專利名稱：金銀花提取物,其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然藥物技術領域，具體地，本發(fā)明涉及從中藥金銀花或其基源植物忍冬或同屬植物中提取、精制得到的植物提取物及其提取方法，以及含有該提取物的藥物組合物。用本發(fā)明方法得到的提取物主要含有開聯番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢子苷酸，secologanic acid)及其衍生物，即環(huán)烯醚萜苷類化合物，或稱為總環(huán)烯醚萜苷。所述的植物提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌和抗病毒作用，該提取物和含有該提取物的藥物組合物可用于制備治療高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是用于治療病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的藥物和保健品。并且，所述的開聯番木鱉苷酸及其衍生物還可作為中藥金銀花的質量控制指標。
背景技術：
金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬?！吨袊幍洹?1963年版)將忍冬作為金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬?！吨袊幍洹?1963年版)將忍冬作為金銀花的唯一來源，1977年后各版《中國藥典》根據臨床療效、地區(qū)習慣用藥等綜合考慮，選定忍冬科的4種植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開的花為金銀花。其中正品為忍冬的干燥花蕾，我國大部分地區(qū)均產，以山東產量最大，河南產的質量較佳。事實上，全國各地所用者遠不止于此。全世界忍冬屬植物約200種，我國有98種，廣布于全國各省區(qū)，而以西南部種類最多，其中可供藥用的品種達47種。由于金銀花的藥用品種相對混亂，因此為了保證其質量和藥效的穩(wěn)定性，2005版《中國藥典》規(guī)定金銀花為忍冬科的植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花；同時，將紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花Lonicera confusa DC.和毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開的花為金銀花單獨列為“山銀花”(參見國家藥典委員會編，《中華人民共和國藥典》一部，2000年版，北京，化學工業(yè)出版社，p.177；和國家藥典委員會編，《中華人民共和國藥典》一部，2005年版，北京，化學工業(yè)出版社，pp.152～153)。金銀花和山銀花具有清熱解毒，涼散風熱等功效。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發(fā)熱。臨床上用于治療風熱犯肺，上呼吸道感染所致發(fā)熱、咽痛等癥。近年來，以金銀花原料相繼開發(fā)了許多單方和復方制劑。盡管金銀花具有較好的臨床療效，但其有效成分及現行的質量控制指標仍然有必要進行深入研究和探討。
化學成分研究表明金銀花中含有有機酸類、三萜皂苷類、黃酮及其苷類、環(huán)烯醚萜苷類、揮發(fā)油等。實驗研究表明金銀花的藥理活性多種多樣，主要有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調節(jié)等作用。雖然從金銀花中已經分離得到并鑒定了多種成分，但目前認為金銀花中主要有效成分為綠原酸類化合物；此外，還有揮發(fā)性成分芳樟醇等。因此，通常以綠原酸的含量高低來評價金銀花質量的優(yōu)劣，金銀花的提取、精制工藝多以綠原酸類化合物為考察指標，少部分以揮發(fā)性成分為考察指標。綠原酸雖具有解熱和廣譜的抗菌、抗病毒作用，但其并非是金銀花中唯一解熱、抑菌和抗病毒成分，且綠原酸在體內能被蛋白質滅活，其抗菌和抗病毒作用并不強。因此，對金銀花解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗病毒的有效成分和作用機理尚不完全清楚。有關金銀花資源和其中成分的研究可參見上海醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥分析室，上海中藥制藥一廠，金銀花有效成分的初步研究，醫(yī)藥工業(yè)，1975，7，24；石鉞，石任兵和陸蘊如，我國藥用金銀花資源、化學成分及藥理研究進展，中國藥學雜志，1999，34(11)，724-727；婁紅祥等人，金銀花中水溶性化合物的分離與結構確定，中草藥，1996，27(4)，195-197；Son KunHo等人，Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica，Phytochemistry，1994，35(4)，1005-1008；Hideaki Kawai等人，Studies on thesaponins of Lonicera japonica Thunb，Chem.Pharm.Bull，1988，36(12)4769-4773；中沖太七郎，金銀花の成分に就いて，藥學雜志，1949，69，320；中沖太七郎，金銀花の成分に就いて，藥學雜志，1961，81，558；高玉敏等，金銀花化學成分的研究，中草藥，1995，26(11)568；黃麗瑛等人，中藥金銀花化學成分的研究，中草藥，1996，27(11)，645；和SonKun Ho等人，Flavonoids from the aerial parts of Lonicera japonica，Arch.Pharmacal Res.，1992，15(4)，365。以上文獻引入本文作為參考。
本發(fā)明人研究發(fā)現金銀花中具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要以環(huán)烯醚萜苷類化合物為主，尤其是以開聯番木鱉苷酸為主(含量大于10％)，而其中綠原酸類化合物的總含量小于5％。在藥理活性評價中，該有效部位和其中的主要化合物均表現出顯著的解熱、抗炎、抗菌和抗病毒作用。然而，現有金銀花提取物的制備方法不但忽略了環(huán)烯醚萜苷類化合物，同時，以綠原酸類化合物為考察指標的質量控制標準也無法反映其中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量情況。
環(huán)烯醚萜類化合物普遍存在于植物界，文獻報道金銀花的基源植物忍冬Lonicera japonica Thunb.中含有以下結構的5個環(huán)烯醚萜類化合物，分別為secologanin dimethylacetal[開聯番木鱉苷二甲基縮醛]、loganin(番木鱉苷，或馬錢子苷)、vogeloside、epi-vogeloside和開聯番木鱉苷酸(或裂環(huán)馬錢子苷酸，secologanic acid)，參見Kim Youngleem，KimYoungmi，Kim Jinwoong等人，Isolation of flavonoids from herbs ofLudwigia prostrate and flowers of Lonicera jiaponica.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，22，43。
文獻中已經報道了通過反復多次的正相和反相硅膠柱色譜分離純化，從金銀花及其基源植物忍冬或忍冬屬其他植物中得到包括開聯番木鱉苷酸和其他環(huán)烯醚萜衍生物類單體化合物的方法，例如可參見HideakiKawai，Masanori Kuroyanagi，Akira Ueno.Iridoid Glucosides from Lonicerajaponica Thunb，Chem.Pharm.Bull.，1988，36(9)，p3664；王國亮等，豫北平原栽培金銀花精油化學成分分析，中國中藥雜志，1992，17(5)，p268；張玲等，山東金銀花鮮花揮發(fā)油的化學成分的研究，中國現代應用藥學，1998，15(1)，p18；姚育法等，超臨界CO2流體萃取金銀花產物的化學成分研究，中藥材，2000，23(9)，p545；王天志和李永梅，細氈毛忍冬花蕾揮發(fā)油成分研究，中藥材，1999，22(11)，p574；郭艷文等，黃褐毛忍冬與金銀花的比較研究，藥物分析雜志，1990，10(1)，p2；Sim KylSoon等，sterols and sterol glycosides from Lonicerae flos.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，4，p79；Kunitomo Junichi等，On the constituentsof Lonicerae Folium.Shoyakugaku Zasshi，1983，37(3)，p294；張重義和李萍，金銀花藥材的綜合研究.現代中藥研究與實踐，2003，17(3)。p58-62；邢俊波等，金銀花質量與生態(tài)系統(tǒng)的相關性研究，中醫(yī)藥學刊，2003，21(8)，p1237-1238；和林丹等，中藥金銀花藥用成分的提取及抑菌實驗研究，天然產物研究與開發(fā)，2003，15(5)，p 436-437。以上文獻被引入本文作為參考。
但是，由于金銀花及其基源植物忍冬或同屬其他植物中環(huán)烯醚萜類化合物的極性較大水溶性很大，利用常規(guī)分離技術富集高含量環(huán)烯醚萜類(總含量大于50％)，尤其是高含量的開聯番木鱉苷酸有較大難度；同時，由于開聯番木鱉苷酸的結構特殊，鑒定存在相當難度，因此，到目前為止尚未有過由上述植物中提取適于藥用的有效部位的報道，更沒有文獻報道從上述植物中得到開聯番木鱉苷酸及其衍生物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。另外，現有技術的有關報道中，開聯番木鱉苷酸及其衍生物的制備也難以實現工業(yè)化生產。
本發(fā)明人經過深入的研究，發(fā)現了從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物中制備得到了具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物，該植物提取物是適于藥用的有效部位；并且，該提取物的制備方法適用于工業(yè)化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供了從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物制備得到具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物的方法，以及由該方法獲得的植物提取物，該提取物中的有效成分是以開聯番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢子苷酸，secologanic acid)為主要成分的環(huán)烯醚萜類化合物，以提取物的總重量計，該提取物中以開聯番木鱉苷酸及其衍生物為主要成分的環(huán)烯醚萜類有效成分群的含量大于50％，優(yōu)選大于70％，最優(yōu)選70-98％；在所述的環(huán)烯醚萜類化合物中，以提取物的總重量計，開聯番木鱉苷酸單一成分的含量大于25％，優(yōu)選大于50％，最優(yōu)選大于70％，特別優(yōu)選70～95％。
本文中上述植物提取物被簡稱為“金銀花提取物”。
本發(fā)明所述環(huán)烯醚萜類化合物或開聯番木鱉苷酸及其衍生物包括如下結構式的化合物 其中，X1和X2各自獨立地表示O、N或S，其中優(yōu)選O；R、R1或R2各自獨立地表示氫、C1-6低級烷基或C2-6低級鏈烯基。
本文中所使用的術語“C1-6低級烷基”是指具有1-6和碳原子的，直鏈或支鏈的飽和烴基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、正戊基、異戊基、正己基等。
本文中所使用的術語“C2-6低級鏈烯基”是指具有2-6個碳原子，以及具有一或二個不飽和雙鍵的直鏈或支鏈烴基，例如乙烯基、丙烯基、異丁烯基、異戊烯基等。
優(yōu)選的，上述R、R1或R2基團各自獨立的是氫、甲基、乙基或異戊烯基。
最優(yōu)選其中的式(1)化合物，特別是其中X1和X2為O，R為H的化合物，即開聯番木鱉苷酸。
本發(fā)明還提供了從金銀花或忍冬屬植物原料中制備金銀花提取物的方法，應用該制備方法得到的提取物中以開聯番木鱉苷酸及其衍生物為主要成分的環(huán)烯醚萜類有效成分群，該有效成分群即是所述植物的有效部位。
本發(fā)明所述金銀花提取物的制備方法包括以下步驟1、提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑進行提取，得到提取液；2、后處理(1)將提取液經常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經噴霧干燥得到粉末；(2)將上一步驟得到的產物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進行沉淀或沉降，用常規(guī)方法進行處理得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，為沉淀物或溶解液濃縮物；3、色譜分離純化將上述后處理得到的沉淀物或溶解液濃縮物，用色譜方法分離純化，用洗脫溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的流份，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物。
其中，所述的色譜方法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠和/或反相硅膠色譜，或者它們的組合；經過上述色譜方法純化的金銀花提取物中，開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量大于50％。
如果需要，可將上述方法得到的產物用凝膠色譜法進一步純化，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的植物提取物。其中所述的凝膠色譜的填料優(yōu)選為Sephadex LH-20；以及洗脫所用的溶劑為選自乙醇、甲醇和水中的一種，或數種溶劑組合的混合溶劑。
具體的，本發(fā)明所述金銀花提取物的制備方法包括以下步驟1、提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑在室溫至加熱回流的溫度下提取，得到提取液；
其中，所述C1-C6烷醇選自甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇，或其中的二種或多種組成的混合溶劑，優(yōu)選乙醇或甲醇，更優(yōu)選乙醇；2、后處理(1)將上述提取液經常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經噴霧干燥得到粉末；(2)將上一步驟得到的產物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進行沉淀或沉降，過濾收集沉淀物直接干燥，或收集溶液后，再經濃縮和干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物；其中，所述用于溶解提取物的溶劑為水或選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇的醇溶劑，或它們的組合，優(yōu)選水、甲醇或乙醇，更優(yōu)選水或乙醇；所述用于沉淀的極性相反的其它溶劑是水或醇溶劑，所述醇溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇，或它們的組合，優(yōu)選水、甲醇或乙醇，更優(yōu)選水或乙醇；3、色譜純化將經過后處理得到的產物用色譜方法分離純化，用洗脫溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，其中所述的色譜方法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠或反相硅膠色譜，或者它們的組合；經過此處理得到的提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％；4、凝膠色譜純化將上述色譜精制得到的提取物用凝膠色譜純化，用水或醇溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的植物提取物，其中總環(huán)烯醚萜苷含量大于70％。
在上述步驟1中，特別是在工業(yè)化生產中，提取步驟所使用的乙醇可以是工業(yè)乙醇，工業(yè)乙醇中的乙醇含量通常是大約60％-95％。
在上述步驟2中，所用的處理方法是中藥制藥領域常規(guī)的沉淀法，例如使用水提醇沉，或使用醇提水沉，或分別使用不同濃度的醇溶劑進行提取和沉淀等，以達到提純的目的。
在所述步驟3的色譜純化中，所述的色譜法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠和反相硅膠柱色譜，或者它們的組合。其中所述的大孔吸附樹脂可使用苯乙烯型大孔吸附樹脂，例如HP-20、D101、SP-70、SP-700、SP-825、RH等型號的樹脂；所述的正相硅膠色譜，其填料例如是硅膠；所述的反相硅膠色譜，其填料例如是C-18。在色譜方法中，優(yōu)選使用大孔吸附樹脂柱色譜的方法，該方法分離效果好，且成本低廉。
所述色譜法的洗脫溶劑為水；C1-C6烷醇，如甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等；鹵代烴，如二氯甲烷、氯仿等；醚類溶劑，如乙醚、甲基叔丁醚等；酮類溶劑，如丙酮、2-丁酮等；酯類溶劑，如乙酸乙酯、甲酸乙酯等；以及由上述二種或多種溶劑組成的混合溶劑。其中，優(yōu)選的洗脫溶劑為氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水以及其中的二種或數種混合的溶劑。在所述色譜方法中，當用苯乙烯型大孔吸附樹脂柱進行分離純化時，洗脫溶劑優(yōu)選水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；當用反相硅膠色譜精制時，洗脫溶劑優(yōu)選水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；當用正相硅膠精制時，洗脫溶劑為三氯甲烷或乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇組成的混合溶劑，它們的比例為10∶1-1∶1。
本發(fā)明所述的色譜法也可以將經后處理步驟得到的產物混合于硅膠或硅藻土中，晾干后用洗脫溶劑逐步洗脫或回流洗脫的方法，所用的洗脫溶劑與使用硅膠或苯乙烯型大孔吸附樹脂柱時類似。
經過色譜方法處理得到的提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％，開聯番木鱉苷酸的含量通?？纱笥?5％，優(yōu)選大于50％。
關于步驟4的凝膠色譜純化，其中所述的凝膠色譜填料優(yōu)選為Sephadex LH-20；洗脫所用的溶劑為選自乙醇、甲醇和水中的一種，或其中數種組成的混合溶劑。
以提取物的總重量計，凝膠色譜處理后得到的金銀花提取物中環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于70％，優(yōu)選大于90％，開聯番木鱉苷酸的含量大于60％，優(yōu)選大于70％。
如果希望所得到的提取物含有更高含量的環(huán)烯醚萜類化合物，可進行多次凝膠色譜處理。
實驗證明，用以上提取和精制方法從金銀花或忍冬屬植物中制備提取物，采用大孔吸附樹脂、反相硅膠或正相硅膠進行植物提取物精制，植物提取物的收率和有效成分群總環(huán)烯醚萜苷類化合物以及主要有效成分開聯番木鱉苷酸的含量差別不十分顯著。
從上述任一步驟得到的產物，包括提取物、浸膏、沉淀物等均可用作含有開聯番木鱉苷酸及其衍生物的金銀花提取物使用。
其中，開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量的測定方法是以開聯番木鱉苷酸或其衍生物或其他可替代的環(huán)烯醚萜苷類化合物為參照物質，按分光光度法比色測定；或，按反相HPLC(外標法、內標法或歸一化法等)方法測定。
本發(fā)明的另一目的是提供了含有所述金銀花提取物的藥物組合物及其制備方法，該組合物含有治療有效量的本發(fā)明的金銀花提取物，以及任選的含有藥用載體。其中所述的藥用載體的藥學領域常用的藥用載體；所述組合物的制備方法是藥學領域常規(guī)的藥物制備方法。
本發(fā)明的藥物組合物中還可以含有其它的植物提取物或其它的藥物化合物，制成復合制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供了由含有所述金銀花提取物的藥物組合物制備的各種藥用制劑。
利用本發(fā)明方法得到的植物提取物可以與藥物上可接受的載體一起制成各種藥物制劑，其中所述的藥物制劑可以是藥學領域常用的劑型，例如注射劑或口服制劑，所述的注射劑例如是溶液、懸浮液、乳液或凍干粉針制劑等，所述的口服制劑例如是片劑、膠囊、口服液或滴丸等。利用本發(fā)明的金銀花提取物制備所需各種劑型時，可以按照藥學領域的常規(guī)生產方法制備。
與常規(guī)的中藥制劑方法相比，應用本發(fā)明的金銀花提取物制備各種制劑時，因其中的有效成分高，以及其含量可以得到有效地控制，因此可獲得高效的、質量均一的藥品，有利于中藥制劑的標準化。
因此，本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明金銀花提取物在制藥和保健品領域中的應用，特別是本發(fā)明金銀花提取物在制備用于解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的藥物中的應用，本發(fā)明的金銀花提取物可用于制備治療高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的藥物和保健品。
在將本發(fā)明的金銀花提取物或本發(fā)明的組合物用于治療上述疾病時，其用藥量可參照使用金銀花進行治療時的用量；在將本發(fā)明的金銀花提取物或本發(fā)明的組合物用作保健品，或將其加入保健品時，其用量應少于通常的治療量。
本發(fā)明人進行了大量的藥物實驗，證明了本發(fā)明的金銀花提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的作用，對高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病具有良好的治療作用，并可用作或加入保健品，有利于改善身體狀況，提高免疫力。
根據文獻報道，目前中藥領域認為金銀花中的主要有效成分為綠原酸類化合物，另外還有揮發(fā)性成分芳樟醇等。因此，通常以綠原酸的含量高低來評價金銀花質量的優(yōu)劣，金銀花的提取、精制工藝多以綠原酸類化合物為考察指標，少部分以揮發(fā)性成分為考察指標。
本發(fā)明人的研究發(fā)現金銀花中具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要是以環(huán)烯醚萜苷類化合物為主，而不是綠原酸類化合物。在金銀花提取物中，開聯番木鱉苷酸的含量(大約10％)遠高于綠原酸類化合物的含量(大約5％)，大約是綠原酸類化合物的二倍。因此，在藥理活性評價中，該有效部位和其中的主要化合物開聯番木鱉苷酸所表現出的解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用顯然大于綠原酸的作用。以綠原酸類化合物為考察指標的質量控制標準無法真實地反映金銀花提取物的內在質量。
因此，另一方面，本發(fā)明還提供了中藥金銀花的質量控制標準，所述的質量控制標準是以從中藥金銀花中提取的具有解熱、抗炎、抗菌和抗病毒的有效部位，即以環(huán)烯醚萜苷類化合物為有效成分群，以開聯番木鱉苷酸為主要有效成分或質量控制的指標成份；以開聯番木鱉苷酸或其他可替代的環(huán)烯醚萜苷類化合物為參照物質，按分光光度法比色測定有效部位中開聯番木鱉苷酸及其衍生物(總環(huán)烯醚萜苷)類化合物的總含量；按HPLC方法測定開聯番木鱉苷酸單一成分的含量。
本發(fā)明新的質量控制標準改變了通常以綠原酸的含量高低來評價金銀花質量優(yōu)劣的標準，能夠更真實準確的反映所述中藥的內在質量。
以上質量控制標準可用于金銀花或忍冬屬植物原料、提取物及其單獨制備的制劑、復合制劑中間品和終產品的質量控制。
具體實施例方式
下面的實施例可進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取3次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡24小時。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水，加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時，過濾，得澄清濾液。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為70％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯型大孔吸附樹脂HP-20，依次用6倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹脂柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至濃縮液，冷凍干燥，得到提取物5.81g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量為75.6％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為33.4％。
實施例2(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，煎煮溫度為98℃，每次煎煮時間為1小時；合并水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/mL。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為75％，靜置16小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯型大孔吸附樹脂D-101，依次用5倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至干，得到提取物4.94g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為75.5％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為27.6％。
實施例3(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取2次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡18小時。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置18小時，過濾，得澄清濾液。
(2)水沉精制金銀花水提取濃縮液，減壓濃縮至干，加1500毫升乙醇(95％)，在充分攪拌溶解，同時緩慢加入蒸餾水使溶液含醇量為75％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液通過經預處理的苯乙烯RH型大孔吸附樹脂色譜柱，依次用4倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用5倍量樹脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至無醇味，冷凍干燥，得到提取物4.28g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為51.4％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為25.8％。
實施例4(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次煎煮時間為1.5小時；合并水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為80％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水400毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹脂色譜柱，用6倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹脂柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物4.68g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為76.6％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為56.8％。
實施例5(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇回流提取2次，每次用50％乙醇量為金銀花藥材干重的13倍，每次提取1小時。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入450毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時，過濾，得澄清濾液。
(2)水沉精制金銀花50％乙醇提取濃縮液，減壓濃縮至干，加1600毫升乙醇(95％)，在充分攪拌溶解，同時緩慢加入蒸餾水使溶液含醇量為75％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液通過經預處理的苯乙烯SP-825型大孔吸附樹脂色譜柱，依次用5倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹脂柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至無醇味，冷凍干燥，得到提取物4.31g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為69.6％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為52.6％。
實施例6(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇浸泡提取3次，每次用50％乙醇量為金銀花藥材干重的15倍，每次提取24小時。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時，過濾，得澄清濾液。
(2)醇沉精制金銀花50％乙醇提取濃縮液，在充分攪拌溶解，加乙醇(95％)至溶液含醇量為85％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液通過經預處理的苯乙烯SP-70型大孔吸附樹脂色譜柱，依次用4倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至無醇味，冷凍干燥，得到提取物6.22g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為66.3％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為38.1％。
實施例7(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次回流提取時間為1.5小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為60％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹脂色譜柱，用6倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹脂柱體積的12％乙醇洗脫，減壓回收12％乙醇洗脫液至干，得到提取物3.60g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.5％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為54.9％。
實施例8(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡提取時間為24小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為60％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)反相硅膠(C-18)柱色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過中壓反相硅膠(C-18)色譜柱，用4倍量柱體積的水洗脫，然后再用4倍量柱體積10％乙醇洗脫，再用8配量柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至干，得到提取物2.63g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.3％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為65.6％。
實施例9(1)提取取山銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煮提2次，每次用水量為山銀花藥材干重的13倍，每次煮提時間為1小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制山銀花水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為70％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹脂色譜柱，用6倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹脂柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物6.26g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為76.7％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為53.8％。
實施例10(1)提取取忍冬(莖和枝)藥材(500g)，粗粉碎，加水煮提3次，每次用水量為藥材干重的8倍，每次煮提時間為1.5小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制忍冬(莖和枝)水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為75％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水350毫升，溶解并過濾，濾液，通過經預處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹脂色譜柱，用6倍量樹脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至干，得到提取物5.58g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為74.3％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為56.1％。
實施例11(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡提取時間為24小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為65％，靜置24小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)反相硅膠(C-18)柱色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過濾，濾液，通過中壓反相硅膠(C-18)色譜柱，用4倍量柱體積的水洗脫，然后再用4倍量柱體積10％乙醇洗脫，再用8配量柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物2.63g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.3％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為65.6％。
實施例12(1)提取取忍冬藥材(莖和枝)(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的10倍，每次提取時間為2.5小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制忍冬藥材(莖和枝)95％乙醇提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為75％，靜置36小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)正相硅膠柱色譜精制將(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加熱溶解，拌入350g色譜用硅膠(100目)，室溫放置72小時至干燥，將拌有樣品的硅膠置正相硅膠(1000g)色譜柱上，然后用氯仿-甲醇(50∶1-1∶1)進行梯度洗脫，每個梯度洗脫用溶劑量為4～5個柱床體積，收集氯仿-甲醇(5∶1-3∶1)洗脫部位，減壓回收溶劑至干，得到提取物5.99g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.8％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為64.0％。
實施例13(1)提取取山銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次提取時間為2.5小時；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制山銀花水提取濃縮液，在充分攪拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量為75％，靜置32小時，過濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)正相硅膠柱色譜富集將(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加熱溶解，拌入250g色譜用硅膠(100目)，室溫放置72小時至干燥，將拌有樣品的硅膠置正相硅膠(1000g)色譜柱上，然后用乙酸乙酯-乙醇(50∶1-1∶1)進行梯度洗脫，每個梯度洗脫用溶劑量為5～7個柱床體積，收集乙酸乙酯-乙醇(10∶1-5∶1)洗脫部位，減壓回收溶劑至干，得到提取物3.86g。
(4)以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計，總環(huán)烯醚萜苷含量為81.2％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為70.8％。
實施例14有效部位的凝膠色譜純化將上述實施例7中得到的金銀花植物提取物有效部位3.60g，用50毫升蒸餾水溶解后，通過Sephadex LH-20凝膠色譜柱純化，用H2O洗脫，收集樣品液，減壓回收，冷凍干燥，得到進一步純化的有效部位2.18g。
進一步純化的有效部位的定量分析以開聯番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測定，經過凝膠柱色譜進一步純化的有效部位中開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量為94.6％；用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為78.9％。
純化后的有效部位定性分析經液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)檢測分析，初步確定進一步純化的有效部位中含有的環(huán)烯醚萜苷類化合物包括番木鱉苷(M＝390)，開聯番木鱉苷(M＝388)，開聯番木鱉苷二甲基縮醛(M＝434)，獐牙菜苷(sweroside) (M＝358)，四乙酰開聯番木鱉苷(secologanoside)7-甲基酯(M＝404)，金銀花甙(kingiside)(M＝404)，莫羅忍冬甙(morroniside)(M＝406)，8-表-番木鱉甙(loganin)(M＝390)，vogeloside(M＝388)，epi-vogeloside(M＝388)，loniceracetalides A(M＝460)，loniceracetalides B(M＝460)和開聯番木鱉苷酸(M＝374)。具體結構如下 實施例15有效部位中主要環(huán)烯醚萜苷類化合物的分離純化和結構鑒定上述實施例14中得到的進一步純化的金銀花植物提取物有效部位2.18g，用20毫升蒸餾水溶解后，注入中壓反相硅膠(C-18)柱色譜，用H2O-甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脫，根據薄層色譜檢查，合并組成成分相似的洗脫液。減壓回收溶劑至干燥，按極性大小得到5個分離部位F1(0.18g)、F2(0.44g)、F3(0.62g)、F4(0.20g)和F5(0.31g)。
取F2部位(0.44g)用純凈水溶解后，經過反相(C-18)制備型HPLC分離純化得到一個單體化合物F2-1(305.8mg)。該化合物經過HPLC歸一化法測定，含量為99.7％；經過紫外光譜，紅外光譜，低分辨和高分辨電噴霧質譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，二維核磁共振同核化學位移相關(COSY)譜、異核單量子相干(HSQC)譜和異核多鍵化學位移相關(HMBC)譜測定，以及化學衍生化后得到的衍生物的紫外光譜，紅外光譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，二維核磁共振COSY譜、HSQC譜和HMBC譜測定，確定為開聯番木鱉苷酸。
取F3部位(0.25g)用純凈水溶解后，經過反相(C-18)制備型HPLC分離純化得到三個單體化合物F3-1(96.1mg)、F3-2(83.8mg)和F3-3(46.2mg)。經HPLC歸一化法測定，得到的三個化合物的純度分別為98.6％，97.4％和95.6％；經過分別測定三個化合物的紫外光譜，紅外光譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，以及電噴霧質譜測定，確定F3-1與F2-1為同一化合物；F3-2和F3-3分別鑒定為開聯番木鱉苷(甙)(或裂環(huán)馬錢子苷secologanin)和開聯氧化番木鱉苷(或裂環(huán)氧化馬錢子苷，secoxyloganin)。
實施例16對二甲苯所致小鼠耳腫脹模型的影響通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗炎活性。
(1)受試藥物①開聯番木鱉苷酸來源為實施例16分離鑒定單一化合物。
②金銀花提取物來源為前述實施例2得到的金銀花提取物，以開聯番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢子苷酸，secologanic acid)為參照物，用紫外分光光度法測定其中環(huán)烯醚萜苷類化合物總含量為75.5％，用HPLC外標法測定開聯番木鱉苷酸含量為27.6％。
③陽性對照藥物阿司匹林片陜西白鹿制藥廠生產，規(guī)格0.3g/片，100片/瓶。生產批號020527。人日最大用量為1.8g.
受試藥物的配制方法臨用時加適量蒸餾水或注射用水稀釋至所需濃度的藥液。
(2)實驗動物ICR小鼠，雄性，體重18-20g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(3)實驗方法ICR小鼠，18-20g，雄性，隨機分為8組，即空白對照組、陽性藥組(阿司匹林)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)3d，給藥體積均為25mL/Kg，對照組給予同體積蒸餾水。于末次給藥后1h，將二甲苯涂于各組小鼠右耳，每只50μL，30min后處死動物，用直徑9mm的打孔器將雙耳同部位的等面積打下，精密天平稱重，以左右耳片重之差值為腫脹度，計算腫脹抑制率，比較組間差異。
(4)實驗結果結果見表1。
表1開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(X±SD；n＝10)

注與對照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(5)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制二甲苯所致小鼠的耳腫脹，同模型對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗炎作用，作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例17對角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹模型的影響通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗炎活性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物ICR小鼠，雌雄性各半，體重18-20g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(2)實驗方法ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，禁食過夜，隨機分為8組，即空白對照組、陽性藥組(阿司匹林)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組12只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)3d，給藥體積均為25mL/Kg，對照組給予同體積蒸餾水。于末次給藥后45分鐘，小鼠右后足跖部皮下注射1％角叉菜膠0.03mL致炎，4小時后處死小鼠，在關節(jié)處剪下雙后足，以右后足與左后足重之差為腫脹程度的指標。
(3)實驗結果結果見表2。
表2開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(X±SD；n＝12)

注與對照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制角叉菜膠致小鼠足跖腫脹，同模型對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗炎作用，作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例18對酵母菌懸液所致大鼠體溫的影響通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的解熱作用。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物大鼠SD種，雌雄各半，體重160-180g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(2)試驗方法在實驗當天和前一天早上測量大鼠肛溫，以每只動物的兩天的平均體溫作為實驗前的基礎體溫。除正常對照組外，其余大鼠1ml/100g體重皮下注射20％的酵母菌懸液，注射4h后測量大鼠的肛溫，按體溫增高值將大鼠均勻分為9組。試驗分別設①正常對照組；②模型對照組；③開聯番木鱉苷酸大劑量組；④開聯番木鱉苷酸中劑量組；⑤開聯番木鱉苷酸小劑量組；⑥金銀花提取物大劑量組；⑦金銀花提取物中劑量組；⑧金銀花提取物小劑量組；和⑨陽性對照藥阿司匹林(0.3g/kg)組；每組10只，各給藥組分別灌胃給藥1次，給藥體積為10mL/Kg體重，正常對照和模型組均灌胃等體積的蒸餾水。各組分別在藥后的0.5h、1h、2h和4h測量大鼠的肛溫。以每只大鼠各不同時間點的體溫與致熱前的基礎體溫的差值作為體溫的增加值。
(3)數據處理和統(tǒng)計分析方法實驗數據經SPSS統(tǒng)計軟件處理，實驗數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。
(4)試驗結果實驗結果見下表。
表3開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物對酵母菌懸液致大鼠發(fā)熱體溫的影響(X±SD；n＝10)

注*表示同對照組比較P＜0.05；**表示同對照組比較P＜0.01。
(5)結論金銀花提取物和開聯番木鱉苷酸對酵母所致大鼠發(fā)熱模型具有明顯的抑制作用，提示它們均具有一定的解熱作用。作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例19對內毒素致家兔發(fā)熱模型的影響通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的對內毒素引起發(fā)熱的解熱活性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物實驗用家兔，體重1.8-2.5Kg，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。
(2)實驗方法健康家兔，每日次量體溫3次，連續(xù)測3天，在第4天，測量正常體溫3次，每次間隔30分鐘，三次體溫波動不超過0.3℃的動物用于實驗，耳緣靜脈注射250ng/mL大腸桿菌內毒素1mL/Kg，注射后測量體溫，30分鐘測量一次，體溫升高0.6℃以上的動物分為8組，即模型對照組、陽性對照組(阿司匹林，口服給藥)、藥物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組5只。各給藥組分別耳緣靜脈注射給藥1次，模型對照給生理鹽水和陽性對照灌胃給藥。各組動物分別在藥后的1h、2h、3h、4h和5h測量家兔體溫。以每只家兔各不同時間點的體溫與致熱后的基礎體溫的差值作為體溫的變化。
(3)數據處理和統(tǒng)計分析方法實驗數據經SPSS統(tǒng)計軟件處理，實驗數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。
(4)實驗結果實驗結果見下表。
表4開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物對內毒素致家兔發(fā)熱體溫的影響(X±SD；n＝5)

注*表示同對照組比較P＜0.05；**表示同對照組比較P＜0.01。
(5)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制大腸桿菌內毒素致家兔發(fā)熱，給藥3-4小時后，同模型對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗內毒素致熱作用，作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例20對醋酸所致小鼠疼痛扭體模型的影響通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的鎮(zhèn)痛活性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物ICR小鼠，雄性，體重18-20g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(2)實驗方法ICR小鼠，18-20g，雌雄兼有，隨機分為8組，即生理鹽水對照組、陽性藥(阿司匹林)組、試驗藥物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只。各組小鼠灌胃給藥30分鐘后，各鼠均腹腔注射0.5％醋酸0.2mL/只。觀察10分鐘內各組小鼠出現扭體反應小鼠只數，計算各藥物鎮(zhèn)痛百分率。
鎮(zhèn)痛百分率(％)＝(對照組扭體反應小鼠數-給藥組扭體反應小鼠數)/對照組扭體反應小鼠數×100％(3)實驗結果結果見下表。
表5.開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物醋酸致小鼠疼痛扭體的影響(X±SD；n＝12)

注與對照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制醋酸致小鼠疼痛扭體作用，同模型對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的鎮(zhèn)痛作用，作用效果金銀花提取物＞開聯番木鱉苷酸。
實施例21體外抗病毒實驗通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗病毒活性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)病毒株和細胞呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)，Hela細胞。
(2)實驗方法①病毒毒力測定將經Hela細胞活化擴增的呼吸道合胞病毒進行10倍系列稀釋，稀釋度10-1～10-9。將各稀釋度的病毒液分別接種2孔生長良好的Hela細胞，每孔接種0.1mL RSV液，37℃吸附1小時后，棄病毒液，每孔細胞加入培養(yǎng)液1mL，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，于24小時和48小時觀察細胞病變情況。結果表明，培養(yǎng)48小時呼吸道合胞病毒的滴毒為10-7(見下表)。
表6呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)致Hela細胞病變

②開聯番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽性對照藥物病毒唑的細胞毒性稱取受試樣品各500mg，分別用10mL蒸餾水溶解后，煮沸15分鐘，分別取1.5mL，加入培養(yǎng)液0.5mL，用5mol/L的NaOH調節(jié)pH至7.2。將上述藥液用培養(yǎng)液進行2倍系列稀釋，稀釋度1∶2～1∶4096。將各稀釋度藥液加入到24孔Hela細胞培養(yǎng)板內，每孔1mL，每個稀釋度接種2個復孔，37℃培養(yǎng)48小時。結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物在稀釋度為1∶2～1∶8的情況下，細胞壞死、脫落，均表現出有明顯的細胞毒性；在稀釋度為1∶16時，均無明顯細胞毒性，在稀釋度為1∶32～1∶4096的藥液中，細胞生長良好，與對照組培養(yǎng)細胞無明顯差異。陽性對照藥物病毒唑，在稀釋度為1∶2～1∶64的情況下，細胞壞死、脫落，表現出明顯的細胞毒性；在1∶128～1∶4096稀釋度的病毒唑藥液中，細胞均生長良好，與正常培養(yǎng)細胞對照組無明顯差別。
③藥物抗病毒作用測試將RSV病毒液進行10倍系列稀釋，稀釋度為10-5。將病毒液接種于24孔生長良好的Hela細胞，每孔接種0.1mL RSV液，37℃吸附1小時后，棄去病毒液，并加入如下待測藥液和陽性藥物藥液。將開聯番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽性對照藥物病毒唑分別進行2倍系列稀釋，稀釋度為1∶128～1∶4096(開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物的濃度分別為293、146、73、18、9μg/mL；病毒唑的濃度為781、391、195、98、49和24μg/mL)。將各稀釋度的藥液分別加入經病毒液(10-5)吸附過的單層培養(yǎng)Hela細胞孔中，每一稀釋度平行加入2孔。然后在37℃培養(yǎng)48小時。
(3)實驗結果結果見表7。
表7開聯番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽性對照藥物病毒唑對呼吸道合胞病毒(RSV)的致Hela細胞病變的抑制作用

(4)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物均能夠明顯抑制呼吸道合胞病毒(RSV)致體外培養(yǎng)Hela細胞的病變作用，提示它們均具有較明顯體外抗病毒作用，作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例22體內抗病毒實驗通過藥理實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的體內抗病毒活性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物ICR小鼠，雌雄各半，體重14-16g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(2)試驗方法ICR小鼠，隨機分為8組，即空白對照組、陽性藥組(病毒唑)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組12只。各組小鼠腹腔注射給藥，每天給藥1次，連續(xù)3天，給藥體積均為25mL/Kg，對照組給予同體積生理鹽水。于末次給藥2h后，除正常對照組小鼠外，其余各組動物用乙醚淺度麻醉后，用10個LD50流感病毒肺適應株(FM1)病毒液，滴鼻感染，每鼠0.05mL，動物自然蘇醒后，繼續(xù)給藥，連續(xù)4天(共給藥7天)。每天觀察動物自主活動情況，并記錄動物死亡情況，死亡動物立即稱重后解剖，取肺并稱濕重；第4天給藥后，禁食8小時后，稱重，并解剖取肺，稱肺濕重；計算肺指數，求肺指數抑制率。
肺指數＝肺濕重(g)/體重×100％

肺指數越大表示肺病變越嚴重。
(3)試驗結果實驗結果見下表。
表8開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物對流感病毒肺適應株(FM1)感染小鼠肺指數的抑制作用(X±SD；n＝12)

注*表示同對照組比較P＜0.05；**表示同對照組比較P＜0.01。
(4)結論金銀花提取物和開聯番木鱉苷酸對流感病毒肺適應株(FM1)感染小鼠的肺指數有抑制作用，提示它們均具有體內抗流感病毒的作用。作用效果開聯番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實施例23溶血性試驗通過實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的溶血作用，以判斷其在制劑中作為注射用藥的可行性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物家兔1只，雄性，體重1.65Kg。
(2)實驗方法自家兔心臟取血20mL，只三角瓶中，去纖維蛋白后，均分轉移至8支10mL刻度離心管內，每管加入生理鹽水2.5mL，混勻后離心，去除上清液，再分別加5mL生理鹽水，混勻離心，反復處理3次，至上清液無色。將得到的紅細胞按體積用生理鹽水稀釋稱2％的紅細胞混懸液。取試管14支，編號并按下表加入藥液。并判斷結果。其中，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物藥液均為生理鹽水配制，濃度分別為10和20mg/mL。
(3)實驗結果結果見下表。
表9開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物的溶血性試驗結果

“+”表示有溶血現象；“-”表示無溶血現象。
(4)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物無溶血性。
實施例24刺激性試驗通過實驗觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開聯番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的血管刺激性，以判斷其在制劑中作為注射用藥的可行性。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物家兔3只，雄性1只，雌性2只，體重1.60-1.80Kg。
(2)實驗方法按照8.33mg/Kg體重，右側耳緣靜脈滴注給予藥液(濃度0.5mg/mL)，每天1次，連續(xù)給藥3天，末次給藥后24小時，處死動物，剪下雙耳，左側耳作為對照，進行組織病理學檢查。
(3)實驗結果三只家兔，其左側和右側耳均無明顯組織病理學差別。
(4)結論本次試驗結果顯示，開聯番木鱉苷酸和金銀花提取物，濃度分別為0.5mg/mL，家兔耳緣靜脈給藥無明顯血管刺激性。
實施例25急性毒性實驗通過實驗觀察以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的急性毒性和半數致死量(LD50)。
此試驗的受試藥物與實施例16相同。
(1)動物ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司提供。動物許可證編號SCXK(京)2002-0003。
(2)實驗方法ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，隨機分為4組，每組10只。分別通過尾靜脈注射給不同劑量的金銀花提取物藥液，各組動物的給藥劑量分別為每公斤體重2.70g、2.43 g、2.19g和1.97g。給藥后觀察并記錄各組小鼠出現的中毒癥狀和死亡情況。觀察7日。死亡率按Bliss法計算LD50和95％可信限，并注意死亡率與性別的關系。
(3)實驗結果金銀花提取物靜脈注射后，較大劑量組多數小鼠立即出現跳躍、掙扎驚厥，然后俯臥或仰臥，翻正反射消失，耳廓蒼白，呼吸停止而死亡。尸檢未見各臟器組織明顯異常。部分小鼠上述癥狀出現數秒鐘后逐漸消失。小劑量組小鼠注射給藥后呼吸減慢、俯臥，持續(xù)近1分鐘后恢復正常。觀察7日，按Bliss法計算LD50和95％可信限，結果見下表。
表10金銀花提取物小鼠靜脈注射給藥的的急性毒性和半數致死量測定(LD50)(Bliss法)

(4)結論本次試驗結果顯示，金銀花提取物小鼠靜脈注射給藥LD50為2.28g/Kg體重；95％可信限為2.14～2.42g/Kg體重。
以上已經詳細描述了本發(fā)明的實施方案，對本領域技術人員來說很明顯可以做很多改進和變化而不會背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進都在本發(fā)明的范圍之內，所附權利要求的技術特征由上述說明書確定。
權利要求
1.一種具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的金銀花提取物，該提取物是從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物中提取制備的，其中的有效成分是以開聯番木鱉苷酸為主要成分的環(huán)烯醚萜類化合物，其中所述環(huán)烯醚萜類化合物的結構式如下 其中X1和X2各自獨立地表示O、N或S；R、R1或R2各自獨立地表示氫、C1-6低級烷基或C2-6低級鏈烯基；其中以提取物的總重量計，所述環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于50％。
2.按照權利要求1所述的金銀花提取物，其中所述基團X1和X2各自獨立地表示O。
3.按照權利要求1所述的金銀花提取物，其中所述的R、R1或R2基團各自獨立的是氫、甲基、乙基或異戊烯基。
4.按照權利要求3的所述的金銀花提取物，其中所述的化合物是開聯番木鱉苷酸。
5.按照權利要求1所述的金銀花提取物，其中環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于70％，優(yōu)選70％-98％。
6.按照權利要求1所述的金銀花提取物，其中開聯番木鱉苷酸單一成分的含量大于25％，優(yōu)選大于50％，更優(yōu)選大于70％，最優(yōu)選70％-98％。
7.按照權利要求1-5任意一項所述的金銀花提取物的制備方法，該方法包括以下步驟(1)提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑進行提取，得到提取液；(2)后處理A.將該提取液經常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經噴霧干燥得到粉末；B.將上一步驟得到的產物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進行沉淀或沉降，用常規(guī)方法進行處理得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，得到沉淀物或溶解液濃縮物；(3)色譜分離純化將上述后處理得到的產物用色譜方法分離純化，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的洗脫液餾分，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物；其中所述的色譜方法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠或反相硅膠色譜，或者它們的組合；由此得到的金銀花提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％。
8.按照權利要求7所述金銀花提取物的制備方法，該方法還包括將上述方法獲得的產物用凝膠色譜進一步純化的步驟，得到環(huán)烯醚萜類化合物含量大于70％的金銀花提取物。
9.一種用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病的藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1-5任意一項所述的金銀花提取物，以及藥學上可接受的載體。
10.權利要求1-6任意一項所述的金銀花提取物和權利要求8的藥物組合物中在制備治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從中藥金銀花(Lonicera japonica Thunb.)或其基源植物忍冬或同屬其他植物中制備植物提取物的方法，以及由該方法制備的金銀花提取物，和含有該提取物的藥物組合物，所述組合物的有效成分為開聯番木鱉苷酸及其衍生物類化合物。該方法包括水或醇提取，提取物經沉淀和色譜方法精制，如果需要還可用凝膠柱色譜進一步純化，得到的提取物中開聯番木鱉苷酸及其衍生物的含量在50％以上，優(yōu)選70％以上。用本發(fā)明的制備方法得到的金銀花提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的活性，可用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。
文檔編號A61K36/185GK101085795SQ20061008355
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月7日 優(yōu)先權日2006年6月7日
發(fā)明者石建功, 李帥, 王素娟, 楊永春, 安玉偉, 韓豐年 申請人:石家莊漢康生化藥品有限公司