專利名稱：：基于5SrRNA間隔序列的草藥鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過分析DNA序列鑒定草藥或植物的方法。特別地，本發(fā)明涉及基于5SrRNA間隔區(qū)域基因組DNA序列的草藥鑒定方法。
背景技術(shù)：
：天然資源，例如植物產(chǎn)品(草藥)、動物產(chǎn)品和礦物質(zhì)，在世界上的很多地方都已經(jīng)被長時間用于健康和醫(yī)療用途、治療或預(yù)防疾病。現(xiàn)在，盡管現(xiàn)代藥物有很大的發(fā)展，但在很多國家那些傳統(tǒng)藥材的市場仍很繁榮。例如在許多亞洲國家里，一些人把它們用作主要治療方法，而另一些人把它們用作輔助治療方法。在傳統(tǒng)藥材中，植物產(chǎn)品(或草藥)是主要成分。草藥通常是各種植物的經(jīng)過加工的部分，例如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等等。從最初開始，對于將草藥用于醫(yī)療目的的人們來說草藥鑒定就是一個巨大的挑戰(zhàn)。當(dāng)使用了錯誤的草藥時，它們可能會是無效的，并因此耽誤疾病的治療，或者它們可能使病情惡化，甚至導(dǎo)致死亡。草藥的錯誤鑒別可以是無意的(加工后的植物部分通常難以區(qū)分)或者是有意的(受到利益驅(qū)使的商家有時用看上去相似的較便宜的草藥替換昂貴的草藥)。傳統(tǒng)上，人們通過觀其外表、嗅其氣味和/或品其味道鑒定草藥，并且這些方法中的一些仍舊在被應(yīng)用。后來，草藥通過在顯微鏡下觀察而鑒定，在這里各種植物細(xì)胞的形狀和內(nèi)容物被檢測和分析。這些基于器官感覺標(biāo)志或解剖學(xué)特征的方法有時是不確定的。分析色譜例如薄層色譜、高效液相色譜、或液相色譜/質(zhì)譜被用于草藥鑒定。然而，化學(xué)表征(chemicalprofile)是多變的，并且可以被真實(shí)性(authenticity)之外的其它因素所影響。最近以來，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將在某些區(qū)域內(nèi)的基因組DNA片段通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增并進(jìn)行限制酶消化，從而產(chǎn)生限制性消化模式，這接下來被用于基于與標(biāo)準(zhǔn)模式(已知樣品)對比而確認(rèn)某些特定草藥的真實(shí)性(見美國專利號5，876，977、6，309，840和6,803,215)。然而，即使是這些現(xiàn)代鑒定技術(shù)也不能被廣泛用于所有草藥物種。仍需要開發(fā)基于各個獨(dú)立物種的可靠的鑒定方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的技術(shù)以鑒定百部屬(^mo加)的草藥或植物。這—屬的三個物種蔓生百部(&ewo"ay'^o"/ca)、直立百部(S.1sew//z/o//a)和對葉百部CS.rt^era^)在中國被官方認(rèn)定為草藥百部(i^fcc^emo"fle)的來源(所述植物干燥塊根(roottuber))。本發(fā)明的鑒定方法是基于對5SrRNA間隔區(qū)域的DNA序列的分析。使用這些區(qū)域作為分子標(biāo)記，本發(fā)明的技術(shù)提供了一種用于鑒定百部的可靠的方法，沒有本方法，這將是一件很有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)椴煌俨繉傥锓N的干燥塊根和摻雜物在外表上非常相似，而它們的化學(xué)表征是變化相當(dāng)大的。本發(fā)明的一方面提供了用于鑒定百部的可重復(fù)的及客觀的方法。所述方法簡單并且可在任何標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。在本發(fā)明一個特定的實(shí)施方案中，代表6個百部屬物種的17個樣品以及一種天門冬屬C4^arag^)物種被用于本發(fā)明的鑒定方法。概括說來，所述鑒定過程包括下面的步驟的一些或全部(a)從植物材料樣品(新鮮的或干燥的植物)中提取DNA;(b)通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增DNA提取物；(c)將PCR產(chǎn)物插入到載體中，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)各個感受態(tài)細(xì)胞克隆并提取所述質(zhì)粒DNA;(d)將各個克隆的經(jīng)擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA測序；(e)將不同樣品的序列和/或得自標(biāo)準(zhǔn)序列的序列進(jìn)行比較和排列對比；(f)計算在樣品自身間的相似性百分比或與所述標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性百分比。關(guān)于真實(shí)性的結(jié)論可以基于對每一個樣品所獲得的相似性百分比得到，或基于通過各種DNA序列分析生成的系統(tǒng)發(fā)生樹或簡約樹(parsimonioustree)得到。根據(jù)本發(fā)明的一個目的，本發(fā)明提供了多個新的DNA序列用作實(shí)施本發(fā)明的鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)序列。下面的DNA序列是用于實(shí)施本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物。每一個列出的序列都可以以其全長用作進(jìn)行對比的標(biāo)準(zhǔn)序列。或者一條列出的序列的一部分，從10%到100%(即等同于全長序列)，都可以用作實(shí)施本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)序列。在下面描述的特殊實(shí)施方案中，所述列出的序列的100%部分被用作標(biāo)準(zhǔn)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地使用所提供的標(biāo)準(zhǔn)序列的較小部分，并且可以針對特定的鑒定任務(wù)確定所述部分的最佳大小。當(dāng)然，本發(fā)明還包括如下內(nèi)容，即包含所列出的一種序列的更大的DNA序列也可用作所述標(biāo)準(zhǔn)序列以通過使用不同的引物實(shí)施本發(fā)明。附圖簡述圖1示出了百部屬物種和羊齒天門冬(J^arag^刀/z'd""力的5SrRNA間隔序列的序列排列對比。圖2示出了通過UPGMA樹構(gòu)建方法基于5SrRNA間隔序列產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖3示出了通過鄰位相連分析基于5SrRNA間隔序列產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖4示出了基于5SrRNA間隔序列產(chǎn)生的嚴(yán)格共有簡約樹。發(fā)明詳述歸糊收集代表六種百部物種的n個樣品和一種天門冬物種。所述n個樣品或者是新鮮植物，或者是干燥的植物材料。在此提供的所述樣品及其來源只是作為示例(表i)，并且作為鑒定方法，樣品的來源并不重要，只要有可用的已知被鑒定的標(biāo)準(zhǔn)樣品就可以了。表1代表六種百部物種的17個樣品和一種天門冬物種的來源和名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在DNA提取前，處理植物材料以避免真菌污染。將清洗過的植物材料在液氮中用杵和研缽研磨成粉末。將所述粉末保持在一80'C直至使用。通過Kang等(1998)的方法從植物樣品(草藥)中提取基因組DNA樣品。所述磨成粉末的樣品與400/ilSDS提取緩沖液(200mMTris-HCl(pH8.0)，200mMNaCl，25mMEDTA,0.5%SDS)和50/ig蛋白酶K混和。將所得混和物在37'C溫育1小時。然后加入400/xl2%CTAB溶液(100mMTris-HCl(pH8.0)，1.4MNaCl,20mMEDTA(pH8.0)，2%(w/v)CTAB，1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)Mr40000)并充分混和。接下來將所得混和物與含有5%苯酚的氯仿:異戊醇(24:1)混和并在12000rpm離心10分鐘。將上清與2/3體積的異丙醇混和并在室溫溫育10分鐘。最后將所得混和物在12000rpm離心5分鐘。將沉淀用70%乙醇洗滌后重懸于50/xl高溫滅菌的雙蒸水中。覆合蘑艦應(yīng)潛》用PCR擴(kuò)增感興趣的DNA區(qū)域。使用引物S-l(5'-GGATCCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTA-3，或SEQIDNO:l)和AS-1(5，-GGATCCTTAGTGCTGGTATGATCGCA-3'或SEQIDN0:2)擴(kuò)增5SrRNA間隔序列。如果用S-l和AS-1未能成功進(jìn)行PCR，則使用另一對引物5S2F(5，-GTGCTTGGGCGAGAGTAGTA-3'或SEQIDN0:3)和5S2R(5，-TTAGTGCTGGTATGATCGCA-3'或SEQIDN0:4)進(jìn)行PCR。該兩對引物在基因組相同的區(qū)域退火，但是5S2F和5S2R比S-l和AS-1短6bp。此處提供的特異引物是為了示例，而不是進(jìn)行限制。當(dāng)然，也可以選擇其它引物擴(kuò)增所希望的DNA區(qū)域并得到令人滿意的結(jié)果。PCR在含有15.3/xl高溫滅菌的雙蒸水、2.5/xlIOXPCR緩沖液(IOOmMTris-HCl(pH8.8)，500mMKC1)、2pd2.5mMdNTP、2/xl25mMMgCl2、luTaq聚合酶、1/d(10mM)兩種引物以及1/d模板DNA的混和物中進(jìn)行。熱循環(huán)在MJ-PTC100熱循環(huán)儀中進(jìn)行，條件如下95。C5min，1個循環(huán)；95°C20sec，56°C30sec，72°C1.5min，20個循環(huán)；以及最終延伸72"C5min。百部屬物種的5SrRNA間隔序列的大小是大約500bp長。羊齒天門冬的5SrRNA間隔序列的大小是大約600bp。遂接力轉(zhuǎn)眾純化所得到的PCR產(chǎn)物并通過連接插入到載體中。PCR產(chǎn)物的連接使用pGEM-TEasyVectorSystemI(Promega)進(jìn)行。將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。從一80'C取出100/il大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并保持在冰上使得所述細(xì)胞融化。當(dāng)所述細(xì)胞剛剛?cè)诨瘯r，加入全部5/xl重組質(zhì)粒。將感受態(tài)細(xì)胞在冰上留置30min后在42'C熱激2min。熱激后，將所述感受態(tài)細(xì)胞在冰上進(jìn)一步保持2min。然后向細(xì)胞中加入200/il37°CLB培養(yǎng)基并將所得混和物在37'C溫育50min。在溫育后，向細(xì)胞中加入5(^12%X-gal和0.4MIPTG。將所得培養(yǎng)物涂布在Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上并在37"C過夜溫育。在溫育后，在所述平板上形成藍(lán)色及白色菌落。對于每一塊平板，選擇幾個白色菌落。每一個單一白色菌落接種至含有50Mg/ml氨芐青霉素的5mlLuria-Bertani培養(yǎng)基中。所得培養(yǎng)物在37。C持續(xù)搖動溫育過夜。從所得培養(yǎng)物中使用Mini-MTMPlasmidDNAExtractionSystem(Viogene，cat.GF1002)分離質(zhì)粒DNA。使用'BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems,PN4337455)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的循環(huán)測序。純化所述循環(huán)測序的產(chǎn)物并重懸于HiDiFormamide(AppliedBiosystems,PN4311320)。然后使用ABIPRISM3100GeneticAnalyzer進(jìn)行樣品電泳。^"蕭i^ffcc汾e附o廳虛房J鑒定比較柯氏百部、蔓生百部、克氏百部、細(xì)花百部、直立百部、對葉百部和羊齒天門冬的DNA序列。對所述序列進(jìn)行排列并示于圖1。計算樣品之間的相似性百分比并將結(jié)果列于表2。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹以顯示它們之間的關(guān)系。使用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,MEGA)軟件2.1版(Kumar等，2001)生成非加權(quán)配對組算數(shù)平均(UnweightedPairGroupMethodw他ArithmeticMean,UPGMA)樹、鄰位相連(NeighborJoining)樹以及最大簡約(MaximumParsimony)樹。對于鄰位相連樹和UPGMA樹，距離使用Kimura2-parameter算法計算。對于簡約分析，使用緊密相鄰互換(close-neighbor-interchange，CNI)方法檢索簡約樹。對于500次重復(fù)進(jìn)行跋靴測試。在5SrRNA基因之間的間隔序列是變化的。這個變化可以足夠大以從其摻雜物中區(qū)分百部以及在不同的百部屬物種之間進(jìn)行區(qū)分。羊齒天門冬的5SrRNA間隔序列與百部屬物種的差別非常大。根據(jù)5SrRNA間隔序列的大小的差別、低相似性百分比以及其在系統(tǒng)發(fā)生樹中的位置可以很容易地從百部屬物種中區(qū)分出羊齒天門冬。得自羊齒天門冬的PCR產(chǎn)物的大小是600bp，而得自百部屬的PCR產(chǎn)物的大小僅有500bp。百部屬和天門冬的5SrRNA間隔序列差別太大以至于無法進(jìn)行排列對比。羊齒天門冬和百部屬物種的相似性百分比是平均大約16%。在構(gòu)建的UPGMA樹(示于圖2)、鄰位相連樹(示于圖3)以及最大簡約樹(示于圖4)中，羊齒天門冬和百部屬物種不屬于同一組。百部屬物種的5SrRNA間隔序列還可以彼此區(qū)分不同的百部屬物種。序列排列對比的結(jié)果顯示所述間隔序列的300bp-400bp區(qū)域是變化最大的區(qū)域(見圖1)。在這個變化區(qū)域中，每一個物種都具有獨(dú)特的插入和缺失部分或獨(dú)特的序列。所述間隔序列的序列在同一物種中是非常保守的，而在物種間的變化則是非常大的。如表2中所述，種內(nèi)相似性百分比大約是90-100%。在不同百部屬物種之間的種間相似性百分比大約是70-80%。因此，5SrRNA間隔序列對于鑒定百部是非常有用的分子標(biāo)記。在基于5SrRNA間隔序列構(gòu)建的所有系統(tǒng)發(fā)生樹中，6種百部屬物種形成了不同于羊齒天門冬的進(jìn)化枝。百部屬的進(jìn)化枝進(jìn)一步分枝出四個表示四種百部屬物種的小進(jìn)化枝。這些進(jìn)化枝在跋靴測試中的跋靴值為100，這意味著這些進(jìn)化枝得到了充分支持。表2:6種百部屬物種間5SrRNA間隔序列的相似性百分比<table><table>如前面的實(shí)施方案中所實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明利用DNA技術(shù)及5SrRNA間隔序列的遺傳學(xué)特征提供了在鑒定這一屬的藥用材料(草藥)和/或植物中有用的方法。作為一個實(shí)例，百部可以容易地以及客觀地從摻雜物中被鑒定。通過分析5SrRNA間隔序列，還可以將對草藥材料的鑒別具體至物種水平。預(yù)期可以通過對其它應(yīng)用實(shí)施前述基于5SrRNA間隔序列的鑒定方法獲得令人滿意的結(jié)果。由于已經(jīng)通過將其應(yīng)用于優(yōu)選的實(shí)施方案而描述并指出了本發(fā)明的基本的具有新穎性的特征，應(yīng)理解在所示范的過程和方法的形式及具體內(nèi)容上的各種省略和取代和改變可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在未背離本發(fā)明精神的前提下完成。例如，應(yīng)特別指出表現(xiàn)基本相同的功能，以基本相同的途徑得到相同結(jié)果的本發(fā)明的方法步驟的各種要素的所有組合都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明不受限于上面描述的具體實(shí)施方案，它們僅僅代表了本發(fā)明的實(shí)例，可以在所附的權(quán)利要求所限定的保護(hù)范圍內(nèi)通過各種方法對其進(jìn)行修改。序列表<110>香港賽馬會中藥研究院有限公司<120>基于5SrRNA間隔序列的草藥鑒定方法<130>HKWIIi0585<160>47<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer'S1<400>1ggatccgtgcttgggcgagagtagta26<210>2<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>PrimerAS1<400>2ggatccttagtgctggtatgatcgca26<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer5S2F<400>3gtgcttgggcgagagtagta20<210>4<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>Primer5S2R<400>4ttagtgctggtatgatcgc19<210>5<211>655<212>DNA<213>Asparagusfilicimis<220><223>5SrDNASpacerclonea<400>5gtgcttgggcgsgsgtsgtsctaggatgggtgscctcctgggaagtcctcgtgttgcacc60cctcctttttgcccggcgcgcaasttgcgactgagagcacgttt33ttttattttattat120tttccgccaatcggcggctcctttttttscCCCCtC3tttcctcccgccgtcsgcgcgga180cgtctgggsatgaga3g3tgagaagcacgtcgggcttctcgtttcgggga240gggggctg3ccgtcgggcascttagccccctccggatcgg3agttgcgggtcggggaggt300cacgcggaagcccgtccggcggasttggagtgtttccccgcgctcggggcascgtcaggg360ggtccgggccagcgtttcccttgtgsgc33ctttatccctggcsggtaca420aaaacgcagat3tCCCtC333ccgt33gggatttggcgaacgsacgaacc480cttcgggttcgttcggttggctccgtctcgccgagataagcgattttcatat3taattcg540tccaattccgscttacggcttgasagttscgccct3ttctccgstctatgttcagsacct600cgcctsagggcggctagtggatgggtgcga七C3t3CC3gC655<210>6<211>658<212>DNA<213>Asparagusfilicinus<220><223>5SrDNASpacercloneb<400>6gtgcttgggcgagagtagtactsggstgggtgacctcctgggssgtcctcgtgttgcacc60cctcctttttgctcggcgcgctgagsgcccgtttastttt3tttcsttat120tttccgccs3tcggcggctcCttttttt3CCCCCtC3tttcttcccgccgtcagggcgga180cgcctgggaacgsgssgatgagsagcacgtcgggcttctcgttgascaaggtttcgcgga240gggggccgaccgtcgggcsactscgtccccccccccggatcggaagttgcgggtcgggga300ggtcscgcggaagcccgtccggcgga3ttggagtgtttccccgcgctcggggc33cggct360gggggtccgggccagcgtttccctcgtaiggtgcctttatccctagcagag420ggstatccctgggatttggcgaaacggaggaagcgascga■acccttcgggttsgttcggttggctccgtctcgtcgagataagcgattttcgtatataat540tcgtccs3ttccgscttscggtttgasagttacgccctattcttcgatctatgttcggag600cctcgcct33ggggggsaggagacggcgagtggatgggtgcgatcatacc3gC3Ct33658<210>7<211>464<212>DNA<213>Stemona.collinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacer<400>7gtgcttgggcgagagteigtactsgg3tgggtgscctcctgggasgtcctcgtgttgcacc60CCttt33Cttttgcsgcgcccgcccgtcscgtctcgcagaasactcggggtcgatttgtg120tccctcgattctgscttgttsgggtgtgsstttggagaattcgacaccgc180cgscggcctgcggctgtcggccgcgccgttgctctcag33tcagctttccgtggscsggt240ssttcgtccgccgtagctcccgcsccgtcgattccagccg3gtcgcgcaa300ttcggctcc3aaatacggcagc3C3cgccg3tCCC3CCCttgttcctcgtaattttagcc360tcgggsgcccctcgcgcgtcgtgscsgccttggtgggtgcaggtgcgcgaggttaaaacg420gssatgcgtcgcacgtgtgtqgggtgcgstC3tatccsgc3464<210>8<211>465<212>DNA<213>Stemonacollinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacercloneb<400>8gtgcttgggcgagsgt3gtsctaggstgggtgscctcctgggasgtcctcgtgttgcacc60CCttt33Cttttgcsgcgcccgcgcgtgscgttttgcagagtcgsttcgc120gggaaaggaaatccctcgsttctgaicttgttsgggtttgsstttggagaattcgscsccg180ccgacggcctgcggctgtcggccgcgccgt3gctctcsg3atcagctttccgtggscagg240tssttcgtccgaaacggacacccgtsgctcccgcsccgtcg3ttCC33CCgagtcgcgca300attcggctccgaastscggc3gcsctctccC3tCCC3CCCttgttcctcgtwtttt3tc360ctcgggsgcccctcgcgcgtcgtg3asgccttggtgggggcgggtgcgcgaggttaaaac420ggaaatgcgtcgcacgtgtgtcgggtgcg3tcataccagc465<210>915<211>465<212>DNA<213>Stemonacollinsae(SpecimenG57)<220><223>5SrDNASpacerclonec<400>9gtgcttgggcgagagtagtactaggatgggtgacctcctgggaagtcctcgtgttgcacc60cctttsacttttgcsgcgcccg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