專利名稱：從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物材料提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，尤其涉及一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
毛楊梅(Myrica esculenta)在我國南方地區(qū)有廣闊的資源分布。毛楊梅樹皮富含植物多酚，其主要成分為局部棓?；木墼淙杆?polymeric prodelphinidins)，這種現(xiàn)象在植物界是不多見的，因為在植物體中原翠雀素多與原花青素(procyanidins)共存。原翠雀素與原花青素同屬于原花色素(proanthocyanidins)類。研究表明，低聚原花色素(oligomeric proanthocyanidins，OPC)具有很強的抗氧化生物活性，能清除人體內(nèi)有害的自由基，提高人體的免疫力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型天然抗氧化劑和自由基清除劑等，已成為醫(yī)藥、保健品的重要原料及食品、化妝品的重要添加劑。
國外對原花色素(主要是原花青素)生物活性的研究已有幾十年歷史，特別是自80年代以來，德國、法國、意大利、奧地利、日本、印度、匈牙利、韓國等國家開展了大量的研究工作。我國從80年代起加入了世界研究開發(fā)原花色素的行列。
1951年法國Jacques Masquelier首次發(fā)現(xiàn)了原花青素的抗氧化性能，并成功地從海岸松皮中提取出原花青素。1967年美國Joslyn等從葡萄皮和葡萄籽中分離出原花色素多酚化合物。1976年Bombardelli發(fā)明了從葡萄籽中提取高含量原花青素混合物的方法，葡萄(籽和皮)作為原花青素的重要資源，日益受到人們的關(guān)注。1979年Jacques Masquelier進一步研究從葡萄籽中提取原花青素并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。1983年法國D.Cagnian等成功地合成了兒茶素和表兒茶素的聚合體。國外文獻同期還有從不同的天然產(chǎn)物中提取分離原花色素的報導(dǎo)。
國外關(guān)于提取原花色素的專利較為有代表性的有法國Jacques Masquellier從海岸松樹皮以沸水提取，乙酸乙酯萃取粗提液，三氯甲烷沉淀產(chǎn)物，1969年申請專利。日本有賀敏明以Aesculus hippocastanum樹皮為原料，用水提取，石油醚洗滌，樹脂吸附產(chǎn)物。美國Tochiakl Ariga從松樹皮以甲醇提取，石油醚洗滌，乙酸乙酯萃取，液相色譜柱分離得到產(chǎn)品，1989年申請專利。波蘭OszmianskiJan，以丙酮為溶劑，采用超聲波從葡萄籽中提取原花青素，乙酸乙酯萃取，三氯甲烷沉淀產(chǎn)物，1996年申請專利。美國Henkel公司從葡萄籽中提取原花青素，以沸水提取，乙酸乙酯萃取粗提物，三氯甲烷沉淀產(chǎn)品，1997年申請專利。
當前已有多種原花青素作為天然抗氧化劑的研究報道，并已有保健產(chǎn)品問世，例如從法國海岸松樹皮和從其它松屬樹皮中提取的碧蘿芷(pycnogenol)、從葡萄籽和皮中提取的原花青素等。
總體上我國原花色素的研究大都處于植物化學(xué)研究階段。近些年來，國內(nèi)對原花青素的提取純化工藝及抗氧化功能作了初步的研究，也有廠家生產(chǎn)葡萄籽和松樹皮提取物，作為天然強抗氧化劑進入市場。
綜上所述，對原花色素提取分離技術(shù)及其抗氧化生物活性的研究已成為國內(nèi)外天然化合物研究領(lǐng)域的熱點，日益廣泛和深入。但大部分的研究開發(fā)工作，主要集中在從葡萄籽(皮)和松樹皮原料中提取分離的以原花青素為主體的天然抗氧化活性物質(zhì)，而本發(fā)明是涉及從毛楊梅樹皮提取以原翠雀素為主體的天然抗氧化活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種以毛楊梅樹皮為原料提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法。
具體方法如下(1)粉碎將凈化后的毛楊梅樹皮原料用植物粉碎機粉碎，篩孔Φ＝2～4mm；(2)提取以水為溶劑，將粉碎好的樹皮原料用水在50～80℃溫度條件下，提取60～120min，得提取液；具體可以選擇以下任一種方法提取罐組逆流連續(xù)浸提法每罐加入粉碎好的樹皮原料和水，固液質(zhì)量體積比為1∶5～10，置于浸提溫度為60～80℃恒溫水槽內(nèi)，單罐浸提時間為60～120min，罐數(shù)4～6個。
超聲強化提取法粉碎好的樹皮和水置于反應(yīng)槽內(nèi)，固液質(zhì)量體積比為1∶5～10，超聲工作頻率為50～100kHz，超聲功率為100～200W，提取溫度為55～65℃，時間為60～90min，過濾除渣，得提取液。
(3)絮凝沉降提取液加入濃度為0.5～1％的殼聚糖乙酸溶液作為絮凝劑，攪拌靜置，冷卻至室溫；殼聚糖的用量為樹皮原料量的0.025～0.05％(提取液可以先濃縮至6～7°Be′)；(4)冷凍分離將加入絮凝劑的提取液降溫至1～7℃，靜置24～48h，分離出清液，沉淀物棄去；(5)樹脂吸附分離將上述清液用水配成固含量為4～5％w/v的上柱液，采用填料為預(yù)先經(jīng)凈化處理的非極性或低極性大孔吸附樹脂，上柱液流速為1.4～1.7Bv/h，吸附后用純凈水洗柱，再用體積比為60～70％v/v的乙醇水溶液以1.4～1.7Bv/h的流速洗脫，收集洗脫液；(6)脫溶劑在常壓(1.01×105Pa)下從醇水洗脫液中蒸出乙醇，用純凈水稀釋，得產(chǎn)物水溶液；(7)真空冷凍干燥產(chǎn)物水溶液經(jīng)冷凍后在0～0.01Mpa的真空低壓下進行脫水干燥，即得粉狀天然抗氧化活性物質(zhì)。
與現(xiàn)有的從植物資源提取原花色素的文獻報道相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.當前國內(nèi)外與原花色素相關(guān)的研究主要集中在從葡萄籽、皮和松樹皮原料中提取分離以原花青素為主體的天然抗氧化活性物質(zhì)，而本發(fā)明是從毛楊梅樹皮提取以原翠雀素為主體的天然抗氧化活性物質(zhì)。毛楊梅在我國南方地區(qū)有廣闊的資源分布，樹皮中富含原翠雀素，因此本發(fā)明的目標產(chǎn)物原料來源豐富。
2.由原翠雀素和原花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的異同可以分析推斷，本發(fā)明從毛楊梅樹皮提取的以原翠雀素為主的多酚化合物與從松樹皮和葡萄籽提取的以原花青素為主的多酚化合物相比，具有更強的抗氧化、清除自由基的生物活性功能。
原花色素是指在植物體內(nèi)形成的、經(jīng)熱酸-醇處理能產(chǎn)生花色素的一類植物多酚。原花色素按分子中羥基取代的不同類型，可分為原花青素、原翠雀素、原刺槐素(prorobinetinidins)、原菲瑟素(profisetinidins)等多種。原花青素與原翠雀素的化學(xué)結(jié)構(gòu)區(qū)別在于前者的分子結(jié)構(gòu)組成單元為兒茶素(1)，而后者的分子結(jié)構(gòu)組成單元為棓兒茶素(2)。
(1)原花青素的結(jié)構(gòu)組成單元(2)原翠雀素的分子結(jié)構(gòu)組成單元 (3)聚原翠雀素從毛楊梅樹皮提取的聚原翠雀素(3)的組成單元黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)中，B環(huán)上3，4，5位共有3個性能非常活躍的鄰位羥基；其另一特征是局部棓酰化底端單元為表棓兒茶素-3-O-棓酸脂，棓?；燃s40％。
原花青素、原翠雀素雖然同屬于原花色素類，但分子結(jié)構(gòu)上的差異必然會導(dǎo)致其抗氧化及清除自由基活性強弱的區(qū)別。酚類化合物是否具有捕獲自由基的能力，取決于其酚羥基能否作為H原子供體，從而與自由基結(jié)合生成共軛穩(wěn)定的化合物，阻斷自由基鏈式反應(yīng)，其清除自由基的能力與其分子結(jié)構(gòu)(PheO-H鍵的離解能、PheO·共軛離域作用、空間位阻等)及其分子量有關(guān)。亦即在原花青素和原翠雀素的分子結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)和相互位置對其生物活性起重要作用，相鄰的酚羥基多則生物活性強。
3.此外，從毛楊梅樹皮提取的多酚化合物中還含有少量其它多酚化合物如栗木鞣花素、沒食子酸、表棓兒茶素-3-O-棓酸酯、表棓兒茶素-3-O-棓酰-表棓兒茶素等，都具有良好的抗氧化、清除自由基的生物活性，對主要成分原翠雀素也能起到協(xié)同作用。
具體實施例方式
實施例1一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法
(1)粉碎，將凈化后的毛楊梅樹皮原料用植物粉碎機粉碎(Φ2～4mm篩孔)；(2)提取，以水為溶劑，將粉碎好的樹皮原料用水在50～80℃恒溫條件下，提取60～120min，得提取液；其中溫度可以是55℃、60℃、65℃、70℃、80℃。
(3)絮凝沉降，提取液加入濃度為0.5～1％的殼聚糖乙酸溶液作為絮凝劑，攪拌靜置，冷卻至室溫；殼聚糖的用量為樹皮原料量的0.025～0.05％；其中殼聚糖乙酸溶液的濃度可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％。
(4)冷凍分離，將加入絮凝劑的提取液降溫至1～7℃，靜置24～48h，分離出清液，沉淀物棄去；(5)樹脂吸附分離，將上述清液用水配成固含量為4～5％w/v的上柱液，采用填料為預(yù)先經(jīng)凈化處理的非極性或低極性大孔吸附樹脂，上柱液流速為1.4～1.7Bv/h，吸附后用純凈水洗柱，再用體積比為60～70％v/v的乙醇水溶液以1.4～1.7Bv/h的流速洗脫，收集洗脫液；(6)脫溶劑，在常壓下(1.01×105Pa)從醇水洗脫液中蒸出乙醇，用純凈水稀釋，得產(chǎn)物水溶液；(7)真空冷凍干燥，產(chǎn)物水溶液經(jīng)冷凍后在0～0.01Mpa的真空低壓下進行脫水干燥，即得粉狀天然抗氧化活性物質(zhì)。
實施例21.將經(jīng)凈化、風(fēng)干和粉碎(用植物粉碎機，通過Φ2mm篩板)的毛楊梅樹皮裝于浸提罐內(nèi)，共6罐，每罐裝原料50g和水500mL，置于80℃恒溫水槽內(nèi)，按逆流浸提法，每罐浸提時間為60min，共用原料300g，出液2500mL；2.將提取液濃縮至550mL(實測比重為4.9°Be′)，加入濃度為1％的殼聚糖乙酸溶液15mL，趁熱強攪拌后靜置，冷至室溫后將其置于7℃冰箱中靜置48h，分出清液534mL(5.2°Be′)；3.將上述清液用純凈水稀釋至濃度為5％(w/v)，作為上柱液將其分為2份，以1.4Bv/h的流速分別加至兩根已經(jīng)過預(yù)處理的AB-8型大孔吸附樹脂柱(Bv＝250cm3)，而后分別用2.4Bv/h的純凈水洗柱，再分別用70％的乙醇水溶液430mL以1.7Bv/h的流速洗脫，合并洗脫液；
4.在常壓下(1.01×105Pa)蒸出乙醇水洗脫液中的乙醇(回用)，用純凈水稀釋，得產(chǎn)物水溶液；5.將產(chǎn)物水溶液在低溫下真空冷凍干燥，獲得天然抗氧化活性物質(zhì)粉狀產(chǎn)品35g，得率為14.3％(樹皮原料按絕干計)。
實施例31.將按實施例2方法預(yù)處理的毛楊梅樹皮350g和浸提水2500mL置于KH-200DB型數(shù)控超聲發(fā)生器槽內(nèi)，在超聲強化作用下進行提取，超聲頻率為50kHz，超聲功率為200W，控制溫度在60±5℃，提取時間為60min，到時后取出，過濾去渣，得提取液2150mL；2.在提取液中加入17.5mL濃度為1％的殼聚糖乙酸溶液，強攪拌后靜置冷至室溫，放入5℃冰箱中靜置24h后分出清液2020mL，實測其固含量為53.7g；3.將上述清液濃縮至1080mL，實測其濃度為5％(w/v)；4.將上述溶液分成3份上大孔樹脂吸附柱，每根柱的上柱液為360mL；5.按實施例2中(3)、(4)、(5)的操作，獲得天然抗氧化活性物質(zhì)粉狀產(chǎn)品36.8g，得率為12.9％(樹皮原料按絕干計)。
本發(fā)明中目標產(chǎn)物的抗氧化活性通過試驗獲得驗證(見附1、附2、附3)對不飽和油脂有抗氧化的作用；對催化油脂過氧化反應(yīng)的金屬離子有絡(luò)合能力；有清除自由基的能力。
附1本發(fā)明中目標產(chǎn)物對不飽和油脂的抗氧化性能測定采用Schaal烘箱法測定目標產(chǎn)物對植物油脂熱氧化的抑制能力。按1kg底物油加入0.4g抗氧化劑的比例，稱取實施例2中制備的目標產(chǎn)物試樣12mg，在容器中溶于3mL的60％乙醇，然后加入30g底物亞麻油，再加入1滴Span80，振蕩混合使其充分乳化，置于60±2℃烘箱內(nèi)，每隔一定時間取油樣3g，用碘量法(GB/T5538-1995《油脂過氧化值測定法》)測定其過氧化值POV(meq/kg)。同行空白。結(jié)果如下
結(jié)果數(shù)據(jù)表明，目標產(chǎn)物具有對不飽和油脂的抗氧化作用。
附2本發(fā)明中目標產(chǎn)物對金屬離子的絡(luò)合性能測定目標產(chǎn)物能與Fe2+離子生成有色絡(luò)合物，用分光光度計在波長584nm處有特征吸收峰，其吸光度與絡(luò)合物的濃度成正比。
稱取實施例2中制備的目標產(chǎn)物試樣0.2g(精確至0.1mg)，溶于200mL蒸餾水中，其濃度為1mg/mL，稱取0.1g(精確至0.1mg)FeSO4·7H2O，溶于100mL蒸餾水中，F(xiàn)e2+濃度為0.2mg/mL。
在5mL的試樣溶液中，分別加入0、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL的Fe2+溶液，再分別用蒸餾水定容至10mL，用分光光度計在584nm處分別測定吸光度，當Fe2+溶液加入量增加至吸光度保持恒定時，表明試樣溶液對Fe2+離子的絡(luò)合已經(jīng)飽和。
由此計算目標產(chǎn)物對Fe2+離子的絡(luò)合能力為181mg/g。
結(jié)果數(shù)據(jù)表明，目標產(chǎn)物具有對金屬離子的絡(luò)合能力。
附3本發(fā)明中目標產(chǎn)物對自由基的清除能力測定以二苯基-苦基-肼基自由基(DPPH，美國Sigma公司)為標準物，用分光光度法測定本發(fā)明目標產(chǎn)物對DPPH的清除率。
配制工作溶液DPPH的乙醇溶液，濃度為0.025mg/mL；目標產(chǎn)物試樣的乙醇溶液，濃度為0.07mg/mL。
分光光度計測定(λ＝517nm；1cm比色皿)DPPH溶液原始吸光度DPPH溶液5mL加乙醇1mL，吸光度0.485。
加入目標產(chǎn)物試樣的DPPH溶液的吸光度變化情況DPPH溶液5mL加試樣溶液1mL，混合后即開始測定吸光度，隨后每間隔1min測定1次，吸光度持續(xù)下降，直至保持恒定不變?yōu)橹?，計時并進行計算。
測定結(jié)果吸光度下降至恒定值的時間7min；DPPH清除率92.0％；DPPH清除速率0.046mg/min。
結(jié)果數(shù)據(jù)表明，目標產(chǎn)物具有對自由基(DPPH)的清除能力。
權(quán)利要求
1.一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于(1)粉碎將凈化后的毛楊梅樹皮原料用植物粉碎機粉碎；(2)提取以水為溶劑，將粉碎好的樹皮原料用水在50～80℃溫度條件下，提取60～120min，得提取液；(3)絮凝沉降提取液加入濃度為0.5～1％的殼聚糖乙酸溶液作為絮凝劑，攪拌靜置，冷卻至室溫；殼聚糖的用量為樹皮原料量的0.025～0.05％；(4)冷凍分離將加入絮凝劑的提取液降溫至1～7℃，靜置24～48h，分離出清液，沉淀物棄去；(5)樹脂吸附分離將上述清液用水配成固含量為4～5％w/v的上柱液，采用填料為預(yù)先經(jīng)凈化處理的非極性或低極性大孔吸附樹脂，上柱液流速為1.4～1.7Bv/h，吸附后用純凈水洗柱，再用體積比為60～70％v/v的乙醇水溶液以1.4～1.7Bv/h的流速洗脫，收集洗脫液；(6)脫溶劑在常壓下從醇水洗脫液中蒸出乙醇，用純凈水稀釋，得產(chǎn)物水溶液；(7)真空冷凍干燥產(chǎn)物水溶液經(jīng)冷凍后在0～0.01Mpa的真空低壓下進行脫水干燥，即得粉狀天然抗氧化活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于步驟〔1〕中粉碎機的篩孔Φ＝2～4mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(2)用下列方式進行提取罐組逆流連續(xù)浸提法每罐加入粉碎好的樹皮原料和水，固液質(zhì)量體積比為1∶5～10，置于浸提溫度為60～80℃恒溫水槽內(nèi)，單罐浸提時間為60～120min，罐數(shù)4～6個。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(2)還可以用下列方式進行提取超聲強化提取法粉碎好的樹皮和水置于反應(yīng)槽內(nèi)，固液質(zhì)量體積比為1∶5～10，超聲工作頻率為50～100kHz，超聲功率為100～200W，提取溫度為55～65℃，時間為60～90min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(3)絮凝沉降，提取液可以先濃縮至6～7°Be′。
全文摘要
一種從毛楊梅樹皮提取天然抗氧化活性物質(zhì)的方法將凈化后的毛楊梅樹皮原料用植物粉碎機粉碎，將粉碎好的樹皮原料用水在50～80℃溫度條件下，提取60～120min，提取液加入濃度為0.5～1％的殼聚糖乙酸溶液作為絮凝劑，攪拌靜置，冷卻至室溫；降溫至1～7℃，靜置24～48h，將上述清液用水配成固含量為4～5％w/v的上柱液，采用填料為預(yù)先經(jīng)凈化處理的非極性或低極性大孔吸附樹脂吸附分離，常壓下從醇水洗脫液中蒸出乙醇，得到的產(chǎn)物水溶液經(jīng)真空冷凍干燥，得粉狀天然抗氧化活性物質(zhì)。由本發(fā)明制得的目標產(chǎn)物具有更強的抗氧化、清除自由基的生物活性功能。
文檔編號A61P39/00GK1850133SQ200610038739
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者陳笳鴻, 汪詠梅, 吳冬梅, 吳在嵩 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所