專利名稱：丹酚酸b的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及逆流色譜制備分離方法，具體地說是關(guān)于應(yīng)用pH區(qū)帶精制逆流色譜法從丹參粗提物中分離制備丹酚酸B的方法。
背景技術(shù)：
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。丹參的主要活性成分有水溶性的丹酚酸類化合物及脂溶性的丹參酮類化合物。丹酚酸是一類既有咖啡?？s酚酸結(jié)構(gòu)又有新木脂素骨架的水溶性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，丹酚酸類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以清除體內(nèi)的超氧陰離子和羥基自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善微循環(huán)。丹酚酸類化合物中丹酚酸B是主要代表性有效成分之一，約占總酚酸的70％，是丹參水溶性有效成分中含量最高、活性最強(qiáng)的一種，其他丹酚酸類成分在丹參及其提取物中的含量與丹酚酸B成正相關(guān)。因此丹酚酸的制備對于丹酚酸系列藥物的開發(fā)、質(zhì)量控制具有重要的意義。
目前，丹酚酸類成分的分離多采用柱層析法，但操作起來十分繁瑣，且分離效率不高；也有用制備型高效液相分離的，但上樣量太少；高速逆流色譜是一種液液分配分離技術(shù)，它的分離原理是利用單向流體動力學(xué)平衡原理，使2個(gè)互不相溶的溶劑相在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管中單向分布，其中一相作固定相，由恒流泵輸送載有樣品的流動相穿過固定相，利用樣品在兩相中分配系數(shù)(K)的不同實(shí)現(xiàn)分離。它完全排除了支撐體對樣品的不可逆吸附、玷染、變性、失活等影響。其與一般色譜的分離方式不同，使其特別適用于制備性分離?！陡咚倌媪魃V法分離制備丹酚酸B》(《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2006年第18卷第1期第100～104頁)中記載采用高速逆流色譜法分離純化丹參水溶性成分丹酚酸類物質(zhì)，制備丹酚酸B化學(xué)對照品，一次分離可制備63.4mg丹酚酸B，純度為98％。
《pH區(qū)帶逆流色譜研究進(jìn)展》(《分析化學(xué)》，2004，32(4)529-533.)中記載pH區(qū)帶逆流色譜(pH-zone-refining counter-current chromatography)是利用待分離有機(jī)酸堿的酸(堿)解離常數(shù)及疏水性的不同進(jìn)行分離。與普通逆流色譜相比，其突出特點(diǎn)是在溶劑體系的固定相中加入保留酸(或堿)，同時(shí)在流動相中加入洗脫堿(或酸)，不同物質(zhì)洗脫出來時(shí)伴隨著pH值的突變。該技術(shù)可以得到最小重疊的矩形峰，同時(shí)雜質(zhì)被集中在峰的兩側(cè)，具有樣品分離容量大、分離純度和分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成功用于多種混合物的分離，如氨基酸衍生物、肽衍生物、氧雜蒽染料、生物堿及立體異構(gòu)體等。它繼承了高速逆流色譜高效、固定相無污染等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有制備量大和快速等特點(diǎn)，能夠針對具體問題達(dá)到更優(yōu)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足提出了一種從丹參提取物中快速分離純化丹酚酸B的方法，該方法工藝簡便，效率高，制備量大，產(chǎn)品純度大于95％。
本方案是通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的將丹參飲片粉碎、醇提、抽濾后的濾液減壓濃縮得濃縮液；濃縮液加水，用堿性溶液調(diào)pH值至7.5，用乙醚萃??；水相用酸性溶液調(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收溶劑，得紅色粉末狀丹參粗提物；將由醚類和水組成的溶劑系統(tǒng)配置于分液漏斗中充分振搖后靜置12小時(shí)，分層，上相加1-30mmol/L酸為固定相，下相加1-30mmol/L堿水為流動相，其中所加酸堿濃度相同；采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，逆流色譜儀由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為230mL)等組成，它的連接順序?yàn)橹谩M(jìn)樣閥→色譜分離柱→紫外檢測儀→記錄儀。首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱，開啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，稱取一定量丹參粗提物放入固定相溶解，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相；根據(jù)檢測器紫外光譜圖，對分離的每個(gè)峰都進(jìn)行收集，得到丹酚酸B。
本方案的有益效果可根據(jù)對上述方案的敘述得知，由于采用pH區(qū)帶逆流色譜分離制備丹酚酸B，制備量是普通逆流色譜制備量的8倍，純度在95％以上，具有分離量達(dá)到克量級、分離時(shí)間短、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)。因此本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)了技術(shù)目的。
本方案的具體特點(diǎn)還有，所述溶劑系統(tǒng)中醚類和水的用量體積比為0.1～1∶1。所述醚類化合物可為叔丁基甲醚、乙醚、石油醚之一。所述固定相中的酸為三氟乙酸，所述流動相中的堿為氨水。所述醇提為用70-95％乙醇回流提取4次，每次1小時(shí)。所述水相中用于調(diào)PH值的酸性溶液為1mol/L的鹽酸、1mol/L的硫酸之一。所述調(diào)PH值的堿性溶液為碳酸氫鈉溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液之一。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
圖1實(shí)施例1丹參提取物的pH區(qū)帶逆流色譜分離的色譜圖A丹酚酸B；溶劑系統(tǒng)叔丁基甲醚∶水＝1∶1；酸堿濃度10mmol/L；上樣量2.0g；A為丹酚酸B，純度95.8％圖2實(shí)施例2丹參提取物的pH區(qū)帶逆流色譜分離的色譜圖A丹酚酸B；溶劑系統(tǒng)叔丁基甲醚∶水＝1∶1；酸堿濃度20mmol/L；上樣量2.0g；A為丹酚酸B，純度95.5％圖3實(shí)施例3丹參提取物的pH區(qū)帶逆流色譜分離的色譜圖A丹酚酸B；溶劑系統(tǒng)乙醚∶水＝1∶1；酸堿濃度10mmol/L；上樣量0.5g；A為丹酚酸B，純度96.6％具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取丹參飲片2200g粉碎后用95％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽濾，濾液減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液加一倍量水，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的鹽酸調(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得紅色粉末狀丹參粗提物57.19g。此粗提物用本發(fā)明的方法分離制備丹酚酸B。
采用半制備型逆流色譜儀，溶劑選用叔丁基甲醚和水體系從丹參粗提物中分離制備丹酚酸B。首先以1∶1的體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開，取上相為固定相，向其中加入10mmol/L三氟乙酸；下相為流動相，加入10mmol/L氨水。采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為230mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，開啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，稱取2g丹參提取物溶解于25mL固定相中，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相；然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖1)接收丹酚酸B，重量為524.2mg，產(chǎn)品純度為96.8％。
利用HPLC分析分離物。HPLC條件島津Shim pack VP-ODS柱(4.6mm×250mm)，柱溫25℃ ，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量5μL，流動相甲醇∶5％乙酸＝35∶65，檢測波長281nm。
實(shí)施例2取丹參飲片1000g粉碎后用80％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽濾，濾液減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液加一倍量水，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的稀硫酸液調(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得紅色粉末狀丹參粗提物25.52g。此粗提物用本發(fā)明的方法分離制備丹酚酸B。采用半制備型逆流色譜儀，溶劑選用叔丁基甲醚和水體系從丹參粗提物中分離制備丹酚酸B。首先以1∶1的體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開，取上相為固定相，向其中加入20mmol/L三氟乙酸；下相為流動相，加入20mmol/L氨水。采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為230mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，開啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，稱取2g丹參提取物溶解于30mL固定相中，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相；然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收丹酚酸B，重量為516mg，，經(jīng)HPLC測定，產(chǎn)品純度為96.5％。
實(shí)施例3取丹參飲片1000g粉碎后用70％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽濾，濾液減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液加一倍量水，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的鹽酸調(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得紅色粉末狀丹參粗提物23.13g。采用半制備型逆流色譜儀，溶劑選用乙醚和水體系從丹參粗提物中分離制備丹酚酸B。首先以1∶2的體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開，取上相為固定相，向其中加入5mmol/L三氟乙酸；下相為流動相，加入5mmol/L氨水。采用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所生產(chǎn)的GS10A2型半制備型逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為230mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，開啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，稱取0.5g丹參提取物溶解于10mL固定相中，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相；然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖3)接收丹酚酸B，重量為130mg，經(jīng)HPLC測定，產(chǎn)品純度為95.6％。
雖然本發(fā)明已經(jīng)通過選用的實(shí)施例及其附圖進(jìn)行描述并完全公開，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不超出本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，任何改變和變化都屬于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種丹酚酸B的分離制備方法，其特征是將丹參飲片粉碎、醇提、抽濾后的濾液減壓濃縮得濃縮液；濃縮液加水，用堿性溶液調(diào)pH值至7.5，用乙醚萃?。凰嘤盟嵝匀芤赫{(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收溶劑，得紅色粉末狀丹參粗提物；將由醚類和水組成的溶劑系統(tǒng)配置于分液漏斗中充分振搖后靜置12小時(shí)，分層，上相加1-30mmol/L酸為固定相，下相加1-30mmol/L堿水為流動相，其中所加酸堿濃度相同；首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱，開啟速度控制器，使半制備型逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min時(shí)，稱取一定量丹參粗提物放入固定相溶解，用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱，設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相；根據(jù)檢測器紫外光譜圖，對分離的每個(gè)峰都進(jìn)行收集，得到丹酚酸B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述溶劑系統(tǒng)中醚類和水的用量體積比為0.1～1∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述醚類化合物可為叔丁基甲醚、乙醚、石油醚之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述固定相中的酸為三氟乙酸，所述流動相中的堿為氨水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述醇提為用70-95％乙醇回流提取4次，每次1小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述水相中用于調(diào)PH值的酸性溶液為1mol/L的鹽酸、1mol/L的硫酸之一。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的分離制備方法，其特征是所述調(diào)PH值的堿性溶液為碳酸氫鈉溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液之一。
全文摘要
一種從丹參提取物中快速分離純化丹酚酸B的分離制備方法，它方法工簡便，效率高，制備量大，產(chǎn)品純度大于95％。將丹參飲片粉碎、醇提、抽濾后的濾液減壓濃縮得濃縮液；濃縮液加水，用堿調(diào)pH值至7.5，用乙醚萃取；水相用酸調(diào)pH值至3，用乙醚萃取，回收溶劑，得紅色粉末狀丹參粗提物；應(yīng)用pH區(qū)帶逆流色譜分離方法，得到丹酚酸B。本發(fā)明主要用于制備丹酚酸B。
文檔編號A61K125/00GK1995027SQ20061017098
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日
發(fā)明者王曉, 劉建華, 耿巖玲, 李福偉, 程傳格 申請人:山東省分析測試中心