專利名稱：：一種脂質(zhì)體藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體藥物及其制備方法，特別是涉及米托蒽醌的脂質(zhì)體制劑及其制備方法。技術(shù)背景脂質(zhì)體可以作為許多藥物的載體。作為抗腫瘤藥物(尤其是化療藥物)的載體，它可以減少藥物在正常組織的分布，增加藥物在腫瘤組織的蓄積量，從而改善藥物的治療指數(shù)。脂質(zhì)體之所以可以被動(dòng)的靶向腫瘤，跟腫瘤的生理特點(diǎn)有關(guān)。腫瘤由于快速生長，其血管間隙可以達(dá)到100-780nm，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙通常在2nm左右。因此，如果脂質(zhì)體可以在血液中較長時(shí)間的循環(huán)，并且脂質(zhì)體的粒度〈200nm，它就可以被動(dòng)的聚集在腫瘤區(qū)。這是因?yàn)殪o脈注射給藥后，小粒度的脂質(zhì)體在血液循環(huán)的過程中，無法進(jìn)入正常組織，但是卻可以有效的穿透腫瘤區(qū)的血管，到達(dá)治療部位。但是，要想真正的實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體的治療優(yōu)勢是不容易的。必須滿足以下四點(diǎn)要求l)藥物能夠以有效的包封效率和足夠的載藥量包封在脂質(zhì)體內(nèi)。2)在體外貯存期內(nèi)，藥物不會(huì)從脂質(zhì)體中釋放出來。3)脂質(zhì)體藥物在血液循環(huán)的過程中，藥物不會(huì)發(fā)生顯著的滲漏。4)當(dāng)脂質(zhì)體聚集在腫瘤區(qū)以后，藥物能夠有效地釋放，從而發(fā)揮藥物的治療作用。就目前的脂質(zhì)體技術(shù)看，已經(jīng)較好地解決了前三個(gè)問題，從而使脂質(zhì)體藥物在體內(nèi)的合理釋放成為研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。如何有效的控制某些脂質(zhì)體藥物在耙向腫瘤區(qū)后合理的釋藥，是開發(fā)脂質(zhì)體藥物時(shí)這對(duì)于某些藥物尤為重要，如米托蒽醌。加拿大的脂質(zhì)體研究小組，使用氫化大豆卵磷脂(HSPC)和膽固醇作為磷脂雙層，300mM的檸檬酸梯度進(jìn)行載藥，脂質(zhì)體的粒度在lOOmn左右，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備得到的脂質(zhì)體的抗腫瘤效應(yīng)不如游離的米托蒽醌。為了改變脂質(zhì)體的治療效果，最終他們把磷脂雙層的組成改為雙肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)和膽固醇，得到了治療指數(shù)改善的處方。但是由于DMPC的相轉(zhuǎn)變溫度在21度左右，在儲(chǔ)存期內(nèi)藥物的滲漏有可能增加，處方會(huì)不穩(wěn)定。(Liposomalformulationsofmitoxantrone，US5,858，397。)美國的Neopharm公司則使用另外一種技術(shù)開發(fā)米托蒽醌脂質(zhì)體。他們在磷脂的雙分子層中添加荷負(fù)電的心磷脂。由于心磷脂可以和米托蒽醌強(qiáng)烈相互作用，因此米托蒽醌可以通過被動(dòng)載藥的方式被插入磷脂雙分子層中。此種技術(shù)和主動(dòng)載藥技術(shù)有差別。使用主動(dòng)載藥技術(shù)，藥物將以沉淀的形式沉積在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中。該公司的產(chǎn)品經(jīng)過一期的臨床研究發(fā)現(xiàn)。脂質(zhì)體藥物和游離藥物相比，可以增加偶發(fā)性感染的幾率。出于安全性的考慮，該產(chǎn)品被停止研發(fā)。(米托蒽醌的脂質(zhì)體制劑，CN01817424.8)。中國的常州太平洋藥物研究所也就米托蒽醌脂質(zhì)體申請(qǐng)了一項(xiàng)專利。該專利申請(qǐng)中使用了傳統(tǒng)的pH值梯度法進(jìn)行載藥。申請(qǐng)保護(hù)的是一個(gè)特定比例的處方。但是根據(jù)作者的檢索。早在上個(gè)世紀(jì)90年代左右，PH梯度法的發(fā)明人(Cullis)等人就使用檸檬酸梯度法進(jìn)行載藥。而且此專利的申請(qǐng)人可能誤認(rèn)為只要將抗癌藥物制成脂質(zhì)體制劑就可以得到毒性降低、療效改善的脂質(zhì)體制劑。所以在他們的專利申請(qǐng)中，并沒有考慮到磷脂組成、內(nèi)水相緩沖鹽種類、脂質(zhì)體粒度、藥脂比等因素對(duì)脂質(zhì)體的療效和毒性的影響。而且該專利中所提到的使用薄膜分散法制備脂質(zhì)體是一個(gè)不具有產(chǎn)業(yè)化前景的技術(shù)路線。(米托蒽醌或鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體注射劑及其制備工藝，CN200410041612.1)。四川大學(xué)華西藥學(xué)院的張志榮等人也曾研究過米托蒽醌脂質(zhì)體制劑。他們使用的磷脂為相轉(zhuǎn)變溫度為O度左右的大豆磷脂酰膽堿(其商品名為EPIKUR0N200)，粒度約為60nm左右。此研究學(xué)者只進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)的研究，沒有進(jìn)一步研究所獲得的脂質(zhì)體制劑的毒性和療效。參考文獻(xiàn)(米托蒽醌長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及藥代動(dòng)力學(xué)的研究，張志榮、于波濤、段逸松，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002Vol.37No.6;硫酸銨梯度法制備米托蒽醌長循環(huán)脂質(zhì)體，張志榮、于波濤、段逸松、黃園，中國藥學(xué)雜志，2002Vol.37No.12;米托蒽醌脂質(zhì)體制備工藝的研究，DU顏Yi-song，華西藥學(xué)雜志，2001Vol.16No.02)。以上的研究中，通常將脂質(zhì)體的粒度控制在80150nm之間，因?yàn)橹|(zhì)體學(xué)界有一個(gè)共識(shí)，認(rèn)為100nm左右的處方有最好的耙向效率?？墒侨缜八觯瑑H有最優(yōu)的耙向效率是不足夠的，藥物必須能夠有效地從脂質(zhì)體中釋放出來，才能夠發(fā)揮作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，旨在提供在體內(nèi)具有合適的釋放速率的脂質(zhì)體藥物。如上所述，為了保證藥物有效的被脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到病灶部位，要求在血液循環(huán)的過程中，藥物基本上不滲漏，這就導(dǎo)致了藥物被靶向到腫瘤區(qū)以后，也很難從脂質(zhì)體中釋放出來。通常使用主動(dòng)載藥技術(shù)，脂質(zhì)體包封的藥物是以膠態(tài)沉淀的方式存在的，不具有生物活性。只有藥物有效的從脂質(zhì)體釋放出來，才可以轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘闹委熜运幬铩Ｈ绻幬锏尼尫胚^于緩慢，即使其被有效的耙向到腫瘤區(qū)，它也很難起到真正的治療作用。其治療效果甚至還會(huì)不如未包封的藥物。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，將某些具有多個(gè)解離基團(tuán)，容易和多價(jià)反離子形成較致密沉淀的藥物，制成小單室的脂質(zhì)體制劑，可以有效地改善脂質(zhì)體的治療指數(shù)，盡管小單室制劑的靶向效率不如大單室脂質(zhì)體制劑。此處所述的小單室脂質(zhì)體制劑粒度為3080nm，粒度的主峰應(yīng)集中在4060nm左右。小單室的脂質(zhì)體制劑為什么可以加快藥物的釋放速度呢？如果藥脂比固定，那末對(duì)于小單室的處方，就會(huì)含有更多的脂質(zhì)體粒子，每個(gè)脂質(zhì)體內(nèi)部含有小尺寸的藥物沉淀。小尺寸的藥物沉淀有更大的比表面積，因此在同樣的條件下，就會(huì)有更快的溶解速率。但是使用小單室的脂質(zhì)體制劑，同時(shí)還要求磷脂雙分子層由相轉(zhuǎn)變溫度較高的的磷脂組成。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果脂質(zhì)體處方使用氫化大豆卵磷脂(HSPC)或雙軟脂酸卵磷脂(DPPC)這樣的磷脂，處方的毒性顯著降低，并且治療指數(shù)明顯改善。如果磷脂雙層由雙肉豆寇酸卵磷脂(DMPC)組成，藥物的釋放速度就會(huì)釋放過快，導(dǎo)致較大的毒性，甚至安全性不如未包封的藥物。因此本發(fā)明技術(shù)方案如下一種脂質(zhì)體藥物，其粒度在3080nm之間，并且含有1)活性成分為多價(jià)離子藥物，它可以和脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子形成難以溶解的沉淀；2)磷脂雙分子層含有Tm高于體溫的磷脂；以及其他可作為脂質(zhì)體藥物的輔料。此處所述的多價(jià)離子藥物，指的是藥物具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的可以解離的基團(tuán)，且藥物所具有的可解離基團(tuán)的解離常數(shù)pKa應(yīng)均在4.59.5之間，從而使藥物在此pKa值范圍內(nèi)帶有多個(gè)正電荷或者多個(gè)負(fù)電荷。包括米托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱或者長春堿等藥物此處所述的脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子具有兩個(gè)或兩個(gè)以上與活性成分相反的電荷。包括檸檬酸根、硫酸根或者磷酸根等。此處所述Tm指的是磷脂的相轉(zhuǎn)變溫度，通常通過DSC等手段可以測定得到。磷脂的Tm值和磷脂的烴鏈的長短有關(guān)系。通常烴鏈越長，磷脂的相轉(zhuǎn)變溫度就越高。此處所述的磷脂通常指的是磷脂酰膽堿。如果磷脂酰膽堿的Tm高于體溫，則其烴鏈的長度不應(yīng)少于16個(gè)碳。具體應(yīng)包括氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、雙軟脂酸卵磷脂(DPPC)或雙硬脂酸卵磷脂(DSPC)等磷脂。當(dāng)然，磷脂雙分子層中也可以含有其他的輔料，從而可以進(jìn)一步修飾脂質(zhì)體的表面特征，從而使脂質(zhì)體具有更佳的體內(nèi)行為。如磷脂雙分子層可以包括含有DSPE-PEG2000(用聚氧乙烯2000修飾的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)，或者是用特定抗體或配基修飾的膜材等。所使用的脂質(zhì)體的粒度在3080mn之間，優(yōu)選4060nm。脂質(zhì)體的粒度可以通過粒度測定儀或者電子顯微鏡等手段獲得。磷脂雙分子層還含有膽固醇。其他脂質(zhì)體藥物輔料含有蔗醣、組氨酸、抗氧劑等。該脂質(zhì)體藥物是注射液或凍干粉針。為了得到具有上述特征的脂質(zhì)體制劑，需要采用合適的方法制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體藥物的制備通常包括2個(gè)重要的步驟，即脂質(zhì)體的形成和藥物的包封。其中脂質(zhì)體的形成可以使用很多種手段實(shí)現(xiàn)。根據(jù)制備脂質(zhì)體時(shí)的出發(fā)體系的不同，可以分為a)以干燥的脂膜、脂類粉末為基礎(chǔ)的制備方法，(2)以乳劑為基礎(chǔ)的方法，(3)以混合膠團(tuán)為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備技術(shù)，(4)以乙醇、磷脂、水三相混合物為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備方法。藥物的包封則可以以被動(dòng)載藥或者主動(dòng)載藥的方式實(shí)現(xiàn)。這些方法在很多的脂質(zhì)體綜述性文章中都可以得到。本申請(qǐng)采用的方法包括如下步驟將所用的脂類輔料溶解于叔丁醇或(環(huán)己垸)中冷凍干燥得到凍干粉末。之后使用含有反離子的溶液水化凍干粉末以形成空白脂質(zhì)體。之后采用透析、或者柱層析等手段除去脂質(zhì)體外的反離子。從而使脂膜內(nèi)外形成反離子梯度。然后在將藥物和脂質(zhì)體孵育，得到脂質(zhì)體藥物。本發(fā)明的脂質(zhì)體藥物不僅保證了有效的包封效率和足夠的載藥量，還保證了在體外貯存期內(nèi)，藥物不會(huì)從脂質(zhì)體中釋放出來，并且還保證了脂質(zhì)體藥物在血液循環(huán)的過程中，不會(huì)發(fā)生顯著的滲漏，而增加毒性。本發(fā)明的脂質(zhì)體藥物重要的顯著效果是有效的加快藥物的釋放速率，改善了脂質(zhì)體的治療指數(shù)，并且與游離藥物相比，半衰期明顯延長，與已有的產(chǎn)品相比，毒性顯著降低，有效的發(fā)揮了藥物的治療作用。附圖1:PLM在KM小鼠體內(nèi)的藥代學(xué)行為及其與游離米托蒽醌藥代對(duì)比。其中PLM表示PEG化的米托蒽醌脂質(zhì)體，F(xiàn)M為米托蒽醌游離藥物，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位為小時(shí)?？v坐標(biāo)為米托蒽醌的血漿濃度，單位為Ug米托蒽醌/mL血槳。附圖2:PLM和FM在小鼠腫瘤內(nèi)分布圖。其中PLM為PEG化的米托蒽醌脂質(zhì)體，F(xiàn)M為米托蒽醌游離藥物，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位為小時(shí)?？v坐標(biāo)為米托蒽醌的在腫瘤組織中的濃度，單位為ug米托蒽醌/g腫瘤組織。附圖3:不同處方在小鼠體內(nèi)的藥代學(xué)對(duì)比。橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位為小時(shí)，縱坐標(biāo)為米托蒽醌的血漿濃度，單位為ug米托蒽醌/mL血漿。不同的處方給藥劑量均為4mg/kg。具體實(shí)施方式用下文的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，所用實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1米托蒽醌脂質(zhì)體的制備(處方為PLM)將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照(3:1:1)的質(zhì)量比混合，在溶解于95%叔丁醇中，得到澄明溶液。之后冷凍干燥得到均勻的凍干粉末。將此凍干粉末用300mM的硫酸銨溶液在6065度水化，之后震蕩lh，得到不均勻的多室脂質(zhì)體。最終的磷脂濃度為96mg/mL。之后使用微射流設(shè)備降低脂質(zhì)體的粒度。將所獲得的樣品用NaCl溶液稀釋200倍后，用NanoZS進(jìn)行檢測，粒子的平均粒度約為60nm，主峰集中在4060nm之間。之后使用超濾裝置移去空白脂質(zhì)體外相的硫酸銨，將外相置換成250mM蔗糖及50mM甘氨酸。以便形成跨膜硫酸銨梯度。按照脂藥比16:l的比例，在空白脂質(zhì)體中加入米托蒽醌鹽酸鹽溶液(10mg/mL)，在6065度進(jìn)行載藥。孵育約lh后，使用凝膠排阻色譜可證明包封效率約為100%。此處方被命名為PLM。實(shí)施例2(處方為PLM18.6)將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照(3:1:1)的質(zhì)量比混合，在溶解于95%叔丁醇中，得到澄明溶液。之后冷凍干燥得到均勻的凍干粉末。將此凍干粉末用300mM的硫酸銨溶液在6065度水化，之后震蕩lh，得到不均勻的多室脂質(zhì)體。最終的磷脂濃度為96mg/mL。之后使用微射流設(shè)備降低脂質(zhì)體的粒度。將所獲得的樣品用NaCl溶液稀釋200倍后，用NanoZS進(jìn)行檢測，粒子的平均粒度約為60nm，主峰集中在4060nm之間。之后使用超濾裝置移去空白脂質(zhì)體外相的硫酸銨，將外相置換成250mM蔗糖及50mM甘氨酸。以便形成跨膜硫酸銨梯度。按照脂藥比18.6:l的比例，在空白脂質(zhì)體中加入米托蒽醌鹽酸鹽溶液(10mg/mL)，在6065度進(jìn)行載藥。孵育約lh后，使用凝膠排阻色譜可證明包封效率約為100%。此處方命名為處方為PLM18.6。實(shí)施例3米托蒽醌脂質(zhì)體的制備(處方為PLM85)將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照(3:1:1)的質(zhì)量比混合，在溶解于95%叔丁醇中，得到澄明溶液。之后冷凍干燥得到均勻的凍干粉末。將此凍干粉末用300mM的硫酸銨溶液在6065度水化，之后震蕩lh，得到不均勻的多室脂質(zhì)體。最終的磷脂濃度為96mg/mL。采用高壓擠出的方法降低脂質(zhì)體的粒度，其粒度為85nm。將所獲得的樣品用NaCl溶液稀釋200倍后，用NanoZS進(jìn)行檢測，粒子的平均粒度約為85nm，之后使用超濾裝置移去空白脂質(zhì)體外相的硫酸銨，將外相置換成250mM蔗糖及50mM甘氨酸。以便形成跨膜硫酸銨梯度。按照脂藥比16:1的比例，在空白脂質(zhì)體中加入米托蒽醌鹽酸鹽溶液(10mg/mL)，在6065度進(jìn)行載藥。孵育約lh后，使用凝膠排阻色譜可證明包封效率約為100%。實(shí)施例4米托蒽醌脂質(zhì)體制備(處方為DPPC)將DPPC、Chol和DSPE-PEG2000按照質(zhì)量比3:1:1的比例混合均勻，其他操作同實(shí)施例l。此處方被命名為DPPC。實(shí)施例5米托蒽醌脂質(zhì)體制備(處方為DMPC)將DMPC、Chol和DSPE-PEG2000按照質(zhì)量比3:1:1的比例混合均勻，其他操作同實(shí)施例l。此處方被命名為DMPC。實(shí)施例6米托蒽醌脂質(zhì)體制備(處方為DMPC-0.1)將DMPC、Chol和DSPE-PEG2000按照質(zhì)量比3:1:0.1的比例混合均勻，其他操作同實(shí)施例l。此處方被命名為DMPC-O.1。實(shí)施例7不同的脂質(zhì)體處方的釋放情況的差異由于在本例中，米托蒽醌是采用硫酸銨梯度進(jìn)行載藥的。如果在釋放介質(zhì)中加入一定濃度的氯化銨，游離的氨分子就會(huì)借助梯度擴(kuò)散到脂質(zhì)體的內(nèi)相空間內(nèi)，從而升高內(nèi)相的pH值。使內(nèi)相的質(zhì)子化的米托蒽醌轉(zhuǎn)變成中性的可以跨膜擴(kuò)散的米托蒽醌。這個(gè)過程同時(shí)又可以加脂質(zhì)體內(nèi)沉淀的溶解。米托蒽醌從脂質(zhì)體中釋放的快慢，是受沉淀溶解和膜通透性雙重控制的。釋放的條件如下將脂質(zhì)體用釋放介質(zhì)稀釋25倍。釋放介質(zhì)含有40mM的氯化銨。等滲，pH為7.4。將稀釋的脂質(zhì)體裝在透析袋中，2mL的脂質(zhì)體稀釋液對(duì)400mL釋放介質(zhì)進(jìn)行透析，在37度進(jìn)行釋放。不同時(shí)間取點(diǎn)進(jìn)行分析，一直取到96小時(shí)。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，PLM85無釋放。PLM的釋放半衰期為134小時(shí)，PLM18.6的釋放半衰期為185小時(shí)。DPPC的釋放半衰期為116小時(shí)。而DMPC的釋放半衰期為26小時(shí)，DMPCO.1的釋放半衰期為15小時(shí)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，減少脂質(zhì)體的粒度可以加快藥物的釋放速度。同時(shí)改用低Tm值的磷脂也可以加快藥物的釋放。實(shí)施實(shí)例8PLM在KM小鼠體內(nèi)的藥代學(xué)行為及其與游離米托蒽醌藥代對(duì)比實(shí)驗(yàn)使用雄性體重約為20g的KM小鼠完成。不同劑量的米托蒽醌通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。PLM的給藥劑量為1、2和4mg/kg，游離米托蒽醌(FM-2)的給藥劑量為2mg/kg。在不同的時(shí)間收集血漿樣品。血漿的處理方法和檢測方法與文獻(xiàn)(Methodsinenzymologyvol391，176-185)中報(bào)道的相似。結(jié)果見表1和附圖1。表1:PLM在KM小鼠體內(nèi)的藥代學(xué)參數(shù)及其與游離米托蒽醌藥代學(xué)參數(shù)對(duì)比PLM-4PLM-2PLM-1FM-2參數(shù)參數(shù)值參數(shù)值參數(shù)值參數(shù)值A(chǔ)UC0-48(mg/L*h)1451.666728.398452.7090.198AUC0-°°(mg/L*h)1654.543892.437503.0780.199AUMC0-4821838.03412050.6817049.2590.103AUMC0-~36234.61124686.91710488.8110.135MRT0-48(h)15.04316.54415.5710.517MRT0-~(h)21.90027.66220.8490.675Tmax(h)0.0830.0830.2500.083Cmax(mg/U86.32947.51325.9700.699從圖1和表1中可以清楚看到，脂質(zhì)體包裹可以顯著的延長米托蒽醌的半衰期。同劑量的PLM和FM相比，其在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間是游離藥物的32倍左右。其AUC值則約為游離藥物的3700倍。同時(shí)以AUC為因變量，對(duì)劑量作圖，可以發(fā)現(xiàn)PLM在體內(nèi)成線性代謝。實(shí)施例9PLM和FM在荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布PLM和FM在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布有明顯的差異。實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠為20g左右的KM雄性小鼠，S-180肉瘤細(xì)胞按照5X105的比例接種于小鼠右側(cè)腋下。當(dāng)腫瘤生長至0.40.7g時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。所測定的組織包括心、肝、脾、肺、腎、腸、髓以及腫瘤。結(jié)果見表2和附圖2。從附圖2可以看出，PLM對(duì)于腫瘤組織具有非常明顯的靶向性。從表2可以看出PLM在某些正常組織中的分布量降低。表2:PLM和FM在荷瘤小鼠正常組織內(nèi)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。PLM-4FM-4TimeC-ug/gSDTimeC-ug/gSDHeart14.010.3815.3850.67943.390.3843.5170.95283.480.6483.1970.357162.830.57242.9430.549242.060.4816.780.7814.7700.99745.990.6743.5560.543Liver86.310.3882.6590.439166.220.95241.9370.346244.520.6514.661.3714.0440.41444.360.6744.4600.494Spleen84.781.7083.7742.676167.562.13247.7522.柳245.911.0018.441.08110.2051.73244.582.3648.0241.859Lung86.331.4387.0180.728165.121.24248.0820.844242.890.2317.090.84118.2431.23847.121.17417.1925.010Kidney87.040.96813.4091.251166.751.16247.4631.209245.820.8411.660.6611.5320.30942.330.6642.1400.655Intestine82.340.6482.5511.204162.420.51243.9361..625242.250.3211.090.5410.1270.■04140.640.14Nfarrow80.730.,16160.540.,24240,120..02191.287..4110.06140.0078463908..5640.01330.0027Plasma854.018..041638:619..192410i.412..67實(shí)施例10不同脂質(zhì)體處方的藥代學(xué)對(duì)比所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為KM種小鼠，雌雄各半，體重在1822克。三種處方的給藥劑量均為4mg/kg，通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。對(duì)比結(jié)果見附圖3和表3。表3:不同處方在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的對(duì)比參數(shù)DPPC-4參數(shù)值證C-0.l-4參數(shù)值DMPC-4參數(shù)值A(chǔ)UC0-48(mg/L*h)1506.710174.849337.641AUC0-w(mg/L*h)1581.242175.705344.134AUMC0-4821425.2741383.7573417.981AUMC0-~26235.6131478.2673818.856MRT0-48(h)14.2207.91410.123MRT0-。(h)16.5928.41311.097Tmax(h)1.0001.0001.000Cmax(mg/U81.97619.85339.115結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)脂雙層的組成發(fā)生顯著的變化后，會(huì)明顯的改變脂質(zhì)體藥物在體內(nèi)的藥代學(xué)行為。DPPC，DMPC-O.1和DMPC這三個(gè)處方在體內(nèi)的MRT值分別為14.22，7.914和10.123小時(shí)。其中DPPC和DMPC相比，其處方的差異就在于使用的磷脂的烴鏈的長度不同，分別為16和14碳。?；湹拈L短的不同，可以顯著的影響磷脂雙分子層的通透性。其中DPPC的Tm值為41度，而DMPC的Tm值為23度。DMPC-0.1以及DMPC這兩個(gè)處方相比，差異就在于PEG化的程度不同。脂質(zhì)體在血槳中的釋放跟2種因素有關(guān)，一是藥物跨磷脂雙分子層的釋放，另外一種與脂蛋白和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬有關(guān)系。由于DMPC-0.1脂質(zhì)體的PEG化不完全，所以由于血漿成分引起的釋放對(duì)其有較大影響。實(shí)施例11PLM和FM的急性毒性的對(duì)比取KM種小鼠100只，雌雄各半，體重在1822克。一共分成IO組，每組10只，雌雄各半。前五組給與不同劑量的游離藥物，后五組給予等劑量的脂質(zhì)體藥物。觀察小鼠的體重變化情況，并記錄小鼠的死亡時(shí)間。小鼠死亡后，對(duì)其進(jìn)行解剖，并進(jìn)行尸檢，記錄游離藥物組和脂質(zhì)體組的死亡情況。結(jié)果見表4。表4:PLM對(duì)KM小鼠的急性毒性及其與游離米托蒽醌對(duì)比SurvivaltimeforMalemiceSurvivaltimeforFemalemiceNo.1No.2No.3No.4No.5No.1No.2No.3No.4No.5Free20788968889NAFree12181313NA712121314NAFree7.2NANANANANANANANANANAFree4.32NANANANANANANANANANAFree2.59NANANANANANANANANANALiposome2017NA12NANANAMNANANALiposome12NANANANANANANANANANALiposome7.2NANANANANANANANANANALiposome4.32NANANANANANANANANANALiposome2.59NANANANANANANANANANA(NA表示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在觀察期內(nèi)沒有死亡，因此死亡時(shí)間值無法獲得)實(shí)驗(yàn)證明PLM的急性毒性遠(yuǎn)低于FM。實(shí)施例12不同脂質(zhì)體處方的急性毒性的對(duì)比取Balb/c種小鼠90只，全部為雄性，體重在1822克。一共分成9組，每組10只。第一組給予游離的米托蒽醌(FM)，劑量為6mg/kg。其余8組分別給予PLM，DPPC，DMPC-0.1和DMPC劑量分別為6和12mg/kg。觀察小鼠的體重變化情況，并記錄小鼠的死亡時(shí)間。小鼠死亡后，對(duì)其進(jìn)行解剖，并進(jìn)行尸檢，記錄游離藥物組和脂質(zhì)體組的死亡情況。結(jié)果見表5。表5:不同脂質(zhì)體處方的急性毒性的對(duì)比12345678910FM-6NANANANANANANANANANAPLM-6NANANANANANANANANANAPLM-12NANANANANA10NANANA11DPPC-6NANANANANANANANANANADPPC-1210101211NANANA13NA14DMPC-64NANA36776NANADMPC-123353334333DMPC0.1-6NANANANANANANANANANA證CO.1-1210121012101010111010(NA表示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在觀察期內(nèi)沒有死亡，因此死亡時(shí)間值無法獲得)實(shí)驗(yàn)證明不同處方的急性毒性順序如下PLM的毒性〈DPPC的毒性〈DMPCO.1的毒性FM的毒性〈DMPC的毒性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明同時(shí)釆用小單室處方，并且改變磷脂雙分子層的組成為Tm較低的磷脂，如DMPC，會(huì)進(jìn)一步加快藥物的釋放速度。從而在體內(nèi)造成更大的毒性。但是值得注意的事，不完全PEG化的處方的毒性反而要低于高PEG化的處方。這可能是由于DMPCO.1的PEG化程度不完全，在血液循環(huán)的過程中，由于脂蛋白的作用和免疫系統(tǒng)的攻擊，藥物和dmpc相比，藥物提前釋放，沒有在重要的組織內(nèi)發(fā)生突釋。從而降低了毒性，但是其毒性勉強(qiáng)與游離藥物相當(dāng)。實(shí)施例13PLM和FM對(duì)S-180肉瘤的治療效果的對(duì)比選取接種S180瘤細(xì)胞7天的腹水型荷瘤小鼠，斷頸處死，抽取乳白色粘稠腹水，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，稀釋后調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為2.5X106個(gè)細(xì)胞/ml。將瘤細(xì)胞懸液接種于體重1822gKM雄性小鼠前肢腋下皮下組織，接種體積為0.2ml，含瘤細(xì)胞約5X105個(gè)，接種完成后，剩余的瘤細(xì)胞懸液在光鏡下計(jì)數(shù)，活瘤細(xì)胞數(shù)〉95%。共接種80只小鼠。接種7天后，挑選腫瘤邊界清楚、瘤徑約5的小鼠39只，按瘤大小將動(dòng)物分層，再按體重隨機(jī)分組。分為空白對(duì)照組7只，米托蒽醌脂質(zhì)體4、6mg/kg組、米托蒽醌游離藥4、6mg/kg組各8只。分別按組靜脈給藥。給藥后動(dòng)物正常飼養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺測定腫瘤直徑，每周測量3次，每次測量同時(shí)稱鼠重。腫瘤體積(tumorvolume,TV)的計(jì)算公式為V=1/2XaXb2(其中a、b分別表示長寬)，根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算出腫瘤體積。接種后第21天脫頸處死小鼠，剖取瘤塊并稱重。根據(jù)公式計(jì)算腫瘤抑制率(％),腫瘤抑制率=(1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表6。表6PLM對(duì)S180實(shí)體瘤瘤重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>a:與空白組相比，p<0.01結(jié)果表明米托蒽醌脂質(zhì)體4、6mg/kg劑量組顯著抑制S180實(shí)體瘤的生長。實(shí)施例14PLM和FM對(duì)L1210腹水模型的治療效果選取接種7天的L1210腹水瘤BDF1小鼠，斷頸處死，無菌條件下抽取乳白色粘稠腹水，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，稀釋后調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為2.5X106個(gè)細(xì)胞/ml。將瘤細(xì)胞懸液腹腔接種于78周齡BDF1雌性小鼠，接種體積為0.2ml，含瘤細(xì)胞約5.OX105個(gè)，接種完成后，剩余的瘤細(xì)胞懸液在光鏡下計(jì)數(shù)，活瘤細(xì)胞數(shù)〉95%。共接種33只小鼠。24小時(shí)后，按體重隨機(jī)分成8組，分別給予米托蒽醌游離藥2，4和8mg/kg;以及米托蒽醌脂質(zhì)體2、4、6和8mg/kg分別尾靜脈注射給藥，給藥容積為20ml/kg。給藥后動(dòng)物正常飼養(yǎng)，每周3次測量鼠重，觀察和記錄動(dòng)物死亡時(shí)間，計(jì)算生存天數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以動(dòng)物平均生存天數(shù)(艮卩meansurvivaltime,)禾卩中位生存時(shí)間(艮卩mediansurvivaltime，MST)來評(píng)價(jià)每組的生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)觀察至接種后60天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。表7L1210腹水瘤對(duì)BDF1小鼠生存時(shí)間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>Nb:在觀察期60天結(jié)束時(shí)僅有少數(shù)動(dòng)物死亡，不能計(jì)算中位生存時(shí)間。結(jié)果表明經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，各給藥組與空白組相比均顯著增加動(dòng)物的生存時(shí)間，相同劑量的米托蒽醌脂質(zhì)體(8mg/kg)與游離藥組相比療效顯著增強(qiáng)(P<0.05)。實(shí)施例15PLM和FM對(duì)L1210肝轉(zhuǎn)移模型的治療效果選取接種7天的L1210腹水瘤BDF1小鼠，斷頸處死，無菌條件下抽取乳白色粘稠腹水，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，稀釋后調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為2.5X105個(gè)細(xì)胞/ml。將瘤細(xì)胞懸液靜脈接種于7-8周齡BDF1雄性小鼠，接種體積為0.2ml，含瘤細(xì)胞約5.0X104個(gè)，接種完成后，剩余的瘤細(xì)胞懸液在光鏡下計(jì)數(shù)，活瘤細(xì)胞數(shù)〉95%。共接種62只小鼠。24小時(shí)后，同1.3分組給藥。給藥后動(dòng)物正常詞養(yǎng)，每周3次測量鼠重，每天觀察和記錄動(dòng)物死亡情況，計(jì)算生存天數(shù)。實(shí)驗(yàn)觀察至接種后60天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組小鼠在接種后第11-14天全部死亡；米托蒽醌游離藥三個(gè)劑量組所有動(dòng)物在接種后第11-17天期間全部死亡；米托蒽醌脂質(zhì)體2mg/kg劑量組所有動(dòng)物在接種后第15-29天期間全部死亡，4mg/kg劑量組僅一只動(dòng)物在接種后第39天死亡，6mg/kg劑量組無動(dòng)物死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。表8靜脈接種L1210對(duì)BDF1小鼠生存時(shí)間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>"""i^':所有動(dòng)物在觀察期60天結(jié)束時(shí)無死亡，不能計(jì)算生存時(shí)間。Nb:在觀察期60天結(jié)束時(shí)僅有一只動(dòng)物死亡，不能計(jì)算中位生存時(shí)間。結(jié)果表明經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，與空白組相比，米托蒽醌游離藥6mg/kg劑量組和脂質(zhì)體各劑量組均顯著增加動(dòng)物的生存時(shí)間。相同劑量的米托蒽醌脂質(zhì)體與其游離藥組相比，均顯著提高動(dòng)物的生存時(shí)間。權(quán)利要求1.一種脂質(zhì)體藥物，其特征在于脂質(zhì)體的粒度在30～80nm之間，并含有1)活性成分為多價(jià)離子藥物，它可以和脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子形成難以溶解的沉淀；2)磷脂雙分子層含有Tm高于體溫的磷脂。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于活性成分具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的可以解離的基團(tuán)，且藥物所具有的可解離基團(tuán)的解離常數(shù)pKa均在4.59.5之間，從而使藥物在此pKa值范圍內(nèi)帶有多個(gè)正電荷或者多個(gè)負(fù)電荷。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于活性成分包括米托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱或者長春堿。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子具有兩個(gè)或兩個(gè)以上與活性成分相反的電荷。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子選自擰檬酸根、硫酸根或者磷酸根。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于Tm高于體溫的磷脂為磷脂酰膽堿。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于磷脂酰膽堿包括氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、雙軟脂酸卵磷脂或者雙硬脂酸卵磷脂。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體藥物，其特征在于脂質(zhì)體的粒度在4060nm之間。全文摘要本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)體藥物及其制備方法，特別是涉及米托蒽醌的脂質(zhì)體制劑及其制備方法。該脂質(zhì)體藥物的特征在于脂質(zhì)體的粒度在30～80nm之間，并含有1)活性成分為多價(jià)離子藥物，它可以和脂質(zhì)體內(nèi)的多價(jià)反離子形成難以溶解的沉淀；2)磷脂雙分子層含有Tm高于體溫的磷脂；以及其他可作為脂質(zhì)體藥物的輔料。文檔編號(hào)A61K9/127GK101209243SQ200610102339公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者孟程軍,蘭張,莉張,李彥輝,李春雷,王彩霞,王金戌,郭文敏申請(qǐng)人:石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司