專利名稱：：CMTM1-v17的新應(yīng)用及其拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及CMTM1-W7的新應(yīng)用及其拮抗劑，具體地說，本發(fā)明涉及CMTMl-v17作為一個(gè)新的耙標(biāo)在診斷腫瘤中的應(yīng)用、CMTMl-v17的拮抗劑在制備診斷和域治療癌癥的藥物中的應(yīng)用、診斷和/或治療癌癥的藥物組合物以及檢測(cè)CMTMl-v17表達(dá)的試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是惡性腫瘤的總稱，目前己成為僅次于心臟病的另一個(gè)嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，而且世界范圍內(nèi)患者的數(shù)量一直呈上升的趨勢(shì)，給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一般認(rèn)為，惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的主要特性之一是無限增殖性。從細(xì)胞凋亡的角度看，腫瘤是腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到抑制、不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果，即由于腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到干擾所致。因此，可利用細(xì)胞凋亡機(jī)制來對(duì)腫瘤進(jìn)行治療?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多基因在癌癥的發(fā)病中起了重要的促進(jìn)作用，它們可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，或者促進(jìn)新生血管的生成等機(jī)制來發(fā)揮作用，因此，這類基因可以作為治療腫瘤的靶標(biāo)，通過相應(yīng)的抑制措施來敲除此類基因或用相應(yīng)的拮抗劑達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，如VEGF、WT等。趨化因子是能夠使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的一類細(xì)胞因子，在炎癥、自身免疫和變態(tài)反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要的作用。CMTMl-vl7(CKLF-likeMARVELtransmembranedomaincontaining,曾稱為CKLF-H1A)是本發(fā)明人以CKLF-1的核苷酸序列(詳見中國(guó)專利99107284.7)為基礎(chǔ)通過分析表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)發(fā)現(xiàn)的，并且發(fā)現(xiàn)其可用于治療造血系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病(中國(guó)專利ZL00121027.0)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供CMTMl-v17的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種多克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種診斷和域治療癌癥的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)CMTMl-v17表達(dá)的試劑在制備用于檢測(cè)癌癥的組合物中的應(yīng)用。根據(jù)上述第一個(gè)方面，本發(fā)明的CMTMl-v17有可能作為一個(gè)新的腫瘤治療的耙標(biāo)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)染CMTMl-v17能抵抗TNF-a誘導(dǎo)的凋亡。當(dāng)使用siRNA干擾掉CMTMl-v17的表達(dá)以后，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞抵抗TNF-a誘導(dǎo)凋亡的能力降低，從而充分證明CMIMl-v17具有抵抗TNF-a誘導(dǎo)的凋亡的作用。本發(fā)明人還證明了體外轉(zhuǎn)染CMTMl-v17能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞在體外的增殖，因此本發(fā)明CMTMl-vl7在具有抵抗TOF-a誘導(dǎo)凋亡作用的同時(shí)，還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。在本發(fā)明中，CMTMl-v17包括CM!Ml-v17基因或CMTMl-v17蛋白等。所述CMTMl-vl7蛋白為如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，其具有149個(gè)氨基酸。所述CMTMl-vl7基因?yàn)榫幋a本發(fā)明的SEQIDNO:2的多核苷酸序列，其可以為SEQIDNO:2所示氨基酸的編碼序列，或者除了上述氨基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA。其中優(yōu)選的基因?yàn)镾EQIDNO:1所示的多核苷酸序列，該序列全長(zhǎng)603個(gè)核苷酸，編碼序列為第1450位核苷敏CDS:第1447位核苷酸)?；蛘?，更優(yōu)選一種分離的核苷酸序列，其只包含編碼CMTMl-v17蛋白序列，例如SEQIDNO:l所示的編碼序列核苷酸1450。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的CMTMl-v17的核苷酸序列可以完全相同于如SEQIDNO:1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。本發(fā)明的CMTMl-v17多核苷酸序列可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴(kuò)增得到。這樣得到的核苷酸可以克隆進(jìn)合適的載體中，并用DNA分析技術(shù)進(jìn)行序列描述。也可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)得到，例如，使用可以按本領(lǐng)域熟知的固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發(fā)明的CMTMl-v17蛋白可以通過常規(guī)方法獲得，例如通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的CMTMl-v17蛋白，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供CMTM1-V17的拮抗劑在制備診斷和域治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。由于拮抗劑(例如蛋白、核酸、碳水化合物)可以與本發(fā)明的CMTM1-V17結(jié)合并抑制或封閉本發(fā)明的CMTMl-v17的生物活性，所以本發(fā)明的拮抗劑可以用于診斷和/或治療癌癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的拮抗劑可以為抗CMTMl-v17或其抗原性片段的特異性單克隆或多克隆抗體。這里所述的"特異性"是指抗體能結(jié)合于本發(fā)明的CMTMl-v17基因產(chǎn)物或片段。優(yōu)選那些能與本發(fā)明的CMTMl-v17的基因產(chǎn)物結(jié)合但不識(shí)別且不與其它非相關(guān)抗原分子結(jié)合的抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知，本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體可以通過本發(fā)明的CMTMl-v17的全長(zhǎng)或其抗原性的片段作為抗原進(jìn)行免疫獲得，所述抗原性片段例如位于SEQIDNO:2的C端的第118149位氨基酸。所述抗原性片段序列短、易于合成，而且經(jīng)生物信息學(xué)分析以及實(shí)驗(yàn)證明其抗原性比較好。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的拮抗劑可以為針對(duì)本發(fā)明的CMTMl-v17的反義RNA。反義RNA能與本發(fā)明的CMTMl-v17的mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制CMTMl-v17的表達(dá)和功能。通常反義RNA由1520個(gè)核苷酸組成，可由人工合成及以表達(dá)載體兩種方式得到。后者是利用基因重組技術(shù)，在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子間反向插入一段靶基因，從而得到反義表達(dá)的RNA。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的拮抗劑可以為小干擾RNA(siRNA)。所謂siRNA，就是包含19個(gè)堿基的小片段RNA，在導(dǎo)入細(xì)胞或組織后，可以特異地誘發(fā)與其同源的靶基因mRNA發(fā)生降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)受到抑制，從而控制與耙基因有關(guān)的功能。所述siRNA可以通過諸如化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或用RNasem消化長(zhǎng)片段雙鏈RNA等體外制備方法或siRNA表達(dá)載體、siRNA表達(dá)框架等體內(nèi)表達(dá)方法來制備，并利用各種方法提高本發(fā)明RNA的穩(wěn)定性。制備方法和提高穩(wěn)定性的方法可參見WO2005/007623及其所參考的文獻(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌和胃癌等8個(gè)腫瘤組織中均檢測(cè)到CMTMl-vl7的表達(dá)；同時(shí)大量的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的CMTMl-v17蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)。而本發(fā)明的CMTM1-W7不但具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，還具有抵抗TNF-a誘導(dǎo)凋亡的作用。因此，本發(fā)明CMTMl-v17可作為癌癥治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。例如抑制本發(fā)明CMTMl-vl7的基因或蛋白，可以用于治療腫瘤，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌或胃癌等癌癥。同時(shí)本發(fā)明的CMTMl-v17可作為癌癥診斷的一個(gè)新的指標(biāo)，利用前述針對(duì)CMTMl-v17或其片段的多克隆抗體或單克隆抗體可檢測(cè)樣品中CMTMl-v17的表達(dá)或表達(dá)水平，從而為診斷腫瘤提供新的診斷依據(jù)。可以利用本領(lǐng)域己知的任何方法檢測(cè)本發(fā)明的CMTMl-v17核苷酸在核酸水平的表達(dá)，例如經(jīng)與用放射性同位素標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴(kuò)增后的DNA序列雜交，這樣可根據(jù)放射性的有無及強(qiáng)度來定性或定量檢測(cè)CMTMl-v17的表達(dá)水平。也可以采用非放射性標(biāo)記物例如生物素、異羥洋地黃毒苷配基、二硝基苯甲醛、光生物素、乙酰氨基芴等。當(dāng)上述方法與PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法結(jié)合后，其檢測(cè)的靈敏度和特異性顯著提高，也可使用衍生于PCR方法檢測(cè)，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。逆轉(zhuǎn)錄PCR不僅可以檢測(cè)DNA，也能對(duì)RNA進(jìn)行分析和研究。作為選擇，可以原位直接從活組織檢查或切除術(shù)得到的患者組織的組織切片(固定和/或冰凍)上來檢測(cè)本發(fā)明CMTMl-v17多核苷酸的表達(dá)，此時(shí)不需要純化核酸。這些分析技術(shù)包括DNA或RNA印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交分析以及聚合酶鏈反應(yīng)。這些分析既可揭示CMTMl-v17表達(dá)的定量方面的情況，也可揭示CMTMl-v17表達(dá)和/或組合物的定性方面的情況。例如可以釆用Southern雜交分析來檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平?，F(xiàn)在有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停梢杂寐《据d體進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，來達(dá)到干擾目的基因的作用。也可以在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)本發(fā)明CMTMl-v17的表達(dá)水平。檢測(cè)方法也是本領(lǐng)域己知的，例如利用本發(fā)明CMTMl-v17蛋白特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，利用直接或間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法、WesternBlot、免疫組織化學(xué)等進(jìn)行檢測(cè)。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horserad-ishPeroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosphatease,AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶、P-D-半乳糖苷酶和脲酶等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知，針對(duì)不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS等。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。免疫印跡(WestemBlot)是借助SDS存在下高分辨率的PAGE電泳將抗原根據(jù)其分子量大小不同而有效分成許多蛋白區(qū)帶，將分離后的蛋白帶經(jīng)不同途徑轉(zhuǎn)移至一種固相支持體如硝酸纖維膜或PVDF膜上，然后以抗體為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)合于固相支持體的抗體可用酶標(biāo)的二抗如堿性磷酸酶或辣根過養(yǎng)化物酶偶聯(lián)的第二抗體等檢測(cè)。免疫印跡可鑒定出混合物中未知蛋白極其分子質(zhì)量。免疫組織化學(xué)是在組織切片中進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，可以檢測(cè)抗原在組織中的含量和定位。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種多克隆抗體，其與SEQIDNO:2的第118149位氨基酸特異性結(jié)合。經(jīng)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，SEQIDNO:2的第118149位氨基酸可以有效產(chǎn)生抗體。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段;抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來制備。例如，純化的本發(fā)明CMTMl-vl7蛋白或其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動(dòng)物等)以誘導(dǎo)含有多克隆抗體的抗血清的產(chǎn)生，必要時(shí)在免疫時(shí)可加入佐劑，以增強(qiáng)免疫效果。為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，需要對(duì)抗血清進(jìn)行純化?？寡寮兓墒褂脦追N不同的方法，常用的是蛋白A/G結(jié)合法和抗原親和純化法。A蛋白或G蛋白對(duì)IgG抗體Fc臂具有特異吸附，此特性可用于純化IgG抗體。對(duì)不同物種產(chǎn)生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差別。免疫親和純化法是用于從原血清中分離抗原特異性抗體的最常用方法。這種方法能得到特異性的Ig?？乖紫裙矁r(jià)結(jié)合于分離柱上的固定相，多抗樣品中對(duì)此抗原有特異吸附的抗體將由于同抗原的吸附而留在分離柱上。未能結(jié)合非特異的抗體將從分離柱上首先被洗脫，進(jìn)一步洗脫將得到特異性抗體。用免疫親和純化法得到的抗體具有很高的特異性。本發(fā)明使用這兩種方法，制備和純化了抗CMTMl-vl7多克隆抗體，經(jīng)證明純化后的抗體具有很好的活性以及特異性。制備本發(fā)明的CMTMl-v17或其片段的單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域己知的方法，例如以蛋白或其片段作為抗原免疫動(dòng)物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動(dòng)物)，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)，與同系動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行單克隆化。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供一種診斷和/或治療癌癥的藥物組合物。該藥物組合物包含針對(duì)CMTMl-v17或其片段的抗體、反義RNA、siRNA等拮抗劑，還可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。所述載體或賦形劑可以包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合。所述藥物組合物還可以進(jìn)一步包含滲透促進(jìn)劑、抗氧化劑和/或蛋白酶抑制劑等；特別是在活性成分為siRNA時(shí)，還優(yōu)選所述藥物組合物包含RNA酶抑制劑，或優(yōu)選藥物組合物的各成分都不含RNA酶。為治療目的，所述藥物組合物可以采用適當(dāng)?shù)闹苿┬问讲⑼ㄟ^適當(dāng)?shù)慕o藥途徑來施用。對(duì)于制劑形式，可以將所述藥物組合物制成各種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體制劑、聚合物制劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑等。對(duì)于給藥途徑，例如對(duì)于肺癌的給藥，可以釆用霧化形式的藥物組合物通過吸入來實(shí)現(xiàn)；對(duì)于乳腺癌等的給藥，可以采用溶液形式的所述藥物組合物通過注射來實(shí)現(xiàn)；對(duì)于膀胱癌等的給藥，可以采用溶液形式的藥物組合物通過清洗靶組織來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于皮膚癌的給藥，可以采用乳劑或凝膠劑等形式通過局部給藥(例如作為液體、乳劑或凝膠劑)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的藥物組合物可以全身給藥，例如通過靜脈注射；或者局部給藥，例如對(duì)患癌部位局部注射。最適的劑量要根據(jù)患者的病情、年齡、性別或體重，給藥方式和所需功效而定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在其知識(shí)范圍內(nèi)無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可確定最佳的施用方式。至于本發(fā)明的藥物組合物在診斷方面的應(yīng)用，可以利用所述藥物對(duì)來自受試者的樣品進(jìn)行檢測(cè)，所述樣品來自脫離受試者的血液、毛發(fā)、組織切片等，尤其是來自結(jié)腸、直腸、食管、肺、腎、肝、膀胱、胃、乳房等組織的組織切片；檢測(cè)的具體方法例如通過直接或間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法、WesternBlot、免疫組織化學(xué)等測(cè)定CMTMl-vl7蛋白在靶組織中的表達(dá)水平；或者，例如經(jīng)與用放射性或非放射性同位素標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴(kuò)增后的DNA序列雜交，進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)上述方法與PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法結(jié)合后，其檢測(cè)的靈敏度和特異性顯著提高，也可使用衍生于PCR方法檢測(cè)，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。作為選擇，可以原位直接從活組織檢査或切除術(shù)得到的患者組織的組織切片(固定和/或冰凍)上來檢測(cè)本發(fā)明CMTMl-v17多核苷酸的表達(dá)，此時(shí)不需要純化核酸。這些分析技術(shù)包括DNA或RNA印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交分析以及聚合酶鏈反應(yīng)分析。本發(fā)明還提供檢測(cè)CMTMl-v17的基因或蛋白的表達(dá)的試劑在制備用于檢測(cè)腫瘤的組合物中的應(yīng)用。所述試劑可以為蛋白、核酸、碳水化合物等，優(yōu)選為抗體、反義RNA或小干擾RNA(siRNA)。本發(fā)明的CMTMl-vl7的基因或蛋白可以作為診斷指標(biāo)。因此，可以利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、熒光原位雜交法(FISH)等方法或它們的組合，檢測(cè)體內(nèi)因本發(fā)明的CMTMl-v17表達(dá)不足或過量所致的病理狀態(tài)。同樣，也可以使用本發(fā)明CMTMl-vl7蛋白的抗體，通過放射性免疫分析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法、Western印跡分析法或酶聯(lián)免疫吸附法OELISA)達(dá)到相同的目的。圖1是pcDNA3.1-CMTMl-vl7質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖2是GST-CMTMl-vl7融合蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果。泳道l:誘導(dǎo)前；泳道2:誘導(dǎo)后；泳道3:超聲破碎后的上清液；泳道4:親和層析后；泳道5:凝血酶切割后釋放的GST蛋白；泳道6:凝血酶切割后釋放的CMTMl-vl7C端蛋白；泳道M:低分子量標(biāo)記。圖3是通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體的純化結(jié)果。泳道1:ProteinG親合層析柱純化后的抗體；泳道2和泳道3:CMTMl-v17C端蛋白親和層析純化后的抗體。圖4是通過免疫印跡檢測(cè)CMTMl-v17多克隆抗體特異性的結(jié)果。泳道1:轉(zhuǎn)染pCDB空載體組，純化前的抗血清；泳道2:轉(zhuǎn)染pCDB/CMTMl-vl7組，純化前的抗血清；泳道3:轉(zhuǎn)染pCDB/CMTMl-vl7組，純化后的抗體。圖5是通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)pCDB-CMTMl-v17真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的促增殖作用的結(jié)果。圖6是通過MTT法檢測(cè)pCDB-CMTMl-v17真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的促增殖作用的結(jié)果。圖7A、圖7B和圖7C是CMTMl-vl7轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后導(dǎo)lfo(寸TNF-a誘導(dǎo)凋亡的抵抗作用的結(jié)果。超表達(dá)CMTMl-v17可增加MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)TNF-a誘導(dǎo)凋亡的抵抗力；內(nèi)源性CMTMl-v17被siRNA抑制以后，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)TNF-a誘導(dǎo)凋亡的抵抗能力降低。圖7A:24h結(jié)果；圖7B:48h結(jié)果；圖7C:柱形圖。圖8是通過RT-PCR檢測(cè)CMTMl-v17在人腫瘤組織中表達(dá)的結(jié)果，所述組織從左向右依次為胃癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、食管癌、直腸癌和結(jié)腸癌；以看家基因G3PDH作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。圖9是通過RT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中CMTMl-v17的表達(dá)結(jié)果。從左向右所述細(xì)胞系為(1)HEK293;(2)HEK293T;(3)Jurkat;(4)Raji;(5)HL-60;(6)MDA;(7)MCF-7;(8)HepG2;(9)HT29;(10)A549;(11)Hela;(12)HelaS3;(13)Dul45;(14)LNcap;以看家基因G3PDH作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。圖10是通過免疫印跡檢測(cè)CMTMl-v17在正常乳腺組織和乳腺癌組織中表達(dá)的結(jié)果，其中N1-N17為正常乳腺組織；T1-T20為乳腺癌組織。圖11是通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CMTMl-vl7在組織芯片中表達(dá)的結(jié)果，左上正常乳腺組織(10x);右上正常乳腺組織(40x);左下乳腺癌組織(10x);右下乳腺癌組織(40x)。圖12是免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ER-a和cal53在乳腺組織芯片中的表達(dá)，左上ER-a陰性非癌乳腺組織(40x);右上ER-a陽(yáng)性乳腺癌組織(40x);左下cal53陰性非癌乳腺組織(40x);右下ca153陽(yáng)性乳腺癌組織(40x)。具體實(shí)施方式以下將參考實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例l1.功能基序預(yù)測(cè)經(jīng)MotifScan軟件(http://nwhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif-scan)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CMTMl-v17有一個(gè)LXXLL信號(hào)基序，提示CMTMl-v17可能與同樣具有LXXLL基序的核受體超家族成員之一的類固醇樣激素受體(Estrogenreceptor,ER)p160輔助調(diào)節(jié)因子具有類似作用，即介導(dǎo)激素受體與輔助調(diào)節(jié)因子之間的相互作用和轉(zhuǎn)錄激活功能。同CMTM家族的其它成員一樣，CMTMl-v17含有MARVEL結(jié)構(gòu)域(MARVEL，MALandrelatedproteinsforvesicletraffickingandmembranelink),并且具有四次跨膜結(jié)構(gòu)，氨基端和羧基端位于胞內(nèi)。SEQIDNO:2的氨基酸序列4753即為"LXXLL"結(jié)構(gòu)域。2.特征性分析通過DNAStar軟件(http:〃www.dnastar.com/)分析了CMTMl-vl7蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，CMTMl-vH由大量疏水氨基酸組成，118位149位的32個(gè)氨基酸具有良好的柔韌性、表面可及性和親水性以及較高的抗原指數(shù)。實(shí)施例2、抗CMTMl-vl7抗體的制備1.抗原的設(shè)計(jì)根據(jù)以上生物信息學(xué)分析的結(jié)果并綜合考慮親水性、抗原性及表面可及性，本發(fā)明人選取了CM!Ml-v17(118149位氨基酸)這一段羧基端胞外區(qū)的序列(以下簡(jiǎn)稱C端)來制備抗體。2.pCDB-CMTMl-v17重組質(zhì)粒的構(gòu)建以人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(購(gòu)自ATCC)cDNA為模板，使用根據(jù)已知的CMTMl-v17序歹ij(SEQIDNO:l)設(shè)計(jì)的上游引物Pl和下游引物P2(分別為5，-ATGTTGAAGATCCTGAGACT-3，；5，-GCACGTGTCTGTCGAATCGCT-3，，SEQIDNO:3禾B4，奧科生物公司)，通過利用PCR儀(AppliedBiosystems)擴(kuò)增CMTMl-v17，采用瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物，并將其連接到pGEM-Teasy載體(Promega公司)中；用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue;篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，用ABIPRISMSequencer遺傳分析儀(AppliedBiosystems)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序確定后，以內(nèi)切酶EcoRI(TAKARA公司)酶切pGEM-Teasy-CMTMl-v17質(zhì)粒，將釋放片段插入到同樣經(jīng)EcoRI酶切和市購(gòu)CIAP(牛小腸堿性磷酸酶，TAKARA公司)處理的pcDNA.3.1/myc-His(-)B載體(Invitrogen公司)中，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)過PCR和測(cè)序驗(yàn)證，得到正向插入的重組質(zhì)粒pCDB-CMTMl-v17，也可稱為pcDNA,3.1-CMTMl-vl7(圖1)。實(shí)施例3、重組質(zhì)粒pGST-CMTMl-v17C端的構(gòu)建以pCDB-CMTMl-v17質(zhì)粒為模板，利用根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果設(shè)計(jì)的上游引物P3和下游引物P2(分別為5'-GAAAAGATTCCTGGGAGTCG-3';5，-GCACGTGTCTGTCGAATCGCT-3，，SEQIDNO:5禾卩4，奧科生物公司)，擴(kuò)增編碼CMTMl-v17的C端118149位氨基酸的序列，PCR反應(yīng)條件同上。采用以上相同方法進(jìn)行克隆，得到正向插入的重組質(zhì)粒pGST-CMTMl-v17C端。1.GST融合蛋白的大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)及純化將構(gòu)建得到的表達(dá)GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白的pGST-CMTMl-v17C端重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(天為時(shí)代科技有限公司)中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0時(shí)，加入1PTG(異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)至終濃度為0.1腿ol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)。離心收集細(xì)菌，用谷胱甘肽-Sepharose4B凝膠珠親和層析法純化GST融合蛋白，所述純化采用Pharmacia公司說明書提供的方法，用SDS-PAGE鑒定蛋白的純度。所有樣品均進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后經(jīng)考馬斯亮蘭染色后掃描。如圖2所示，pGST-CMTMl-vl7-C端蛋白在BL21菌中呈可溶性表達(dá)，其分子量約為30kD，與預(yù)期蛋白大小相符；這些可溶性蛋白經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose4B凝膠柱親和層析后，GST-CMTMl-vl7C端為單一蛋白條帶；用凝血酶(TAKARA公司)對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切后洗脫，先后從洗脫液中得到兩種不同的蛋白條帶，分別為純化的CMTMl-v17C端蛋白和GST蛋白。純化后的CMTMl-v17C端蛋白經(jīng)N端氨基酸測(cè)序，所得序列與預(yù)期的序列一致。用同樣的方法獲得全長(zhǎng)的蛋白。2.多克隆抗體的制備和純化初次免疫將純化的CMTMl-v17C端蛋白100pg/lml與弗氏完全佐劑(Sigma公司)l:l混勻，用所得混合液各0.25ml對(duì)家兔(北大醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心)兩足部進(jìn)行皮下注射，其余溶液在該家兔后背皮內(nèi)多點(diǎn)注射。之后，每3周加強(qiáng)免疫一次。共加強(qiáng)了3次，最后一次加強(qiáng)免疫后第10天心臟取血，將制備的抗血清稀釋5倍，上樣至市購(gòu)的ProteinG親和層析柱(按說明書操作)進(jìn)行純化。為了得到更特異的抗CMTMl-v17抗體，本發(fā)明人將大腸桿菌表達(dá)的CMTMl-v17C端純蛋白偶聯(lián)到溴化氰活化的Sepharose4B上，制備親和層析柱，將上述抗體溶液上樣至所述親合層析柱上，再使用pH2.7、濃度為0.2mol/L的甘氨酸洗脫液洗脫，分步收集洗脫液，并立即按上述方法進(jìn)行中和透析，將所得抗體于-70'C保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳分析表明，經(jīng)過ProteinG和CMTMl-v17C端蛋白親和柱兩步純化后，可見清晰的抗體重鏈和輕鏈條帶(圖3)，純化后CMTMl-v17的抗體純度可以達(dá)到85%以上。3.多克隆抗體的免疫印跡檢測(cè)為了驗(yàn)證抗CMTMl-v17抗體是否能特異性地與真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白結(jié)合，本發(fā)明以超表達(dá)CMTMl-v17的細(xì)胞裂解液為研究對(duì)象，分別使用純化前的抗血清和純化后多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231在DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中培養(yǎng)，將細(xì)胞接種在12孔板中。接種后24h(小時(shí))后,將總量為1.0嗎pCDB-CMTM-v17的DNA與80piDMEM培養(yǎng)基混合，再將2.5(^1Lipofectamine2000(Invitrogen)與80plDMEM培養(yǎng)基混合，將上述兩種溶液混合，在室溫放置20分鐘，然后加入到細(xì)胞中。在對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10分鐘，離心后，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Amersham-Pharmaciabiotech公司)上，以5%的脫脂牛奶封閉2小時(shí)，與上述兔抗人CMTMl-v17的多克隆抗體于4'C反應(yīng)過夜，之后用TBST每10分鐘洗一次，共3次；加入相應(yīng)ERDyeTM800-conjugated二抗(LI-CORBIOSCIENCEINC),避光放置l個(gè)小時(shí)，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，上機(jī)檢測(cè)。如圖4所示，用未經(jīng)純化的抗血清可以檢測(cè)到多條蛋白條帶，特異性較差，經(jīng)過親和層析純化的多抗能夠與真核蛋白反應(yīng)，特異性明顯增高，僅在大約40kD左右處見到一條明顯的蛋白條帶，證明抗CMTMl-v17多克隆抗體具有很好的特異性。生物信息學(xué)分析CMTMl-vl7蛋白序列中有N糖基化位點(diǎn)，一般真核蛋白經(jīng)糖基化修飾后其分子量會(huì)增大，因此推測(cè)免疫印跡檢測(cè)到的特異條帶分子量的增大是由于糖基化的原因。實(shí)施例4、CMTMl-v17的功能研究1.通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)CMTMl-v17超表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響在本實(shí)施例中，分別用pcDNA3.1、pcDNA-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，取0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，于顯微鏡下對(duì)未被臺(tái)盼藍(lán)染色的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)臺(tái)盼藍(lán)的通透性升高，可被染成藍(lán)色，因此，在光學(xué)倒置顯微鏡(01ympus公司)下計(jì)數(shù)沒有被染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)即可。從圖5中可以看出，pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度的加快。2.通過MTT法檢測(cè)CMTMl-vl7對(duì)細(xì)胞增殖的影響MTT(3-(4，5-dimethyltiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，Invitrogen公司)為淡黃色甲基四氮唑鹽，活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能與MTT產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲臢，甲臢經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)溶解可進(jìn)行比色。甲臢生成的量與活細(xì)胞的代謝強(qiáng)弱成正比，且僅有活細(xì)胞有此反應(yīng)。結(jié)果可用酶標(biāo)儀測(cè)量，可以根據(jù)顯色的深淺反映細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。在本實(shí)施例中，分別用pCDB和pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，取0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用MTT檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。從圖6可以看出，由pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)速度要快于對(duì)照轉(zhuǎn)染空載體組的細(xì)胞，在培養(yǎng)72小時(shí)后，與空載體對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染CMTMl-vl7組可引起25.12%的增高。3.利用CMTMl-v17和CMTMl-vl7-siRNA轉(zhuǎn)染檢測(cè)CMTMl-v17對(duì)細(xì)胞凋亡的影響將MDA-MB-231細(xì)胞按照2xl(^個(gè)細(xì)淑孔的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用CMTMl-vl7和CMTMl-vl7-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)行(轉(zhuǎn)染方法同上)，分別在轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后進(jìn)行胰酶消化，按FITC-Annexin-V(寶賽公司)試劑盒說明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀(FACSCaliburflowcytometer，Becton-Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每個(gè)樣品收集10000個(gè)細(xì)胞。磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞雙層質(zhì)膜內(nèi)層向外層的移位是凋亡發(fā)生的一個(gè)重要生化指標(biāo)，Amexin-V能夠特異地與膜外層的PS結(jié)合，根據(jù)Annexin-V偶聯(lián)熒光的強(qiáng)度變化可以容易地判斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)通過用細(xì)胞膜不通透的碘化丙啶(PI)染色來判斷細(xì)胞膜的完整性。如圖7A和圖7B所示，橫坐標(biāo)表示FITC-Annexin-V的熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示PI的熒光強(qiáng)度，左下區(qū)域代表正常細(xì)胞，左上區(qū)域代表PI熒光強(qiáng)度升高的細(xì)胞膜已經(jīng)不完整的死亡細(xì)胞，右下區(qū)域代表FITC-Annexin-V熒光強(qiáng)度升高的細(xì)胞，右上區(qū)域代表FITC-Annexin-V和PI熒光強(qiáng)度都升高的細(xì)胞。分別用pCDB和pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞6小時(shí)后換液，一組作為對(duì)照，另一組加入20ng/mlTNF-a來誘導(dǎo)凋亡，分別于24小時(shí)(圖7A)和48小時(shí)(圖7B)后收集細(xì)胞，用PI、araiexinV雙染后通過FACS分析凋亡的情況。從圖7A、圖7B以及圖7C可看出，pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染細(xì)胞組凋亡數(shù)與對(duì)照組沒有明顯區(qū)別，但是在TNF-a誘導(dǎo)條件下，pCDB-CMTMl-v17轉(zhuǎn)染細(xì)胞組凋亡數(shù)明顯少于對(duì)照組。結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明CMTMl-v17在細(xì)胞抵抗TNF-a誘導(dǎo)凋亡的過程中發(fā)揮了作用，即CMTMl-v17具有抵抗死亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。在MCF-7細(xì)胞中也獲得了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給)。人CMTMl-vl7雙鏈SiRNA(19bp)合成自上海吉?jiǎng)P公司，PAGE純化。正義鏈序列為5'-ACCACUUGCUGACCUAUUUdTdT(SEQIDNO:6)，反義鏈序列為5，-AAAUAGGUCAGCAAGUGGUdTdT(SEQIDNO:7)。非沉默(5，-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3，，SEQIDNO:8)在上海吉?jiǎng)P公司合成并經(jīng)PAGE純化。用其轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，6小時(shí)后換液，一組作為對(duì)照，另一組加入20ng/mlTNF-a來誘導(dǎo)凋亡，分別于24小時(shí)和48小時(shí)后收集細(xì)胞，用PI、annexinV雙染后通過FACS分析凋亡情況。從圖7A、圖7B以及圖7C可看出，與非沉默組相比，轉(zhuǎn)染了siRNA的細(xì)胞組其凋亡數(shù)較對(duì)照組有了明顯的增加。說明CMTMl-vl7被干擾以后，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)TNF-a誘導(dǎo)凋亡的抵抗力下降。進(jìn)一步印證了CMTMl-vl7在細(xì)胞抵抗TNF-a誘導(dǎo)凋亡過程中發(fā)揮的作用。在MCF-7細(xì)胞中也獲得了基本一致的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給)。實(shí)施例5、CMTMl-vl7的表達(dá)1.通過RT-PCR分析CMTMl-v17的表達(dá)譜U.各細(xì)胞系的培養(yǎng)和表達(dá)譜檢測(cè)將人細(xì)胞系HEK293、HEK293T、HL-60、MDA-MB-231、MCF-7、HepG2、HT29、A549、Hela、HelaS3和Dul45培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，而Lncap、Jurkat和Raji(均來自ATCC)則培養(yǎng)于RPM1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，所有培養(yǎng)基中均含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ng/ml鏈霉素。將所得細(xì)胞用于以下表達(dá)分析研究。1.2.通過逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA1)用收集到的各細(xì)胞的總RNA分別配制如下所示的反應(yīng)體系成分體積⑨細(xì)胞總RNA4.5Oligo(dT)20(50^M)0.5lOmMdNTPMix1.02)于65'C孵育5分鐘，使RNA模板和弓I物變性，然后置于冰上;3)配制如下所示的反應(yīng)體系，分別加入上述體系中;<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4)于5(TC孵育50分鐘；5)于85。C孵育5分鐘，終止反應(yīng)；6)于9(TC孵育15分鐘，滅活體系中的DNase。1.3.RT-PCR利用Invitrogen公司的Superscriptn試劑盒(Invitrogen公司)，用2|ig以上的總RNA合成單鏈cDNA。PCR反應(yīng)所用引物序列為CMTMl-v17(上游引物P5:5，-ATGTTGAAGATCCTGAGACT-3，，SEQIDNO:9，下游引物P6:5，-GCACGTGTCTGTCGAATCGCT-3，，SEQIDNO:10);以G3PDH作為系統(tǒng)內(nèi)參(上游引物P7:5，-CTAGCTAGCTGGGATTACAGGCGTGAG-3，，SEQIDNO:11，下游引物P8:5，-CTAGCTAGCTTATATACAGCGGTTTC-3，，SEQIDNO:12)。通過瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物，將所得回收產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Bhie;篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用ABIPRISM3100DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果證明在不同的細(xì)胞系中均可檢測(cè)到CMTMl-v17不同程度的表達(dá)(圖9)。利用類似方法，在胃癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、食管癌、直腸癌和結(jié)腸癌等8個(gè)腫瘤組織(上海睿星公司)中均檢測(cè)到CMTMl-v17的明顯表達(dá)(圖8)。2.通過Western印跡檢測(cè)CMTMl-vl7的表達(dá)20例乳腺癌組織標(biāo)本和17例正常乳腺組織由北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院(北京世紀(jì)壇醫(yī)院)病理科和北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院標(biāo)本庫(kù)提供。所有組織標(biāo)本在獲取以后立即凍存于液氮中。在液氮中將組織標(biāo)本研磨成粉末，加入RIPA裂解液，然后放置于冰上待其融化，吸至eppendorf管中，于4'C放置30分鐘，于4°C以18,000g離心20分鐘，取上清并用BCA(美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品)法進(jìn)行定量均衡后，將蛋白煮沸加熱10分鐘，然后立即放在冰上冷卻，于4。C以18,000g離心10分鐘后取上清，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)(見圖10)。在本發(fā)明人檢測(cè)的17例正常乳腺組織中，2例為CMTMl-v17表達(dá)陽(yáng)性，占11.76%,而15例為陰性，占88.24%;在20例乳腺癌組織中，13例為CMTMl-vl7陽(yáng)性，占65.00%,而7例為陰性，占35.00%。卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)提示，CMTMl-v17的表達(dá)水平在正常乳腺和乳腺癌組織間存在顯著性差異(pO.01)(見表1)。表l.通過Western印跡分析的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織芯片中CMTMl-v17的表達(dá)為了分析了CMTMl-vl7在各種癌癥尤其是乳腺癌中的表達(dá)情況，本發(fā)明人購(gòu)買了組織芯片(陜西超英公司，貨號(hào)分別為CC08-02-004、CC08-11-001和CC08-11-002)。處理方法同上。用正常羊血清工作液于室溫封閉20分鐘，加抗CMTMl-v17多克隆抗體(經(jīng)PBS稀釋)，于室溫反應(yīng)16h，用PBS洗5分鐘x3次，不時(shí)晃動(dòng)，以抗cal53抗體(北京中杉金橋公司)作為陽(yáng)性對(duì)照。按照DAKO公司說明書使用ChemMate，DAKOEnVision系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。通過對(duì)組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分析乳腺組織中CMTMl-v17的表達(dá)情況(結(jié)果見圖ll)。在本發(fā)明人進(jìn)行一組實(shí)驗(yàn)中，三張芯片總計(jì)包含103例乳腺癌和129例非癌組織(其中含100正常組織和29例其它乳腺疾病組織)。結(jié)果顯示大多數(shù)正常乳腺標(biāo)本(100例中的82例)顯示陰性結(jié)果，占總數(shù)的82.0%;其它乳腺疾病組織的結(jié)果與此類似(29例中占26例，百分比為89.66%)。而在103例腫瘤組織中，70例(67.96%)顯示出明顯的CMTMl-v17陽(yáng)性表達(dá)，剩余的33例為陰性表達(dá)。這樣，在129例非癌組織中，總計(jì)僅有21例檢測(cè)到CMTMl-v17的表達(dá)，占總數(shù)的16.28%;而在103例乳腺癌標(biāo)本中有70例顯示出CMTMl-v17的表達(dá)，占總數(shù)的67.96%。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，CMTMl-v17的表達(dá)水平在正常乳腺和乳腺癌組織間存在顯著性差異(pO.Ol)。與此同時(shí)，本發(fā)明人還檢測(cè)了同樣標(biāo)本中cal53的表達(dá)情況(圖12)。結(jié)果顯示，68例(40.96%)腫瘤標(biāo)本和7例(12.96%)非癌標(biāo)本中有cal53的表達(dá)(pO.Ol)。說明CMTMl-v17與cal53在乳腺癌組織中的表達(dá)具有良好的相關(guān)性。cal53系腫瘤相關(guān)性抗原，位于腫瘤細(xì)胞表面，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，細(xì)胞膜上蛋白酶和唾液酸酶的活性增高，細(xì)胞骨架破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞表面抗原凋落，使血清cal53含量升高。cal53存在于多種腺癌內(nèi)，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌及胰腺癌，被認(rèn)為是診斷乳腺癌較為靈敏的腫瘤標(biāo)志物，在臨床工作中廣泛使用。本研究不僅發(fā)現(xiàn)CMTMl-v17在乳腺癌中高表達(dá)，而且與cal53之間存在高度相關(guān)性，提示CMTMl-v17具有成為乳腺腫瘤診斷標(biāo)志物的可能性，應(yīng)用于腫瘤的輔助診斷、療效監(jiān)測(cè)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的判定。在本發(fā)明進(jìn)行的另一組類似實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人進(jìn)一步證明了CMTMl-vl7的表達(dá)水平在正常乳腺和乳腺癌組織間存在顯著性差異(pO.01);CMTMl-vl7與cal53在乳腺癌組織中的表達(dá)具有良好的相關(guān)性(結(jié)果見表2、表3和表4)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步探討了ER與CMTMl-vl7之間的關(guān)系。ER-a在乳腺組織芯片中的表達(dá)情況見圖12和表2。有研究表明，部分乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤，雌激素與雌激素受體(Estrogenreceptor,ER)有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，參與調(diào)控與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的基因的表達(dá)。通過生物信息學(xué)分析顯示CMTMl-vl7包含一個(gè)核受體盒基序(nuclearreceptorboxmotif)——LXXLL，該結(jié)構(gòu)能介導(dǎo)與核受體的相互作用和轉(zhuǎn)錄激活功能。雌激素受體(Estrogenreceptor,ER)正是核受體超家族成員之一。而且統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ER-a表達(dá)的乳腺癌組織中，絕大多數(shù)CMTMl-vl7為陽(yáng)性且高表達(dá)；而在ER-ot表達(dá)的乳腺非癌組織中僅有半數(shù)CMTMl-vl7為陽(yáng)性且均為低表達(dá)。這一結(jié)果提示CMTMl-vl7可能在ER-a參與的乳腺癌疾病過程中起到一定的作用。表2.CMTMl-v17、cal53和ER在組織芯片中的表達(dá)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3.CMTMl-v17、cal53在乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)情況的差異性<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表4.CMTMl-v17、cal53在非癌乳腺標(biāo)本中表達(dá)情況的差異性<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>序列表<110〉北京大學(xué)〈120>CMTM1-v17的新應(yīng)用及其拮抗劑<130>GBI06CN0243〈160〉12<170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉603<212>腿<213〉智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(447)〈400〉1atgttgaagatcctgagactgagtcttatcttaggagcattagettgt48MetLeuLyslieLeuArgLeuSerLeulieLeuGlyAlaLeuAlaCys151015ttcateateacccaagccaatgagteatttataacaateacaagtctg96PhelielieThrGinAlaAsnGluSerPhelieThrlieThrSerLeu202530gaaatetgcattgtcgttttttttattetaatatatgtgetaaccctt144GlulieCyslieValValPhePhelieLeulieTyrValLeuThrLeu354045caccacttgctgacctatttacattggcccttacttgatcttaccaac192HisHisLeuLeuThrTyrLeuHisTrpProLeuLeuAspLeuThrAsn505560agtateattacagetgtgttccttteagtagttgccatettggccatg240SerlielieThrAlaValPheLeuSerValValAlalieLeuAlaMet65707580caagaaaagaaaagaaggcatttaetctatgtcggggggtecctgtgt288GinGluLysLysArgArgHisLeuLeuTyrValGlyGlySerLeuCys859095etcacagcggtaategtgtgttgcategatgcgtttgtggtcaccacg336LeuThrAlaVallieValCysCyslieAspAlaPheValValThrThr100105110aagatgaggaccaacttgaaaagattcctgggagtcgaagttgaaagg384LysMetArgThrAsnLeuLysArgPheLeuGlyValGluValGluArg115120125aagcttteccccgccaaggacgcctaccccgaaaccggccccgacgcc432LysLeuSerProAlaLysAspAlaTyrProGluThrGlyProAspAla130135140ccgcagaggcccgcctgaagecageccggcgccctageagatgeacgtgtctgtc487ProGinArgProAla145gaatcgctgcctccgagcccacccccgagctegcatgetgtcacccattccagectaaat547gtgaccataaaattagggctgetgettttatcgagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa603〈210〉2<211〉149<212〉PRT〈213〉智人<400〉2MetLeuLyslieLeuArgLeuSerLeulieLeuGlyAlaLeuAlaCys151015PhelielieThrGinAlaAsnGluSerPhelieThrlieThrSerLeu202530GlulieCyslieValValPhePhelieLeulieTyrValLeuThrLeu354045HisHisLeuLeuThrTyrLeuHisTrpProLeuLeuAspLeuThrAsn505560SerlielieThrAlaValPheLeuSerValValAlalieLeuAlaMet65707580GinGluLysLysArgArgHisLeuLeuTyrValGlyGlySerLeuCys859095LeuThrAlaVallieValCysCyslieAspAlaPheValValThrThr100105110LysMetArgThrAsnLeuLysArgPheLeuGlyValGluValGluArg115120125LysLeuSerProAlaLysAspAlaTyrProGluThrGlyProAspAla130135140ProGinArgProAla145〈210〉3〈211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉引物〈400〉3atgttgaagatcctgagact20〈210〉4〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物〈400〉4gcacgtgtctgtcgaatcgct21〈210〉5<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉5gaaaagattcctgggagtcg20〈210〉6〈211〉19<212〉匿〈213〉智人〈400〉6accacuugcugaccuauuu19〈210〉7〈211〉19〈212〉脆〈213〉智人〈400〉7aaauaggucagcaaguggu19〈210〉8〈211〉19〈212〉隨〈213〉智人〈400〉8uucuccgaacgugucacgu19<210〉9〈211〉20<212〉隱〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉9atgttga卿tcctg卿ct20〈210〉10〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物<400〉10gcacgtgtctgtcgaatcgct21〈210〉11〈211〉27〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉引物函〉11ctagctagctgggattacaggcgtgag27〈210〉12<211〉26〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400〉12ctagctagcttatatacagcggtttc2權(quán)利要求1.針對(duì)SEQIDNO2所示的氨基酸序列或編碼該序列的多核苷酸序列的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的多核苷酸序列為SEQIDNO:1所示的序列或SEQIDNO:1所示序列的第1447位核苷酸。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述的癌癥為乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。4.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述的拮抗劑為siRNA、反義RNA或抗體。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述的抗體為單克隆抗體或經(jīng)純化的多克隆抗體；優(yōu)選所述的多克隆抗體針對(duì)SEQIDNO:2所示序列的第118149位氨基酸。6.—種多克隆抗體，其與SEQIDNO:2的第118149位氨基酸特異性結(jié)合；所述多克隆抗體優(yōu)選為中和抗體。7.—種診斷和/或治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包含針對(duì)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或編碼該序列的多核苷酸序列的拮抗劑，以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑；優(yōu)選所述的拮抗劑為siRNA、反義RNA或抗體；優(yōu)選所述siRNA的正義鏈和反義鏈分別如SEQIDNO:6和7所示。8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述的癌癥為乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。9.檢測(cè)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或編碼該氨基酸序列的多核苷酸序列的表達(dá)的試劑在制備用于檢測(cè)癌癥的組合物中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述的癌癥為乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌或胃癌。全文摘要本發(fā)明涉及CMTM1-v17作為一個(gè)新的靶標(biāo)在診斷和/或治療癌癥中的應(yīng)用、CMTM1-v17的拮抗劑在診斷和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用以及檢測(cè)CMTM1-v17表達(dá)的試劑在制備用于檢測(cè)癌癥的組合物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K38/17GK101161283SQ20061011362公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2006年10月10日優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日發(fā)明者揚(yáng)崔,京王,露王,慧范,馬大龍申請(qǐng)人:北京大學(xué)