸鈉、?；悄懰徕c、牛磺鵝去氧膽酸鈉鹽、?；敲撗跄懰徕c鹽一水合物、?；鞘懰?-硫酸二鈉鹽、牛熊脫氧膽 酸鈉鹽、Trizma 十二烷基硫酸鹽、DSS (多庫酯鈉，CAS注冊號 [577-11-7])、多庫酯鉤，CAS注冊號[128-49-4])、多庫酯鉀，CAS 注冊號[7491-09-0] ) 、 SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、十 二烷基磷酸膽堿(F0S-膽堿-12)、癸基礴酸膽堿(F0S-膽堿-lO)、 壬基磷酸膽堿(F0S-膽堿-9 ) 、 二棕櫚酰基磷脂酸、辛酸鈉和/或熊果 脫氧膽酸。陽離子表面活性劑可以選自烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、苯 扎氯銨、千基二甲基十六烷基氯化銨、千基二甲基十四烷基氯化銨、 千基三甲基四氯碘酸銨、二曱基雙十八烷基溴化銨、十二烷基乙基二 甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、乙基 十六烷基二曱基溴化銨、十六烷基三曱基溴化銨、十六烷基三曱基溴 化銨、聚氧乙烯(10)-N-牛油-1， 3-二氨基丙烷、通佐溴胺和/或三曱基 (十四烷基)溴化銨。非離子表面活性劑可以選自BigCHAP、雙(聚乙二醇雙[咪唑基羰 基])、嵌段共聚物如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物例如泊洛沙 姆、泊洛沙姆-188和泊洛沙姆-407、 Brij 35、 Brij 56、 Brij 72、 Brij 76、 Brij 92V、 Brij 97、 Brij 58P、 Cremophor EL、十乙 二醇單十二烷基醚、N-癸酰-N-甲基葡糖胺、n-十二烷酰-N-曱基葡糖 胺、烷基-多聚葡萄糖苷、乙氧化蓖麻油、七乙二醇單癸基醚、七乙二 醇單十二烷基醚、七乙二醇單十四烷基醚、六乙二醇單十二烷基醚、 六乙二醇單十六烷基醚、六乙二醇單十八烷基醚、六乙二醇單十四烷 基醚、Igepal CA-630、 Igepal CA-630、甲基-6-0-(N-庚基氨基曱酰)-P-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇單十二垸基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、 N-壬酰-N-曱基葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇單十二烷基醚、 八乙二醇單十六烷基醚、八乙二醇單十八烷基醚、八乙二醇單十四烷 基醚、辛基-p-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二醇單十 二烷基醚、五乙二醇單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單
十八烷基醚、五乙二醇單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇醚W-l、聚氧乙烯IO十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙 烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20 油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸 酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯雙(咪 唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、來自Quillaja bark的 Saponin 、 Span⑧20、 SpanMO、 Span⑧60、 SpanK65、 Span①80、 Span8 85、 Tergitol ( 15—S-12型)、Tergitol ( 15—S—30型)、Tergitol (15—S-5型)、Tergitol ( 15+7型)、Tergitol ( 15-S-9型)、 Tergitol ( NP-10型)、Tergitol ( NP-4型)、Tergitol ( NP-40型)、 Tergitol ( NP-7型)、Tergitol ( NP-9型)、十四烷基-p-D-麥芽苷、 四乙二醇單癸基醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、 三乙二醇單癸基醚、三乙二醇單十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、 三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、Triton CF-H、 Triton CF_32、 TritonDF-12、 TritonDF-16、 TritonGR-5M、 TritonQS-15、 Triton QS-44、 Triton X-100、 Triton X-102、 Triton X-15、 Triton X-151、 TritonX-200、 Triton X-207、 Triton X-100、 Triton X-114、 Triton X-165溶液、Triton X-305溶液、Triton X-405、 Triton X-45、 Triton X-705-70、 TWEEN 20、 TWEEN 40、 TWEEN 60、 TWEEN 6、 TWEEN 65、 TWEEN 80、 TWEEN 81、 TWEEN 85、四丁酚醛、鞘磷 脂(神經(jīng)鞘磷脂)和鞘糖脂類(神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷酯)、磷脂和/或正十 一烷基|3-D-吡喃葡萄糖苷。兩性離子表面活性劑可以選自CHAPS、 CHAPSO、 3-(癸基二甲基 銨)丙磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二曱基銨)丙磺酸內(nèi)鹽、3-(十二烷基二 曱基銨)丙磺酸內(nèi)鹽、3-(N， N-二甲基十四烷基銨)丙磺酸鹽、3-(N， N-二甲基十八烷基銨)丙磺酸鹽、3-(N， N-二曱基辛基銨)丙磺酸內(nèi)鹽、 3-(N， N-二曱基十六烷基銨)丙磺酸鹽、N-烷基-N, N-二甲基銨-l-丙 磺酸鹽、3-膽酰胺-l-丙基二甲基銨-l-丙磺酸鹽、十二烷基磷酸膽堿、 肉豆蔻酰溶血磷脂酰膽堿、Zwittergent 3-12 (^十二烷基-#， A^二 曱基-3-銨基-l-丙磺酸鹽)、Zwittergent 3-10 (3-(癸基二曱基銨)
丙磺酸內(nèi)鹽)、Zwittergent 3-08 (3-(辛基二曱基銨)丙磺酸鹽)、甘 油磷脂類(卵磷脂、腦磷酯、磷脂酰絲氨酸)、甘油糖脂類(吡喃半乳糖 苷)、溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧 基(烷基醚)-衍生物，例如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿 的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，以及極性頭基團的修飾物，即膽堿、乙 醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰絲氨酸和 溶血磷脂酰蘇氨酸)、?；舛緣A及其衍生物、賴氨酸、精氨酸或組 氨酸的N^-?；难苌?，或者賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈酰化的衍生 物，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸任意組合的二 肽的W-?；难苌?，包含中性氨基酸和兩個帶電荷氨基酸的任意 組合的三肽的W-酰化的衍生物，或者表面活性劑可選自咪唑啉衍生 物、長鏈脂肪酸及其鹽C6-C12 (例如油酸和辛酸)、N-十六烷基-N， N-二曱基-3-銨-1-丙磺酸鹽、陰離子型(烷基-芳基-磺酸酯)單價表面活 性劑、棕櫚酰溶血磷脂-L-絲氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、膽堿、絲 氨酸或蘇氨酸的l-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)或其混合物。如此處使用的，術(shù)語"烷基-多聚葡萄糖苷"涉及由一個或多個糖 苷部分(例如麥芽糖苷、糖類等)取代的直鏈或支鏈的Cw。-烷基、-鏈烯基或-炔基鏈。這些烷基-多聚葡萄糖苷的實施方案包括CH8-烷基-多聚葡萄糖苷。這些烷基-多聚葡萄糖苷的特定實施方案包括偶數(shù) 碳鏈例如Ce, Cs、 d。、 C12、 C14、 C16、"和C2。烷基鏈。糖苷部分的特定 實施方案包括吡喃糖苷、吡喃葡萄糖苷、麥芽糖苷、麥芽三糖苷和蔗 糖。在本發(fā)明的一個實施方案中，少于6個的糖苷部分連接至烷基基 團。在本發(fā)明的一個實施方案中，少于5個的糖苷部分連接至烷基基 團。在本發(fā)明的一個實施方案中，少于4個的糖苷部分連接至垸基基 團。在本發(fā)明的一個實施方案中，少于3個的糖苷部分連接至烷基基 團。在本發(fā)明的一個實施方案中，少于2個的糖苷部分連接至烷基基 團。烷基-多聚葡萄糖苷的特定實施方案是烷基葡萄糖苷如正癸基 P-D-吡喃葡萄糖苷、癸基(3-D-吡喃麥芽糖苷、十二烷基(3-D-吡喃葡萄 糖苷、正十二烷基p-D-麥芽糖苷、正十二烷基p-D-麥芽糖苷、正十二
烷基|3-D-麥芽糖苷、十四烷基p-D-吡喃葡萄糖苷、癸基|3-D-麥芽糖苷、 十六烷基P-D-麥芽糖苷、癸基p-D-麥芽三糖苷、十二烷基p-D-麥芽三 糖苷、十四烷基P-D-麥芽三糖苷、十六烷基(3-D-麥芽三糖苷、正十二 烷基-蔗糖、正癸基-蔗糖、蔗糖單癸酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單 十四酸酯，以及蔗糖單棕桐酸酯。表面活性劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便 起見，可參考Remington: T力e Sc/e/7ce a/7tf尸rac〃ce o/ /^ar/z7ac/， 19th edition, 1995。在本發(fā)明的進一步實施方案中，所述的制劑還包括蛋白酶抑制劑 例如EDTA (乙二胺四乙酸)和節(jié)脒HC1，但也可以使用其它可商業(yè)獲 得的蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的使用在含有蛋白酶酶原的藥物組 合物中是特別有用的，以便抑制自身催化。其它成分可以存在于本發(fā)明的肽藥物制劑中。這些額外的成分可 以包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、 金屬離子、油質(zhì)載體、蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì)) 以及兩性離子(例如，氨基酸如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、 賴氨酸和組氨酸)。當然，這些額外成分不應該不利地影響本發(fā)明藥 物制劑的整體穩(wěn)定性。含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物組合物可以在多個位點施用給需要 這種治療的患者，例如在局部位點(如皮膚和粘膜位點)、在不經(jīng)過 吸收的位點(如在動脈、靜脈、心臟施用)、以及在涉及吸收的位點 (如在皮膚、皮下、肌肉或腹部施用)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用可以通過多種給藥途徑施用給需 要這種治療的患者，例如舌、舌下、口頰、口中、經(jīng)口、在胃和腸內(nèi)、 鼻、肺(如通過細支氣管和肺泡或它們的組合)、表皮、真皮、經(jīng)皮 膚、陰道、直腸、目艮(例如通過結(jié)膜)、輸尿管和腸胃外施用。本發(fā)明組合物 乳劑、微乳劑、復合型乳劑、泡沫劑、油青劑、糊劑、硬骨劑、軟青 劑、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠嚢劑(例如硬明膠膠嚢劑和軟明膠 膠嚢劑)、栓劑、直腸用膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、氣 溶膠、吸入劑、滴眼劑、眼膏劑、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、 陰道軟膏劑、注射溶液、原位轉(zhuǎn)化溶液(例如原位凝膠化、原位固定、 原位沉淀、原位結(jié)晶)、輸注液和埋植劑施用。本發(fā)明組合物可以進一步例如通過共價、疏水性和靜電相互作用 混合進或連接至藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)以便進 一步增強本發(fā)明化合物的穩(wěn)定性、提高生物利用率、增強溶解性、降 低不利效應、達到本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的定時治療(chronotherapy )，以及增強患者順應性或它們的任意組合。載體、 藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實例包括(但不限于)聚合物(如 纖維素及其衍生物)、多糖(如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、 聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及 它們的嵌段共聚體、聚乙二醇、載體蛋白(如白蛋白)、凝膠如熱凝 股系纟充(thermogelling system) ， i口本4頁^戈秀卩些才支術(shù)人員熟^p的嵌 段共聚體系統(tǒng)、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米微粒、液晶及其分散體(dispersion) 、 L2相及其分散體，月旨-水系統(tǒng)的相行為領(lǐng)域中的那 些技術(shù)人員熟知的高分子膠束、復合型乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán) 糊精和其衍生物，以及樹狀分子。固體、粉末和溶液，所述的肺部施用是使用例如定量吸入器、干粉吸 入器和噴霧器來進行，所有這些裝置是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的。 本發(fā)明組合物特別可用于制備控制釋放、持續(xù)釋放、延長釋放、 阻釋和緩釋藥物遞送系統(tǒng)。更特別地，但不作為限制，組合物可用于 制備本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的腸胃外控制釋放系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)(這兩個系統(tǒng)都導致施用量減少許多倍)。甚至更特別地是，組合物 可用于制備經(jīng)皮下施用的可控制釋放系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)。無意于限 制本發(fā)明領(lǐng)域，有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的實例是水凝膠、油性 凝膠、液晶、高分子微團、微球、納米微粒。生產(chǎn)可用于本發(fā)明組合物的控制釋放系統(tǒng)的方法包括(但不限于) 結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻化、膠嚢 化、噴霧干燥、微膠嚢化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生微球、擠出(extrusion )和超臨界;危體過禾呈(supercritical fluid process )。 一般參考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D丄，ed. Marcel Dekker ， New York, 2000 )和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99 : Protein Formulation and Delivery (MacNally， E. J. , ed. Marcel Dekker， New York, 2000 )。 腸胃外施用可以用注射器，任選筆式注射器通過皮下、肌內(nèi)、腹 膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來實施。備選地，腸胃外施用可以通過輸注泵實施。 進一步的選擇是，可以以鼻或肺液體或粉末噴霧形式施用本發(fā)明化合 物的溶液或混懸劑或粉劑的組合物。作為更進一步的選擇，含有本發(fā) 明化合物的藥物組合物也能夠適合例如通過無針注射或通過藥貼，任 選離子導入藥貼(iontophoretic patch)經(jīng)皮膚施用，或者經(jīng)粘膜(如 口腔)施用。本發(fā)明化合物可以使用適合肺部藥物遞送的任何已知類型的裝 置，在載體中作為溶液、混懸劑或干粉劑通過肺部途徑施用。這些裝 置的實例包括(但不限于)用于肺部藥物遞送的三種通用型氣溶膠發(fā) 生器，并且可以包括噴射霧化器或超聲波霧化器、定量吸入器或干粉 吸入器(參見YuJ， Chien YW. Pulmonary drug del ivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997) 395-453)?；跇藴驶臏y試方法學，將粒子的氣體動力學直徑(da)定義 為單位密度Ug/cm3)的參考標準球形粒子的幾何等效直徑。在最簡 單的情形中，對于球形微粒，da作為相對密度的平方根函數(shù)與基準直 徑(d)相關(guān)，如Modifications to this relationship occur for non-spherical particles中描述(參見Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, . J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 )。術(shù)語"MMAD"和"MMEAD"是本領(lǐng)域已充分描述和已知的(參見 Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385)。質(zhì) 量中值直徑(MMAD)和質(zhì)量中值有效直徑(MMEAD)可以交換使用，是 統(tǒng)計參數(shù)，并且經(jīng)驗地描述氣溶膠粒子大小(該大小與它們在肺中沉 積的潛力相關(guān))，不依賴于實際形狀、大小或密度(參見Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 ) 。 MMAD通常用碰撞器(測量粒子在氣體中的 慣性行為的裝置)測量計算。在進一步的實施方案中，制劑可以通過任何已知的煙霧化技術(shù)(例 如噴霧技術(shù))而煙霧化，以達到氣溶膠粒子的畫AD小于10pm，更優(yōu) 選1-5 pm，并且最優(yōu)選1-3 pm。優(yōu)選的粒子大小是基于遞送藥物進 肺深部(在那里蛋白質(zhì)得以最佳吸收)的最有效大小(參見Edwards DA， Ben-Jebria A， Langer A， Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385 )。技術(shù)的改變形式進一步優(yōu)化，所述的吸入技術(shù)的改變形式是例如(但 不限于)緩慢吸入氣流(例如30L/分鐘)、屏氣和定時釋放(breath holding and timing of actuation)。術(shù)語"穩(wěn)定制劑，，指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學穩(wěn)定 性或增加的物理和化學穩(wěn)定性的制劑。
如此處使用的術(shù)語蛋白制劑的"物理穩(wěn)定性"指該蛋白由于其暴 露于熱-機械應力下和/或與失穩(wěn)的界面和表面(如疏水表面和界面) 相互作用而形成生物學上失活的和/或不可溶的蛋白聚集物的傾向性。 含水的蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性可通過在不同的溫度下將置于合適容 器(如藥筒或小瓶)中的制劑暴露于機械/物理應力(如攪動)下多個 時間段后通過視覺檢查和/或濁度測量來評估。制劑的視覺檢查在具有 黑色背景的強聚焦光下進行。制劑的濁度通過視覺打分評定混濁程度等級來表征，如以0-3的等級來表征(未顯示混濁的制劑對應視覺打 分O,而在日光下顯示可見的混濁的制劑對應視覺打分3)。當制劑在 日光下顯示可見的混濁度時，將蛋白分類為關(guān)于蛋白聚集是物理不穩(wěn) 定的。備選地，制劑的濁度可通過技術(shù)人員熟知的簡單濁度測量法評 估。含水蛋白質(zhì)制劑的物理學穩(wěn)定性也可以通過使用光譜劑 (spectroscopic agent )或蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的揮:4f來評估。該探針 優(yōu)選為優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 小分子光譜探針(spectroscopic probe)的一個實例是硫磺素T。硫 磺素T是已經(jīng)廣泛用于檢測淀粉樣蛋白原纖維的熒光染料。在有原纖 維，或許也有其它蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況下，硫磺素T在結(jié)合原纖維蛋白 質(zhì)形式時在約450認處產(chǎn)生新的激發(fā)極大值并且在約482 nm處發(fā)射 增強。未結(jié)合的疏磺素T在這些波長下基本上是無熒光的。其它小分子可以用作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變(從天然到非天然狀態(tài))的 探針。例如，優(yōu)選結(jié)合蛋白質(zhì)的暴露的疏水片(hydrophobic patch) 的"疏水片"探針。疏水片通常是包埋于天然態(tài)蛋白的三級結(jié)構(gòu)中， 但當?shù)鞍组_始去折疊或變性時其變?yōu)楸┞对谕?。這些小分子、光語探 針的實例是芳香的、疏水染料如antrhacene、吖啶、二氮雜菲等。其 它光鐠探針是金屬-氨基酸絡合物例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和纈氨酸等的鈷金屬絡合物。如此處使用的術(shù)語，蛋白質(zhì)制劑的"化學穩(wěn)定性"指蛋白結(jié)構(gòu)中 的化學共價變化，其中所述的這種變化導致具有較于天然蛋白結(jié)構(gòu)潛 在較小的生物學效力和/或潛在增加的免疫原特性的化學降解產(chǎn)物的 形成?？梢孕纬啥喾N化學降解產(chǎn)物，這取決于天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì) 以及該蛋白質(zhì)暴露的環(huán)境。化學降解的消除幾乎不可能完全實現(xiàn)并且 在存儲和使用蛋白質(zhì)制劑過程中通?？梢娀瘜W降解產(chǎn)物的量增加，這 是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。多數(shù)蛋白質(zhì)易于脫酰胺作用，即谷氨酰胺 或天冬酰胺殘基中的側(cè)鏈酰胺基水解形成游離的羧酸的過程。其它降 解途徑包括高分子量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或多個蛋白分子通 過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用共價地彼此結(jié)合導致形成共價結(jié)合二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M. C. ， Plenum Press, New York 1992 )。氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)可認為是化學降 解的另一種變體。蛋白制劑的化學穩(wěn)定性可通過在其暴露于不同的環(huán) 境條件(降解產(chǎn)物的形成通?？赏ㄟ^例如增加溫度來加速)下后，在 多個時間點測量化學降解產(chǎn)物的量來評估。每種單獨的降解產(chǎn)物的量 通?？筛鶕?jù)分子大小和/或電荷，使用多種色i普技術(shù)(如SEC-HPLC和/ 或RP-HPLC)而分離降解產(chǎn)物測定。因此，按上面描述，"經(jīng)穩(wěn)定的制劑"指具有增強的物理學穩(wěn)定 性、增強的化學穩(wěn)定性或增強的物理和化學穩(wěn)定性的制劑。通常，制 劑在使用和存儲過程中(根據(jù)建議的使用和存儲條件)必須是穩(wěn)定的， 直到達到有效期滿。在本發(fā)明的一個實施方案中，含有本發(fā)明化合物的藥物制劑在6 周以上的使用和3年以上的存儲中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，含有本發(fā)明化合物的藥物制劑在 4周以上的使用和3年以上的存儲中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明進一步的實施方案中，含有本發(fā)明化合物的藥物制劑在 4周以上的使用和2年以上的存儲中是穩(wěn)定的。在本發(fā)明進一步的實施方案中，含有本發(fā)明化合物的藥物制劑在 2周以上的使用和2年以上的存儲中是穩(wěn)定的。在另 一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備藥物的用途。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備治療或預防高 血糖、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、l型糖尿病、肥胖癥、高血壓、 X綜合征、血脂障礙、認知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、 冠心病和其它心血管疾病、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍的藥物。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備延緩或預防 2型糖尿病的疾病發(fā)展的藥物。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備減少食物攝 取、減少p-細胞凋亡、增加P-細胞功能和p-細胞量和/或恢復P-細胞的葡萄糖敏感性的藥物。使用根據(jù)本發(fā)明化合物的治療也可以與另 一種或多種藥理活性物 質(zhì)組合，所述的藥理活性物質(zhì)例如選自抗糖尿病藥、減肥藥、食欲調(diào) 節(jié)劑、抗高血壓藥、用于治療和/或預防由糖尿病引發(fā)或與其相關(guān)的并 發(fā)癥的制劑以及用于治療和/或預防由肥胖癥引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā) 癥和障礙的制劑。這些藥理活性物質(zhì)的實例是胰島素、磺脲類、雙 胍、氯茴苯酸類、葡萄糖苷酶抑制劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二 肽基肽酶-IV)抑制劑、涉及刺激糖異生和/或糖原分解的肝臟酶的抑 制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂類代謝的化合物如抗高血脂藥劑如 HMGCoA抑制劑(他汀類藥物)、胃抑制性多肽(GIP類似物)、降低 食物攝取的化合物、RXR激動劑和作用于P細胞的ATP依賴性鉀通道的 制劑；考來烯胺、考來替泊、安妥明、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他 汀、辛伐他汀、普羅布考、右甲狀腺素、neteglinide、瑞格列奈；|3 阻滯劑如烯丙心安、氨酰心安、噻嗎心安、吲哚心安、萘心安和甲氧 乙心安、ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、恩 納普利、福森普利、賴諾普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利、 鈣通道阻滯劑如硝苯吡啶、二氯苯吡啶、硝苯千吡啶、依拉地平、尼 莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及a阻滯劑如多沙唑溱、哌胺甲尿 啶、哌唑溱和特拉唑溱；CART (可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動 劑、NPY (神經(jīng)肽Y)拮抗劑、PYY激動劑、PYY2激動劑、PYY4激動 劑、混合的PPY2/PYY4激動劑、MC4 (黑皮質(zhì)素4)激動劑、阿立新拮 抗劑、TNF (腫瘤壞死因子)激動劑、CRF (促皮質(zhì)素釋放因子)激動 劑、CRF BP (促皮質(zhì)素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、urocortin激動 劑、激動劑、MSH (黑素細胞-刺激激素)激動劑、MCH (黑素細胞 收縮激素)拮抗劑、CCK (膽嚢收縮素)激動劑、血清素重吸收抑制劑、 血清素和去甲腎上腺素重吸收抑制劑、經(jīng)混合的血清素和去甲腎上腺 素化合物、5HT(血清素)激動劑、蛙皮素激動劑、神經(jīng)節(jié)肽拮抗劑、 生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動 劑、UCP 2或3 (解偶聯(lián)蛋白2或3 )調(diào)節(jié)劑、瘦素激動劑、DA激動劑 (溴隱停、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(視黃醇類X受 體)調(diào)節(jié)劑、TR (3激動劑；組胺H3拮抗劑、胃抑制性多肽激動劑或 拮抗劑(GIP類似物)、胃泌素和胃泌素類似物。使用根據(jù)本發(fā)明化合物的治療還可以與外科手術(shù)(即影響葡萄糖 水平和/或脂質(zhì)體內(nèi)平衡的外科手術(shù))例如胃嚢帶術(shù)或胃旁路術(shù)聯(lián)合。應該理解的是，根據(jù)本發(fā)明的化合物與一種或多種上面提及的化 合物，以及任選一種或多種其它藥理活性物質(zhì)的任何合適的組合可以 認為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明通過下面的實施例來進一步闡述，然而，所述的實施例不 應理解為限制本專利保護的范圍。在前面描述和下列實施例中公開的 特征(個別地和它們的任何組合)可以是用于以其不同形式實現(xiàn)本發(fā) 明的材料。實施例
使用的縮寫 r. t:室溫DIPEA: 二異丙基乙胺 H20:水 CH3CN:乙腈DMF: N， N-二甲基曱酰胺HBTU: 2-(lH-苯并三唑-l-基-)-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸Fmoc: 9 H-芴-9-基甲氧基羰基Boc: ^又丁氧羰基0tBu: *又丁酯tBu:叔丁基Trt:三苯曱基Pmc: 2， 2， 5， 7， 8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；鵇de: 1-(4， 4-二曱基-2， 6-二氧環(huán)亞己基)乙基ivDde: 1- (4， 4-二甲基-2， 6-二氧環(huán)亞己基)-3-甲基丁基Mtt: 4-曱基三苯曱基Mmt: 4-曱氧基三苯甲基DCM: 二氯曱烷TIS:三異丙基硅烷)TFA:三氟乙酸Et20: 乙醚NMP: l-甲基-吡咯烷-2-酮 DIPEA: 二異丙基乙胺 H0At: l-羥基-7-氮雜苯并三唑 H0Bt: 1-羥基苯并三唑 DIC: 二異丙基碳二亞胺使用制造商提供的FastMocUV方法，在Applied Biosystems 433 肽合成儀上根據(jù)Fmoc策略合成0. 25 mmol或1. 0 mmol量級的經(jīng)保護 的肽酰樹脂，所述的FastMoc UV方法采用在NMP (N-甲基吡咯烷酮) 中的HBTU ( 2- ( lH-苯并三唑-l-基-)-1, 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷 酸)或HATU(0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸) 介導的偶聯(lián)，并且UV監(jiān)控Fmoc保護基團的去保護。用于合成GLP-1 肽酰胺的起始樹脂是Rink-Amide樹脂并且Wang或氯三苯甲基樹脂用 于具有羧基C端的GLP-1肽。除了非天然的氨基酸例如Fmoc-Aib-0H (Fmoc-氨基異丁酸)以外，使用的經(jīng)保護的氨基酸衍生物是在適合用 于ABI433A合成儀的預稱量筒中提供的標準Fmoc-氨基酸(由例如 Anaspec或Novabiochem提供)。N端氨基酸在a氨基處用Boc保護(例 如將Boc-His (Boc)0H用于N端具有His的肽)。位置26的賴氨酸的 s氨基用Mtt、 Mmt、 Dde、 ivDde或Boc保護，這取決于連接白蛋白結(jié) 合部分和間隔物的方式。肽的合成在一些情況中可以通過利用在二肽酰胺鍵上用酸性條件下能夠切割的基團保護的二肽來改善，所述的基 團例如是但不限于2-Fmoc-氧-4-甲氧節(jié)基或2， 4, 6-三甲氧基芐基。在肽中存在絲氨酸或蘇氨酸的情況中，可以使用假脯氨酸 (pseudoproline) 二肽(見例如NovoMochem 2002/2003或更新版 本的目錄，或W.R. Sampson (1999)， J. Pep. Sci. 5， 403 )。除去ivDde或Dde—呆護的方法。將樹脂(0.25 mmol)置于一個手動振蕩器/過濾裝置中并用N-曱 基吡咯烷酮中的2%肼(20ml， 2xl2分鐘)處理以除去Dde或ivDde 基團并用N-甲基吡咯烷酮(4x20 ml)洗滌。除去Mtt或Mmt-保護的方法。將樹脂(0.25 mmol)置于手動振蕩器/過濾裝置中并用DCM中的 2 % TFA和2-3 % TIS處理(20 ml， 5-10分鐘，重復6-12次)以除
去Mtt或Mmt基團，并用DCM (2 x 20 ml) 、 DCM中的10 °/。 MeOH和5 % DIPEA ( 2 x 20ml )和N-曱基吡咯烷酮(4x20 ml )洗滌。將側(cè)鏈連接至賴氨酸殘基的方法.白蛋白結(jié)合殘基(式I的B-U-側(cè)鏈)可以通過使用標準酰化劑(例 如但不限于DIC、 H0Bt/DIC、 H0At/DIC或HBTU)酰化至結(jié)合樹脂的肽 上或在溶液中?；廖词鼙Ｗo的肽上而連接至GLP-1。連接至結(jié)合樹脂的肽上 路徑I將活化的(活化酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合殘基(式I的B-U-側(cè) 鏈)例如十八烷二酸單-(2， 5-二氧-吡咯烷-l-基)酯(Ebashi爭， EP511600,相對于結(jié)合樹脂的肽4摩爾當量)溶解于NMP( 25 mL)中， 在室溫下加入至樹脂并搖動過夜。過濾反應混合物并用NMP、 二氯曱 烷、2-丙醇、甲醇和乙醚仔細洗滌樹脂。路徑II將白蛋白結(jié)合殘基(式I的B-U-側(cè)鏈)溶解于N-甲基吡咯烷酮/ 二氯甲烷(l:l， 10ml)中。加入活化試劑例如羥基苯并三唑(H0Bt)(相對于樹脂4摩爾當量)和二異丙基碳二亞胺(相對于樹脂4摩爾 當量)并攪拌溶液15分鐘。將該溶液加入至樹脂中并加入二異丙基乙 胺(相對于樹脂4摩爾當量)。將樹脂在室溫下?lián)u動2_24小時。用 N-甲基吡咯烷酮(2x2Qml) 、 N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1: 1 ) (2x 20ml )和二氯甲烷(2x20 ml )洗滌樹脂。路徑III將活化的(活化酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合殘基(式I的B-U-側(cè) 鏈)例如十八烷二酸單-(2，5-二氧-吡咯烷-l-基)酯(Ebashi爭， EP511600,相對于GLP-1肽1-1. 5摩爾當量)溶解于有機溶劑例如乙 腈、THF、 DMF、 DMSO或水/有機溶劑的混合物(1-2 ml)中，并與10 摩爾當量的DIPEA—起加入至水中的肽溶液(10-20 ml)中。在保護 基團位于白蛋白結(jié)合殘基例如叔丁基的情形中，0/N凍干反應混合物 并然后將分離的肽粗產(chǎn)物去保護-在叔丁基的情形中，將肽溶解于三氟 乙酸、水和三異丙基甲硅烷的混合物(90:5:5)中。30分鐘后，在真 空中蒸發(fā)該混合物并且使用制備級HPLC純化肽終產(chǎn)物。除去Fmoc-保護的方法將樹脂(0. 25 mraol )置于手動振蕩器的 濾瓶中并用N-曱基吡咯烷酮/二氯曱烷(1: 1 ) ( 2 x 20ml )和N-甲基 吡咯烷酮(1 x 20 ml )、 N-曱基吡咯烷酮中的20 %旅咬溶液(3 x 20 ml ， 每次IO分鐘)處理。用N-甲基吡咯烷酮(2x20 ml) 、 N-甲基吡咯 烷酮/二氯甲烷(1: 1 ) ( 2 x 20 ml )和二氯甲烷(2x20 ml )洗滌樹 脂。用于將肽從樹脂裂解的方法通過用三氟乙酸、水和三異丙基硅烷(95: 2.5: 2. 5至92: 4: 4 ) 的混合物在室溫下攪拌180分鐘將肽從樹脂裂解。過濾裂解混合物并 通過氮氣流將濾出液濃縮為油狀產(chǎn)物。用45 ml乙醚從油狀產(chǎn)物中沉 淀出肽粗產(chǎn)物并用45 ml乙醚洗滌1至3次。純化將肽粗產(chǎn)物在裝填有5 n或7 ja C-18珪石的20mmx 250 mm柱上通過半制備HPLC純化。根據(jù)肽使用一個或兩個純化系統(tǒng)。TFA:千燥后，將肽粗產(chǎn)物溶解于5 ml 50 %乙酸H20中并用H20 將其稀釋成20 ml并注入柱中，隨后在40 °C下50分鐘內(nèi)將該柱用0. 1 % TFA中的40-60 %的CH3CN梯度以10 ml/分鐘洗脫。收集含有肽的 級分。用水稀釋洗脫物后凍干純化的肽。硫酸銨用經(jīng)濃H2S04調(diào)節(jié)至pH 2. 5的0.05M (NH4) 2S04中的40 % CH3CN平衡柱子。干燥后，將肽粗產(chǎn)物溶解于5mlH20中50%的乙酸中 并用}120稀釋至20 ml并注入柱中，隨后在40 。C下50分鐘內(nèi)將該柱
用0. 05M (N仏)2S04中的40-60 %的CH3CN梯度以10 ml/分鐘洗脫。收 集含有肽的級分并用3倍體積的H20稀釋，并且使其通過已經(jīng)用0.1% TFA平衡了的Sep-Pak C18筒(Waters part. #: 51910)。隨后用 含有0. 1 % TFA的70 % CH3CN將其洗脫并在用水稀釋洗脫物后通過凍 干來分離純化的肽。荻得的終產(chǎn)物通過分析型RP-HPLC (保留時間)和LCMS鑒定。 RP-HPLC分析用214 nm下的UV檢測和在42 。C下以1 ml/分鐘洗 脫的Vydac 218TP54 4. 6 ram x 250 mm 5pC-18硅柱(The Separations Group, Hesperia， USA)進行。使用兩種不同的洗脫條件Al:在由用濃112304調(diào)節(jié)至pH 2. 5的0.1 M (NH4) 2S04組成的緩沖 液中平衡該柱，并用相同緩沖液中的0 %-60 °/。的CH3CN梯度洗脫50 分鐘。Bl:用0. 1 % TFA/H20平衡該柱并用0 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20至 60 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20的梯度洗脫50分鐘。B6:用0.1 % TFA/H20平衡該柱并用0 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20至 90 % CH3CN/0. 1 % TFA/H20的梯度洗脫50分鐘。備選地，RP-HPLC分析用214 nm下的UV檢測和在"。C下以1 ml/ 分鐘洗脫的Symmetry300， 3. 6 mm x 150 mm, 3. 5pC-18珪柱(Waters) 進行。B4:用0.05 % TFA/H20平衡該柱并用5 % CH3CN/0. 05 % TFA/H20 至95 % CH3CN/0. 05 % TFA/H20的梯度洗脫15分鐘。使用了下列儀器LCMS在由Sciex API 100 Single quadropole質(zhì)語儀、Perkin Elmer系列200 Quard泵、Perkin Elmer系列200自動采樣器、Applied Biosystems 785A UV檢測器、Sedex 75蒸發(fā)光散射檢測器組成的裝 置上進行4義器控制和數(shù)據(jù)采集由在Windows 2000計算機上運行的SciexSample控制軟件完成。HPLC泵連接至兩個洗脫液Ji&液器，貯液器含有 A:水中0. 05 %的三氟乙酸 B:乙腈中0. 05 %的三氟乙酸在室溫下，通過注射適宜量樣品(優(yōu)選為20 pl)至經(jīng)乙腈梯度 洗脫的柱上進行分析。使用的HPLC條件、檢測器設置和質(zhì)譜儀設置在下表中給出。柱Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5拜梯度 在7. 5分鐘內(nèi)以1. 5 ml/分鐘進行的5 %-90 %的乙腈線性梯度檢測210 nm (從DAD模擬輸出) ELS (從ELS模擬輸出)，40 。C MS離子化模式API-ES備選地，LCMS在由Hewlett Packard系列1100 G1312A Bin Pump、 Hewlett Packard系列1100柱室、Hewlett Packard系列1100 G1315A DAD 二極管陣列檢測器、Hewlett Packard系列1100 MSD和由HP Chemstation軟件控制的Sedere 75蒸發(fā)光散射檢測器組成的裝置中 進行。HPLC泵連接至兩個洗脫液貯液器，所述的貯液器含有A: 水中的10 mM NH40HB: 90 %乙腈中的10 mM NH40H分析在23。C下，通過注射適宜量樣品(優(yōu)選為20 Ml)至柱上， 用A和B梯度洗脫該柱來進行。使用的HPLC條件、檢測器設置和質(zhì)譜儀設置在下表中給出。 柱Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 ju m
梯度在6.5分鐘內(nèi)以L5 ml/分鐘進行的5 %-100 %的乙腈線 性梯度檢測 210 nm (從DAD模擬輸出) ELS (從ELS模擬輸出)MS離子化模式API-ES。掃描100-1000 amu 步長為0. 1 amu結(jié)合表達人GLP-1受體的質(zhì)膜的放射性配體結(jié)合測定法用含有人GLP-1受體的經(jīng)純化的質(zhì)膜進行。含有受體 的質(zhì)膜從穩(wěn)定表達的BHK tk-ts 13細胞純化。將膜在檢測緩沖液(50 mM HEPES、 5 mM EGTA、 5 mM MgCl2、 0.005 %吐溫20， pH=7. 4 )中 稀釋至終濃度為0. 2 mg/ml的蛋白質(zhì)并將其分配至用0. 3 % PEI預包 被的96孔微量滴定板中。膜與0.05 nM [mI]GLP-l、濃度漸增的未 標記配體和不同HSA濃度(0. 005 %、 0. 05 %和2 %)在30匸下孵育 2小時。孵育后，通過多頭抽真空裝置過濾使未結(jié)合的配體與結(jié)合的 配體分離，隨后用2 x 100 jil冰冷的測定緩沖液洗滌。將濾出液在RT 下過夜千燥，取出(punch out)并在Y-計數(shù)器中定量。實施例1<formula>formula see original document page 63</formula>N-s26- (17-羧基十七烷酰)-[Aib8, Arg34] GLP-l- (7-37)-肽 根據(jù)制造商的說明書，在ABI433A機器上用樹脂(Fmoc-Gly-NovaSyn TGT， 0.22 mmol/g Novabiochem 0.25 mmole)產(chǎn)生一級序列。除在 位置26處使用的殘基(FmocLys (ivDde) -OH, Novabiochem)夕卜，所 有的保護基團都是酸不穩(wěn)定性，使得該賴氨酸特定地去保護而不是任 何其它賴氨酸。 方法將樹脂(0.09 mmol)置于手動振蕩器/過濾裝置中并用N-甲基吡 咯烷酮中的4 %肼(4xl0分鐘，4x4 ml)處理以除去ivDde基團。用 N-甲基吡咯烷酮(3x4ml)洗滌樹脂。將十八烷二酸單-(2, 5-二氧-吡咯烷酮-l-基)酯)(相對于樹脂4 mol當量)溶解于DMF (4 ml)中。 將該溶液加入至樹脂并加入二異丙基乙胺(相對于樹脂8 mol當量)。 在室溫下?lián)u動樹脂24小時。用N-甲基吡咯烷酮(4x4 ral)和DCM(4 x4 ml)洗滌樹脂。在室溫下，通過用三氟乙酸、水及三異丙基硅烷 的混合物(92.5:5.0:2.5 4 ml )攪拌180分鐘將肽從樹脂裂解。過濾 裂解混合物并用40 ml乙醚沉淀出肽粗產(chǎn)物并用45 ml乙醚將其洗滌3 次。在裝填有7ia C-18硅石的20mmx 250腿柱上通過制備級HPLC純化 該肽粗產(chǎn)物。將肽粗產(chǎn)物溶解于5 ml水中50 °/。乙酸中，用仏0稀釋至20 ml并將其注射至柱上，隨后將該柱在RT下用25-65 %的梯度(在含有O. 1 % TFA的水中的CH3CN)以20 ml/分鐘洗脫40分鐘。收集含有肽的級分。 用水稀釋洗脫物后凍干純化的肽。 HPLC (方法B4) : RT-9. 94分鐘(91 %) LCMS: m/z = 1232 (MH33+)計算值(MH +) - 1232N-s26- (19-羧基十九烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-1- (7-37) -肽如實施例l并依照"合成法"制備。HPLC(方法B4): RT-10. 42分鐘(91 % )LCMS: m/z = 1242 (MH33+)計算值(MH +) = 1242實施例3實施例2 N-e26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰)氨基]甲基}苯甲 酰)[Arg34]GLP-l-(7-37)-肽加入DIPEA (7 pl)和O-(l-琥珀酰亞胺基)-N，N，r ，r-四曱基 脲六氟磷酸(TSTU， 17 mg， 56 pl)至THF (1 ml )中的4-(N-(2-(叔 丁氧基羰基)乙基)-N- (15-(叔丁氧基羰基)十五烷酰)氨甲基)苯曱酸 (36 mg， 60 ;imol)溶液中。在室溫下攪拌1小時后，用THF ( 1 ml ) 稀釋該混合物，并且加入1 ml得到的溶液至水(5 ml )中的 [Arg34]GLP-l-(7-37)肽(約100mg)和DIPEA (103 jil)溶液中。在 0.5 h后，加入更多的THF-?；瘎┤芤?0. 4 ml)。在室溫下攪拌總 共1.5 h后，過濾反應混合物并應用于制備級HPLC ( 35-55 % MeCN/55-35 °/。水/含有1 % TFA的10 %水的梯度洗脫)。合并含有期 望產(chǎn)物的級分并凍干。然后在室溫下用25 ml TFA和水的混合物(95/5 vol)處理產(chǎn)物15分鐘，將其濃縮，并通過HPLC再次純化。得到了 15.4 mg標題化合物。HPLC (方法B4 ) : RT= 9. 41分鐘(99 % )LCMS: m/z=1287 ( MH33+)。計算值(MH33+) :1 2 8 7實施例4N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧 基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)肽。 通過標準的Fmoc-固相肽合成制備[Aib8, Arg34] GLP-l-(7-37)-肽并通過制備級HPLC純化。將[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽溶解 于水(15 ml )中并加入DIPEA ( 50 ul )。將17-((S)-l-叔丁氧基羰 基-3- {2- [2- ({2- [2- (2， 5-二氧吡咯烷-l-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰)曱氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰)丙基氨基甲酰)十七烷 酸#又丁酯(21mg)溶解于2:1的乙腈/水(1. 5 ml )中并且分批加入。 通過HPLC監(jiān)控該反應。當不再發(fā)現(xiàn)有[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽時，將反應混合物0/N凍干。將10 ml 90 % TFA/5 % TIS/5 %水加 入至分離的化合物中并保持反應混合物2小時，將其在真空中蒸發(fā)， 并與庚烷共蒸發(fā)。將剩余的油狀產(chǎn)物溶解于含有1 % NH3-aq的15 ml 水中并通過制備級HPLC純化以產(chǎn)生標題化合物。 HPLC(方法B4): RT=9. 60分鐘(100 % ) LCMS: m/z=1372 (MH33+)。計算值(MH33+) :1 37 2N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (19-羧基十九烷酰氨基)-4 (S) -羧 基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽。根據(jù)下列方法制備肽A.將在Fmoc-Gly-Wang樹脂(0. 66 mmol/g Novabiochem)上合成的0. 25 mMol量的結(jié)合樹脂的肽用于根據(jù)制造商 的說明書在ABI433A機器上產(chǎn)生一級序列。除在位置26處使用殘基 (FmocLys (Mtt) -OH, Novabiochem)對酸超級敏感外，所有的保護 基團都是對酸敏感的，使得該賴氨酸而不是任何其它賴氨酸能特定地 去保護。
除去Mtt-保護的方法。將樹脂(0. 25mmol)置于手動振蕩器/過 濾裝置中并用DCM中的2 % TFA、 3 % TIS (20 ml， 5-10分鐘，重復 6-12次)處理以除去MU基團并用DMF洗滌。繼續(xù)用方法合成將側(cè)鏈 連接至賴氨酸殘基上，按照路徑II,使用適當方法除去Fmoc-保護。 根據(jù)該方法進行最終的去保護、HPLC-純化和HPLC及LC-MS分析。 HPLC (方法B6 ) : RT=34. 56分鐘(100 % ) LCMS: m/z-1381.8 ( MH33+)。計算值(M+H+) : 4142.7實施例6<formula>formula see original document page 67</formula>N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[3-(4-咪唑基)丙?；?， Arg34]GLP-1-(7-37)肽如實施例5并依照"合成法"制備。HPLC (方法B6 ) : RT-32. 89分鐘(100 % )LCMS: m/z=1362. 3 ( MH33+)。計算值(M+H+) : 4085.6實施例7<formula>formula see original document page 67</formula>N-e26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-(羧甲基-氨 基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽
如實施例5并依照"合成法"制備。HPLC (方法B6 ) : RT-32. 67分鐘(100 % )LCMS: m/z=1367. 3 ( MH33+)。計算值(M+H+) : 4100.6實施例8N-s"- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-3 (S)-磺丙?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽如實施例5并依照"合成法，，制備。HPLC(方法B6): RT=32. 04分鐘(100 % )LCMS: m/z=1379.8 ( MH33+)。計算值(M+H+) : 4136.7實施例9N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S)-羧基丁 ?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Gly8， Arg34]GLP-1-(7-37)肽。使用購自Advanced Cheratech的Apex396,通過Fmoc-固相肽合 成從150 mg 2-氯三苯甲基氯樹脂(1.4 mmol/g)開始制備[Gly8， Arg34]GLP-l (7-37)肽。將位置26的Lys殘基保護為Lys (ivDde), 同時其它氨基酸的官能側(cè)鏈用標準的對酸敏感的保護基保護。在NMP 中使用3 %肼/3 %哌啶將Lys殘基去保護1小時。然后，使用DIC/H0At 將2單位的8-氨基-3, 6-二氧辛酸、y-谷氨酸和十八烷二酸偶聯(lián)至
連接樹脂的肽上。最后用TFA/TIS/H2O/苯曱硫醚(90/5/3/2)使肽去保 護并從樹脂裂解。通過LC-MS分離肽。HPLC:在46 %乙腈處洗脫MALDI: 4087 (MH+)實施例10N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰基氨基)-4 (S) -羧基 丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)酰胺使用購自Advanced Chemtech的Apex396，通過Fmoc-固相肽合 成從200 mg Tentagel RAM S樹脂(0.26 mmol/g )開始制備 [Aib8， 34] GLP-1(7-37) 酰胺。將位置26的Lys殘基保護為 Lys(ivDde)，同時其它氨基酸的官能側(cè)鏈用標準的對酸敏感的保護基 保護。在NMP中使用3 %肼/3 %哌啶將Lys殘基去保護1小時。然 后，使用DIC/H0At將2單位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、y-谷氨酸、 十八烷二酸偶聯(lián)至連接樹脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H20/苯甲硫醚 (90/5/3/2)將肽去保護并從樹脂裂解。通過LC-MS分離肽。HPLC:在49 %乙腈處洗脫MALDI: 4114 (MH+)實施例11N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷?；被?-4 (S)-羧基 丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰
基][Aib8， Arg34， Pro37] GLP-1-(7-37)酰胺肽在Rink酰胺樹脂(0.70 mmol/g Novabiochem)上制備，或如實施 例5并依照"合成法"制備。HPLC(方法B6): RT=32. 13分鐘(100 %)(方法A1): RT=44. 33 分鐘(98. 4 %)LCMS: m/z=1385.3 ( MH33+)。計算值(M+H+) : 4153.8實施例12Aib8， Lys26 (N-s26- (2- (2- (2- (2- [2- (2- (4-(十五烷酰氨基)-4-羧基丁 ?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙?；?}), Arg")GLP-l H (7-37)-OHHPLC (方法B6) : RT-30. 41分鐘LCMS: m/z = 1362.9 (MH33+)計算值(M+) = 4085.61N-s26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- {[N- (2-羧乙基)-N- (17-羧基十七烷酰) 氨基]甲基}苯甲酰)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基) 乙?；絒Aib8， Arg34〗GLP-1(7-37)使用購自Advanced Chemtech的Apex396，通過Fmoc-固相肽合 成從150 mg 2-氯三苯甲基氯樹脂(1.4 mmol/g)開始制備[Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)肽。將位置26的Lys殘基保護為Lys (ivDde)， 同時其它氨基酸的官能側(cè)鏈用標準的對酸敏感的保護基保護。在NMP 中使用3 %肼/3 %哌啶將Lys殘基去保護1小時。使用DIC/H0At將 2單位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸和4 {[ (2-叔丁氧基羰基-乙基)-(17-叔 丁氧基羰基-十七烷酰)-氨基]-曱基}-苯甲酸偶聯(lián)至連接樹脂的肽上。 最后使用TFA/TIS/H20/苯曱硫醚(90/5/3/2)將肽去保護并從樹脂裂 解。通過制備級LC-MS分離肽。HPLC:在52 %乙腈處洗脫MALDI: 4191細+)實施例14N- a 7-甲酰基，N- e 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧 基)乙?；鵠[Arg"]GLP-l-(7-37)-肽HPLC (方法B6) : RT-32. 6分鐘LCMS: m/z = 1377.3 (MH33+)計算值(M+) = 4128.0實施例15N- e 2626- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4 (S) -羧 基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Glu22, Arg34]GLP-1-(7-37)肽。使用購自Advanced Chemtech的Apex396，通過Fmoc-固相肽合 成從150 mg Fmoc-Gly-Wang樹脂(0.66 mmol/g)開始制備[Aib8, Glu22, Arg34]GLP-l(7-37)肽。將位置26的Lys殘基保護為 Lys(Mtt),同時其它氨基酸的官能側(cè)鏈用標準的對酸敏感的保護基保 護。在DCM中使用2 % TFA/2 % TIS將Lys殘基去保護4 x 5分鐘。使 用DIC/H0At將2單位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、y-谷氨酸和十八烷 酸叔丁酯偶聯(lián)至連接樹脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H20/苯曱硫醚 (90/5/3/2)將肽去保護并從樹脂裂解。通過LC-MS分離肽。HPLC:在50 %乙腈處洗脫MALDI: 4187 (MH+)實施例16N- s 26 {3- [2- (2- {2- [2- (2- {2- [2- (2- [4- (15- (N- ((S) -l ， 3-二羧基 丙基)氨基甲酰)十五烷酰氨基)-(S)-4-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧 基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙?；鶀 [Aib8, Arg34]GLP-l-(7-37)-肽 方法和分析如實施例3并依照"合成法，，制備。HPLC(方法B4): RT-10. 29分鐘(92 % )LCMS: m/z=1450 ( MH33+)。計算值(匪33+) :1 4 5 0實施例17N- s 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- {[N- (2-羧乙基)-N- (17-羧基十七烷 酰)氨基]甲基}苯甲酰)氨基](4 (S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基] 乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Aib8， Arg34]GLP-l (7-37)使用購自Advanced Chemtech的Apex396，通過Fmoc-固相肽合 成從150 mg Fmoc-Gly-Wang樹脂(0.66 mmol/g)開始制備[Aib8，
Arg34]GLP-l(7-37)肽。將位置26的Lys殘基保護為Lys (Mtt)，同 時其它氨基酸的官能側(cè)鏈用標準的對酸敏感的保護基保護。在DCM中 用2 % TFA/2 % TIS將Lys殘基保護4 x 5分鐘。用DIC/HOU將2單 位的8-氨基-3， 6-二氧辛酸、Y-谷氨酸和4{[(2-叔丁氧基羰基-乙 基)-(17-叔丁氧基羰基-十七烷酰)-氨基]-甲基}-苯甲酸偶聯(lián)至連接 樹脂的肽上。最后使用TFA/TIS/H2O/苯甲硫醚(90/5/3/2)將肽去保護 并從樹脂裂解。通過制備級HPLC分離肽。HPLC:在51 %乙腈處洗脫MALDI: 4 320 (MH+)實施例18N- s 26- {(S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基-4- ((S) -4-羧基 -4- (19-羧基十九烷酰氨基)丁?；被?丁酰基氨基)丁?；被?丁 酰基氨基} [Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)在Liberty Microwave肽合成儀(CEM公司)上用Fmoc化學合成 該肽。該合成在載荷為0. 66 mmol/g的Gly-Wang樹月旨(Novabiochem) 上進行，使用4倍過量的氨基酸和DIC/H0At用于偶聯(lián)。N-端組氨酸是 Boc-保護的并且要修飾的賴氨酸是Mt t-保護的。在合成肽的主鏈后， 在DCM中用3 %的TFA除去Mtt基團并用標準肽合成方法在Liberty 上構(gòu)建側(cè)鏈。在最后的步驟中，將脂肪二酸作為單叔丁酯加入。在用TFA/TIS/水(95: 2. 5: 2. 5)裂解后，通過加入DIPEA將肽溶解 于50 %乙腈中并且在室溫下通過7. 8 x 300 mra X-Terra Prep MS C18 10 ^m柱將其在Waters LC-MS系統(tǒng)上純化。在30 % CH3CN、 0.08 % TFA 下5分鐘后(4 ml/分鐘)，用30至70 °/。的CH3CN線性梯度洗脫該柱 40分鐘。收集含有期望化合物的級分并通過測量280 nm下的UV吸 光度來測定洗脫液中肽的濃度(假定酪氨酸和色氨酸的摩爾消光系數(shù)分別為1280和3690 )。通過MALDI確定性質(zhì)和純度。在濃度測定后， 將洗脫液以等份分配進可容納期望量的管形瓶中并通過真空離心干 燥。HPLC:在52 %乙腈處洗脫 MALDI: 4239 (MH+)實施例19N-s 26-(17-羧基十七烷酰氨基)-4(S)-羧基丁酰基-[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽方法和分析如實施例4并依照"合成法"制備。HPLC (方法B4) : RT-9. 64分鐘(97 %)LCMS: m/z: = 1276 (MH,)，計算值(MH33+)為1276實施例20 。 。N- e 26- {3- [2- (2- {2- [2- (2- {2- [2- (2- [4- (17-羧基十七烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙氧基)乙氧基] 乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙?；鶀 [Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)-肽。 LCMS*: m/z: = 1417 (MH33+)，計算值(MH33+)為1417 *HPLC (在42 。C下使用5——>80%乙腈、85——>10%水和10 %的l.O %三氟乙酸溶液的線性梯度以0. 5 mL/分鐘洗脫50分鐘。UV檢測在 Symmetry300, 5um， 3.9 mm x 150 mm C-18桂柱上于214 nm下進行) 方法B4) : Rt = 32.09分鐘(95 %)實施例21^ w —H3CCH3 0 H《H3C CH3N- s 26- {2- (2- (2- (2- [2- (2- (4- (17-羧基十七烷酰氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰 基)}-[Aib8,22,27,3。,35， Arg34， Pro37, Lys26] GLP-1 (7-37)酰胺HPLC (方法B6) : RT=35. 0分鐘LCMS: m/z = 1394.0 (MH33+)計算值(M+) = 4180.0實施例22-H-K H3C-R》N- s 26- [2- (2- [2- [4- (21-羧基uneicosanoy 1氨基)-4 (S)-羧基丁 ?；被鵠乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Aib8, Arg34]GLP-l-(7-37) 使用與實施例19中相同的方法制備。HPLC:在5 3. 4 °/。乙腈處洗脫 MALDI: 4025 (MH+)本發(fā)明的其它化合物包括:<formula>formula see original document page 76</formula>N- s 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (21-羧基uneicosanoyl氨基)-4 (S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰 基][Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽。<formula>formula see original document page 76</formula>N-al-曱酰基-N- e 26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (19-羧基十九烷酰氨 基)-4 (S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧 基)乙?；鵠[Arg34]GLP-1-(7-37)-肽。<formula>formula see original document page 76</formula>
<formula>formula see original document page 77</formula>使用db/db小鼠的藥效研究在本發(fā)明的一個方面，GLP-1激動劑在以30nmol/kg劑量施用給 db/db小鼠后具有至少24小時的作用持續(xù)時間。 效力和作用持續(xù)時間在db/db小鼠中測量。8-10周大的雄性db/db小鼠購自丹麥的Taconic。 從到達開始， 在標準條件但是在24 。C下圏養(yǎng)小鼠。每個籠子放置IO只小鼠直到用 于試驗，所述的小鼠在正常時日光循環(huán)(在上午6時開始光照)下 能夠自由攝取標準食物(Altromin, Brogaarden APS，丹麥)和自來 水。每周將小鼠用于l次試驗，進行3周。之后，讓小鼠安樂死。在1周的適應期后，通過從小鼠的尾部頂端毛細血管取樣來測量 血糖。簡而言之，將5 jil血液取樣于肝素化的玻璃毛細管中并立即 混懸于1.5 ml Eppendorf管中的250 jul EBIO緩沖液(Eppendorf, 德國)中。血糖濃度在EBIO Plus自動分析儀(Eppendorf,德國)上 通過葡萄糖氧化酶法測量。血糖的截斷值是10 mM。當評估小鼠時，基本上是，參與試驗的 所有42只小鼠具有大于10 mM的血糖值，而且小鼠之間的差異很小。 因此，如果許多小鼠沒有嚴重的糖尿病(盡管某些是)，試驗的開始 時間應該延遲一周并且應該測量新的基礎(chǔ)血糖值?；诨A(chǔ)血糖值，將小鼠分為7組(n-6)，與組的平均血糖值匹配。在測定基礎(chǔ)血糖值的當天，如上面描述的測定早晨值并測定每只 小鼠的基礎(chǔ)體重。在0時，在頸部的頸背皮下施用化合物(劑量為約 300 jnl/50 g小鼠)。然后測量一直到48小時的血糖值(在1、 3、 6、 24和48小時時)并測定最后的體重。將所有數(shù)據(jù)輸入Graphpad Prism中計算平均血糖和平均△體重。本發(fā)明的一個方面是制備適合每周施用一次的，具有延長的血漿 物。藥物動力學特性可以如下面描述地在 迷你豬或家豬中評估。每周施用一次的GLP-1類似物的藥物動力學篩選 用于鑒定適合每周施用一次的候選物的GLP-1類似物的藥物動力 學篩選在這樣的候選物上進行，所述候選物根據(jù)該篩選方案顯示了十 分有效的降低糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中的葡萄糖的潛力，并 且隨后在db/db小鼠模型中具有48小時或更長的持續(xù)時間。 初步的篩選藥物動力學篩選的第一部分由皮下施用2認ol/kg的單次劑量給 重8-12 kg的三只迷你豬組成。在施用劑量前、注射后0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 48、 72、 96和120小時，抽取每只動物的血樣。 >使用 pH調(diào)節(jié)至7. 4的特定穩(wěn)定緩沖液來穩(wěn)定所有血樣以防止GLP-1類似物 的酶降解，所述的穩(wěn)定緩沖液由EDTA (二鈉)0. 18 M、 Aprotenin 15000 KIE/ml、 Val-Pyr 0.30 raM組成。通過離心(4 °C, 10分鐘，1270 G (4000 rpm))收集每種經(jīng)穩(wěn)定的血樣的血漿，并通過ELISA測定法 分析GLP-1類似物的含量。三種不同的ELISA檢測法用于血漿分析 使用抗體組合Fl/Ra2135，以35 pM的檢測限度(LOD)和35-30000 pM 動態(tài)分析范圍檢測N端完整的7-37GLP-l分子和N端經(jīng)酶促降解的 9-37GLP-l分子兩者的"Total測定法"。使用抗體組合Fl/Mab26. 1 的"Intact測定法"。該檢測法只檢測N端完整的7-37GLP-l分子。 LOD是35 pM并且動態(tài)分析范圍是35-30000 pM。使用抗體組合 F1/GLP162-3F15的"Aib-intact檢測法"。該檢測法檢測GLP-1分 子的Aib穩(wěn)定的N端，使得能夠檢測穩(wěn)定的GLP-1類似物。LOD是45 pM 并且動態(tài)分析范圍是45-30000 pM。所有的血漿濃度-時間曲線通過非房室模型分析來進行藥物動力 學分析。如果數(shù)據(jù)允許則計算下列藥物動力學參數(shù)tmax、 Cmax、 AUC、 AUC/Dose、 AUC仏uap。,、 Az、 t1/2、 CL/F、 Vz/F和MRT。第二次篩選藥物動力學篩選的第二部分在具有60-70小時或更長的初始終末
半衰期的那些化合物上進行。這次篩選由靜脈內(nèi)和皮下施用單次劑量2 nmol/kg給迷你豬組成，每種施用途徑6只。在靜脈內(nèi)和皮下施用 后，血液取樣時間分別從0-120小時延長至0-432和0-504小時。這 樣作是為了增加藥物動力學參數(shù)評估值(尤其是終末半衰期、AUC和 推導出的參數(shù)清除率以及分布容量)的精確度和準確度，并且是為了 評估皮下施用后的生物利用率。 GLP-1 (AIB8- INTACT)測定法該檢測法是將分析物與捕獲物和檢測抗體同時孵育的雙位點測定 法。用即用型化學發(fā)光底物使信號最大化。該測定法既不識別內(nèi)源性GLP-1 ( 7-37 )也不識別經(jīng)DPPIV裂解 的GLP-1 ( 9-37 )。GLP-1測定法的參照血漿血漿制備。將混合的EDTA血漿在37 。C下孵育4小時以除去痕量的 GLP-1并在孵育后加入纈氨酸Pyrrolidide和抑肽酶。緩沖液包被緩沖液PBS用作包被緩沖液調(diào)節(jié)至pH 7. 4的10mM磷酸鈉和l"raM氯 化鈉。洗滌緩沖液含有0. 05 % (v/v)吐溫20的PBS 測定緩沖液含有0. 05 % (v/v)吐溫20、 10 g/L BSA和10 mg/L抗TNP的PBS。鏈霉抗生物素蛋白緩沖液含有額外的0. 5 M NaCl的洗滌緩沖液。底物即用型底物SuperSignal EUSA Femto( Pierce, cat. no. 37075 )。 標準品 標準品從0113-0000-0217的25 pM儲液制備。將該肽系列稀釋 進參照血漿中產(chǎn)生具有30000-10000-3333-1111-370-123-41和0 pM 的終濃度的標準品。在-20 。C下將標準品以100 PL等份存儲于 Micronic試管中。測定法步驟在4 。C下用PBS中100 juL 5 pg/mL的單克隆抗體GLPbl-7Fl包 被Crystal 2000微量滴定板(black)過夜。在自動化平板洗滌器(SkanWasher， Skatron)中用洗滌緩沖液洗 滌平板5次并讓其保持至少30分鐘，用洗滌緩沖液封閉剩余的位點。將20 fiL樣品或標準品加入至每個孔中(一式兩份)，隨后立即 加入100 iaL檢測緩沖液中l(wèi)pg/mL的生物素化GLP162-3F15。 在室 溫下將該板在平板振蕩器上孵育2小時，隨后如先前描述的進行5次 洗滌循環(huán)。加入IOO ^L鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液(KPL，編碼為 14-30-00， 1:20000于鏈霉抗生物素蛋白緩沖液中)至每個孔中并在 室溫下于平板振蕩器上孵育1小時。如先前描述的洗滌平板并在倒空 后加入100 |uL SuperSignal femto。將該板置于振蕩器中1分鐘并在 Orion Luminometer (Berthold)中測量。將數(shù)據(jù)傳送到MultiCalc 并使用加權(quán)的4PL方法計算標準曲線。從標準曲線計算樣品濃度。 GLP-1 (TOTAL)測定法該檢測法是將分析物與捕獲物和檢測抗體同時孵育的雙位點測定 法。該測定法識別N-端裂解直至GLP-1 ( 12-37)的GLP-l。緩沖液包被緩沖液將PBS用作包被緩沖液調(diào)節(jié)至pH 7. 4的10mM磷酸鈉和l45 mM 氯化鈉。洗滌緩沖液含有0. 05 % (v/v)吐溫20的PBS 測定緩沖液 含有0. 05 % (v/v)吐溫20、 10 g/L BSA和10 mg/L抗TNP的PBS。鏈霉抗生物素蛋白緩沖液含有額外的0. 5 M NaCl的洗滌緩沖液。底物即用型底物TMB (KemEnTec code 4380A)終止緩沖液4 M H3P04標準品標準品從0113-0000-0217的25 pM儲液制備。將該肽系列稀釋 進參照血漿中產(chǎn)生具有30000-10000-3333-1111-370-123-41和0 pM 的終濃度的標準品。在-20 。C下將標準品以100 iaL的等份存儲于 Micronic試管中。檢測法步驟在4 。C下用PBS中100 iliL 5 ^g/mL的單克隆抗體GLPbl-7F1包 被Maxisorp微量滴定板(NUNC)過夜。在自動化平板洗滌器(SkanWasher, Skatron)中用洗滌緩沖液洗 滌平板5次并讓其保持至少30分鐘，用洗滌緩沖液封閉剩余的位點。將20 樣品或標準品加入至每個孔中，隨后立即加入100 檢測緩沖液中1 pg/mL的生物素化Ra2135。在室溫下將板在平板振 蕩器上孵育2小時，隨后如先前描述地進行5次洗滌循環(huán)。將100 鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液(Amersham Bioscinces code RPN4401V， 1: 8000于檢測緩沖液)加入至每個孔中 并在室溫下于平板振蕩器上孵育1小時。如先前描述的洗滌平板并且 在倒空后加入100 nL TMB并在5分鐘后用100 ^tL 1^04終止。在Victor Multilabel Reader (Wallac)中測量平板。將數(shù)據(jù)傳 送到MultiCalc并使用加權(quán)的4PL方法計算標準曲線。從標準曲線計 算樣品濃度。
活體實驗方法、血漿分析和藥物動力學分析與"初步的篩選"中 描述的一樣。藥物配制本發(fā)明化合物可以如下配制 實施例4的化合物6. 25 mg/ml 丙二醇 14. 0 mg/ml 苯酚5. 5 mg/ml 磷酸鹽緩沖液pH 8. 15任選地，化合物在制備之前如PCT/EP2005/055946中描述的可用 熱和/或堿處理。
權(quán)利要求
1.在相對于序列GLP-1(7-37)(SEQ ID No 1)的位置7和/或8上具有至少一種非蛋白質(zhì)源性氨基酸殘基的修飾的GLP-1類似物，所述的類似物在位置26的賴氨酸殘基處用部分進行?；?，并且其中所述的部分包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團在末端連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的GLP-1類似物，其中在位置26連接的部分 包含親水性連接物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的GLP-1類似物，其中所述的親水性連接物包 含至少5個非氫原子，其中30-50 y。的這些非氫原子是N或0。
4. 根據(jù)任一上述權(quán)利要求的GLP-1類似物，其中在位置26處連 接的部分包含通過親水性連接物與肽隔開的白蛋白結(jié)合部分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的GLP-1類似物，其中白蛋白結(jié)合部分是在末 端具有酸性基團的含有4-40個碳原子的直鏈或支鏈的親脂性部分。
6. 根據(jù)任一上述權(quán)利要求的GLP-1類似物，其中酰化的部分是 B-U，，其中U，選自<formula>formula see original document page 3</formula>m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6， n是1、 2或3， s是0、 1、 2或3, t是0、 1、 2、 3或4，p是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 17、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是選自下列的酸性基團
7.其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20,GLP-l類似物，所述的類似物是式I (SEQ ID No. 2)的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-<formula>formula see original document page 4</formula>Xaa23-Ala-Xaa25-—n ~"Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa:<formula>formula see original document page 4</formula>式I其中Xaa,是L-組氨酸、咪唑并丙酰基、a-羥基-組氨酸、D-組氨酸、 脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、p-羥基-組氨酸、高組氨酸、Na-乙?；?組氨酸、F-曱?；?組氨酸、a-氟甲基-組氨酸、a-甲基-組氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Thr、 Ser、 Lys、 Aib、 (l-氨 基環(huán)丙基)羧酸、(l-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(l-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(l-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa6是Val或Leu;Xaa8是Ser、 Lys或Arg;Xaai9是Tyr或Glir，Xaa2。是Leu或Met;Xaau是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln、 Glu、 Lys或Arg;Xaa"是Ala或Val;Xaa27是Glu或LeujXaa3o是Ala、 Glu或Arg'，Xaa33是Val或LysjXaa"是Lys、 Glu、 Asn或ArgjXaa"是Gly或Aib;Xaaw是Arg、 Gly或Lys，或缺失；Xaa"是Gly、 Ala、 Glu、 Pro、 Lys，或缺失； 并且B和U， 一起是?；牟糠?，其中U，選自<formula>formula see original document page 5</formula>m是0、 1、 2、 3、 4、 5或6, n是1、 2或3， s是0、 1、 2或3， t是0、 1、 2、 3或4，p是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16 17、 18、 19、 20、 21、 22或23;并且其中B是選自下列的酸性基團HO其中1是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20, <formula>formula see original document page 6</formula>m是2、 3、 4或5，n是1或2，s是0、 1或2，t是0、 1、 2或3，p是1、 2、 3、 4、 7、 11或23。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7的GLP-1類似物，其中U，選自
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8的GLP-1類似物，其中B-U，-是<formula>formula see original document page 7</formula>
10.根據(jù)權(quán)利要求9的GLP-1類似物，其中 其中1是14、 15、 16、 17或18, p是1、 2、 3、 4或11， s是0、 1或2, t是0或1。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的GLP-1類似物，其中s是l。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的GLP-1類似物，其中1是16。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的GLP-1類似物，其中p是3或4。
14. 根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的GLP-1類似物，其中n是l。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7-14任一項的GLP-1類似物，其中 Xaa7是His或脫氨基-組氨酸；Xaas是Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Lys或Aib;Xaai6是Val;Xaa8是SerjXaai9是Tyr;Xaa20是Leu5Xaau是Gly、 Glu或Aib;Xaa23是Gln或Glu;Xaa25是Ala5Xaa27是GlujXaa3。是Ala或GlujXaa"是Val;Xaa34是Lys或Arg'，Xaa^是Gly或Aib;Xaa36是Arg或Lys'，Xaa37是Gly、酰胺或缺失。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的GLP-1類似物，其中 Xaa7是HisXaa^是Gly或Aib;Xaa"是Val.，Xaa8是Ser;Xaa9是Tyr;Xaa20是Leu5Xaa"是Glu或AibjXaa"是Gln;Xaa25是Ala^Xaa27是Glu.，Xaa3。是Ala;Xaa"是Val;Xaa"是Lys或Arg;Xaa"是Gly或AibjXaa36是Arg;Xaan是Gly。
17. ^4居4又利要求1-15任一項的GLP-1類似物，其中所述的GLP-1 類似物包含在GLP-1 (7-37)序列位置7的N-端L-組氨酸的^^飾。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的GLP-l類似物，其中所述的GLP-1類似物包 含咪唑并丙酰基7、 a-幾基-組氨酸7或N-甲基-組氨酸7、 D-組氨酸7、 脫氨基-組氨酸7、 2-氨基-組氨酸7、 p-羥基-組氨酸7、高組氨酸7、 Na -乙?；?組氨酸7、 a-氟曱基-組氨酸7、 a-甲基-組氨酸7、 3-吡咬丙 氨酸7、 2-吡啶丙氨酸7或4-吡啶丙氨酸7。
19. 根據(jù)權(quán)利要求l-18任一項的GLP-1類似物，其中所述的GLP-1 類似物包含用另一種氨基酸殘基對GLP-1 (7-37)序列位置8的L-丙氨酸 的取代。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的GLP-1類似物，其中所述的GLP-l類似物包 含Aib8、 Gly8、 Val8、 Ile8、 Leu8、 Ser8、 Thr8、 (1-氨基環(huán)丙基)羧酸、 (l-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、 (l-氨基環(huán)庚基)羧酸或(l-氨基環(huán)辛基)羧酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的GLP-l類似物，其中所述的GLP-1類似物包 含Aib8。
22.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的GLP-1類似物，其中所述的GLP-1 類似物與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比較包含不超過15個已4皮交換、 加入或缺失的氨基酸殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的GLP-1類似物，其中與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. l)比較有不超過IO個已被交換、加入或缺失的氨基酸殘基。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的GLP-1類似物，其中所述的GLP-1類似物 與GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1)比較包含不超過6個已被交換、加入 或缺失的氨基酸殘基。
25. 根據(jù)任意上述權(quán)利要求的GLP-1類似物，其中所述的GLP-l 類似物包含不超過3個不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
26.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的GLP-1類似物，其中所述的 GLP-1類似物只包含一個賴氨酸殘基。
27. 根據(jù)任意上述權(quán)利要求的GLP-1類似物，所述的GLP-1類似物是Aib8, Arg"-GLP-1 (7-37), Aib8'22, Arg34-GLP-1 (7-37)， Arg"-GLP-1 (7-37)，[3-(4-咪唑基)丙?；?， Arg34]GLP-l-(7-37)肽,GlyS， Arg34-GLP-1 (7-37)，Aib8， Arg34， Pro"-GLP-l (7-37),Aib8'22'27'30'35, Arg34, Pro37- GLP-1 (7-37)酰胺，它們都在位置26由B-U，取代。
28. 根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的化合物，所述的化合物選自N-s26- (17-羧基十七烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-1- (7-37)-肽，N- s 26- (19-羧基十九烷酰)-[Aib8， Arg34] GLP-l- (7-37)-肽，N- e 26- (4- {[N- (2-羧乙基)-N- (15-羧基十五烷酰)氨基]甲基)苯 曱酰)[Arg34]GLP-l-(7-37)，EGTFTSDVSSYLEGQA A-N^~E F I AWLVRGR G—嗎nh2- HAEGTFTSDVSSYLEG3AA——N ^~~ EF I /V\LVRG R G c。。h <formula>formula see original document page 12</formula>N- s 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷?；?基)-4 (S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基) 乙?；鵠[Aib8， Arg34]GLP-l-(7-37)肽，<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula>
29.用于增加GLP-1類似物在患者中的作用時間的方法，所述方 法的特征是在所述GLP-1類似物位置26的賴氨酸殘基上用如在任意上 述權(quán)利要求中公開的B-U，?；龅腉LP-l類似物。
30.用于增加GLP-1類似物在患者中的作用時間至長于約40個小 時的方法，所述方法的特征是修飾GLP-1 (7-37)肽或其類似物的位置7 和8的至少一個氨基酸殘基，并且在所述GLP-1類似物的位置26的賴氨 酸殘基上，用如任意上述權(quán)利要求中公開的B-U，-?；鯣LP-l類似 物。
31. —種藥物組合物，所述的藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-28 任意 一 項的化合物和可藥用賦形劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物，所述的藥物組合物適合腸胃 外施用。
33. 根據(jù)權(quán)利要求l-28任意一項的化合物在制備藥物中的用途。
34. 根據(jù)權(quán)利要求l-28任意一項的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制備治療或預防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1 型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認知障礙、動脈 粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風、炎性腸綜合 征、消化不良和胃潰瘍的藥物。
35. 根據(jù)權(quán)利要求l-28任意一項的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制備延緩或預防2型糖尿病發(fā)展的藥物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求l-28任意一項的化合物的用途，其中所述的化 合物用于制備減少食物攝取、減少P-細胞凋亡、增加P-細胞功能和 P -細胞量和/或恢復p -細胞的葡萄糖敏感性的藥物。
全文摘要
長效GLP-1化合物及其治療用途。
文檔編號A61K47/48GK101133082SQ200680006674
公開日2008年2月27日 申請日期2006年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者F·Z·多沃爾德, H·斯蒂芬森, J·勞, K·邁德森, P·布洛克, T·K·漢森 申請人:諾和諾德公司