專(zhuān)利名稱(chēng)：I*－紅景天苷及其制備和在抗老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
I*-紅景天苷及其制備和在抗老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用，屬于中藥藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞生物學(xué)、核技術(shù)、中藥學(xué)及神經(jīng)退行性疾病等。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，天然藥物成了藥物研究及開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。紅景天屬多年生草木或亞灌木植物，分布在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及我國(guó)東北、西北及西南等高寒地區(qū)，一般海拔在1500-5000米左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界共有紅景天90多種，我國(guó)就分布有70多種。由于其生長(zhǎng)在極其惡劣的環(huán)境下，如缺氧、低溫干燥、強(qiáng)紫外線照射等，因而具有很強(qiáng)的生命力和特殊的適應(yīng)性。
自上世紀(jì)50年代起，由于航空航天的發(fā)展，前蘇聯(lián)學(xué)者首先開(kāi)始了太空防護(hù)藥物的研究，經(jīng)對(duì)紅景天屬植物進(jìn)行系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)該屬植物具有類(lèi)似人參等的興奮中樞神經(jīng)的作用，而沒(méi)有人參等過(guò)度興奮的作用。進(jìn)一步研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗衰老及增強(qiáng)腦力、體力機(jī)能等方面的特殊功效，且自身毒性小，按1000mg/kg劑量給藥不引起動(dòng)物毒性反應(yīng)，因而越來(lái)越受到人們的廣泛重視，成為重要的抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗衰老的天然藥物來(lái)源之一。
紅景天苷(salidroside，也稱(chēng)毛柳苷)，化學(xué)名為對(duì)羥苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucoside)，是紅景天的特征性成份，也是主要活性成分之一。一般從各類(lèi)高原藥用紅景天科植物及常用中藥女貞子中分離提取，也有以酪醇和四溴代乙酰葡萄糖、或?qū)αu基苯乙酸等為原料經(jīng)化學(xué)合成獲得，其結(jié)構(gòu)式如下 隨著社會(huì)的發(fā)展及環(huán)境問(wèn)題的突出，人口老齡化及伴隨的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率越來(lái)越高。老年性癡呆癥(也稱(chēng)阿爾茲海默癥Alzheimer’s Disease，AD)是其中重要的一類(lèi)疾病，其主要的兩大病理特征是神經(jīng)元細(xì)胞外的淀粉樣斑塊(也稱(chēng)老年斑)沉積及神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的微管相關(guān)蛋白構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。AD是一種慢性精神致殘及致死性疾病，美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家老年性癡呆在老年人死因中僅次于心臟病、腫瘤和中風(fēng)。專(zhuān)家們預(yù)言，本世紀(jì)危害人類(lèi)健康的第一殺手將是老年性癡呆。
AD的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，與多個(gè)基因相關(guān)，目前已確知4種基因的突變與AD有關(guān)，它們是β淀粉樣肽前體蛋白(Amyloid Protein Precursor，APP)基因、早老1基因(PS1)、早老2基因(PS2)和ApoE基因。此外，其它病因?qū)W危險(xiǎn)因子已達(dá)百余種。主要涉及自由基、淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、炎癥等。近來(lái)有許多研究認(rèn)為AD的發(fā)生發(fā)展與自由基損傷密切相關(guān)，AD伴有大量自由基生成，而清除自由基能力又不足，所以神經(jīng)元受到自由基損傷不可避免。
而紅景天及其主要活性成份紅景天苷具有抗自由基損傷的作用，如李天威等研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷對(duì)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞超氧陰離子和過(guò)氧化氫損傷有保護(hù)作用；文鏡等報(bào)道紅景天提取物能提高體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，減少組織中羥自由基含量，保護(hù)組織蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜；此外紅景天對(duì)腦缺血再灌注時(shí)自由基的損傷也有保護(hù)作用。
紅景天及其主要活性成份紅景天苷在抗自由基損傷等方面具有明顯的作用，但至今尚無(wú)對(duì)其在體內(nèi)、體外的吸收、分布、代謝等的研究，也沒(méi)有以老年性癡呆癥為特定對(duì)象開(kāi)展系統(tǒng)的藥物干預(yù)的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種I*-紅景天苷的制備方法，目的是使紅景天苷在制備預(yù)防及治療老年性癡呆癥藥物中應(yīng)用。本發(fā)明系統(tǒng)地將藏藥紅景天的特征活性成份紅景天苷應(yīng)用于老年性癡呆癥的預(yù)防及治療藥物中，有機(jī)地將我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)結(jié)合，為開(kāi)發(fā)中藥新藥提供了新的思路，為老年性癡呆癥患者提供了一種無(wú)毒副作用的預(yù)防和治療新藥，以減少患者的痛苦，改善患者的生存質(zhì)量，也減輕社會(huì)及患者家庭的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明對(duì)紅景天苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在其酚羥基鄰位處引入核素碘，使得有關(guān)紅景天苷在體內(nèi)、體外的吸收、分布、代謝及藥效的狀況可以簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速地得到反映，更好地用于老年性癡呆癥的預(yù)防及治療藥物的開(kāi)發(fā)和制備中。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括二項(xiàng)內(nèi)容1.一種I*-紅景天苷及其制備方法紅景天苷的碘標(biāo)記物I*-紅景天苷，具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物 式中碘I*表示核素碘123I、124I、125I、127I、131I中的任一種。
本發(fā)明涉及的I*-紅景天苷的制備是將紅景天苷采用氯胺-T法、過(guò)氧化物氧化法或Iodogen法進(jìn)行碘標(biāo)記，步驟如下(1)將紅景天苷在磷酸鹽緩沖體系中與適量NaI*及氧化劑在10-50℃下振蕩混合一定時(shí)間；(2)向(1)中加入過(guò)量還原劑以終止反應(yīng)；(3)將(2)小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷甲醇丙酮水層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/LpH 7.4的PBS溶解，離心取水相。
上述步驟(1)所述反應(yīng)時(shí)間對(duì)于氯胺-T為30-60s，其他則為10-25min；步驟(2)中所述還原劑包括硫代硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉中的一種；步驟(3)所述層析體系為三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水體積比為6∶3∶1∶1(v/v)，適量緩沖液以能完全浸泡硅膠為宜，離心則為臺(tái)式離心機(jī)1000cpm×10min。
優(yōu)選條件如下10μg紅景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(0.5-2mCi)，1mg/ml的氯胺-T20μl，渦旋振蕩30-60s，加入2mg/ml的偏重亞硫酸鈉100μl終止反應(yīng)。將反應(yīng)液小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/L pH7.4的PBS溶解，離心取水相。
2、以I*-紅景天苷原型藥紅景天苷為活性成份被應(yīng)用于制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥藥物的開(kāi)發(fā)和制備中。
本發(fā)明的123I-紅景天苷可通過(guò)SPECT(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像)、124I-紅景天苷可通過(guò)PET(正電子計(jì)算機(jī)斷層顯像)用于乏氧組織等的顯像，這是核醫(yī)學(xué)所特有的無(wú)創(chuàng)、活體及動(dòng)態(tài)影像手段；也可用于反映該化合物在體內(nèi)、體外的吸收、分布、代謝及藥效等，以便于將該化合物應(yīng)用于藥物中，在預(yù)防及治療老年性癡呆相關(guān)疾病時(shí)作為有效觀察手段。
本發(fā)明的I*-紅景天苷可用于表征紅景天苷應(yīng)用于藥物中時(shí)，在體內(nèi)和體外的吸收、分布、代謝和藥效的研究及在制藥中的應(yīng)用，也可用于乏氧組織的顯像。
本發(fā)明的I*-紅景天苷原型化合物紅景天苷安全無(wú)毒，具有較強(qiáng)的抗過(guò)氧化作用、抗H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血作用、和明顯的抗H2O2誘導(dǎo)或淀粉樣蛋白聚集體誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡作用，維持和恢復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞的正常形態(tài)及功能，利用I*-紅景天苷靈敏的放射性示蹤作用，將其應(yīng)用于以I*-紅景天苷原型藥紅景天苷為活性成分的抗老年性癡呆癥藥物的開(kāi)發(fā)及制備中。揭示其具有較好的預(yù)防和治療老年性癡呆癥的藥用前景。
本發(fā)明也適用于與紅景天苷結(jié)構(gòu)相似的化合物。
本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明制備了新化合物I*-紅景天苷，其制備工藝簡(jiǎn)單，標(biāo)記物穩(wěn)定，便于臨床、科研及藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)一步應(yīng)用。
(2)本發(fā)明的I*-紅景天苷原型藥紅景天苷安全無(wú)毒，抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用明顯，有較好的預(yù)防和治療老年性癡呆癥的藥用前景。
(3)本發(fā)明的I*-紅景天苷可用于以其原型藥紅景天苷為活性成份被應(yīng)用于制備預(yù)防和治療老年性癡呆癥藥物的開(kāi)發(fā)和制備中。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1I*-紅景天苷的制備(氯胺-T法) 10μg紅景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，20μl 1mg/ml氯胺-T，渦旋振蕩30-60s，加入100μl 2mg/ml硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。將反應(yīng)液小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，離心取水相。
實(shí)施例2I*-紅景天苷的制備(過(guò)氧化物氧化法)10μg紅景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，20μl 3％雙氧水，渦旋振蕩30-60s，室溫放置15min，加入100μl 2mg/ml偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)。將反應(yīng)液小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，離心取水相。
實(shí)施例3I*-紅景天苷的制備(Iodogen法)取10μg紅景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入已涂布有2μgIodogen的Eppendorf管中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，渦旋振蕩30-60s，于室溫放置20min，取出反應(yīng)液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，離心取水相。
實(shí)施例4I*-紅景天苷的鑒定采用薄層層析和高效液相法鑒定A薄層層析以硅膠紙為支持介質(zhì)，展開(kāi)體系為三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)，待展開(kāi)結(jié)束，于紫外燈下檢測(cè)標(biāo)記物在Rf＝0.6-0.7處呈黃色斑點(diǎn)，將硅膠紙剪成等份十段，γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定各段放射性計(jì)數(shù)，I*-紅景天苷標(biāo)記物在Rf＝0.6-0.7處，游離碘在Rf＝0.0-0.1處。
B高效液相法Lichrospher C18(250×4.6μm，Hanbon Sci.&tech)，21％甲醇水溶液(含0.2％磷酸)，流速1ml/min，紫外檢測(cè)(波長(zhǎng)290nm)，未標(biāo)記紅景天苷原藥的保留時(shí)間約為10min，I*-紅景天苷的保留時(shí)間則約為5min，游離碘則為1min。
實(shí)施例5I*-紅景天苷在ICR小鼠體內(nèi)的分布正常4周齡ICR小鼠尾靜脈注射131-I*-紅景天苷(0.111MBq/只)，分別于5min、30min、60min、120min、240min斷頭處死，取血、心、肝、肺、腎、小腸、肌肉、腦、骨、脾等感興趣組織，稱(chēng)濕重，γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算ID％/g組織。
結(jié)果顯示放射性在腎及肝中分布最多，血及肺中次之?？捎纱伺袛嗉t景天苷主要是通過(guò)肝臟代謝，腎臟排泄，肝和腎5分鐘時(shí)ID％/g組織分別為9.25％和10.20％，4小時(shí)分別為0.27％和0.40％；在腦中分布較少，但清除較慢，5分鐘時(shí)為0.27％，4小時(shí)為0.11％；血液清除快，5分鐘時(shí)為5.11％，30分鐘時(shí)即為1.70％；在心、肺、脾、肌、骨及腸中分布不多；2小時(shí)后各臟器的ID％/g組織基本在1％以下，揭示其在體內(nèi)排泄較快，這也是其較小的毒副作用的原因之實(shí)施例6紅景天苷的抗過(guò)氧化作用油脂的過(guò)氧化作用形成的毒性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致一些極為嚴(yán)重的后果，如致癌、誘導(dǎo)機(jī)體突變、加速衰老等。取1mL紅景天苷水溶液，加入1mL 2.50％(v/v)亞油酸、2mL 0.05mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1mL蒸餾水，密封后40℃恒溫避光氧化，空白對(duì)照以溶劑代替抗氧化劑。于不同時(shí)間取0.1mL上述亞油酸乳化液，依次加入9.7mL 75％的乙醇和0.1mL 30％硫氰酸氨，再加入0.1mL0.02mol/L溶于3.5％鹽酸的氯化亞鐵，快速混勻，反應(yīng)3分鐘后測(cè)定500nm吸光值。
結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，紅景天苷可使體系吸光值維持在較低的水平，過(guò)氧化作用受到明顯的抑制，100μg/ml紅景天苷的抑制率保持在20％左右，并且隨著紅景天苷濃度的增加，對(duì)亞油酸體系的抗氧化作用增大，即有一定的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。
實(shí)施例7紅景天苷的抗H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血作用紅細(xì)胞具有典型的生物體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于膜脂質(zhì)過(guò)氧化的研究。取大鼠紅細(xì)胞懸液1mL，模型管加入H2O2使終濃度為100mmol/L，樣品管分別加入100mmol/L H2O2以及不同濃度的樣品液，混勻后于37℃溫浴1h，以生理鹽水稀釋?zhuān)x心，取上清于540nm處比色測(cè)定，計(jì)算溶血率。
結(jié)果顯示，紅景天苷可使紅細(xì)胞溶血率明顯降低，隨著濃度的增加，抑制率升高，50μg/ml、100μg/ml的紅景天苷的抑制率分別達(dá)到68％和81％，具有明顯的濃度依賴(lài)性。而VC、VE在100μg/ml時(shí)的抑制率僅為40％左右。
實(shí)施例8紅景天苷抗H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后易引起氧化應(yīng)激損傷，而經(jīng)不同濃度的紅景天苷干預(yù)后，觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖狀況。
結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度紅景天苷干預(yù)后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞數(shù)顯著增加，此效應(yīng)呈明顯的濃度依賴(lài)性。
實(shí)施例9紅景天苷抗老化淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷淀粉樣斑塊是老年性癡呆癥患者的重要病理特征，其主要成份是淀粉樣蛋白Aβ，研究表明Aβ易引起神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。經(jīng)不同濃度的紅景天苷干預(yù)后，觀察Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞增殖狀況。
結(jié)果顯示經(jīng)紅景天苷干預(yù)后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯減少，細(xì)胞增殖顯著增加。
權(quán)利要求
1.紅景天苷的碘標(biāo)記物I*-紅景天苷，其特征是具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物 式中碘I*表示核素碘123I、124I、125I、127I、131I中的任一種。
2.如權(quán)利要求1所述的I*-紅景天苷的制備方法，其特征是將紅景天苷采用氯胺-T法、過(guò)氧化物氧化法或Iodogen法進(jìn)行碘標(biāo)記，包括如下步驟(1)將紅景天苷在磷酸鹽緩沖體系中與適量NaI*及氧化劑在10-50℃下振蕩混合一定時(shí)間；(2)加入過(guò)量還原劑以終止反應(yīng)；(3)小心、均勻點(diǎn)樣于制備型硅膠層析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水層析體系中展開(kāi)分離，刮取收集Rf0.6-0.7的硅膠，以適量0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液溶解，離心取水相；步驟(1)所述NaI*用量為1μg紅景天苷與0.05-0.2mCi的NaI*反應(yīng)；所述氧化劑包括氯胺-T、雙氧水或Iodogen中的一種；所述反應(yīng)時(shí)間對(duì)于氯胺-T為30-60s，對(duì)于雙氧水或Iodogen則為10-25min；步驟(2)所述還原劑包括硫代硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉中的一種；步驟(3)所述層析體系為三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水體積比為6∶3∶1∶1，適量緩沖液以能完全浸泡硅膠為宜，離心則為臺(tái)式離心機(jī)1000rpm×10min。
3.如權(quán)利要求1所述的I*-紅景天苷的應(yīng)用，其特征是表征紅景天苷應(yīng)用于藥物中時(shí)，在體內(nèi)和體外的吸收、分布、代謝和藥效的研究及在制藥中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的I*-紅景天苷的應(yīng)用，其特征是在制備抗老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用，其原型化合物紅景天苷安全無(wú)毒，具有抗過(guò)氧化作用、抗H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血作用、抗H2O2誘導(dǎo)或淀粉樣蛋白聚集體誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡作用，維持和恢復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞的正常形態(tài)及功能，利用I*-紅景天苷靈敏的放射性示蹤作用，將其應(yīng)用于以I*-紅景天苷原型藥紅景天苷為活性成分的抗老年性癡呆癥藥物的開(kāi)發(fā)及制備中。
全文摘要
I*－紅景天苷及其制備和在抗老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用，屬于中藥藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞生物學(xué)、核技術(shù)、中藥學(xué)及神經(jīng)退行性疾病等。本發(fā)明化合物I*－紅景天苷是藏藥紅景天的活性成分紅景天苷進(jìn)行碘標(biāo)記后的產(chǎn)物，其制備方法是采用氯胺－T法、過(guò)氧化物氧化法或Iodogen法對(duì)紅景天苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在其酚羥基鄰位引入放射性核素碘。該I*－紅景天苷屬首次報(bào)道，其制備工藝簡(jiǎn)便，所得產(chǎn)物穩(wěn)定，可應(yīng)用于以I*－紅景天苷原型藥紅景天苷為活性成分的抗老年性癡呆癥藥物的開(kāi)發(fā)及制備中。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1821256SQ20061003879
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者俞惠新, 張莉, 林秀峰, 譚成, 陳波, 張榮軍, 吳春英, 周杏琴, 楊敏, 朱鈞清, 曹?chē)?guó)憲, 羅世能 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所