專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于預(yù)防和治療i型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及一種包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽；2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗的用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是造成人類(lèi)死亡的主要病因之一，嚴(yán)重危及人類(lèi)健康。I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的兩種主要形式。凋亡即程序性死亡是I型和II型糖尿病胰島細(xì)胞死亡的主要原因。I型和II型糖尿病人都表現(xiàn)有進(jìn)行性的胰島B-細(xì)胞質(zhì)量減少和B-細(xì)胞功能降低。
胰高血糖素類(lèi)似肽(GLP-1，從7位到36位氨基酸的氨基化合物)是一種主要的生理性胰島素類(lèi)似激素。由于天然GLP-1獨(dú)特的促胰島素樣作用和抗高血糖素樣作用，以及對(duì)胰臟B細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用，因此在治療糖尿病方面展現(xiàn)了極大的藥學(xué)應(yīng)用前景。這一點(diǎn)與臨床治療糖尿病重新制定的治療目標(biāo)不謀而合。其藥學(xué)的重要意義還在于，與當(dāng)今使用的磺基脲、胰島素等治療糖尿病的一線藥物相比，它并不會(huì)產(chǎn)生增加體重等副作用。實(shí)際上，由于GLP-1能促進(jìn)漲飽的感覺(jué)，可自然減少食物的攝取，因此限制了患者體重的增加，甚至有可能造成體重的降低。
進(jìn)行治療的主要困難在于一些酶類(lèi)(如二肽酰二肽酶(DPPIV))可以使GLP-1快速失活，再加腎臟對(duì)GLP-1的排出作用，使得GLP-1本身的半衰期很短(t1/2＜2min)。因此采取持續(xù)性的皮下灌流可以維持機(jī)體內(nèi)GLP-1的功效。DPPIV抑制劑能夠延長(zhǎng)GLP-1的半衰期并且正在臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，但是這種方法仍然缺乏特異性，這是因?yàn)镈PPIV同時(shí)還能使其他幾種多肽激素和趨化因子失活，將其抑制會(huì)產(chǎn)生各種不利反應(yīng)。
Exendin-4(Ex-4)是一種39個(gè)殘基的蜥蜴唾液腺多肽，是GLP-1的同功因子，有55％的序列同源性，藥學(xué)性質(zhì)與GLP-1相似。與GLP-1相反，Ex4在水溶液中能形成單體螺旋。這種螺旋由于疏水性C端的首尾相互作用，表現(xiàn)出罕見(jiàn)的熱穩(wěn)定性。由于GLP-1缺乏C端首尾的相互作用、其自身的柔韌性以及16位的甘氨酸殘基(是指甘氨酸還是氨基酸的殘基)被認(rèn)為是降低單體螺旋狀態(tài)穩(wěn)定性的因素。而Ex4螺旋內(nèi)部的穩(wěn)定性可減少結(jié)合受體時(shí)的正位功效，這一結(jié)合需要C末端保持螺旋狀態(tài)。
此外，白蛋白偶聯(lián)的GLP-1(Albugon)也同樣具有和較長(zhǎng)的半衰期和治療糖尿病的功能。
盡管像Ex4一樣具有DPP-IV-抗性的GLP-1受體激動(dòng)劑在治療糖尿病方面展示很大的藥用價(jià)值前景，但這些多肽需每日注射1-2次或配合口服藥物使用。由于Albugon分子較大，由腎臟排出量較少，因而也具有較長(zhǎng)的半衰期。然而體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示融合蛋白的功效不如Ex-4。而且，更重要的是多肽類(lèi)藥物可以產(chǎn)生危險(xiǎn)的致敏反應(yīng)。這使得人們投入更多精力去開(kāi)發(fā)在體內(nèi)功效更持久，穩(wěn)定性更高的效應(yīng)分子。
I型糖尿病是一種復(fù)雜的自體免疫性疾病，當(dāng)胰島抗原反應(yīng)性T細(xì)胞侵潤(rùn)到胰島蘭氏小島，會(huì)啟動(dòng)炎癥過(guò)程殺死胰島細(xì)胞。這種由T殺傷細(xì)胞對(duì)胰島細(xì)胞造成的傷害是自體免疫主要的和持續(xù)性的效應(yīng)，也是I型糖尿病難以治愈的主要原因之一。基因治療目前已應(yīng)用到糖尿病動(dòng)物模型上。例如，基因療法已經(jīng)應(yīng)用于調(diào)節(jié)性的淋巴因子如IL-4，IL-10，TGF-beta-1的全身給藥方面，或是用于體內(nèi)B細(xì)胞移植的體外修飾方面。研究人員也選擇了將bcl-2基因轉(zhuǎn)染至用于細(xì)胞移植的B細(xì)胞，以防治細(xì)胞的凋亡。但這些治療措施都有極大的局限性。在臨床應(yīng)用方面可能有許多負(fù)面效應(yīng)，如將基因?qū)胍浦驳囊葝u中會(huì)受到抗胰島免疫反應(yīng)和某些質(zhì)粒相對(duì)較短的表達(dá)時(shí)間所限。此外，已經(jīng)通過(guò)基因療法投送胰島素或胰島素類(lèi)似物到肝臟，肌肉和其它組織，但并沒(méi)有取得預(yù)期的對(duì)血糖水平的生理調(diào)節(jié)。另類(lèi)療法涉及到體內(nèi)投送基因(如PDX-1)誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化胰島細(xì)胞，但初期的成功實(shí)驗(yàn)卻很難重復(fù)。近年來(lái)確實(shí)提出了許多以基因?yàn)榛A(chǔ)的治療方法，但這些療法幾乎都建立在病毒載體基因轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上，有許多局限性諸如病原性和免疫原性，還沒(méi)有一例可以應(yīng)用于人類(lèi)。顯然，只要I型糖尿病的自體免疫反應(yīng)得不到控制，新移植的胰島或是由于再生而產(chǎn)生的新的胰島終究會(huì)被肌體排斥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物。組成藥物復(fù)合物之一的GLP-1-IgG-Fc融合蛋白及其類(lèi)似物能促進(jìn)胰島B細(xì)胞增殖、再生和減少凋亡，從而增加胰島細(xì)胞質(zhì)量，并且能促進(jìn)胰臟B細(xì)胞分泌胰島素和對(duì)葡萄糖的耐受性，激活cAMP和其耦聯(lián)的第二信使途徑和促進(jìn)B細(xì)胞中蛋白激酶(Akt1和MAPK)的表達(dá)以及增加其含量，降低caspase-3的活性。
組成藥物復(fù)合物之一的核酸疫苗，通過(guò)與CTLA-4配體結(jié)合，使得提供負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)的T-細(xì)胞受體與抗原識(shí)別的聯(lián)結(jié)，通過(guò)持續(xù)產(chǎn)生的T-調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tr)抑制了肌體T-細(xì)胞對(duì)胰島素或GAD65多肽的反應(yīng)，因此控制了存在于1型糖尿病的持續(xù)的自體免疫反應(yīng)。解除了由T-殺傷細(xì)胞造成的胰島B細(xì)胞損傷和肌體持續(xù)的自體免疫狀態(tài)。加上GLP-1促進(jìn)胰島B-細(xì)胞再生的效應(yīng)，從而在控制了自體免疫的同時(shí)，促進(jìn)了胰島B細(xì)胞的增殖和功能的改善?？傊?，該藥物復(fù)合物有針對(duì)性地對(duì)導(dǎo)致1型糖尿病無(wú)法治愈的兩個(gè)關(guān)鍵病因雙管齊下，從根本上為預(yù)防與治療1型糖尿病提供了嶄新的思路與有效的途徑。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物的給藥途徑。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物的給藥劑量。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物用于制備治療糖尿病的藥物的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物，其中，該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽，或含有該多肽的基因的表達(dá)質(zhì)粒；2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物，其中，所述多肽能夠治療I型糖尿病的多肽為胰高血糖素類(lèi)似肽GLP-1或與其具有50％以上同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白，所述IgG-Fc可以為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
在上述藥物復(fù)合物中，所述融合蛋白可以為胰高血糖素類(lèi)似肽GLP-1與IgG1-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3；或GLP-1的同功因子extendin-4與IgG1-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物，其中，所述融合蛋白為突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc，并且IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3。其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代，或者被其它氨基酸取代，或者對(duì)GLP-1序列其它氨基酸修飾使得突變體GPL-1耐受其降解酶(如二肽酰二肽酶，DPPIV)。
根據(jù)本發(fā)明的上述藥物復(fù)合物可以口服、肌肉注射、靜脈注射、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥，并且，被給藥的具有蛋白活性的藥物復(fù)合物的量為0.05nmol～1nmol/kg體重，或有效cDNA的量為1μg-10μg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物可以用于制備治療糖尿病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物，GLP-1-IgG-Fc結(jié)合核酸疫苗(胰島素原，GAD65和能結(jié)合CTLA-4(CD152)的突變體B7(B7-1wa)接種以促進(jìn)B細(xì)胞再生和同時(shí)控制自體免疫過(guò)程。這樣，可以完全免除有高度危險(xiǎn)發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病，或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他們的胰臟仍然有少量有活性的胰島B細(xì)胞。
用于本研究的NOD鼠是自體免疫性糖尿病極佳的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。NOD鼠發(fā)生糖尿病與T-helper 1(Th1)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)胰島抗原反應(yīng)有關(guān)，也與T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tr)失調(diào)有關(guān)。改變產(chǎn)生生長(zhǎng)因子B1(TGF-β1)-的Tr細(xì)胞對(duì)該病可起保護(hù)作用，但其功能隨年齡而下降。我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因療法可以預(yù)防NOD鼠發(fā)生糖尿病，多種治療措施如CD3Ab療法可以部分誘導(dǎo)Tr細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，其他Tr細(xì)胞也可能參與其中，如CD4+CD25+細(xì)胞通過(guò)引導(dǎo)細(xì)胞接觸，來(lái)誘導(dǎo)天然Tr細(xì)胞(nTr)。
研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)核酸疫苗接種，即通過(guò)遞送抗原基因與CTLA-4(CD152)配體結(jié)合可以產(chǎn)生Tr細(xì)胞。核酸疫苗接種對(duì)預(yù)防NOD鼠I型糖尿病效果顯著。CTLA-4是高效的T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)某些Tr細(xì)胞的活性是必不可少。CTLA-4與其相關(guān)分子CD28之間有天然配體的區(qū)別，因?yàn)槎叨冀Y(jié)合B7-1和B7-2(由抗原呈現(xiàn)細(xì)胞[APCs]表達(dá))。我們使用了突變體B7-1分子(B7-1wa)，該分子有氨基酸點(diǎn)突變(W88 to A)，其能結(jié)合CTLA-4但不能結(jié)合CD28。如果用前胰島素原1(PPIns)作為核酸疫苗接種的目標(biāo)分子并與B7-1wa同時(shí)接種，則因Tr細(xì)胞無(wú)法識(shí)別而只有部分的保護(hù)作用。因此用PPIns/GAD65融合(Ins-GAD)作為目標(biāo)抗原以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的自體抗原目標(biāo)抗原決定簇(autoantigenic target epitopes)。雙核酸疫苗的接種使得提供負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)的T-細(xì)胞受體(TCR)與抗原識(shí)別的聯(lián)結(jié)，這樣持續(xù)產(chǎn)生的Tr細(xì)胞抑制了對(duì)胰島素或GAD65多肽的反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免于自體免疫疾病。重要的是特異性抑制作用只針對(duì)免疫胰島抗原。
I型糖尿病是T-細(xì)胞依賴(lài)性的自體免疫性疾病。由于患者廣泛的胰島B細(xì)胞損傷和持續(xù)的自體免疫狀態(tài)，因此很難治愈。成功的治療手段必須能補(bǔ)充胰島細(xì)胞質(zhì)量，控制自體免疫過(guò)程。根據(jù)本發(fā)明，GLP-1-IgG-Fc結(jié)合核酸疫苗(胰島素原，GAD65和能結(jié)合CTLA-4(CD152)的突變體B7(B7-1wa)是一種雙管齊下的治療方法。它既能夠通過(guò)GLP-1的作用促進(jìn)B細(xì)胞再生和增殖，改善B細(xì)胞功能，進(jìn)而恢復(fù)胰島B細(xì)胞正常分泌胰島素，增加胰島B細(xì)胞質(zhì)量，和減少分泌高血糖素，從根本上解除了患者高血糖癥狀的病因，改變以往治標(biāo)不治本的治療方法；同時(shí)通過(guò)核酸疫苗的作用控制患者的自體免疫過(guò)程，終止T殺傷細(xì)胞對(duì)胰島B細(xì)胞的持續(xù)傷害所造成的B細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，結(jié)束I型糖尿病患者必須終生依賴(lài)外源胰島素但仍然無(wú)法逆轉(zhuǎn)病程惡化的悲慘局面。本發(fā)明的藥物復(fù)合物的應(yīng)用可以完全免除有高度危險(xiǎn)發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病，或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他們的胰臟仍然有少量有活性的胰島B細(xì)胞。此外，使用本發(fā)明的藥物復(fù)合物的方法簡(jiǎn)便、療效持久、副作用少、費(fèi)用低廉，從而為徹底戰(zhàn)勝I(mǎi)型糖尿病提供了一條嶄新的途徑。


圖1說(shuō)明構(gòu)建GLP-1-IgG-Fc質(zhì)粒示意圖，其中圖A和圖B表示鼠GLP-1-IgG1-Fc；圖C和圖D表示人GLP-1-IgG2-Fc。
圖2說(shuō)明IgG-Fc融合蛋白在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)和檢測(cè)。
圖3說(shuō)明檢測(cè)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞分泌的GLP-1。
圖4(A)說(shuō)明COS-7細(xì)胞大量表達(dá)IgG-Fc融合蛋白，圖4(B)說(shuō)明GLP-1在哺乳細(xì)胞和大腸桿菌中的表達(dá)。
圖5說(shuō)明GLP-1融合蛋白在COS-7細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)。
圖6說(shuō)明GLP-1-IgG-Fc融合蛋白對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響。
圖7說(shuō)明GLP-1-IgG-FC對(duì)INS-1細(xì)胞產(chǎn)生cAMP與Ex-4有相似的功效。
圖8說(shuō)明GLP-1-IgG-IgG-Fc在二型糖尿病模型db/db受試鼠中表達(dá)的效果。
圖9說(shuō)明在經(jīng)STZ誘導(dǎo)形成的胰島素分泌缺陷的I型糖尿病模型鼠體內(nèi)表達(dá)GLP-1-IgG-Fc的效果。
圖10說(shuō)明GLP1-IgG-Fc在大型哺乳動(dòng)物豬中表達(dá)對(duì)血糖的影響。
圖11說(shuō)明用PPI/GAD和B7.1-wa進(jìn)行雙重疫苗接種的效果。
圖12說(shuō)明移植雙重疫苗接種的鼠脾細(xì)胞能夠預(yù)防由糖尿病NOD鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)的自家免疫疾病。
圖13抗原刺激引起的致糖尿病細(xì)胞(D)釋放IFNγ在體外被給以雙重疫苗接種鼠(V)脾細(xì)胞所抑制。只有CD4+，而不是CD8+抑制了致糖尿病細(xì)胞的反應(yīng)。
圖14顯示抗原刺激所致致糖尿病細(xì)胞(D)被來(lái)自雙重疫苗接種的鼠脾懸浮培養(yǎng)細(xì)胞CD4+B7.1+級(jí)分所抑制。
圖15顯示致糖尿病脾細(xì)胞抗原刺激引起的IFNγ釋放被雙重疫苗接種的鼠脾細(xì)胞抑制。
圖16說(shuō)明顯型抑制細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是用來(lái)自JacksonLaboratories(Bar Harbor，ME，USA)4周齡的雌性db/db模型鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb，批號(hào)000642)，來(lái)自Charles River Canada(Montreal，QC，Canada)作為對(duì)照的C57BLKS/J鼠和CD1鼠。購(gòu)自Taconic Farms(Germantown，NY)的雌性NOD鼠。受試鼠飼養(yǎng)在有控光照(12hs/12hs)、恒溫、無(wú)病原菌的條件下，提供充足的適宜嚙齒類(lèi)的食物和飲水。NOD鼠給以常規(guī)的滅菌的Charles River#5075食物。每日注射低劑量的STZ(55mg/kg，i.p.)連續(xù)5天誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素分泌缺陷的糖尿病鼠。
糖尿病的診斷受試鼠血糖水平每周用AccuSoft AdvantageTM測(cè)試儀或血糖儀(Roche Diagnostics)測(cè)試。當(dāng)連續(xù)2次測(cè)量血糖水平高于17.0mmol/L即診斷為糖尿病。
核酸疫苗的制備裝有鼠野生型GAD65 cDNA的Bluescript KS+質(zhì)粒為市售可得。無(wú)終止密碼子的全長(zhǎng)PPIns I序列已由本發(fā)明人于2002年在Hum.Gene Therapy雜志公開(kāi)。。重疊PCR法將PPIns I與全序列的GAD65融合，得到5‘-PPIns-GAD65-3’的PCR產(chǎn)物Ins-GAD，然后通過(guò)限制性酶切位點(diǎn)裝入已經(jīng)刪除熒光素酶基因的VR1255表達(dá)質(zhì)粒(Vical Inc.，San Diego，CA)，起名VR-Ins-GAD。在COS-7細(xì)胞表達(dá)裝有VR-Ins-GAD基因的質(zhì)粒，得到分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液的Ins-GAD雜交分子，并經(jīng)免疫印跡法確認(rèn)。同樣，注射這個(gè)質(zhì)粒并結(jié)合電轉(zhuǎn)移，在肌肉細(xì)胞里產(chǎn)生Ins-GAD蛋白。提取后經(jīng)免疫印跡和ELISA實(shí)驗(yàn)確認(rèn)?？盏腣R1255-質(zhì)粒取名VR作為對(duì)照。VR-B7-1wa的序列編碼B7-1分子并在88位點(diǎn)以色氨酸置換丙氨酸，置換方法為現(xiàn)有點(diǎn)突變技術(shù)。這些VR1255衍生的質(zhì)粒有人細(xì)胞巨化病毒(CMV)直接早期強(qiáng)化子和啟動(dòng)子(IE-EP)元件，CMV內(nèi)含子A，以及兔球蛋白終結(jié)序列。
質(zhì)粒構(gòu)建為擴(kuò)增GLP-1的全序列和鼠IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG質(zhì)粒為模板，以下列特異性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3’和5’-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’為引物進(jìn)行第一輪交迭PCR(overlap PCR)。以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪交迭PCR產(chǎn)生GLP-1-IgG-Fc cDNA序列。將擴(kuò)增的產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒Vmew的BamHI和Eco RV位點(diǎn)。為擴(kuò)增GLP-1和人IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG質(zhì)粒為模板，以下列特異性序列構(gòu)建人IgG2 FC(鉸鏈-CH2-CH3)所用引物為5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’和5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。所用載體同上。為構(gòu)建IgG-Fc對(duì)照質(zhì)粒，以下列特異性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’；和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒Vmew的Bam HI和Eco RV位點(diǎn)。載體含有CMV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，單一真核生物轉(zhuǎn)錄單元，兔最小貝它球蛋白多聚腺嘌呤尾和轉(zhuǎn)錄終止序列。
Vrnew載體是由VR1255載體刪除熒光素酶報(bào)告基因的衍生載體，并添加了限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。為使GLP-1或Exendin-4序列分泌，通過(guò)PCR于5‘端引入Igκ鏈信號(hào)肽或GHRH信號(hào)肽序列。為在細(xì)菌中表達(dá)GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，通過(guò)PCR擴(kuò)增Vrnew載體的融合cDNA序列，并亞克隆至pET-28a質(zhì)粒(Novagen)。構(gòu)建質(zhì)粒的示意圖如圖1所示。
GLP-1-IgG-Fe融合蛋白的表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，是將GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞系。其過(guò)程是先將密度為每孔2.5×105個(gè)的COS-7細(xì)胞生長(zhǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。添加含有4μg DNA IgG-Fc cDNAs和10μL轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的無(wú)血清無(wú)抗菌素的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)在37℃的CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。6h后，轉(zhuǎn)換為DMEM全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48h分別收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞分泌的融合蛋白見(jiàn)圖3。為了大規(guī)模地表達(dá)GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，將COS-7細(xì)胞培養(yǎng)在150mm培養(yǎng)皿，分別用150mM NaCl將陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑Poly(ethyleneimine)(PEI，25kDa)和80μg相關(guān)cDNA稀釋?zhuān)旌虾蠓胖?0min.然后將DNA/PEI復(fù)合物加到盛有無(wú)血清無(wú)抗菌素DMEM培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿在37℃的CO2培養(yǎng)箱放置6h后，以加有10％FBS和1％P/S的DMEM培養(yǎng)液取代。該方法的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)85％。大量表達(dá)融合蛋白的結(jié)果見(jiàn)圖4A。
為建立穩(wěn)定表達(dá)GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的COS-7細(xì)胞系，細(xì)胞以每孔2.5×105的密度在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，并按照上述步驟轉(zhuǎn)染4μg線性化的GLP-1/IgG-Fc質(zhì)?；蜃鳛閷?duì)照的IgG-Fc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染以后24h，細(xì)胞在含有G418(500μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，以篩選已經(jīng)穩(wěn)定整合重組外源cDNA的細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程中，每3天換培養(yǎng)液一次直至穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞克隆形成。分離單克隆細(xì)胞培養(yǎng)成穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)液分別用鼠GLP-1 RIA試劑盒檢測(cè)融合蛋白。將能分泌融合蛋白的細(xì)胞揀出并供以后的特性分析。穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的COS-7細(xì)胞系RIA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。在細(xì)菌細(xì)胞系中表達(dá)GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，是將GLP-1-IgG-Fc/pET28a質(zhì)?；?qū)⒆鳛閷?duì)照的IgG-Fc/pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta gami 2細(xì)胞系(Novagen，EMD biosciences，San Diego，CA)。方法可以是傳統(tǒng)的氯化鈣法或是應(yīng)用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。其具體參數(shù)可以從任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中查到。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于培養(yǎng)皿過(guò)夜培養(yǎng)，挑揀并篩選最佳表達(dá)融合蛋白的細(xì)菌菌斑。挑揀單個(gè)菌斑在50mL加有卡那霉素的2XYT培養(yǎng)液于37℃以225rpm過(guò)夜培養(yǎng)。而后將培養(yǎng)液以1∶50稀釋到新培養(yǎng)液，直至細(xì)胞密度達(dá)到O.D600讀數(shù)值0.6后，再在培養(yǎng)液中添加1mM的IPTG(EMD)以誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。添加后3hr離心收集細(xì)菌細(xì)胞并在-80度保存。融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和大腸桿菌的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖4B。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的純化本發(fā)明的實(shí)例是從轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或是大腸桿菌中以中小規(guī)模提取純化融合蛋白。小規(guī)模提取純化的具體做法是從培養(yǎng)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中每孔取2.5mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至以含100mM Tris pH 8.0和150mM NaCl的緩沖液平衡過(guò)的裝有70μL滿體積事先結(jié)合G蛋白的葡聚糖凝膠4快速洗脫樹(shù)脂(Amersham-Pharmacia)。經(jīng)過(guò)4℃過(guò)夜后，以Tris緩沖液沖洗，然后以30μL含SDS的樣品緩沖液將融合蛋白洗脫。
中規(guī)模提取純化是用來(lái)獲得較大量的融合蛋白。其具體步驟是從轉(zhuǎn)染后48h的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或是從穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞中，收集50mL的DMEM培養(yǎng)液。裝入1mL滿體積事先結(jié)合G蛋白的葡聚糖凝膠柱(Amersham-Pharmacia).并在1％Triton X-100下4℃過(guò)夜。而后反復(fù)用含0.1％Triton X-100的PBS沖洗，最后一步用150mM NaCl沖洗。用1mL 0.1 M glycine(pH 2.7)洗脫融合蛋白。洗脫液用Tris緩沖液(pH 9.0)中和，融合蛋白用PD-10柱(Amersham-Pharmacia)脫鹽并用PBS洗脫。經(jīng)凝膠柱純化的蛋白經(jīng)以上洗脫、中和、除鹽后的最終體積為1mL。
用同樣的方法也可以從細(xì)菌中純化融合蛋白。將轉(zhuǎn)化有融合蛋白基因質(zhì)粒的細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)，次日離心后的沉淀重新溶于含有多種蛋白酶抑制劑(Sigma，MO)的冷PBS緩沖液并通過(guò)超聲波裂解細(xì)胞。緩沖液中加入1％Triton X-100保持30min后離心(12,000g，10min)，得到含有融合蛋白的上清液。其經(jīng)凝膠柱純化的過(guò)程以及洗脫、中和、除鹽的過(guò)程與上述相似。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的檢測(cè)1.使用一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)確定GLP-1-IgG-Fc融合蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。設(shè)計(jì)基因特異性引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。
從轉(zhuǎn)染融合蛋白質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞系取100ng的總RNA作為模板和添加0.6μM的引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’和
5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。其它條件無(wú)特殊要求。一步RT-PCR的條件是50℃，30min；95oC，15Min；40循環(huán)。94℃，30sec，55℃，30sec；72℃，60sec，最后10min，72℃.RT-PCR產(chǎn)物通過(guò)1％agarose電泳分離，用溴化乙錠染色檢測(cè)。2.SDS-PAGE和免疫印跡反應(yīng)對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行翻譯水平上的檢測(cè)。取小規(guī)模提取的融合蛋白30μL經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，并用抗鼠抗體(15000，Amersham-Pharmacia)探測(cè)，用ECL顯影(Amersham-Pharmacia)。30μL中等規(guī)模提取的融合蛋白則經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳分離后用考馬斯亮蘭染色檢測(cè)。融合蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的表達(dá)分別見(jiàn)圖2a和圖2b。
模型鼠體內(nèi)表達(dá)GLP-1-IgG-Fc對(duì)糖尿病db/db模型鼠、NOD模型鼠和注射STZ的CD1鼠分別于肌肉注射GLP-1-IgG-Fc/Vmew載體或注射IgG-FcVRnew對(duì)照載體。注射后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化用來(lái)促進(jìn)基因體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。對(duì)受試鼠施行麻醉，用27號(hào)針頭于肌肉注射50mg溶于PBS的GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc質(zhì)粒。注射針頭套以塑料套以限制針頭進(jìn)入肌肉深度小于5mm。注射后進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，在電極之間施加100V方波電脈沖(1S間隔)。注射DNA后4、6、32周在空腹情況下取隱靜脈血?？崭寡呛坑靡徊椒ɑ狙怯?jì)(Lifescan Canada)測(cè)定，GLP-1，胰島素和高血糖素含量的檢測(cè)見(jiàn)下述。GLP-1-IgG-Fc在受試鼠中表達(dá)效果見(jiàn)圖8。
大型哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)GLP1-IgG-Fc將GLP-1-IgG-Fc或?qū)φ誌gG-Fc質(zhì)粒肌肉注射到Y(jié)orkshire公豬，每頭4mg/23kg隨后用ADViSYS電轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。注射3天后，將能引起高血糖癥的Alloxan水化物(80mg/kg，Sigma)溶于25ml鹽水，PH調(diào)中性，在麻醉?xiàng)l件下靜脈注射。因該中性溶液不能有效引起高血糖，隨后又在僅注射空白IgG-Fc質(zhì)粒的對(duì)照組注射以引起中等程度高血糖。每周測(cè)量空腹血糖2次并用ELISA檢測(cè)Fc蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖10。
GLP-1分泌實(shí)驗(yàn)GLP-1分泌實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)是采用GLP-1放射免疫試劑盒(Linco)，對(duì)瞬時(shí)或永久表達(dá)GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc融合蛋白的COS-7細(xì)胞系的培養(yǎng)液或轉(zhuǎn)化融合蛋白基因的細(xì)菌裂解液檢測(cè)其總GLP-1(包括各種形式的GLP-1)水平。對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)GLP-1水平的檢測(cè)是用GLP-1 ELISA試劑盒(Linco)對(duì)取自db/db受試鼠的血漿GLP-1水平進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。
胰臟胰島素含量檢測(cè)為了比較GLP-1-IgG-Fc(Ex4-IgG-Fc，或GLP-1A8G-IgG-Fc)基因注射的鼠與僅注射Fc片斷的鼠胰臟胰島素總量的差別，將胰臟提取液按照已發(fā)表的方法用鼠胰島素RIA試劑盒(Linco，St.Charles，MO)測(cè)量。
胰島灌注實(shí)驗(yàn)為了比較GLP-1-Fc(Ex4-Fc，或GLP-1A8G-Fc)基因注射的鼠與僅注射Fc片斷的鼠胰臟胰島素分泌量的不同，按照已發(fā)表的方法進(jìn)行胰島灌注實(shí)驗(yàn)。
B細(xì)胞質(zhì)量測(cè)定胰腺切片(4mm)按如前描述的處理.簡(jiǎn)言之，通過(guò)脫蠟，脫水和在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，切片與豚鼠抗胰島素抗體(Dako Diagnostics)在4℃孵育過(guò)夜，然后樣品用生物素標(biāo)記的抗豚鼠抗體(Vector Laboratories)孵育1h，隨后用抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物(Vectastain Elite ABC試劑盒；Vector Laboratories，Burlingame，CA)處理1h。切片然后用DAB(Sigma-Aldrich)染色10min。DAB染色后，切片用自來(lái)水沖洗，并用蘇木精復(fù)染。通過(guò)連接帶有彩色監(jiān)視器和圖像采集軟件的視頻照像設(shè)備的Nikon(ECLIPSE-E1000)顯微鏡，從切片上胰島素抗體著色程度測(cè)定B細(xì)胞質(zhì)量。由B細(xì)胞占據(jù)的樣品切面區(qū)和所有胰腺組織的樣品切面區(qū)進(jìn)行定量。B細(xì)胞質(zhì)量測(cè)定和以下B細(xì)胞質(zhì)量分析結(jié)果見(jiàn)圖9。
胰島B細(xì)胞質(zhì)量分析胰島細(xì)胞質(zhì)量，特別是B細(xì)胞質(zhì)量，是評(píng)估胰島B細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。為了弄清GLP-1-Fc(Ex4-Fc或GLP-1A8G-Fc)受試鼠或Fc對(duì)照鼠以及空白對(duì)照鼠細(xì)胞質(zhì)量的不同，我們對(duì)先前的方法進(jìn)行了改進(jìn)，A-，B-和D細(xì)胞依次用抗胰島素、抗高血糖素和抗生長(zhǎng)激素抑制素抗體(11,000；DAKO)和相關(guān)的熒光二抗(DAKO)染色。所有3次染色的胰島細(xì)胞以及胰臟組織切片置于裝有數(shù)碼相機(jī)和ImagePlus軟件(NIH)的熒光顯微鏡定量檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定切面3重染色的胰島細(xì)胞面積除以總的組織切面面積和固定前的胰腺重量，得到每個(gè)胰腺的總的B細(xì)胞質(zhì)量。同樣，胰臟總的B細(xì)胞(或alpha細(xì)胞)是通過(guò)測(cè)定切面胰島素陽(yáng)性染色的B細(xì)胞(或A細(xì)胞)面積除以總的組織面積和固定前的胰腺重量。
B細(xì)胞增殖和凋亡是應(yīng)用文獻(xiàn)所述BrdU和Tunel染色技術(shù)。胰臟切片用抗胰島素和抗BrdU鼠IgG抗體(Sigma)雙重染色，或是Tunel染色(ApopTag試劑盒；Intergen)并用Nikon顯微鏡(x1000)觀察。BrdU+或Tunel+陽(yáng)性B細(xì)胞計(jì)數(shù)以得到BrdU+或Tunel+的數(shù)值/B細(xì)胞總數(shù)。由于淋巴因子誘導(dǎo)的B細(xì)胞破壞是伴隨著細(xì)胞壞死，B細(xì)胞壞死是用DAPI/propidium iodide染色技術(shù)確定。
胰島再生的檢測(cè)是采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的方法，即切片上總的胰島數(shù)目(包括單個(gè)的B細(xì)胞或3-5個(gè)B細(xì)胞群)除以切片上總的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。
口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)是為了確定GLP-1-Fc治療的胰島素分泌和體內(nèi)葡萄糖利用情況，實(shí)驗(yàn)方法采用以前發(fā)表的文獻(xiàn)的方法。
胰島素和高血糖素分泌實(shí)驗(yàn)將胰島素分泌細(xì)胞系INS-1細(xì)胞以每孔2.5×105的密度在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。使用含10％FBS血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液。次日，以無(wú)葡萄糖的新鮮KRB緩沖液培養(yǎng)2次每次30min。然后細(xì)胞分別接受加有0.5或20mM的葡萄糖及不同濃度的純化的GLP-1 IgG融合蛋白的KRB緩沖液處理1hr。按照使用說(shuō)明書(shū)用鼠胰島素RIA試劑盒(Linco，St.Charles，MO)測(cè)量25 LKRB緩沖液中的胰島素水平。
cAMP的測(cè)量將INS-1細(xì)胞以每孔62,500個(gè)細(xì)胞的密度在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。在次日的實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞在加有100 M IBMX的450mL的無(wú)血清SF-RPMI培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)5h。而后細(xì)胞在加有提純的Fc融合多肽(120nM)或Exendin-4(100nM)的SF-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)10min后，加入1mL冰凍乙醇結(jié)束反應(yīng)。提取物保持在-20℃條件下3h或過(guò)夜。然后將每200μL分裝并凍干。凍干的樣品重新溶于50μL醋酸鈉緩沖液并用cAMP RIAs試劑盒檢測(cè)(Biomedical Technologies)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。
核酸疫苗的應(yīng)用肌肉注射和體內(nèi)電轉(zhuǎn)移的方法為現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)使用的方法。核酸疫苗的應(yīng)用包括組成藥物復(fù)合物的3種核酸疫苗分別單獨(dú)使用，或共同使用，以及與GLP-1-IgG-Fc(或其突變體或Ex4-IgG-Fc)同時(shí)聯(lián)合使用。簡(jiǎn)言之，小鼠麻醉后在后腿肌注射總量50μg的DNA。注射后立即實(shí)施電轉(zhuǎn)移。使用ECM830型電轉(zhuǎn)移儀的卡鉗式電極(Genetronics Inc)以200V/cm電壓，對(duì)受試鼠涂以傳導(dǎo)膠的皮膚表面實(shí)施8次電脈沖，每次持續(xù)時(shí)間20ms。3-4周后重復(fù)注射。核酸疫苗的應(yīng)用結(jié)果見(jiàn)圖11-16。
體外脾細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)從核酸疫苗免疫的受試鼠得到的脾懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)去除血紅細(xì)胞后置于無(wú)血清AIM V培養(yǎng)液(Invitrogen)并添加0.05mM B巰基乙醇。將免疫抗原加入培養(yǎng)液使其終濃度為0.05mg/ml。同時(shí)合成了同樣摩爾數(shù)的3份GAD65多肽，這3份多肽的序列分別是TYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGD(amino acids206-236)；AALGIGTDSVILIKCDERGK(amino acids 290-309)和VPPSLRTLEDNEERMSRLSKVAPVIKARMMEYGTT(amino acids509-543).它們覆蓋了T細(xì)胞識(shí)別的大多數(shù)抗原決定簇。牛胰島素購(gòu)自Sigma Chemicals，MO.用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)言之，免疫抗原刺激后72h將MTT溶液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，終濃度為1mg/ml。實(shí)驗(yàn)平行做4份樣品。4h后，加入異丙醇終止反應(yīng)并加入0.04 M HCl酸化。溶解的MTT反應(yīng)產(chǎn)物在540nm比色。以抗原刺激細(xì)胞MTT減少量的光密度增加值與非抗原刺激的對(duì)照組的光密度值的比值來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖。
淋巴因子白介素分泌實(shí)驗(yàn)上述脾細(xì)胞以每孔5×105cell的密度培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)72h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液并分裝后冷凍保存，用以測(cè)定IL-10，IFN和TGF釋放量。在每100μL培養(yǎng)液加入10μL1NHCl酸化處理活化后測(cè)定TGF1含量。用BD Biosciences公司ELISA試劑盒按操作手冊(cè)規(guī)定的程序測(cè)定淋巴因子白介素水平。
不同淋巴細(xì)胞的分離和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用干細(xì)胞技術(shù)公司(Toronto，Canada)生產(chǎn)的鼠CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞EasySep試劑盒將分離紅血細(xì)胞后懸浮培養(yǎng)的脾細(xì)胞中的CD4+和CD8+細(xì)胞進(jìn)行分離。該試劑盒是采用負(fù)磁性分揀技術(shù)。分揀后的細(xì)胞純度經(jīng)流式細(xì)胞儀證實(shí)為92-95％。用該公司所產(chǎn)鼠生物素選擇EasySep試劑盒將CD4+細(xì)胞又進(jìn)一步分為CD25+和CD25-兩類(lèi)。并用生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD25抗體(BD Pharmingen)、抗小鼠B7.1抗體(BD Pharmingen)、抗人/小鼠LAP-TGF抗體以及兔抗大鼠/小鼠Nrp1抗體和生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(BD Pharmingen)與上述正篩選試劑盒聯(lián)用，將B7.1+，Nrp1+，or LAP-TGF.淋巴細(xì)胞由總CD4+淋巴細(xì)胞中分離。以上操作都依照試劑盒實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行，分離后淋巴細(xì)胞純度經(jīng)由流式細(xì)胞儀測(cè)定。流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)如下所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11-16。
流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)FITC-或PE-標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4，CD25，CD 86(B7.1)，CD152(CTLA-4)和IgG同系物購(gòu)自BD Pharmingen公司。非標(biāo)記的和生物素標(biāo)記的大鼠抗人/小鼠LAP-TGF購(gòu)自R&D Systems公司。兔抗鼠neuropilinl(Nrp1)多克隆IgG購(gòu)自O(shè)ncogene公司?？筁AP-TGF以及鼠IgG同系物標(biāo)記了Molecular Probes公司的Alexa Fluor 488染料?？笰nti-Nrp1IgG和兔正常IgG標(biāo)記了Alexa Fluor 647染料。由于抗Nrp1抗體含有0.2％明膠，豬明膠也標(biāo)記了Alexa Fluor 647染料并加到抗體同系物中，其最終濃度為0.2％以便校正標(biāo)記的作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的明膠結(jié)合可能造成的誤差。
核酸疫苗誘導(dǎo)免疫耐受性的實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)GLP-1-Fc融合蛋白基因治療方法對(duì)NOD自體免疫糖尿病的有效性，我們同時(shí)進(jìn)行了核酸疫苗誘導(dǎo)免疫耐受性的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。使用了Ins-GAD核酸疫苗(pIns-GAD質(zhì)粒)作為抗原。該疫苗特性已經(jīng)了解得很清楚并在我們先前的疫苗接種實(shí)驗(yàn)中取得了鼓舞人心的結(jié)果。該疫苗編碼I型糖尿病2種主要目標(biāo)分子大部分的抗原決定簇，即前胰島素原和GAD65。該疫苗將與第2個(gè)質(zhì)粒同用，如pB7-1wa編碼選擇性的CTLA-4配體(B7-1分子的突變體B7-1wa)。基因轉(zhuǎn)移如我們先前所進(jìn)行的由體內(nèi)電轉(zhuǎn)移進(jìn)行強(qiáng)化，基因電轉(zhuǎn)移可以大大增加基因轉(zhuǎn)移的效率并可能在人類(lèi)和大型動(dòng)物中應(yīng)用，之前人類(lèi)中使用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)較嚙齒類(lèi)動(dòng)物中效率低的多。先前的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)觀察到同時(shí)使用Ins-GAD/B7-1wa這2種核酸疫苗改善了新發(fā)糖尿病的NOD鼠葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡，并獲約32％的受試鼠完全的治愈率，對(duì)比只接受空質(zhì)粒治療的對(duì)照組只有＜5％的治愈率(p＜0.01)。多數(shù)受試鼠沒(méi)有治愈是由于在治療之前胰島細(xì)胞受損程度太高，或是疫苗不完全誘導(dǎo)耐受性。在疫苗接種的同時(shí)施加GLP-1-Fc基因轉(zhuǎn)移，目的在于確定胰島細(xì)胞的再生是否可獲治愈，并分析在已經(jīng)出現(xiàn)糖尿病的受試鼠中是否能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11-16。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SEM)的形式表示。用SAS軟件(Statistical Analysis Systems，Cary，NC)進(jìn)行學(xué)生T檢驗(yàn)和ANOVA”n-1”分析，以p＜0.05表示顯著性差異。并應(yīng)用SAS軟件(StatisticalAnalysis Systems，Cary，NC)或是GraphPad Prism 3.0軟件(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA)。用Kaplan-Meier法對(duì)糖尿病影響范圍作圖，應(yīng)用對(duì)數(shù)歸類(lèi)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。insulitis scores的顯著性差異用Chi方檢驗(yàn)。體外增殖實(shí)驗(yàn)各組之間差別以及淋巴因子釋放實(shí)驗(yàn)用ANOVA分析確定，p＜0.05表示顯著性差異。
以上列舉對(duì)本專(zhuān)利的描述僅僅是一些實(shí)施舉例說(shuō)明。此將意識(shí)到，由于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或是由于提交本發(fā)明專(zhuān)利的方法引起的一些明顯的誤差包括筆誤將很容易被行內(nèi)專(zhuān)別。這些差異所寓本意也應(yīng)屬于本發(fā)明的描述和權(quán)利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物，其特征在于，該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽或含有該多肽的基因的表達(dá)質(zhì)粒；2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物，其特征在于，所述能夠治療I型糖尿病的多肽為胰高血糖素類(lèi)似肽GLP-1或與其具有50％以上同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物，其特征在于，所述IgG-Fc為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
4.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物，其特征在于，所述融合蛋白為胰高血糖素類(lèi)似肽GLP-1與IgG-Fc的融合蛋白，其中IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3；或GLP-1的同功因子為蜥蜴唾液腺多肽extendin-4與IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物，其特征在于，所述的融合蛋白的突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc，其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代，并且IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3。
6.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物的給藥途徑，其特征在于，所述給藥途徑為口服、肌肉注射、靜脈注射、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥。
7.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物的給藥劑量，其特征在于，被給藥的具有蛋白活性的藥物復(fù)合物的量為0.05nmol～1nmol/kg體重，或有效cDNA的量為1μg-10μg/kg體重。
8.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物用于制備治療糖尿病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用，該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽；2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)蛋白CTLA－4的B7－1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物可以有效地預(yù)防和治療糖尿病。本發(fā)明的藥物復(fù)合物能夠促進(jìn)B細(xì)胞再生和同時(shí)控制自體免疫過(guò)程，這樣，可以完全免除有高度危險(xiǎn)發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病，或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的Ⅰ型糖尿病人。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1935261SQ200610127238
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日
發(fā)明者王慶華, 黃曉航 申請(qǐng)人:王慶華, 黃曉航