專(zhuān)利名稱(chēng)：涉及新化合物及其靶標(biāo)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的化學(xué)化合物，其發(fā)現(xiàn)方法，及其治療應(yīng)用。特別地，本發(fā)明提供了苯二氮雜類(lèi)衍生物和相關(guān)化合物以及使用苯二氮雜類(lèi)衍生物和相關(guān)化合物作為治療與程序性細(xì)胞死亡、自身免疫性、炎癥和過(guò)度增殖等過(guò)程的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)相關(guān)的一系列病癥的治療劑的方法。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生物體可精確地發(fā)揮其控制細(xì)胞數(shù)量過(guò)度的作用。細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡之間的平衡獲得了這種穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞死亡通過(guò)壞死或通過(guò)稱(chēng)作編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的自殺形式發(fā)生在幾乎每種類(lèi)型的脊椎動(dòng)物細(xì)胞中。編程性細(xì)胞死亡由實(shí)施通常的遺傳性程序性死亡機(jī)制的各種胞外和胞內(nèi)信號(hào)引起。
多細(xì)胞生物體使用編程性細(xì)胞死亡指導(dǎo)受損或不需要的細(xì)胞破壞其自身以便對(duì)生物體有利?？刂萍?xì)胞凋亡過(guò)程由此對(duì)正常發(fā)育是極為重要的，例如，胎兒的手指和足趾發(fā)育需要通過(guò)編程性細(xì)胞死亡以受控方式除去過(guò)量的互連組織，正如在大腦內(nèi)形成神經(jīng)突觸一樣。類(lèi)似地，受控的編程性細(xì)胞死亡導(dǎo)致月經(jīng)開(kāi)始時(shí)子宮內(nèi)襯層(子宮內(nèi)膜)的腐肉形成脫離。盡管編程性細(xì)胞死亡在組織造形和正常細(xì)胞維持中起重要作用，它還是對(duì)威脅健康生物體的細(xì)胞和侵入物(例如病毒)的主要防御措施。
并不令人意外的是許多疾病與細(xì)胞死亡過(guò)程的失調(diào)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)建立了異常細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)與各種腫瘤、自身免疫性和病毒疾病的致病性之間的因果關(guān)系。例如，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，效應(yīng)細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞“CTLs”)通過(guò)誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡破壞病毒-感染的細(xì)胞。生物體隨后在不再需要它們時(shí)依賴(lài)于破壞效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡過(guò)程。自身免疫性一般由誘導(dǎo)彼此的編程性細(xì)胞死亡的CTLs并且甚至由它們自身預(yù)防。在該過(guò)程中的缺陷與各種自身免疫疾病相關(guān)，諸如紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
多細(xì)胞生物體還使用編程性細(xì)胞死亡指導(dǎo)含有受損的核酸(例如DNA)的細(xì)胞在其變成癌性前破壞其自身。某些導(dǎo)致癌癥的病毒通過(guò)使感染(轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞程序重排以終止正常的細(xì)胞凋亡過(guò)程而克服這一防護(hù)措施。例如，幾種人乳頭瘤病毒(HPVs)已經(jīng)通過(guò)因產(chǎn)生使p53編程性細(xì)胞死亡啟動(dòng)子失活的蛋白質(zhì)(E6)而抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞凋亡性去除涉及到產(chǎn)生宮頸癌。類(lèi)似地，單核細(xì)胞增多癥和伯基特淋巴瘤病原體EB病毒(EBV)使感染細(xì)胞重編程序以產(chǎn)生蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以防止異常細(xì)胞的正常細(xì)胞凋亡性去除，由此允許癌細(xì)胞增殖并且在整個(gè)生物體內(nèi)擴(kuò)散。
其它病毒破壞性地操作細(xì)胞凋亡器，而不會(huì)直接導(dǎo)致癌發(fā)育。例如，認(rèn)為感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的個(gè)體免疫系統(tǒng)的破壞通過(guò)指導(dǎo)未感染的姐妹細(xì)胞經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡的感染CD4+T細(xì)胞(100,000個(gè)中約1個(gè))發(fā)展。
因非-病毒方式而增加的某些癌癥還發(fā)生了通過(guò)編程性細(xì)胞死亡脫離破壞的機(jī)制。例如，黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)抑制編碼Apaf-1的基因的表達(dá)避免編程性細(xì)胞死亡。其它癌細(xì)胞，尤其是肺和結(jié)腸癌細(xì)胞分泌高水平的抑制CTL介導(dǎo)的異常細(xì)胞清除啟動(dòng)的可溶性誘餌分子。細(xì)胞凋亡器的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)還涉及各種變性疾病和血管疾病。
顯而易見(jiàn)的是，細(xì)胞凋亡過(guò)程及其細(xì)胞器的受控調(diào)節(jié)對(duì)多細(xì)胞生物體存活而言是極其關(guān)鍵的。一般而言，發(fā)生在指導(dǎo)進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞中的生化改變以依次排列方式出現(xiàn)。然而，如上所述，編程性細(xì)胞死亡的缺陷調(diào)節(jié)可以在生物體內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的有害作用。
已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來(lái)控制和恢復(fù)異常細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)中的細(xì)胞死亡器的調(diào)節(jié)。例如，已經(jīng)做了大量工作來(lái)研發(fā)在異常細(xì)胞增殖前破壞它們的細(xì)胞毒性劑。照此，細(xì)胞毒性劑廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物健康并且代表了用于幾乎所有形式的癌癥和過(guò)度增殖性自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的第一線療法。
許多在臨床應(yīng)用中細(xì)胞毒性劑通過(guò)破壞DNA(例如順式-二氨基二氯鈀(II)交聯(lián)DNA，而博來(lái)霉素誘導(dǎo)鏈切割)發(fā)揮其作用。如果由細(xì)胞因子、如p53系統(tǒng)識(shí)別，那么這種核損害的結(jié)果在于啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致受損的細(xì)胞死亡。
然而，現(xiàn)存的細(xì)胞毒性化療劑存在嚴(yán)重的缺陷。例如，許多已知的細(xì)胞毒性劑幾乎無(wú)法在健康與患病細(xì)胞之間表現(xiàn)出分辨力。這一特異性的缺乏通常導(dǎo)致可能限制功效和/或?qū)е略缙谒劳雎实膰?yán)重的副作用。此外，延長(zhǎng)給予許多現(xiàn)存的細(xì)胞毒性劑產(chǎn)生使得進(jìn)一步給藥有效性較低或無(wú)效的抗性基因的表達(dá)(例如bcl-2家族或多藥物抗性(MDR)蛋白)。某些細(xì)胞毒性劑誘導(dǎo)突變成p53和相關(guān)蛋白。基于這些考慮，理想的細(xì)胞毒性藥物僅應(yīng)殺傷患病細(xì)胞，而對(duì)化學(xué)抗性不敏感。
一種選擇性殺傷患病細(xì)胞的策略在于研發(fā)選擇性識(shí)別患病細(xì)胞中表達(dá)的分子的藥物。因此，有效性的細(xì)胞毒性化療劑可以識(shí)別疾病指示分子并且誘導(dǎo)(例如直接或間接)患病細(xì)胞死亡。盡管已經(jīng)使用治療抗體和小分子鑒定和靶向了對(duì)某些類(lèi)型癌細(xì)胞的標(biāo)記，但是對(duì)大部分癌癥而言，尚不了解用于針對(duì)和治療利用的獨(dú)特特性。此外，對(duì)如狼瘡這類(lèi)疾病而言，尚未鑒定用于藥物研發(fā)的特異性分子靶標(biāo)。
需要用于調(diào)節(jié)患有特征在于這些過(guò)程錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的疾病和病癥(例如病毒感染、過(guò)度增殖性自身免疫性疾病、慢性炎癥疾病和癌癥)的受試者的細(xì)胞凋亡過(guò)程的改進(jìn)的組合物和方法。
概述本發(fā)明提供了用于治療許多疾病和病癥并且用于研究、化合物篩選和診斷應(yīng)用的新化合物。本發(fā)明還提供了這些新化合物的應(yīng)用以及引起特定生物反應(yīng)的已知化合物(例如結(jié)合特定靶分子和/或產(chǎn)生特定的細(xì)胞活動(dòng)的化合物)的應(yīng)用。這類(lèi)化合物和應(yīng)用貫穿于本申請(qǐng)上下文的描述中并且代表了不同組的組合物和應(yīng)用。
某些優(yōu)選組合物和應(yīng)用如下所述。本發(fā)明并不限于這些特定的組合物和應(yīng)用。
本發(fā)明提供了貫穿于本申請(qǐng)上下文中所述的大量有用的組合物。本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案包括含有如下通式的組合物 其中R1選自萘丙氨酸(napthalalanine)；苯酚；1-萘酚(napthalenol)；2-萘酚；
和喹啉類(lèi)其中R2選自下列基團(tuán)組成的組 且其中R1和R2包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案包括含有如下通式的組合物 其中R1選自H、烷基或取代的烷基；其中R2選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)烷基、取代的氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基、雜環(huán)；其中R3選自H、烷基或取代的烷基，且其中至多一個(gè)取代基為羥基子基團(tuán)；其中R4選自 其中n＝0-5；且其中R1、R2、R3和R4包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案包括含有如下通式的組合物
其中R1選自H、烷基或取代的烷基；其中R2選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)烷基、取代的氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基、雜環(huán)；其中R3選自H、烷基或取代的烷基，且其中至多一個(gè)取代基為羥基子基團(tuán)；其中R4選自
其中n＝0-5；且其中R1，、R2、R3和R4包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物。在這類(lèi)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合寡霉素賦予蛋白的化合物以及活性劑(例如白藜蘆醇、picetannol、雌激素、蘭索拉唑)。
本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方法和組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了受試者和包括選自由下列通式組成的組的組合物

其中R選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基、雜環(huán)；且將這類(lèi)組合物對(duì)所述的受試者給藥。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的組合物和方法。在這類(lèi)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了受試者和包括選自如下通式的組合物

其中R選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基、雜環(huán)；且將這類(lèi)組合物對(duì)所述的受試者給藥。
本發(fā)明提供了許多用于影響細(xì)胞、組織和生物體生命的方法。本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案包括用于調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方法。在這類(lèi)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有線粒體的靶細(xì)胞和含有如下通式的組合物
其中R1包括大于苯的疏水性芳族基團(tuán)；其中R2包括酚羥基；且其中R1和R2包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。在額外的實(shí)施方案中，使細(xì)胞在所述的組合物結(jié)合寡霉素敏感性賦予蛋白的條件下接觸該組合物，以便增加所述的細(xì)胞中的超氧化物水平或改變細(xì)胞ATP水平。
在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為體外細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為體內(nèi)細(xì)胞。仍然是在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為離體細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞選自下列細(xì)胞組成的組B細(xì)胞、T細(xì)胞和粒細(xì)胞。
在用于調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了如下組合物 其中R1選自下列基團(tuán)組成的組萘丙氨酸；苯酚；1-萘酚；2-萘酚；
和喹啉類(lèi)其中R2選自下列基團(tuán)組成的組
且其中R1和R2包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中本發(fā)明調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，該組合物接觸靶細(xì)胞導(dǎo)致靶細(xì)胞的細(xì)胞死亡增加。
本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的方法和組合物。在這類(lèi)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有線粒體的增殖的靶細(xì)胞和含有如下通式的組合物 其中R1包括大于苯的疏水性芳族基團(tuán)；其中R2包括酚羥基；且其中R1和R2包括R或S對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物；且其中使細(xì)胞在所述的組合物結(jié)合線粒體ATP合酶的條件下接觸該組合物，以便增加所述的細(xì)胞中超氧化物水平或改變細(xì)胞ATP水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物結(jié)合寡霉素敏感性賦予蛋白。
在某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為體外細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為體內(nèi)細(xì)胞。仍然是在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為離體細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為癌細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞選自下列細(xì)胞組成的組B細(xì)胞、T細(xì)胞和粒細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為增殖細(xì)胞。
在本發(fā)明調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下組合物 其中R1選自萘丙氨酸；苯酚；1-萘酚；2-萘酚； 和喹啉類(lèi)；其中R2選自下列基團(tuán)組成的組
本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案包括含有如下通式(包括R和S對(duì)映體和外消旋混合物)的組合物 其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基、腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝(nitronium)子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；NR’；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基、腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2，其中R’如上述R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)其中所述的大于苯包括含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)并且為芳基或脂族環(huán)狀基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，R’為防止R5的氧在體內(nèi)代謝，直到化合物達(dá)到其生物靶標(biāo)(例如線粒體)的任意官能基。在某些實(shí)施方案中，R’保護(hù)基在靶部位被代謝，使R5轉(zhuǎn)化成羥基。
另外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5起與細(xì)胞線粒體發(fā)生相互作用的功能(即在沒(méi)有R5存在下，化合物對(duì)線粒體成分的結(jié)合親和力下降)。在額外的實(shí)施方案中，R1-R4起防止不需要的組合物且特別是R5上的羥基代謝的功能。在其它實(shí)施方案中，R1-R4其促進(jìn)組合物的細(xì)胞線粒體代謝的功能。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物與細(xì)胞線粒體的相互作用包括結(jié)合OSCP。甚至在額外的實(shí)施方案中，結(jié)合OSCP導(dǎo)致超氧化物水平增加。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5起調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的功能。
本發(fā)明還提供了用于治療受損(compromised)血管的組合物和方法。例如，本發(fā)明提供了用于治療受損的心臟血管的組合物和方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受損血管為閉塞的血管。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療受損血管的方法，包括提供藥物-洗脫支架介質(zhì)(media)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物-洗脫支架介質(zhì)包括本發(fā)明的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將藥物組合物涂敷在藥物-洗脫支架介質(zhì)上。在額外的實(shí)施方案中，藥物組合物包括活性劑和藥物上可接受的賦形劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性劑包括本文所述的任意結(jié)構(gòu)。
在用于治療患有受損血管的受試者的受損血管的組合物和方法中，本發(fā)明進(jìn)一步包括使用藥物-洗脫支架介質(zhì)治療所述的受試者并且將所述的藥物組合物涂布在受損血管上。在某些實(shí)施方案中，將藥物組合物涂布在所述的受損血管上抑制了再狹窄。在額外的實(shí)施方案中，涂布藥物組合物抑制了平滑肌細(xì)胞分化、遷移和增殖。
在其它實(shí)施方案中，所述的藥物組合物進(jìn)一步包含粘合劑。在某些實(shí)施方案中，所述的粘合劑為生物可降解的。甚至在額外的實(shí)施方案中，所述的粘合劑為纖維蛋白膠。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定治療組合物的方法。在某些實(shí)施方案中，所述的方法提供包括線粒體F1F0-ATPase和候選F1F0-ATPase抑制劑的樣品。在額外的實(shí)施方案中，使所述的樣品接觸所述的抑制劑。在額外的實(shí)施方案中，測(cè)定所述的線粒體F1F0-ATPase的kcat/Km并且將主要結(jié)合F1F0-ATPase-底物復(fù)合物并且在結(jié)合所述的線粒體F1F0-ATPase時(shí)不會(huì)改變和所述線粒體F1F0-ATPase的所述kcat/Km比例的組合物選作治療組合物。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括在動(dòng)物中測(cè)試選擇的組合物以便鑒定低毒性和治療自身免疫性疾病的能力的步驟。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的樣品進(jìn)一步包括線粒體。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)1F0-ATPase為純的酶。甚至在額外的實(shí)施方案中，F(xiàn)1F0-ATPase位于亞線粒體顆粒中。
在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定ATP水解速率或作為ATP濃度函數(shù)的合成速率來(lái)確定kcat/Km之比。甚至在額外的實(shí)施方案中，根據(jù)Km Vmax和km計(jì)算kcat/Km之比。
在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇的組合物在高底物濃度下具有高度抑制活性并且在低底物濃度下具有低活性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療自身免疫性疾病的方法。在這類(lèi)實(shí)施方案中，受試者和組合物能夠結(jié)合線粒體F1F0-ATPase，而提供了不改變F1F0-ATPase kcat/Km之比，并且將該組合物對(duì)所述的受試者給藥。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞的方法，包括提供含有過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞的樣品和包括苯二氮雜類(lèi)化合物的組合物，并且將該組合物施用給所述的樣品。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物包括增加過(guò)度增殖上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的活性劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述的組合物施用給所述的樣品增加了該樣品內(nèi)的ROS水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述的組合物施用給所述的樣品減少了該樣品內(nèi)的Erk活化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述的組合物施用給所述的樣品抑制了該樣品內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包括局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇。在某些實(shí)施方案中，所述的局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇選自下列0.1％曲安奈德霜和二丙酸倍他米松0.05％霜組成的組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包括2-10％煤焦油。在某些實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包括維生素D-3類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，所述的維生素D-3類(lèi)似物為卡泊三烯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包括角質(zhì)軟化劑。在某些實(shí)施方案中，所述的角質(zhì)軟化劑為0.1-1％地蒽酚。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的組合物進(jìn)一步包括局部用類(lèi)視色素。在某些實(shí)施方案中，所述的局部用類(lèi)視色素選自下列基團(tuán)維A酸和他扎羅汀組成的組。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的樣品為有生命的受試者。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的有生命的受試者為患有表皮超常增生的人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的有生命的受試者患有牛皮癬。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的活性劑為Bz-423或本文披露的其它化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的活性劑含有如下通式 包括R和S對(duì)映體形式和外消旋混合物；其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2；其中R’如R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中大于苯包括含有7個(gè)或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括苯二氮雜類(lèi)化合物和選自下組的活性劑的藥物組合物局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇、角質(zhì)軟化劑、局部用類(lèi)視色素(retinoid)、2-10％煤焦油和維生素D-3類(lèi)似物。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加過(guò)度增殖水平細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的化合物和選自下組的活性劑局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇、角質(zhì)軟化劑、局部用類(lèi)視色素、2-10％煤焦油和維生素D-3類(lèi)似物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的苯二氮雜類(lèi)化合物為Bz-423。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的化合物為Bz-423。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的化合物含有如下通式 包括R和S對(duì)映體形式和外消旋混合物；其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2；其中R’如R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中大于苯包括含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的藥物組合物用于治療表皮超常增生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的表皮超常增生由牛皮癬導(dǎo)致。
附圖描述c附圖1表示證實(shí)OSCP成分為Bz-423的結(jié)合蛋白的數(shù)據(jù)。
附圖2為表示Bz-423和純化的人OSCP的結(jié)合等溫線的示意圖.
附圖3表示OSCP的siRNA調(diào)節(jié)。
附圖4表示用本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞的基因表達(dá)特性的數(shù)據(jù)。將來(lái)自有Bz-423存在下增量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4A中。將來(lái)自有Bz-423存在下減量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4B中。將來(lái)自有Bz-OMe存在下增量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4C中。將來(lái)自有Bz-OMe存在下減量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4D中。
附圖5表示阻斷類(lèi)視色素-誘導(dǎo)的表皮超常增生的Bz-423。上組組織學(xué)表觀。將2-mm皮膚鉆取活組織檢查樣品在器官培養(yǎng)物中溫育8天并且在用蘇木精和曙紅染色后通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查。A和D未處理的皮膚維持正常組織學(xué)表觀。B和E在有連續(xù)RA(1μg/ml)存在下培養(yǎng)的皮膚表現(xiàn)出顯著的表皮超常增生。C和FRA-誘導(dǎo)的表皮增厚在含有RA(1μg/ml)和Bz-423(1μg/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的樣本中基本上減少。A-C 160X，D-F 400X)。下組定量數(shù)據(jù)。所示的值為基于來(lái)自5個(gè)不同受試者的器官培養(yǎng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
附圖6表示在1小時(shí)處理內(nèi)增加細(xì)胞中ROS的Bz-423。給角質(zhì)形成細(xì)胞(開(kāi)放的正方形)和成纖維細(xì)胞(封閉的圓圈)的單層培養(yǎng)物中加載ROS特異性指示劑DCFH，并且與指定濃度下的Bz-423一起溫育1小時(shí)，此后進(jìn)行分析。展示了在一式三份進(jìn)行的單一實(shí)驗(yàn)中的DCF熒光強(qiáng)度平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
定義為了有利于理解本發(fā)明，許多術(shù)語(yǔ)和措詞如下所定義。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“苯二氮雜類(lèi)”意旨與苯環(huán)稠合的7元非芳族雜環(huán)，其中7元環(huán)帶有2個(gè)氮原子作為雜環(huán)的組成部分。在某些方面中，兩個(gè)氮原子位于1和4位上，正如如下的一般結(jié)構(gòu)中所示。
苯二氮雜可以被1個(gè)酮基(一般在2-位上)或2個(gè)酮基取代，它們各自在2-和5-位上。當(dāng)苯二氮雜帶有各自位于2-和5-位上的2個(gè)酮基時(shí)，它稱(chēng)作苯二氮雜-2，5-二酮。最一般的情況是，苯二氮雜進(jìn)一步在6-元苯環(huán)上或在7-元雜環(huán)或在兩個(gè)環(huán)上進(jìn)一步被不同的取代基取代。這些取代基在本文中更完整地描述。
術(shù)語(yǔ)“大于苯”意旨含有7個(gè)或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“取代的脂族”意旨帶有少于10個(gè)碳的烷，其中脂族氫原子中的至少1個(gè)被鹵素、氨基、羥基、硝基、硫代基團(tuán)、酮、醛、酯、酰胺、低級(jí)脂族基團(tuán)、取代的低級(jí)脂族基團(tuán)或環(huán)(芳基、取代的芳基、環(huán)脂族基團(tuán)或取代的環(huán)脂族基團(tuán)等)取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于1-氯乙基等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“取代的芳基”意旨芳族環(huán)或由不超過(guò)3個(gè)稠合環(huán)組成的稠合的芳族環(huán)系，所述3個(gè)稠合環(huán)中至少1個(gè)為芳族的，并且其中環(huán)碳上的氫原子中的至少1個(gè)被鹵素、氨基、羥基、硝基、硫代基團(tuán)、酮、醛、酯、酰胺、低級(jí)脂族基團(tuán)、取代的低級(jí)脂族基團(tuán)或環(huán)(芳基、取代的芳基、環(huán)脂族基團(tuán)或取代的環(huán)脂族基團(tuán)等)取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于羥基苯基等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)脂族基團(tuán)”意旨帶有少于8個(gè)碳的環(huán)烷或由不超過(guò)3個(gè)稠合環(huán)脂族環(huán)組成的稠合環(huán)系。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于十氫萘等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“取代的環(huán)脂族基團(tuán)”意旨帶有少于10個(gè)碳的環(huán)烷或由不超過(guò)3個(gè)稠合環(huán)組成的稠合環(huán)系，并且在所述的3個(gè)稠合環(huán)中，脂族氫原子中的至少1個(gè)被鹵素、氨基、羥基、硝基、硫代基團(tuán)、酮、醛、酯、酰胺、低級(jí)脂族基團(tuán)、取代的低級(jí)脂族基團(tuán)或環(huán)(芳基、取代的芳基、環(huán)脂族基團(tuán)或取代的環(huán)脂族基團(tuán)等)取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于1-氯萘烷基、雙環(huán)-庚烷類(lèi)、辛烷和壬烷類(lèi)(例如降冰片基)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”意旨帶有少于8個(gè)碳的環(huán)烷和/或芳基環(huán)系或由不超過(guò)3個(gè)稠合環(huán)組成的稠合環(huán)系，其中環(huán)碳原子中的至少1個(gè)被氧、氮或硫取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于嗎啉代等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“取代的雜環(huán)”意旨帶有少于8個(gè)碳的環(huán)烷和/或芳基環(huán)系或由不超過(guò)3個(gè)稠合環(huán)組成的稠合環(huán)系，其中環(huán)碳原子中的至少1個(gè)被氧、氮或硫取代，并且其中脂族氫原子中的至少1個(gè)被鹵素、氨基、羥基、硝基、硫代基團(tuán)、酮、醛、酯、酰胺、低級(jí)脂族基團(tuán)、取代的低級(jí)脂族基團(tuán)或環(huán)(芳基、取代的芳基、環(huán)脂族基團(tuán)或取代的環(huán)脂族基團(tuán)等)取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于2-氯吡喃基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“連接基”意旨含有至多并且包括8個(gè)連續(xù)的連接兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)部分的原子的鏈，其中這類(lèi)原子例如為碳、氮、氧或硫。乙二醇為一個(gè)非限制性實(shí)例。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)-烷基-取代的-氨基”意旨含有至多并且包括8個(gè)碳原子的原子的任意烷基單元，其中脂族氫原子之一被氨基取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于乙氨基等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)-烷基-取代的-鹵素”意旨含有至多并且包括8個(gè)碳原子的原子的任意烷基，其中脂族氫原子之一被鹵素取代。這類(lèi)的實(shí)例包括，但不限于氯乙基等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“乙酰氨基”應(yīng)指的是乙酰化的任意伯或仲氨基。這類(lèi)實(shí)例包括，但不限于乙酰胺等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)化合物的″衍生物″意旨化學(xué)修飾的化合物，其中化學(xué)修飾在該化合物的官能基或芳族環(huán)上進(jìn)行。本發(fā)明的1，4-苯二氮雜類(lèi)衍生物的非限制性實(shí)例可以包括下該化合物的任意可利用的氮上的N-乙酰基、N-甲基、N-羥基。額外的衍生物包括那些在苯環(huán)上帶有三氟甲基的衍生物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“表皮超常增生”意旨在表皮組織中正常排列的正常細(xì)胞數(shù)量異常倍增或增加。表皮超常增生為許多病癥的特征，包括，但不限于牛皮癬。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“角質(zhì)形成細(xì)胞”意旨表皮的角質(zhì)化層的皮膚細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“成纖維細(xì)胞”意旨分泌原纖維前膠原(fibrillarprocollagen)、纖連蛋白和膠原酶的結(jié)締組織中胚層衍生的居留細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″支架″或“藥物-洗脫支架”意旨在放入接觸所治療的腔壁中的部位時(shí)將使血纖蛋白在腔壁上就位并且使其保留在腔壁中的任意裝置。它尤其可以包括經(jīng)皮遞送以便治療冠狀動(dòng)脈閉塞并且封閉脾、頸動(dòng)脈、回腸和腘血管的剖離部分或動(dòng)脈瘤的裝置。支架還可以帶有涂布了血纖蛋白的潛在的聚合物或金屬結(jié)構(gòu)元件或該支架可以為纖維蛋白與聚合物混合的復(fù)合物。例如，可以給可變形的金屬絲支架、諸如美國(guó)專(zhuān)利US4,886,062中披露的支架在一層或多層涂層中如上所述涂敷血纖蛋白(即通過(guò)涂布血纖蛋白原溶液或凝固血纖蛋白原的蛋白質(zhì)的溶液在金屬框架上聚合血纖蛋白)或使其帶有諸如包圍的血纖蛋白薄膜的結(jié)合的血纖蛋白預(yù)形成物。然后可以將支架和血纖蛋白置于氣囊式導(dǎo)管遠(yuǎn)端上的氣囊上并且通過(guò)常規(guī)的經(jīng)皮方式(例如作為在血管成形術(shù)操作步驟中)遞送至所治療的局限或閉合部位，其中通過(guò)可以氣囊加壓，它隨后膨脹接觸體腔。然后可以抽出導(dǎo)管，從而將本發(fā)明的血纖蛋白支架保留就位在治療部位上。該支架由此可以在治療部位上提供對(duì)腔的支持結(jié)構(gòu)并且還在腔壁上提供支持血纖蛋白固定就位的結(jié)構(gòu)。一般而言，藥物-洗脫支架允許在支架起作用的部位上有效釋放特定藥物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)管”一般意旨用于進(jìn)入與體腔或血管的管。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“瓣膜”或“血管”意旨哺乳動(dòng)物內(nèi)的任意腔。實(shí)例包括，但不限于動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)血管和生物腔。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“再狹窄”意旨變狹窄的任何瓣膜。實(shí)例包括，但不限于在因嘗試開(kāi)放狹窄的動(dòng)脈部分，諸如，例如通過(guò)氣囊擴(kuò)張術(shù)、切除、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或激光治療動(dòng)脈導(dǎo)致的對(duì)所述動(dòng)脈的創(chuàng)傷后的外周或冠狀動(dòng)脈再閉合。
本文所用的“血管成形術(shù)”或“氣囊療法”或“氣囊血管成形術(shù)”或“經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈成形術(shù)”意旨治療血管病癥的方法，包括使用氣囊式導(dǎo)管擴(kuò)張血管且由此改善血流。
本文所用的“心導(dǎo)管插入術(shù)”或“冠狀動(dòng)脈造影”意旨使用導(dǎo)管插入術(shù)診斷冠狀動(dòng)脈疾病的試驗(yàn)。這類(lèi)操作步驟可以包括例如，將造影劑通過(guò)導(dǎo)管注入冠狀動(dòng)脈，從而使狹窄或阻塞的動(dòng)脈顯影。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”意旨通過(guò)本發(fā)明方法治療的生物體。這類(lèi)生物體優(yōu)選包括，但不限于哺乳動(dòng)物(例如鼠、猴、馬、牛、豬、犬、貓等)且最優(yōu)選包括人。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“受試者”一般意旨為特征在于因細(xì)胞凋亡過(guò)程失調(diào)的疾病而接受或已經(jīng)接受治療(例如給予苯二氮雜類(lèi)化合物和任選一種或多種其它活性劑)的任何個(gè)體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“診斷”意旨根據(jù)其征兆和癥狀(例如耐受常規(guī)療法)或遺傳分析、病理分析、組織學(xué)分析等識(shí)別疾病。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗癌藥”或“常用抗癌藥”意旨用于治療癌癥的任意化療化合物、放療或外科手術(shù)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“體外”意旨人工環(huán)境和發(fā)生在人工環(huán)境內(nèi)的過(guò)程或反應(yīng)。體外環(huán)境包括，但不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語(yǔ)″體內(nèi)″意旨天然環(huán)境(例如動(dòng)物或細(xì)胞)和發(fā)生在天然環(huán)境中的過(guò)程或反應(yīng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意旨任意的真核細(xì)胞或原核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、魚(yú)細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞)，無(wú)論是在體外還是在體內(nèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞培養(yǎng)物″意旨任意的體外細(xì)胞培養(yǎng)物。在該術(shù)語(yǔ)內(nèi)包括連續(xù)細(xì)胞系(例如含有無(wú)限增殖化表型)、初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物、有限細(xì)胞系(例如未-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)和任意其它維持在體外的細(xì)胞群，包括卵母細(xì)胞和胚。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物和方法中的“靶細(xì)胞”包括，意旨，但不限于淋巴樣細(xì)胞或癌細(xì)胞。淋巴樣細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞和粒細(xì)胞。粒細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞或獲自患者活檢的未培養(yǎng)的細(xì)胞。
癌細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、贅生細(xì)胞、惡性細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和超常增生細(xì)胞。贅生細(xì)胞可以為良性或惡性的。如果贅生細(xì)胞不侵入或轉(zhuǎn)移，那么它們是良性的。惡性細(xì)胞為能夠侵入和/或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。超常增生為組織或器官中的細(xì)胞病理性蓄積，但結(jié)構(gòu)或功能不會(huì)顯著改變。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的靶細(xì)胞表現(xiàn)出病理性生長(zhǎng)或增殖。本文所用的術(shù)語(yǔ)“病理性增殖或生長(zhǎng)的細(xì)胞”意旨不受通常正常生長(zhǎng)限制控制的動(dòng)物的局限化增殖細(xì)胞群。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“未-活化的靶細(xì)胞”意旨在G0期中的細(xì)胞或未施加刺激物的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“活化的靶淋巴樣細(xì)胞”意旨已經(jīng)用合適的刺激物處理而產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的的淋巴樣細(xì)胞或不處于G0期的淋巴樣細(xì)胞?；罨牧馨蜆蛹?xì)胞可以增殖，經(jīng)歷活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡或產(chǎn)生以細(xì)胞類(lèi)型(例如CD8+或CD4+)為特征的細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子和其它相關(guān)的膜結(jié)合蛋白中的一種或多種。它們還能夠識(shí)別和結(jié)合在其表面上展示出特定抗原且隨后使其釋放效應(yīng)分子的任意靶細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“活化的癌細(xì)胞”意旨已經(jīng)用合適的刺激物處理而產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌細(xì)胞?；罨陌┘?xì)胞可以處于也可以不處于G0期中。
活化劑為與靶細(xì)胞發(fā)生相互作用時(shí)產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的刺激物。活化刺激物的實(shí)例包括但不限于小分子、輻射能和結(jié)合細(xì)胞活化細(xì)胞表面受體的分子。由活化刺激物誘導(dǎo)的反應(yīng)的特征可能在于胞內(nèi)Ca2+、超氧化物或羥基水平改變；如激酶或磷酸酶這類(lèi)酶的活性；或細(xì)胞的能態(tài)。就癌細(xì)胞而言，活化劑還包括轉(zhuǎn)化的癌基因。
在一個(gè)方面中，所述的活化劑為結(jié)合細(xì)胞表面活化受體的任意活性劑。它們可以選自T細(xì)胞受體配體、B細(xì)胞活化因子(“BAFF”)、TNF、Fas配體(FasL)、CD40配體、增殖誘導(dǎo)配體(“APRIL”)、細(xì)胞因子、趨化因子、激素、氨基酸(例如谷氨酸)、類(lèi)固醇、B細(xì)胞受體配體、γ輻照、UV輻射、促進(jìn)細(xì)胞應(yīng)激的活性劑或條件或特異性識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞表面活化受體的抗體(例如抗-CD4，抗-CD8，抗-CD20，抗-TACI，抗-BCMA，抗-TNF受體、抗-CD40、抗-CD3、抗-CD28、抗-B220、抗-CD38和-CD19，和抗-CD21)組成的組。BCMA為B細(xì)胞成熟抗原受體且TACI為跨膜激活物和CAML相互作用劑。(Gross，A.等(2000)Laabi，Y.等(1992)和Madry，C.等(1998))?？贵w包括單克隆抗體或多克隆抗體或其混合物。
T細(xì)胞配體的實(shí)例包括但不限于結(jié)合MHC分子的肽、肽MHC復(fù)合物或識(shí)別T細(xì)胞受體的成分的抗體。
B細(xì)胞配體的實(shí)例包括但不限于結(jié)合或識(shí)別B細(xì)胞受體的成分的分子或抗體。
結(jié)合細(xì)胞表面活化受體的試劑的實(shí)例包括但不限于這些受體的天然配體或?qū)λ鼈冊(cè)黾拥目贵w(例如抗-CD20)。RITUXIN(Genentech，Inc.，San Francisco，CA)為商購(gòu)的抗-CD 20嵌合單克隆抗體。
促進(jìn)細(xì)胞應(yīng)激的活性劑或條件的實(shí)例包括加熱、輻射、氧化應(yīng)激或生長(zhǎng)因子停藥等。生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括但不限于血清、IL-2、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(“PDGF”)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”意旨足以影響有益或所需結(jié)果的化合物(例如苯二氮雜)用量。有效量可以在一次或多次給藥、施用或劑量中給予，并且不限于特定的制劑或給藥途徑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞死亡過(guò)程失調(diào)″意旨細(xì)胞通過(guò)壞死或編程性細(xì)胞死亡發(fā)生細(xì)胞死亡的能力中的任何異常(例如遺傳缺陷)。細(xì)胞死亡失調(diào)與各種疾病相關(guān)或由其誘導(dǎo)，包括，例如，自身免疫性疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、重癥肌無(wú)力、斯耶格倫綜合征等)、慢性炎癥疾病(例如牛皮癬、哮喘和克羅恩病)、過(guò)度增殖性疾病(例如腫瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤等)、病毒感染(例如皰疹、乳頭瘤、HIV)和其它諸如骨關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化這類(lèi)疾病。
應(yīng)注意當(dāng)失調(diào)由病毒感染誘導(dǎo)或與之相關(guān)時(shí)，可以在失調(diào)發(fā)生或被觀察到時(shí)檢測(cè)到病毒感染，也可能檢測(cè)不到。即病毒誘導(dǎo)的失調(diào)甚至可能在病毒感染癥狀消失后發(fā)生。
本文所用的″過(guò)度增殖性疾病″意旨動(dòng)物的局限化增殖細(xì)胞器群不受通常的正常生長(zhǎng)限制的控制。過(guò)度增殖性疾病的實(shí)例包括腫瘤、新生物、淋巴瘤等。如果新生物不發(fā)生侵害或轉(zhuǎn)移，那么認(rèn)為它為良性的，并且如果它發(fā)生其中任意一種情況，那么認(rèn)為它是惡性的。轉(zhuǎn)移細(xì)胞或組織意旨細(xì)胞可以侵害和破壞相鄰的身體結(jié)構(gòu)。超常增生為涉及組織或器官中的細(xì)胞數(shù)量增加，但結(jié)構(gòu)或功能沒(méi)有顯著改變的細(xì)胞增殖形式。組織變形是受控的細(xì)胞生長(zhǎng)形式，其中一種類(lèi)型的完全分化細(xì)胞代替了另一種類(lèi)型的分化細(xì)胞。組織變形可以在上皮或結(jié)締組織細(xì)胞中發(fā)生。典型的組織變形包括一定程度的病癥性組織轉(zhuǎn)化上皮。
活化的淋巴樣細(xì)胞的病理性生長(zhǎng)通常產(chǎn)生自身免疫性疾病或慢性炎癥疾病。本文所用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫性疾病”意旨生物體產(chǎn)生識(shí)別生物體自身分子、細(xì)胞或組織的抗體或免疫細(xì)胞的任意疾病。自身免疫性疾病的非限制性實(shí)例包括自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、貝格爾病或IgA腎病、口炎性腹瀉、慢性疲乏綜合征、克羅恩病、皮肌炎、纖維肌痛、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、扁平苔癬、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、牛皮癬、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、斯耶格倫綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、白癜風(fēng)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“慢性炎癥疾病”意旨生物體免疫細(xì)胞活化的疾病。這類(lèi)疾病的特征在于帶有病理性后遺癥的持久性炎癥應(yīng)答。這種狀態(tài)的特征在于單核細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞和小血管增殖、結(jié)締組織增加和組織破壞。慢性炎癥疾病的實(shí)例包括，但不限于克羅恩病、牛皮癬、慢性阻塞性肺病癥、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化和哮喘。自身免疫性疾病，諸如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡也可以導(dǎo)致慢性炎癥疾病。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“共同給予”意旨對(duì)受試者給予至少兩種活性劑(例如苯二氮雜類(lèi))或療法。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種活性劑/療法的共同給予是同時(shí)的。在其它實(shí)施方案中，在第二種活性劑/療法前給予第一種活性劑/療法。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所用的各種活性劑/療法的制劑和/或給藥途徑可以改變。共同給予的合適的劑量易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將活性劑/療法共同給予時(shí)，以低于適合于其單獨(dú)給予的劑量給予相應(yīng)的活性劑/療法。因此，共同給予尤其在活性劑/療法共同給予降低已知可能有害(例如毒性)活性劑的必需劑量的實(shí)施方案中是理想的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“毒性”意旨與給予毒物前的相同細(xì)胞或組織相比對(duì)細(xì)胞或組織的任何不良或有害作用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”意旨活性劑與惰性或活性載體的組合，使得該組合物尤其適合于在體內(nèi)、體內(nèi)或離體診斷或治療應(yīng)用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物上可接受的載體”意旨任意的標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，諸如磷酸緩沖鹽水溶液、水、乳劑(例如諸如油/水或水/油乳劑)和各種類(lèi)型的濕潤(rùn)劑。所述的組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。例如，載體、穩(wěn)定劑和佐劑(例如參見(jiàn)Martin，Remington′sPharmaceutical Sciences，15th Ed.，Mack Publ.Co.，Easton，PA )。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物上可接受的鹽”意旨本發(fā)明化合物的任意藥物上可接受的鹽(例如酸式鹽或堿式鹽)，它在對(duì)受試者給予時(shí)能夠提供本發(fā)明的化合物或其活性代謝物或殘留物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本發(fā)明化合物的“鹽”可以來(lái)源于無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和堿。酸的實(shí)例包括，但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來(lái)酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯-對(duì)-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，諸如草酸可以用于制備用作獲得本發(fā)明化合物及其藥物上可接受的酸加成的鹽的中間體的鹽。
堿的實(shí)例包括，但不限于堿金屬(例如鈉)氫氧化物、堿土金屬(例如鎂)、氫氧化物、氨和式NW4+的化合物，其中W為C1-4烷基等。
鹽的實(shí)例包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(flucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過(guò)硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽等。鹽的其它實(shí)例包括與合適的陽(yáng)離子，諸如Na+、NH4+和NW4+(其中W為C1-4烷基)等化合的本發(fā)明化合物的陰離子。
就治療應(yīng)用而言，關(guān)注作為藥物上可接受的本發(fā)明化合物的鹽。然而，例如，非藥物上可接受的酸和堿的鹽也可以應(yīng)用于制備或純化藥物上可接受的化合物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″固相支持體(solid phase supports)″或″固相支持體(solid supports)″以其最廣泛的含義使用，意旨可利用并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多支持體。固相支持體包括但不限于硅膠、樹(shù)脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉織品、塑料珠、氧化鋁凝膠等。本文所用的″固相支持體″還包括合成的抗原呈遞基質(zhì)、細(xì)胞、脂質(zhì)體等。合適的固相支持體可以基于所需的組織應(yīng)用和用于各種方案的適合性來(lái)選擇。例如，為了進(jìn)行肽合成，固相支持體可以意旨樹(shù)脂，諸如聚苯乙烯(例如獲自Bachem，Inc.，Peninsula Laboratories的PAM-樹(shù)脂等)、POLYHIPE)樹(shù)脂(獲自氨基tech，Canada)、聚酰胺樹(shù)脂(獲自Peninsula Laboratories)、與聚乙二醇接枝的聚苯乙烯樹(shù)脂(TENTAGEL，Rapp Polymere，Tubingen，Germany)或聚二甲基丙烯酰胺樹(shù)脂(獲自Milligen/Biosearch，California)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“病原體”意旨使宿主產(chǎn)生疾病狀態(tài)的生物病原體(例如感染、癌癥等)?！安≡w”包括但不限于病毒、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、支原體、阮病毒和寄生生物體。
術(shù)語(yǔ)″細(xì)菌(bacteria)″和″細(xì)菌(bacterium)″意旨所有的原核生物，包括那些所有Kingdom Procaryotae門(mén)中的生物。指定術(shù)語(yǔ)包括認(rèn)為是細(xì)菌的所有微生物，包括支原體屬(Mycoplasma)、衣原體屬(Chlamydia)、放線菌屬(Actinomyces)、鏈霉菌屬(Streptomyce)和立克次氏體屬(Rickettsia)。所有形式的細(xì)菌均包括在該定義內(nèi)，包括球菌、桿菌、螺旋菌、原生質(zhì)球、原生質(zhì)體等。在該術(shù)語(yǔ)中還包括為革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性的原核生物。″革蘭氏陰性″和″革蘭氏陽(yáng)性″意旨使用本領(lǐng)域眾所周知的革蘭氏染色法的染色模式(例如參見(jiàn)Finegold和Martin，Diagnostic Microbiology，6th Ed.，CV MosbySt.Louis，pp.13-15 )。″革蘭氏陽(yáng)性菌″為保留在用于革蘭氏染色的原染料的細(xì)菌，導(dǎo)致染色的細(xì)胞在顯微鏡下表現(xiàn)出深藍(lán)色至紫色?！甯锾m氏陰性菌″不保留用于革蘭氏染色中的原染料，但被復(fù)染劑染色。因此，革蘭氏陰性菌看起來(lái)為紅色的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″微生物″意旨任意種類(lèi)或類(lèi)型的微生物，包括但不限于細(xì)菌、古細(xì)菌(archaea)、真菌、原生動(dòng)物、支原體和寄生蟲(chóng)生物體。本發(fā)明關(guān)注其中包括的大量微生物對(duì)受試者而言也是致病性的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“真菌”用以指真核生物，諸如霉菌和酵母，包括雙態(tài)性真菌。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″病毒″意旨微小的病原體，其中除某些外，均不可能通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查觀察到，它們?nèi)狈Κ?dú)立的代謝并且僅能夠在活的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。各顆粒(即病毒體)一般由核酸和蛋白質(zhì)外鞘或外殼組成；某些病毒體還具有含脂質(zhì)的膜。術(shù)語(yǔ)″病毒″包括所有類(lèi)型的病毒，包括動(dòng)物、植物、噬菌體和其它病毒。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“樣品”以其最廣泛的含義使用。疑似表現(xiàn)出特征在于細(xì)胞凋亡功能失調(diào)的情況的樣品可以包括細(xì)胞、組織或流體、分離自細(xì)胞的染色體(例如展開(kāi)的中期染色體)、基因組DNA(在溶液中或與固相支持體結(jié)合，諸如對(duì)DNA印跡分析而言)、RNA(在溶液中或與固相支持體結(jié)合，諸如對(duì)RNA印跡分析而言)、cDNA(在溶液中或與固相支持體結(jié)合)等。疑似含有蛋白質(zhì)的樣品可以包括細(xì)胞、組織的部分、含有一種或多種蛋白質(zhì)的提取物等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″純化的″或″用于純化″意旨從樣品中除去不需要的成分。本文所用的術(shù)語(yǔ)″基本上純化的″意旨其中至少60％不含，優(yōu)選至少75％不含且最優(yōu)選至少90％或90％以上不含通常結(jié)合的其它成分的分子。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″抗原結(jié)合蛋白″意旨結(jié)合特異性抗原的蛋白質(zhì)?！蹇乖Y(jié)合蛋白″包括但不限于免疫球蛋白，包括多克隆、單克隆、嵌合、單鏈和人源化抗體；Fab片段、F(ab′)2片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。本領(lǐng)域中公知的各種操作步驟用于生產(chǎn)多克隆抗體。微量生產(chǎn)抗體，可以通過(guò)注射相當(dāng)于所需表位的肽給各種宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的肽與免疫原性載體(例如白喉類(lèi)毒素、牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白[KLH])綴合。各種佐劑用于增加免疫應(yīng)答，這取決于宿主的種類(lèi)，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑；礦物凝膠，諸如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，諸如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇類(lèi)、聚陰離子、肽類(lèi)、油乳劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚；和可能有用的人佐劑，諸如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。
為了制備單克隆抗體，可以使用通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系提供生產(chǎn)抗體分子的任意技術(shù)(例如，參見(jiàn)Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)。這些技術(shù)包括但不限于最初由Khler和Milstein研發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Khler和Milstein，Nature，256495-497 )以及三源雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤接受(例如，參見(jiàn)Kozbor等，Immunol.Today，472 )和用于生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，在Monoclonal Antibodies andCancer Therapy中，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96 )。
按照本發(fā)明，為生產(chǎn)單鏈抗體描述的技術(shù)(US4,946,778；引入本文作為參考)可以適用于生產(chǎn)所需的特異性單鏈抗體。本發(fā)明的一個(gè)額外的實(shí)施方案使用了本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，Science，2461275-1281 )，以便快速和便利地鑒定具有所需的特異性的單克隆Fab片段。
可以通過(guò)公知技術(shù)產(chǎn)生含有抗體分子的獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段。例如，這類(lèi)片段包括但不限于可以通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab′)2片段；可以通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab′片段；和可以通過(guò)用木瓜酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法分離編碼抗原結(jié)合蛋白的基因。在生產(chǎn)抗體的過(guò)程中，可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的技術(shù)對(duì)所需抗體進(jìn)行篩選(例如放射性免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、″夾心式″免疫測(cè)定、免疫放射測(cè)定、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、原位免疫測(cè)定(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)斑跡法、沉淀反應(yīng)、凝集試驗(yàn)(例如凝膠聚集試驗(yàn)、血細(xì)胞凝集試驗(yàn)等)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光測(cè)定、蛋白質(zhì)A測(cè)定和免疫電泳試驗(yàn)等)等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″免疫球蛋白″或″抗體″意旨結(jié)合特異性抗原的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合和人源化抗體、Fab片段、F(ab′)2片段且包括如下類(lèi)的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IbE和分泌型免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白一般包括兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。然而，術(shù)語(yǔ)″抗體″和″免疫球蛋白″還包括單鏈抗體和雙鏈抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″表位″意旨接觸特定免疫球蛋白的抗原部分。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于免疫接種宿主動(dòng)物時(shí)，該蛋白質(zhì)的大量區(qū)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，這些抗體特異性結(jié)合蛋白質(zhì)上指定的區(qū)域或三維結(jié)構(gòu)；這些區(qū)或結(jié)構(gòu)稱(chēng)作″抗原決定簇″?？乖瓫Q定簇可以與完整抗原(即″免疫原″用于引起免疫應(yīng)答)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。
術(shù)語(yǔ)″特異性結(jié)合(specific binding)″或″特異性結(jié)合(specifically binding)″在用于涉及抗體和蛋白質(zhì)或肽的相互作用時(shí)意旨這種相互作用依賴(lài)于蛋白質(zhì)上存在的特定結(jié)構(gòu)(即抗原決定簇或表位)；換句話說(shuō)，抗體一般識(shí)別和結(jié)合特異性結(jié)構(gòu)而非蛋白質(zhì)。例如，如果抗體對(duì)表位″A″具有特異性，那么在含有標(biāo)記的″A″和抗體的反應(yīng)體系中存在含有表位A(或游離的未標(biāo)記的A)的蛋白質(zhì)會(huì)減少與抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″非特異性結(jié)合″和″背景結(jié)合″在用于涉及抗體和蛋白質(zhì)或肽的相互作用時(shí)意旨不依賴(lài)于存在的特定結(jié)構(gòu)的相互作用(即抗體一般結(jié)合非諸如表位這類(lèi)特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì))。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”意旨化合物(例如苯二氮雜?；衔?影響(例如促進(jìn)或延緩)細(xì)胞功能的方面，包括但不限于細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、編程性細(xì)胞死亡等的活性。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合”用于涉及第一種分子(例如第一種苯二氮雜衍生物)具有與第二種分子(例如第二種苯二氮雜衍生物或結(jié)合在線粒體ATP合酶中的寡霉素敏感性賦予蛋白的另一種分子等)結(jié)合相同底物(例如在線粒體ATP合酶中的寡霉素敏感性賦予蛋白)的活性。第一種分子的結(jié)合功效(例如動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué))可以與結(jié)合第二種分子的底物的功效相同或大于或小于其功效。例如，結(jié)合底物的平衡結(jié)合常數(shù)(KD)對(duì)兩種分子而言可以不同。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″將所述化合物給予受試者的技術(shù)說(shuō)明”及其語(yǔ)法上等同的含義包括使用包含在試劑盒中的組合物治療特征在于細(xì)胞或組織中細(xì)胞凋亡過(guò)程失調(diào)的疾病的技術(shù)說(shuō)明(例如提供給藥、給藥途徑、臨床醫(yī)師建立患者的特異性特征與治療作用過(guò)程之間的相關(guān)性的治療決策樹(shù))。該術(shù)語(yǔ)還特別意旨使用包含在試劑盒中的組合物治療如下疾病的技術(shù)說(shuō)明自身免疫性疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、重癥肌無(wú)力、斯耶格倫綜合征等)、慢性炎癥疾病(例如牛皮癬、哮喘和克羅恩病)、過(guò)度增殖性疾病(例如腫瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤等)、病毒感染(例如皰疹病毒、乳頭瘤病毒、HIV)和其它疾病，諸如骨關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化等。
術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”意旨可以用于治療或預(yù)防疾病、病、病癥或身體功能紊亂，否則就是改變樣品的生理或細(xì)胞狀態(tài)(例如細(xì)胞或組織中編程性細(xì)胞死亡失調(diào)水平)。測(cè)試化合物既包括已知的化合物，又包括潛在的治療化合物。可以通過(guò)使用本發(fā)明的篩選方法確定測(cè)試化合物為治療性的?！耙阎闹委熁衔铩币庵家呀?jīng)證實(shí)(例如通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)或?qū)θ私o藥的預(yù)實(shí)驗(yàn))在這類(lèi)治療或預(yù)防中為有效的治療化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“測(cè)試化合物”為調(diào)節(jié)細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的活性劑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“第三團(tuán)體”意旨從事關(guān)注測(cè)試化合物的銷(xiāo)售、入庫(kù)、分配或通過(guò)出售的任何實(shí)體，使用該化合物給藥可以治療特征在于細(xì)胞凋亡過(guò)程失調(diào)的疾病。
本發(fā)明的一般性描述作為一類(lèi)藥物，苯二氮雜類(lèi)化合物已經(jīng)得到廣泛研究并且報(bào)導(dǎo)為治療許多疾病的有效藥物。例如，US 4,076823、4,110,337、4,495,101、4,751,223和5,776,946報(bào)導(dǎo)某些苯二氮雜類(lèi)化合物作為止痛藥和抗炎藥是有效的，將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考。類(lèi)似地，US 5,324,726和US 5,597,915報(bào)導(dǎo)某些苯二氮雜類(lèi)化合物為縮膽囊肽和胃泌素的拮抗劑且由此可以用于治療某些胃腸道病癥，將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考。
已經(jīng)將其它苯二氮雜類(lèi)化合物研究為治療人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶-介導(dǎo)的疾病中的人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，所述的人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶介導(dǎo)的疾病諸如心肌缺血、膿毒性休克綜合征等(例如參見(jiàn)US 5,861,380，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。US5,041,438中報(bào)導(dǎo)了某些苯二氮雜類(lèi)化合物用作抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
盡管已經(jīng)描述了對(duì)苯二氮雜類(lèi)化合物的關(guān)注，但是從下文的描述中顯而易見(jiàn)，本發(fā)明提供了新的苯二氮雜類(lèi)化合物和相關(guān)化合物和使用新化合物以及已知化合物治療各種疾病的方法。
已知苯二氮雜類(lèi)化合物結(jié)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的苯二氮雜受體且由此用于治療各種CNS病癥，包括焦慮和癲癇。還鑒定了外周苯二氮雜受體，這些受體有時(shí)也存在于CNS中。本發(fā)明證實(shí)苯二氮雜類(lèi)和相關(guān)化合物具有可用于治療組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞凋亡前和細(xì)胞毒性特性。這些化合物的作用途徑并非通過(guò)上述鑒定的苯二氮雜受體。
在本發(fā)明研發(fā)過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)鑒定了苯二氮雜類(lèi)化合物和相關(guān)化合物(其中的某些涉及其結(jié)合細(xì)胞靶分子的能力而非其與所有苯二氮雜類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的同系性)的新生物靶標(biāo)。特別地，本發(fā)明提供了直接或間接與特定線粒體蛋白發(fā)生相互作用以引起所需生物作用的化合物。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了定向于新的細(xì)胞靶標(biāo)以獲得所需生物效果的大量新化合物和上述已知的化合物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用這類(lèi)化合物調(diào)節(jié)生物過(guò)程的方法。本發(fā)明還提供了鑒定和優(yōu)化化合物的藥物-篩選方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定疾病和病癥、用于監(jiān)測(cè)治療方案和/或用于鑒定最優(yōu)化治療作用過(guò)程的診斷標(biāo)記。這些和其它研究和治療應(yīng)用如下所述。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的化學(xué)化合物、其發(fā)現(xiàn)方法及其治療應(yīng)用。特別地，本發(fā)明提供了苯二氮雜類(lèi)衍生物和相關(guān)化合物以及使用苯二氮雜類(lèi)衍生物和相關(guān)化合物作為治療許多疾病的治療劑的方法，所述的疾病與程序性細(xì)胞死亡、自身免疫性炎癥和過(guò)度增殖等過(guò)程的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)有關(guān)。
本發(fā)明的典型組合物和方法更具體地描述在如下部分中I.細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑；II.細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖調(diào)節(jié)劑；III.處理細(xì)胞的表達(dá)分析；IV.典型化合物；V.藥物組合物、制劑和典型給藥途徑和給藥方案；VI.藥物篩選；和VII.治療應(yīng)用。
除非另有陳述，否則本發(fā)明的實(shí)踐使用常規(guī)的有機(jī)化學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的技術(shù)，這些技術(shù)均屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)。這類(lèi)技術(shù)完整地解釋在文獻(xiàn)中，諸如“Molecular cloninga laboratory manual”SecondEdition(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide synthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal cell culture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“Methods in enzymology”系列(Academic Press，Inc.)；“Handbook of experimental immunology”(D.M.Weir & C.C.Blackwell，eds.)；“Gene transfer vectors for mammalian cells”(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；“Current protocols inmolecular biology”(F.M.Ausubel等，eds.，1987和最新期刊)“PCRthe polymerase chain reaction”(Mullis等，eds.，1994)；和“Current protocols in immunology”(J.E.Coligan等，eds.，1991)，將它們各自完整地引入本文作為參考。
I.細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)使細(xì)胞接觸化合物調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡。可以通過(guò)檢測(cè)任何數(shù)量的細(xì)胞改變來(lái)測(cè)定化合物的作用。如本文和本領(lǐng)域中所述檢測(cè)細(xì)胞死亡。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件下(例如氣體(CO2)、溫度和培養(yǎng)基)將細(xì)胞系維持適當(dāng)?shù)臅r(shí)間期限以便在沒(méi)有密度依賴(lài)性約束下獲得指數(shù)增殖。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如錐蟲(chóng)藍(lán)排除/血細(xì)胞計(jì)數(shù)或MTT染料轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和或存活率。或者，分析細(xì)胞的與編程性細(xì)胞死亡或壞死異常相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使本發(fā)明接觸細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明多種細(xì)胞ROS水平(例如O2-)開(kāi)始增加。在額外的實(shí)施方案中，使本發(fā)明的化合物接觸細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞O2-水平增加。仍然在額外的實(shí)施方案中，可以使用與O2-發(fā)生特異性反應(yīng)的氧化還原敏感性試劑(例如dihyroethedium(DHE))檢測(cè)到因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞O2-水平增加。
在其它實(shí)施方案中，因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞O2-水平增加在一定時(shí)間期限(例如10分鐘)后下降。在其它實(shí)施方案中，因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞O2-水平增加在一定時(shí)間期限后下降并且在隨后再次增加(例如10小時(shí))。在額外的實(shí)施方案中，因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞O2-水平增加在1小時(shí)時(shí)下降并且在4小時(shí)后再次增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞O2-水平早期增加，隨后細(xì)胞O2-水平下降，隨后細(xì)胞O2-水平再次增加因不同的細(xì)胞過(guò)程所致(例如雙模態(tài)細(xì)胞機(jī)制)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致細(xì)胞線粒體Δψm塌落(collapse)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用線粒體選擇性電位測(cè)定探針(例如DiOC6)檢測(cè)到因本發(fā)明導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體Δψm的塌落。在額外的實(shí)施方案中，因本發(fā)明導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體Δψm的塌落在細(xì)胞O2-水平開(kāi)始增加后出現(xiàn)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明能夠使胱天蛋白酶(caspace)活化。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體中釋放。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明改變了細(xì)胞色素c水平。在其它實(shí)施方案中，可以使用免疫印跡胞質(zhì)級(jí)分檢測(cè)到因本發(fā)明導(dǎo)致的cystolic細(xì)胞色素c水平改變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在一定時(shí)間期限(例如10小時(shí))后檢測(cè)到因本發(fā)明導(dǎo)致的胞質(zhì)細(xì)胞色素c水平下降。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在5小時(shí)后檢測(cè)到因本發(fā)明導(dǎo)致的胞質(zhì)細(xì)胞色素c水平下降。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致線粒體PT孔開(kāi)放。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，因本發(fā)明導(dǎo)致的細(xì)胞色素c的細(xì)胞釋放與線粒體Δψm塌落一致。仍然是在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致線粒體Δψm塌落和細(xì)胞色素c釋放后細(xì)胞O2-水平增加。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，因本發(fā)明導(dǎo)致的線粒體Δψm塌落和細(xì)胞色素c釋放造成細(xì)胞O2-水平升高。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致細(xì)胞胱天蛋白酶活化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用泛-胱天蛋白酶敏感性熒光底物(例如FAM-VAD-fmk)測(cè)定因本發(fā)明導(dǎo)致的胱天蛋白酶活化。仍然是在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，因本發(fā)明導(dǎo)致的細(xì)胞胱天蛋白酶活化可追蹤線粒體Δψm塌落。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明導(dǎo)致亞二倍體DNA出現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，因本發(fā)明的導(dǎo)致的亞二倍體DNA的出現(xiàn)因胱天蛋白酶活化而稍稍延緩。
在某些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分子靶標(biāo)在線粒體內(nèi)。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子靶標(biāo)包括線粒體ATPase。細(xì)胞ROS的主要來(lái)源包括氧化還原酶和線粒體呼吸鏈(下文的MRC)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞色素C氧化酶(MRC的IV復(fù)合物)抑制劑(例如NaN3)阻礙了本發(fā)明細(xì)胞ROS水平的依賴(lài)性增加。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，MRC復(fù)合物III抑制劑(例如FK506)的泛醇-細(xì)胞色素C還原酶成分阻礙了本發(fā)明ROS水平的依賴(lài)性增加。
在某些實(shí)施方案中，因本發(fā)明化合物導(dǎo)致的細(xì)胞ROS水平增加是由于本發(fā)明化合物與線粒體內(nèi)的靶標(biāo)結(jié)合所致。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物將2′，7′-二氯二氫熒光素(下文的DCF)二乙酸鹽氧化成DCF。DCF為能夠產(chǎn)生ROS的氧化還原-活性種類(lèi)。在額外的實(shí)施方案中，因本發(fā)明導(dǎo)致的DCF生成速率(rate of production)在遲滯期后增加。
抗霉素A通過(guò)抑制泛醇-細(xì)胞色素C還原酶產(chǎn)生O2-。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明以與抗霉素A等同的方式增加了ROS產(chǎn)率。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明以與抗霉素A等同的方式在支持狀態(tài)3呼吸的需氧條件下增加了ROS產(chǎn)率。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物并不直接靶向MPT孔。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物并不在亞細(xì)胞S15級(jí)分(例如胞質(zhì)溶膠；微粒體)中產(chǎn)生大量ROS。甚至在額外的實(shí)施方案中，如果線粒體處于狀態(tài)4呼吸中，那么本發(fā)明的化合物不會(huì)刺激ROS。
MRC復(fù)合物I-III為線粒體內(nèi)ROS的主要來(lái)源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，因依賴(lài)于本發(fā)明導(dǎo)致的細(xì)胞ROS水平增加來(lái)源于這些復(fù)合物作為抑制線粒體F1F0-ATPase的結(jié)果。實(shí)際上，仍然是在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明抑制了牛亞線粒體顆粒(下文的SMPs)的線粒體ATPase活性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物結(jié)合線粒體F1F0-ATPase的OSCP成分。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有如下結(jié)構(gòu)或其藥物上可接受的鹽、前體藥物或衍生物 或其對(duì)映體，其中R1為脂族基團(tuán)或芳基；R2為脂族基團(tuán)、芳基、-NH2、-HC(＝O)-R5或參與氫鍵形成的部分，其中R5為芳基、雜環(huán)、-R6-NH-C(＝O)-R7或-R6-C(＝O)-NH-R7，其中R6為1-6個(gè)碳的脂族連接基且R7為脂族基團(tuán)、芳基或雜環(huán)；且R3和R4各自獨(dú)立為氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、芳基或雜芳基。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果R3為羥基，那么含有R3的環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)額外的位置包括防止羥基在體內(nèi)發(fā)生代謝的化學(xué)基團(tuán)(例如烷基鏈)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以在C’4位和芳族環(huán)上帶有羥基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物導(dǎo)致細(xì)胞ROS水平增加作為C’4位和芳族環(huán)上帶有羥基的結(jié)果。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中的功效與使用SMPs的ATPase抑制實(shí)驗(yàn)相關(guān)。實(shí)際上，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與并不顯著抑制線粒體ATPase活性的一般苯二氮雜類(lèi)和PBR配體(例如PK11195和4-氯地西泮)的細(xì)胞毒性(80μM)濃度相比，本發(fā)明顯著抑制了線粒體ATPase活性。照此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子靶標(biāo)位線粒ATPase。寡霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯天然產(chǎn)物，它結(jié)合線粒體F1F0-ATPase，誘導(dǎo)狀態(tài)3-4的過(guò)渡并且作為結(jié)果產(chǎn)生ROS(例如O2-)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物結(jié)合線粒體F1F0-ATPase的OSCP成分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物結(jié)合OSCP與線粒體F1F0-ATPase的F1亞單位之間的接頭。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物結(jié)合F1亞單位。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的篩選試驗(yàn)允許檢測(cè)OSCP、F1或OSCP/F1接頭的結(jié)合配偶體。OSCP實(shí)質(zhì)上位熒光蛋白。在某些實(shí)施方案中，逐步將本發(fā)明的測(cè)試化合物滴入超表達(dá)OSCP的大腸桿菌(E.Coli)樣品導(dǎo)致內(nèi)在OSCP熒光猝滅。在其它實(shí)施方案中，可以在直接結(jié)合試驗(yàn)中使用熒光或放射性測(cè)試化合物。在其它實(shí)施方案中，可以進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在這類(lèi)試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)測(cè)試化合物與Bz-423競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合例如OSCP的能力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物通過(guò)調(diào)節(jié)OSCP基因(例如改變OSCP基因的表達(dá))導(dǎo)致增加的細(xì)胞ROS水平下降和細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡減少。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)改變ATPase發(fā)動(dòng)蛋白的分子運(yùn)動(dòng)起作用。
II.細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和方法導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和方法導(dǎo)致細(xì)胞增殖和編程性細(xì)胞死亡減少。例如，在本發(fā)明研發(fā)過(guò)程中進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的化合物和方法在延長(zhǎng)的培養(yǎng)期(例如3天)后防止了細(xì)胞生長(zhǎng)。
III.處理細(xì)胞的表達(dá)分析在本發(fā)明的研發(fā)過(guò)程中，生成表達(dá)模式以便鑒定在處理和未處理細(xì)胞中差別表達(dá)的那些基因。該模式提供了本發(fā)明化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)指紋。這種指紋鑒定了作為對(duì)本發(fā)明反應(yīng)的增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)的基因并且鑒定這類(lèi)基因?yàn)樗幬锖Y選和檢測(cè)化合物治療作用的診斷標(biāo)記。這些基因還提供了調(diào)節(jié)用靶標(biāo)以便模擬本發(fā)明化合物的作用。將來(lái)自對(duì)在有Bz-423存在下增量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4A中。將來(lái)自對(duì)在有Bz-423存在下減量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4B中。將來(lái)自對(duì)在有Bz-OMe存在下增量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4C中。將來(lái)自對(duì)在有Bz-OMe存在下減量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)分析的數(shù)據(jù)列在附圖4D中。
例如，對(duì)表達(dá)模式的分析提供了作為新治療劑的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶蛋白1(OAZ1)。OAZ1為控制合成和將聚胺類(lèi)，包括腐胺、精脒和精胺轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)蛋白。細(xì)胞中聚胺類(lèi)的合成包括幾個(gè)酶促步驟，不過(guò)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶為主要調(diào)節(jié)該過(guò)程的酶。通過(guò)抑制位于質(zhì)膜中的聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且通過(guò)靶向蛋白水解降解的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，OAZ1降低了細(xì)胞中的聚胺水平。聚胺類(lèi)為細(xì)胞存活和生長(zhǎng)必需的。聚胺類(lèi)的異常蓄積促使腫瘤誘導(dǎo)、癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。聚胺生物合成抑制劑，并且特別是鑒定為二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)的一種分子在臨床試驗(yàn)中用于證實(shí)其抗癌和治療潛能。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在使用本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞中，OAZ1被誘導(dǎo)至高于對(duì)照組細(xì)胞中水平16-倍的水平。本發(fā)明關(guān)注直接或間接誘導(dǎo)OAZ1水平的任意方法(例如用本發(fā)明化合物、基因療法等處理)。
OAZ1為聚胺代謝的重要調(diào)節(jié)劑并且通過(guò)作為鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)抑制劑起作用發(fā)揮降低聚胺水平的功能，其中鳥(niǎo)氨酸脫羧酶控制聚胺生物合成中的限速步驟。在使用抗酶蛋白抑制后，靶向ODC以便蛋白體降解。聚胺類(lèi)與細(xì)胞穩(wěn)定性緊密相關(guān)并且是細(xì)胞增殖所需的。抑制聚胺合成可抑制增殖。照此，仍然是在額外的實(shí)施方案中，使ODC表達(dá)或活性降低(例如使用siRNA、反義寡核苷酸、基因療法、已知或隨后降低的抑制劑、本發(fā)明的化合物等)以便引起所需的生物作用。
抗酶蛋白1表達(dá)以轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平得到調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)這種基因產(chǎn)物中起特別重要的作用，并且通過(guò)依賴(lài)于聚胺類(lèi)(polymanes)(通過(guò)負(fù)反饋袢)或另一種精氨酸代謝物精胺的獨(dú)特翻譯移碼發(fā)生?？梢酝ㄟ^(guò)使用3H-鳥(niǎo)氨酸對(duì)鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化成腐胺進(jìn)行定量來(lái)獲得ODC活性水平。在某些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的化合物處理細(xì)胞劑量依賴(lài)性方式顯著降低了ODC活性。仍然是在額外的實(shí)施方案中，與ODC活性降低平行發(fā)生的是在類(lèi)似條件下測(cè)定的ODC蛋白水平下降。預(yù)先與MnTBAP一起孵育的細(xì)胞降低了ROS水平。在某些實(shí)施方案中，預(yù)先與接觸本發(fā)明化合物的MnTBAP一起孵育的細(xì)胞展示出逆轉(zhuǎn)的ODC抑制。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用高水平(例如＞10μM)本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞產(chǎn)生大量無(wú)法被細(xì)胞抗氧化劑解毒的ROS，并且導(dǎo)致短期內(nèi)(例如18小時(shí))的編程性細(xì)胞死亡。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用低水平(例如＜10μM)的本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞誘導(dǎo)減少的ROS反應(yīng)，這種反應(yīng)不足以引起編程性細(xì)胞死亡，但能夠抑制ODC，否則阻斷細(xì)胞增殖。在其它實(shí)施方案中，酚羥基被Cl或OCH3取代的本發(fā)明化合物衍生物具有最低的細(xì)胞毒性，在細(xì)胞中產(chǎn)生少量ROS反應(yīng)，與OSCP結(jié)合的較不緊密并且抑制ODC活性。在其它實(shí)施方案中，用酚羥基被Cl取代的本發(fā)明化合物衍生物處理的細(xì)胞展示出的增殖下降程度與未修飾的化合物類(lèi)似。照此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用阻斷增殖而不誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的本發(fā)明化合物的化學(xué)衍生物獲得抗增殖作用。
作為對(duì)抗原或促有絲分裂刺激的反應(yīng)，淋巴細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)介導(dǎo)體，其中之一稱(chēng)作具有防止體外巨噬細(xì)胞遷移的能力的移動(dòng)抑制因子(MIF)。MIF可以為抗-腫瘤劑。此外，利用MIF預(yù)防巨噬細(xì)胞遷移的能力來(lái)處理傷口。MIF可以改變對(duì)不同抗原的免疫應(yīng)答。MIF結(jié)合活性和免疫解毒系統(tǒng)。MIF被Bz-423誘導(dǎo)了約10-倍。因此，本發(fā)明關(guān)注MIF作為本發(fā)明化合物靶標(biāo)的應(yīng)用。
抑制蛋白(Prolifin)在用本發(fā)明處理的細(xì)胞中以高水平被誘導(dǎo)。抑制蛋白結(jié)合肌動(dòng)蛋白單體并且于幾種蛋白質(zhì)和磷酸肌醇發(fā)生相互作用，從而使信號(hào)傳導(dǎo)途徑與細(xì)胞骨架連接。抑制蛋白可以分離肌動(dòng)蛋白單體，增加肌動(dòng)蛋白上ATP交換ADP，并且增加肌動(dòng)蛋白絲更新率。在幾種不同的腫瘤發(fā)生癌細(xì)胞系與非致瘤性細(xì)胞系之間的比較證實(shí)了在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)性較低的抑制蛋白1水平。將抑制蛋白1cDNA轉(zhuǎn)染入CAL51乳腺癌細(xì)胞升高了抑制蛋白1水平，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著性作用并且抑制裸鼠中超表達(dá)細(xì)胞克隆的致腫瘤性。因此，誘導(dǎo)抑制蛋白1(例如用本發(fā)明的化合物或額外的化合物)可以抑制癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。
干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF-4)在用本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞中以高于正常水平被誘導(dǎo)。IRF-4為在成熟淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能中起主要作用的I RF轉(zhuǎn)錄因子的淋巴樣/骨髓樣-受限成員。IRF-4表達(dá)在靜止初級(jí)T細(xì)胞中得到調(diào)節(jié)并且在用刺激物活化，諸如TCR交聯(lián)或用佛波醇酯和鈣離子載體(PMA/伊屋諾霉素)處理后以mRNA和蛋白質(zhì)水平被短暫誘導(dǎo)。IRF-4在Jurkat細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)導(dǎo)致白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10和IL-13合成中的顯著促進(jìn)。IRF-4代表了控制T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特征性細(xì)胞因子陣列的淋巴樣特異性成分之一。在埃布爾森-轉(zhuǎn)化的前-B細(xì)胞系中，IRF-4的表達(dá)促進(jìn)足以誘導(dǎo)種系Igk轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明化合物誘導(dǎo)IRF-4的作用可以解釋為其對(duì)B和T細(xì)胞顯性過(guò)程中自身免疫疾病的影響及其影響腫瘤B細(xì)胞克隆存活的能力。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞死亡-調(diào)節(jié)蛋白GRIM19在用本發(fā)明化合物處理的細(xì)胞中以高于正常水平被誘導(dǎo)。已知干擾素(IFN)途徑在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的重要性。研究證實(shí)IFN與全反式維甲酸的組合對(duì)體外和體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制比單獨(dú)的活性劑更為有效。通過(guò)反義剔除手段鑒定在IFN/RA-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起作用的特異性基因并且稱(chēng)作GRIM基因。GRIM19為不包括在任意已知死亡基因類(lèi)型中的新細(xì)胞死亡-關(guān)連基因。這種基因編碼局限于核中的144-aa蛋白質(zhì)。GRIM19的超表達(dá)促進(jìn)了胱天蛋白酶-9活性和對(duì)IFN/RA處理反應(yīng)的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。GRIM19位于對(duì)前列腺腫瘤抑制而言必需的人染色體的19p13.2區(qū)域中，從而表明該蛋白質(zhì)可以為新的腫瘤阻抑蛋白。本發(fā)明化合物誘導(dǎo)GRIM19可以產(chǎn)生抗-腫瘤作用。
IV.典型化合物如下提供了本發(fā)明的典型化合物或其藥物上可接受的鹽、前體藥物或衍生物 或其對(duì)映體，其中R1為脂族基團(tuán)或芳基；R2為脂族基團(tuán)、芳基、-NH2、-HC(＝O)-R5或參與氫鍵形成的部分，其中R5為芳基、雜環(huán)、-R6-NH-C(＝O)-R7或-R6-C(＝O)-NH-R7，其中R6為1-6個(gè)碳的脂族連接基且R7為脂族基團(tuán)、芳基或雜環(huán)；且R3和R4各自獨(dú)立為氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、芳基或雜芳基。
在上述結(jié)構(gòu)中，R1為1-20個(gè)碳和1-20個(gè)氫的烴基。優(yōu)選R1帶有1-15個(gè)碳，且更優(yōu)選帶有1-12個(gè)碳。優(yōu)選R1帶有1-12個(gè)氫，且更優(yōu)選1-10個(gè)氫。因此，R1可以為脂族基團(tuán)或芳基。
術(shù)語(yǔ)″脂族基團(tuán)″代表通常稱(chēng)作烷基、鏈烯基、炔基、脂環(huán)基的基團(tuán)。本文所用的術(shù)語(yǔ)″芳基″代表諸如苯環(huán)這類(lèi)單芳族環(huán)或彼此連接(例如聯(lián)苯基)或彼此稠合(例如萘或蒽)的兩個(gè)或多個(gè)芳族環(huán)。芳基可以任選被低級(jí)脂族基團(tuán)(例如C1-C4烷基、鏈烯基、炔基或C3-C6脂環(huán)基)取代。另外，脂族基團(tuán)和芳基可以進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)官能基取代，諸如-NH2、-NHCOCH3、-OH、低級(jí)烷氧基(C1-C4)、鹵素(-F、-Cl、-Br或-I)。優(yōu)選R1主要為非極性部分。
在上述結(jié)構(gòu)中，R2可以為脂族基團(tuán)、芳基、-NH2、-NHC(＝O)-R5或參與氫鍵形成的部分，其中R5為芳基、雜環(huán)、R6-NH-C(＝O)-R7或-R6-C(＝O)-NH-R7，其中R6為1-6個(gè)碳的脂族連接基且R7為脂族基團(tuán)、芳基或雜環(huán)。術(shù)語(yǔ)″脂族基團(tuán)″和″芳基″如上述所定義。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″參與氫鍵的部分″代表可以接受或提供質(zhì)子而由此形成氫鍵的基團(tuán)。
參與氫鍵的部分的某些具體的非限制性實(shí)例包括氟、本領(lǐng)域眾所周知的含氧和含氮基團(tuán)。參與氫鍵的含氧基團(tuán)的某些實(shí)例包括羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)羰基、低級(jí)羧基、低級(jí)醚類(lèi)和酚基。本文所用的限定語(yǔ)″低級(jí)″意旨低級(jí)連接相應(yīng)含氧官能基的脂族基團(tuán)(C1-C4)。
因此，例如，術(shù)語(yǔ)″低級(jí)羰基″特別意旨甲醛、乙醛。
參與氫鍵形成的含氮基團(tuán)的某些非限制性實(shí)例包括氨基和酰氨基。另外，含氧和氮的基團(tuán)也可以參與氫鍵形成。這類(lèi)基團(tuán)的實(shí)例包括硝基、N-羥基和亞硝基。
另外可能的是本發(fā)明中的氫-鍵受體可以為芳族環(huán)的∏電子。然而，本發(fā)明的氫鍵參與者不包括那些含有金屬原子，諸如硼的基團(tuán)。此外，在實(shí)施本發(fā)明范圍內(nèi)形成的氫鍵不包括那些在兩個(gè)氫之間形成的稱(chēng)作″二氫鍵″的氫鍵(就這類(lèi)二氫鍵的描述而言，參見(jiàn)，R.H.Crabtree，Science，2822000-2001 )。
術(shù)語(yǔ)″雜環(huán)″代表例如含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的3-6元芳族或非芳族環(huán)。雜原子可以彼此相同或不同。優(yōu)選雜原子中的至少1個(gè)為氮?？梢源嬖谟陔s環(huán)上的其它雜原子包括氧和硫。
芳族和非芳族雜環(huán)為本領(lǐng)域眾所周知的。芳族雜環(huán)的某些非限制性實(shí)例包括吡啶、嘧啶、吲哚、嘌呤、喹啉和異喹啉。非芳族雜環(huán)的非限制性實(shí)例包括哌啶、哌嗪、嗎啉、吡咯烷和吡唑烷、含氧雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于呋喃、環(huán)氧乙烷、2H-吡喃、4H-吡喃、2H-色烯和苯并呋喃。含硫雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于噻吩、苯并噻吩和對(duì)噻嗪。
含氮環(huán)的實(shí)例包括，但不限于吡咯、吡咯啉、吡唑、吡唑啉、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡啶、哌啶、吡嗪、哌嗪、嘧啶、吲哚、嘌呤、苯并咪唑、喹啉、異喹啉、三唑和三嗪。
含兩個(gè)不同雜原子的雜環(huán)的實(shí)例包括，但不限于吩噻嗪、嗎啉、對(duì)噻嗪、嗪、唑、噻嗪和噻唑。
雜環(huán)如下進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)選自脂族基團(tuán)、硝基、乙?；?i.e.，-C(＝O)-CH3)或芳基的基團(tuán)取代。
R3和R4可以各自獨(dú)立為羥基、烷氧基、鹵素、氨基或取代的氨基(諸如低級(jí)-烷基-取代的-氨基或乙酰氨基或羥基氨基)或帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)。當(dāng)R3和R4各自為脂族基團(tuán)時(shí)，它可以進(jìn)一步如上所述被一個(gè)或多個(gè)官能基取代，諸如羥基、烷氧基、鹵素、氨基或取代的氨基。術(shù)語(yǔ)″脂族基團(tuán)″如上述所定義?；蛘撸琑3和R4可以各自為氫。
眾所周知許多1，4-苯二氮雜類(lèi)因在雜環(huán)的瓦樣(tile)C3位上引入了手性而作為旋光異構(gòu)體存在。這些旋光異構(gòu)體在文獻(xiàn)中有時(shí)被描述為L(zhǎng)-或D-異構(gòu)體?；蛘撸@些異構(gòu)體也稱(chēng)作R-和S-對(duì)映結(jié)構(gòu)體。為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，將這些異構(gòu)體稱(chēng)作對(duì)映異構(gòu)體或?qū)τ丑w。本文所述的1，4-苯二氮雜類(lèi)化合物包括其對(duì)映異構(gòu)體形式和外消旋混合物。因此，本文的用法″苯二氮雜類(lèi)或及其對(duì)映體″意旨如所述或描繪的苯二氮雜，包括其對(duì)映異構(gòu)體及其外消旋混合物。
從上述描述中顯然可以看出許多具體的實(shí)例由上述提供的一般通式表示。因此，在一個(gè)實(shí)例中，R1為脂族基團(tuán)，R2為脂族基團(tuán)，而在另一個(gè)實(shí)例中，R1為芳基且R2為參與氫鍵形成的部分?；蛘?，R1可以為脂族基團(tuán)且R2可以為-NHC(＝O)-R5或參與氫鍵的部分，其中R5為芳基、雜環(huán)、-R6-NH-C(＝O)-R7或-R6-C(＝O)-NH-R7，其中R6為1-6個(gè)碳的脂族連接基且R7為脂族基團(tuán)、芳基或雜環(huán)。來(lái)源于在各取代基位置上選擇特定基團(tuán)的各種這類(lèi)子組合是可能的，并且所有這類(lèi)組合均屬于本發(fā)明的范圍。
此外，應(yīng)理解本說(shuō)明書(shū)上下文中指定的數(shù)值范圍應(yīng)視為靈活的范圍，它關(guān)注在該范圍內(nèi)的任何可能的子范圍。例如，帶有1-10個(gè)碳范圍的基團(tuán)的描述也可以涉及具有如下子范圍的基團(tuán)例如，1-3，1-5，1-8或2-3，2-5，2-8，3-4，3-5，3-7，3-9，3-10個(gè)碳等。因此，1-10個(gè)的范圍應(yīng)理解為代表該范圍的外部邊界，在其中顯然涉及許多可能的子范圍。可以在本說(shuō)明書(shū)中找到上下文中其它部分涉及范圍的額外的實(shí)例，其中這類(lèi)范圍包括其中類(lèi)似的子范圍。
本發(fā)明的苯二氮雜類(lèi)化合物的某些具體實(shí)例包括 其中R2為
和二甲基苯基(所有異構(gòu)體)和二-三氟甲基(所有異構(gòu)體)。
還關(guān)注下列化合物
本發(fā)明還提供了化合物Bz-423。
Bz-423在臨床應(yīng)用上不同于苯二氮雜類(lèi)的方面在于在C-3上存在疏水取代基。這種取代產(chǎn)生與外周苯二氮雜受體(“PBR”)的弱結(jié)合(Kd約為1μM)并且防止結(jié)合中樞苯二氮雜受體，以便Bz-423不為鎮(zhèn)靜劑。
在某些實(shí)施方案中，R2為允許化合物結(jié)合OSCP的任意化學(xué)基團(tuán)。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，R2包括疏水芳族基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2包括大于苯的疏水芳族基團(tuán)(例如含有非-氫取代基的苯環(huán)、帶有兩個(gè)或多個(gè)芳族環(huán)的部分、帶有7或7個(gè)以上碳原子的部分等)。
本發(fā)明額外的具體苯二氮雜衍生物實(shí)例包括下列化合物


R2＝H、烷基或取代的烷基R3＝H、烷基或取代的烷基R1選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán)
R1＝H、烷基或取代的烷基R2＝H、烷基或取代的烷基
R1＝H、烷基或取代的烷基R2＝H、烷基或取代的烷基





R1為H或羥基R2-R6各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán) R1-R10各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán)

R1-R11各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán) R1-R10各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán)
R1-R10各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán) R1-R6各自可以相同或不同并且選自氫、羥基、烷氧基、鹵素、氨基、低級(jí)-烷基-取代的-氨基、乙酰氨基、羥基氨基、帶有1-8個(gè)碳和1-20個(gè)氫的脂族基團(tuán)、類(lèi)似大小的取代脂族基團(tuán)、由＜10個(gè)碳組成的環(huán)脂族基團(tuán)、取代的環(huán)脂族基團(tuán)、芳基和雜環(huán)


其中R1選自萘丙氨酸；苯酚；1-萘酚；2-萘酚； 和喹啉類(lèi)。
組合物含有如下通式
其中R1選自 本發(fā)明中包括的所有衍生物的立體化學(xué)為R、S或外消旋物。
本發(fā)明額外的具體苯二氮雜衍生物的實(shí)例包括如下含有如下通式的組合物
含有如下通式的組合物 其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基，腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；NR’；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐湥粠в兄辽?個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基，腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2；其中R’如R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中所述的大于苯包括含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)并且為芳基或脂族環(huán)狀基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，R’為防止R5的氧在體內(nèi)代謝，直到化合物達(dá)到其生物靶標(biāo)(例如線粒體)的任意官能基。在某些實(shí)施方案中，R’保護(hù)基在靶點(diǎn)上被代謝，從而將R5轉(zhuǎn)化成羥基。
概括地說(shuō)，本文提供了大量苯二氮雜類(lèi)化合物和相關(guān)化合物。這些化合物中的任意一種或多種可以用于治療關(guān)注與本文另有描述的細(xì)胞死亡相關(guān)的失調(diào)性病癥。上述化合物還可以用于藥物篩選試驗(yàn)和其它診斷方法。
V.藥物組合物、制劑和典型給藥途徑和給藥方案下文提供了各種關(guān)注的藥物和藥物組合物的典型實(shí)施方案。
A.制備藥物本發(fā)明的化合物用于制備治療各種與細(xì)胞死亡、異常細(xì)胞生長(zhǎng)和過(guò)度增殖相關(guān)的疾病的藥物。
此外，這些化合物還用于制備治療其它病癥的藥物，其中已知或可預(yù)測(cè)所述化合物的有效性。這類(lèi)病癥包括，但不限于神經(jīng)(例如癲癇)或神經(jīng)肌肉障礙。用于制備化合物的藥物的方法和技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知。下文描述了典型藥物制劑和遞送途徑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本文所述，包括許多具體的實(shí)施方案的任意一種或多種化合物通過(guò)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)制藥操作步驟制備?？梢酝ㄟ^(guò)使用制藥領(lǐng)域眾所周知的遞送方法將這類(lèi)藥物遞送至受試者。
B.典型藥物組合物和制劑在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，單獨(dú)給予所述的組合物，而在某些其它實(shí)施方案中，優(yōu)選以藥物制劑的形式給予所述的組合物，這些藥物制劑包括如上述定義的至少一種活性組分/活性劑(例如苯二氮雜衍生物)與固體載體或與一種或多種藥物上可接受的載體和任選的其它治療劑。每種載體必須是″可接受的″的含義在于它與制劑中的其它組分相容并且對(duì)受試者而言無(wú)害。
關(guān)注的制劑包括那些適合于口服、直腸、鼻部、局部(包括透皮、口含和舌下)、陰道、非腸道(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和透皮)和肺部給藥的制劑。在某些實(shí)施方案中，便利的是將制劑制成單位劑型并且通過(guò)制藥領(lǐng)域公知的任意方法制備。這類(lèi)方法包括將活性組分與構(gòu)成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。一般而言，通過(guò)均勻和緊密地使活性組分與液體載體或固體載體細(xì)粉接觸(例如混合)且然后如果需要使產(chǎn)物成形來(lái)制備制劑。
可以將適合于口服給藥的本發(fā)明制劑制成分散單位，諸如膠囊、扁囊劑或片劑，其中它們各自?xún)?yōu)選含有預(yù)定量的活性組分；粉末或顆粒；在水或非-水液體中的溶液或混懸液；或水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。在其它實(shí)施方案中，將活性組分以大丸劑藥糖劑或糊劑形式存在等。
在某些實(shí)施方案中，片劑包括至少一種活性組分和任選的一種或多種助劑/載體并且通過(guò)壓制或模制相應(yīng)試劑制備。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在合適的機(jī)器中壓制自由流動(dòng)形式的活性組分，諸如任選與粘合劑(例如聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合的粉末或顆粒制備壓制片。通過(guò)在合適的機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉狀化合物(例如活性組分)的混合物制備模制片?？梢匀芜x給片劑包衣或刻痕并且可以使用例如可變比例的羥丙基甲基纖維素配制它們以便使其中的活性組分緩釋或控釋?zhuān)瑥亩峁┧璧尼尫盘匦浴？梢匀芜x給片劑包腸溶衣，以便提供在腸中而不是在胃中部分釋放。
適合于在口腔中局部給藥的制劑包括包括在矯味基質(zhì)、通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠中的活性組分的錠劑；包括在惰性基質(zhì)、諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的活性組分的軟錠劑；和包括在合適的液體載體中的活性組分的漱口劑。
任選將用于局部給藥的本發(fā)明藥物組合物配制成霜?jiǎng)?、混懸液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、氣溶膠或油。在備選的實(shí)施方案中，局部用制劑包括貼劑或敷料，諸如浸漬了活性組分和任選一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或橡皮膏。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，局部用制劑包括促進(jìn)活性組分通過(guò)皮膚或其它受侵害區(qū)域吸收或透入的化合物。這類(lèi)皮膚滲透促進(jìn)劑的實(shí)例包括二甲亞砜(DMSO)和相關(guān)類(lèi)似物。
如果需要，霜?jiǎng)┗|(zhì)中的水相包括例如，至少約30％多元醇，即帶有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醇，諸如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露糖醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的油相乳劑由已知組分按照公知方式構(gòu)成。該相一般包括單獨(dú)的乳化劑(否則稱(chēng)作利泄劑)，在某些實(shí)施方案中，對(duì)該相而言，另外需要進(jìn)一步包括至少一種乳化劑與脂肪或油或脂肪與油的混合物。
優(yōu)選包括親水性乳化劑與親脂性乳化劑以便起穩(wěn)定劑的作用。在某些實(shí)施方案中，另外優(yōu)選包括油和脂肪。乳化劑與或不與穩(wěn)定劑共同構(gòu)成所謂的乳化蠟，并且這種蠟與油和/或脂肪構(gòu)成所謂的形成霜?jiǎng)┯头稚⑾嗟娜榛浉嗷|(zhì)。
適用于本發(fā)明制劑的利泄劑(emulgent)和乳化穩(wěn)定劑包括Tween60、Span 80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
用于制劑的合適的油或脂肪的選擇基于獲得所需的特性(例如化妝品特性)，因?yàn)榛钚曰衔?活性劑在大部分可能用于藥物乳劑中的油中的溶解度極低。因此，霜?jiǎng)?yīng)優(yōu)選為具有適當(dāng)稠度的非油膩的無(wú)染色且可洗滌的產(chǎn)品，以便避免從管或其它容器中滲漏?？梢允褂弥辨溁蛑ф溡?或二元烷基酯類(lèi)，諸如二-異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己酯或稱(chēng)作Crodamol CAP的支鏈酯類(lèi)的摻合物，最后三種為優(yōu)選的酯類(lèi)。根據(jù)需要的特性可以將它們單獨(dú)或組合使用。或者，可以使用高熔點(diǎn)脂質(zhì)，諸如白凡士林和/或液體石蠟或其它礦物油。
適合于對(duì)眼部局部給藥的制劑還包括滴眼劑，其中將活性組分溶于或懸浮于合適的載體，尤其是用于活性劑的合適溶劑中。
可以將用于直腸給藥的制劑制成含有合適的基質(zhì)的栓劑，所述的基質(zhì)包括，例如可可脂或水楊酸鹽。
可以將適合于陰道給藥的制劑制成陰道栓劑、霜?jiǎng)?、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧劑，它們還含有試劑，這類(lèi)載體在本領(lǐng)域中已知為合適的。
載體為固體的適合于鼻部給藥的制劑包括具有例如約20-約500微米范圍的顆粒大小的粗粉，可以通過(guò)施用鼻吸藥的方式，即通過(guò)快速吸入(例如促使)經(jīng)鼻道從保持接近鼻部的粉末容器中給予它們。載體為液體的用于給藥的其它合適的制劑包括但不限于鼻腔噴霧劑、滴劑或使用噴霧器的氣溶膠，它們各自包括活性劑的水溶液或油溶液。
適合于非腸道給藥的制劑包括含水和非水等滲無(wú)菌注射溶液，它們可以含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑(bacteriostats)和賦予該制劑與指定接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和含水和非水無(wú)菌混懸液，它們可以包括懸浮劑和增稠劑；以及脂質(zhì)體或其它微粒系統(tǒng)，可以將它們?cè)O(shè)計(jì)成使化合物靶向至血液成分或一種或多種器官。在某些實(shí)施方案中，將制劑制成/配制成單位劑量或多劑量密封容器，例如，安瓿和小瓶并且可以將它們貯存在僅需要在使用前即刻添加無(wú)菌液體載體、例如注射用水的冷凍干燥(凍干)條件下?？梢杂缮鲜鲱?lèi)的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備臨時(shí)注射溶液和混懸液。
優(yōu)選的單位劑型為如上文所述的那些含有活性劑每日劑量或單位每日亞劑量的制劑或其合適的部分。
應(yīng)理解除上文特別描述的組分外，本發(fā)明的制劑還可以包括其它本領(lǐng)域中就所述制劑類(lèi)型而言常用的其它試劑，例如，適合于口服給藥的制劑可以進(jìn)一步包括這類(lèi)試劑，如增甜劑、增稠劑和矯味劑。還預(yù)計(jì)可以將本發(fā)明的活性劑、組合物和方法與其它合適的組合物和療法合并。其它制劑仍然可以任選包括食品添加劑(合適的增甜劑、矯味劑、著色劑等)、植物營(yíng)養(yǎng)物(例如亞麻子油)、礦物質(zhì)(例如Ca、Fe、K等)、維生素和其它可接受的組合物(例如共軛的亞油酸(linoelicacid))、補(bǔ)充劑和穩(wěn)定劑等。
C.典型給藥途徑和給藥方案各種遞藥系統(tǒng)為已知的并且可以用于給予本發(fā)明的治療劑(例如苯二氮雜類(lèi)衍生物)，例如脂質(zhì)體包囊、微粒、微囊、受體-介導(dǎo)的胞吞等。遞送方法包括但不限于動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和口服途徑。在具體的實(shí)施方案中，需要將本發(fā)明的藥物組合物局部給藥至需要治療的區(qū)域；通過(guò)例如但不限于在手術(shù)過(guò)程中局部輸注或通過(guò)導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)這一目的。
可以對(duì)易感或處于靶細(xì)胞病理性生長(zhǎng)和與此相關(guān)的疾病中的受試者或個(gè)體給予本文鑒定的作為對(duì)指定目的而言有效的活性劑。當(dāng)將活性劑給予受試者、諸如小鼠、大鼠或人體患者時(shí)，可以將活性劑加入到藥物上可接受的載體中并且通過(guò)全身或局部給予受試者。為了確定治療有益的患者，從患者中取組織樣品并且檢測(cè)細(xì)胞對(duì)活性劑的敏感性。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定治療量并且根據(jù)所治療的病理情況、所治療的受試者和活性劑的功效和毒性的不同而改變。當(dāng)對(duì)動(dòng)物遞送時(shí)，該方法用于進(jìn)一步證實(shí)活性劑的功效。動(dòng)物模型的一個(gè)實(shí)例為MLR/MpJ-lpr/lpr(“MLR-lpr”)(購(gòu)自Jackson Laboratories，BalHarbor，Maine)。MLR-lpr小鼠發(fā)生全身性自身免疫性病。或者，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)，例如通過(guò)給裸鼠經(jīng)皮下接種如本文定義的約105-約109個(gè)過(guò)度增殖的癌或靶細(xì)胞研發(fā)其它動(dòng)物模型。當(dāng)建立腫瘤時(shí)，例如，通過(guò)在腫瘤周?chē)は伦⑸浣o予本文所述的化合物。使用venier測(cè)徑器每周2次測(cè)量2個(gè)尺寸的腫瘤大小減小的腫瘤測(cè)量值。如果合適，也可以使用其它動(dòng)物模型。用于上述疾病和病癥的這類(lèi)動(dòng)物模型為本領(lǐng)域眾所周知的。
在某些實(shí)施方案中，在整個(gè)治療過(guò)程中以1種劑量連續(xù)或間歇進(jìn)行體內(nèi)給藥。測(cè)定最有效給藥方式和劑量的方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且根據(jù)用于療法的組合物、療法的目的、所治療的靶細(xì)胞和所治療的受試者的不同而改變。使用由治療臨床醫(yī)師選擇的劑量水平和模式進(jìn)行單一或多次給藥。
易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定合適的給藥劑型和方法。優(yōu)選以約0.01mg/kg-約200mg/kg，更優(yōu)選約0.1mg/kg-約100mg/kg，甚至更優(yōu)選約0.5mg/kg-約50mg/kg給予化合物。當(dāng)將本文所述的化合物與另一種活性劑(例如作為敏化劑)共同給藥時(shí)，有效量可以低于單獨(dú)使用活性劑時(shí)的用量。
可以通過(guò)口服、鼻內(nèi)、非腸道或通過(guò)吸入療法給予藥物組合物，并且該藥物組合物可以采用片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、安瓿、栓劑或氣溶膠劑型的形式。它們還可以采用活性組分在含水或非水稀釋劑中的混懸液、溶液和乳劑、糖漿劑、顆?；蚍勰┑男问健３景l(fā)明的活性劑外，藥物組合物還可以含有其它藥物活性化合物或多種本發(fā)明的化合物。
更具體地說(shuō)，可以通過(guò)任意合適的途徑給予在本文中還稱(chēng)作活性組分的本發(fā)明活性劑用于療法，包括但不限于口服、直腸、鼻內(nèi)、局部(包括但不限于透皮、氣溶膠、頰和舌下)、陰道、非腸道(包括但不限于皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮內(nèi))和肺。還可以理解優(yōu)選的途徑根據(jù)接受者的病情和年齡以及所治療的疾病的不同而改變。
理想的情況是，應(yīng)給予活性劑以便在疾病部位上獲得活性化合物的峰值濃度。例如，可以通過(guò)靜脈內(nèi)注射任選在鹽水中的活性劑或例如作為含有活性組分的片劑、膠囊或糖漿劑口服給藥實(shí)現(xiàn)這一目的。
可以通過(guò)連續(xù)輸注維持活性劑的理想血液水平以便在疾病組織內(nèi)提供活性組分的治療有效量。關(guān)注手術(shù)組合的應(yīng)用以便提供治療組合，這些治療組合所需的各抗病毒藥成分的劑量低于單獨(dú)使用各治療化合物時(shí)所需的劑量，由此減少了不良反應(yīng)。
D.典型的共同給藥途徑和給藥方案本發(fā)明還包括涉及將本文所述的化合物與一種或多種額外的活性劑共同給藥的方法。實(shí)際上，本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供通過(guò)共同給予本發(fā)明的化合物促進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的療法和/或藥物組合物的方法。在共同給藥的操作步驟中，可以同時(shí)或依次給予所述的活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給予其它活性劑之前給予本文所述的化合物。藥物制劑和給藥方式可以為如上所述中的任意種。此外，可以使用不同的方式或不同的制劑給予兩種或多種共同給予的化學(xué)活性劑、生物活性劑或放射。
共同給予的活性劑或多種活性劑依賴(lài)于所治療的疾病的類(lèi)型。例如，當(dāng)所治療的疾病為癌癥時(shí)，額外的活性劑可以為化療劑或放射。當(dāng)所治療的疾病為自身免疫性疾病時(shí)，額外的活性劑可以為免疫抑制劑或抗炎藥。當(dāng)所治療的疾病為慢性炎癥時(shí)，額外的活性劑可以為抗炎藥。共同給予的額外的活性劑諸如抗癌藥、免疫抑制劑、抗炎藥并且可以為本領(lǐng)域眾所周知中的任意種，包括但不限于那些目前在臨床應(yīng)用中的活性劑。放射的合適類(lèi)型和劑量的確定也屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍或相對(duì)易于測(cè)定。
與異常編程性細(xì)胞死亡相關(guān)的關(guān)注疾病的治療一般限于下列兩種主要因素(1)發(fā)生耐藥性；和(2)已知治療劑的毒性。例如，在某些癌癥中，已經(jīng)證實(shí)耐受化學(xué)品和放療與編程性細(xì)胞死亡抑制相關(guān)。某些治療劑具有有害的副作用，包括非特異性淋巴細(xì)胞毒性、腎和骨髓毒性。
本文所述的方法解決了這些問(wèn)題。如果需要增加劑量以獲得治療有益性，那么通過(guò)共同給予本文所述的化合物與已知活性劑克服耐藥性。本文所述的化合物表現(xiàn)出使靶細(xì)胞對(duì)已知活性劑致敏(且反之亦然)，且由此需要較少的這些活性劑來(lái)篩選治療有益性。
所要求保護(hù)的化合物的致敏功能也解決了與已知治療劑毒性作用相關(guān)的問(wèn)題。在已知活性劑為毒性的實(shí)例中，需要在所有情況中且特別是在那些耐藥性已經(jīng)增加了必需劑量的情況中限制給藥劑量。當(dāng)將要求保護(hù)的化合物與已知活性劑共同給藥時(shí)，它們減少了所需的劑量，由此減輕了有害作用。此外，因?yàn)樗蟊Ｗo(hù)的化合物自身具有活性并且在大劑量下無(wú)毒性，所以按比例共同給予這些化合物比已知的毒性治療劑可以獲得更理想的作用，同時(shí)將毒性作用減少到最低限度。
VI.藥物篩選在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，篩選對(duì)線粒體ATP合酶復(fù)合物的寡霉素敏感性賦予蛋白(OSCP)部分的結(jié)合親和力的本發(fā)明化合物和其它潛在有用的化合物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定與重組OSCP蛋白的結(jié)合(biding)親和力選擇用于本發(fā)明方法的化合物。用于測(cè)定藥物和其它小分子與受體的結(jié)合親和力的合適的篩選方法為本領(lǐng)域中公知的。在某些實(shí)施方案中，在體外系統(tǒng)中進(jìn)行結(jié)合親和力篩選。在其它實(shí)施方案中，這些篩選在體內(nèi)或離體系統(tǒng)中進(jìn)行。盡管在某些實(shí)施方案中，在給予本發(fā)明化合物后對(duì)ATP的胞內(nèi)水平進(jìn)行定量提供了方法功效的指征，但是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案并不需要胞內(nèi)ATP或pH水平定量。
額外的實(shí)施方案涉及測(cè)定細(xì)胞和/或組織中的超氧化物水平(例如胞內(nèi))以便確定本發(fā)明特別關(guān)注的方法和化合物的有效性。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解并且能夠提供許多用于測(cè)定細(xì)胞和/或組織內(nèi)超氧化物水平的試驗(yàn)和方法。
在某些實(shí)施方案中，關(guān)注基于結(jié)構(gòu)的實(shí)際篩選方法以便預(yù)測(cè)本發(fā)明化合物與OSCP的結(jié)合親和力。
可以使用能夠測(cè)定苯二氮雜?；蚱渌衔锱cOSCP結(jié)合率或親和力的任意合適的試驗(yàn)。實(shí)例包括但不限于使用Bz-423的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合、表面等離共振(SPR)和放射性免疫沉淀試驗(yàn)(Lowman等，J.Biol.Chem.26610982 )。表面等離共振技術(shù)包括用導(dǎo)電金屬、諸如金、銀、鉻或鋁的薄膜涂敷表面，其中可以通過(guò)在稱(chēng)作表面等離共振角的具體角度下的金屬玻璃界面上的入射光束誘導(dǎo)稱(chēng)作表面等離的電磁波。在結(jié)合俘獲的大分子后調(diào)節(jié)溶液與金屬表面之間的界面區(qū)的屈光指數(shù)導(dǎo)致SPR角改變，這一角度可以直接測(cè)定或?qū)е聫慕饘俦砻娴南聜?cè)反射的光的量改變。這類(lèi)改變可能與結(jié)合SPR裝置表面的分子的質(zhì)量和其它光學(xué)特性直接相關(guān)。已經(jīng)披露了幾種基于這類(lèi)原理的生物傳感器系統(tǒng)(例如參見(jiàn)WO 90/05305)。還存在幾種商購(gòu)的SPR生物傳感器(例如BiaCore，Uppsala，Sweden)。
在某些實(shí)施方案中，在體外細(xì)胞培養(yǎng)物或在體內(nèi)(例如非-人或人哺乳動(dòng)物)篩選具有調(diào)節(jié)線粒體ATP合酶活性的化合物(copmpounds)?？梢允褂萌我夂线m的試驗(yàn)，包括但不限于細(xì)胞增殖試驗(yàn)(例如購(gòu)自Promega，Madison，WI和Stratagene，La Jolla，CA)和基于細(xì)胞的二聚化試驗(yàn)(例如參見(jiàn)Fuh等，Science，2561677 Colosi等，J.Biol.Chem.，26812617 )。應(yīng)用于本發(fā)明的額外的試驗(yàn)方式包括但不限于用于測(cè)定細(xì)胞ATP水平和細(xì)胞超氧化物水平的試驗(yàn)。
本發(fā)明還提供了改變和衍生本發(fā)明組合物以便增加所需特性(例如結(jié)合親和力、活性等)或?qū)⒉恍枰奶匦詼p少到最低限度(例如非特異性反應(yīng)性、毒性等)的方法?；瘜W(xué)衍生的原理為充分了解的。在某些實(shí)施方案中，重復(fù)設(shè)計(jì)(iterative design)和化學(xué)合成手段用于從母體化合物產(chǎn)生衍生的子代化合物庫(kù)。在其它實(shí)施方案中，合理的設(shè)計(jì)方法用于預(yù)測(cè)和模擬in silico配體-受體相互作用，此后通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)果。
VII.治療應(yīng)用A.一般治療應(yīng)用在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物(例如苯二氮雜類(lèi)衍生物)通過(guò)調(diào)節(jié)(例如抑制或促進(jìn))受侵害細(xì)胞或組織中線粒體ATP合酶(同樣稱(chēng)作線粒體F0F1ATPase)復(fù)合物的活性給患有許多疾病(例如特征在于細(xì)胞或組織中壞死和/或編程性細(xì)胞死亡失調(diào)的疾病、特征在于異常細(xì)胞生長(zhǎng)和/或過(guò)度增殖的疾病等)中的任意一種或多種的或者提供了治療有益性。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療自身免疫性疾病/慢性炎癥疾病(例如牛皮癬)。甚至在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與狹窄療法聯(lián)合用于治療受損(例如閉塞的)血管。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過(guò)結(jié)合這種多-亞單位蛋白復(fù)合物的特異性亞單位抑制線粒體ATP合酶復(fù)合物的活性。在某些實(shí)施方案中，盡管本發(fā)明并不限于任何特定的機(jī)理，也不限于對(duì)給予活性劑的作用的任何理解，但是關(guān)注本發(fā)明的組合物結(jié)合線粒體ATP合酶復(fù)合物的寡霉素敏感性賦予蛋白(OSCP)部分，結(jié)合OSCP/F1接頭或結(jié)合F1亞單位。同樣，進(jìn)一步關(guān)注當(dāng)本發(fā)明的組合物與OSCP結(jié)合時(shí)，最初的影響在于完全抑制線粒體ATP合酶復(fù)合物，并且結(jié)合的下游后果在于ATP或pH水平改變和活性氧簇(例如O2-)產(chǎn)生。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，盡管本發(fā)明并不限于任何特定的機(jī)理，也不限于對(duì)給予活性劑的作用的任何理解，但是關(guān)注游離基的產(chǎn)生最終導(dǎo)致殺傷細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，盡管本發(fā)明并不限于任何特定的機(jī)理，也不限于對(duì)給予活性劑的作用的任何理解，但是關(guān)注使用本發(fā)明的組合物和方法抑制線粒體ATP合酶復(fù)合物提供了對(duì)細(xì)胞增殖的治療上有用的抑制作用。
因此，關(guān)注本發(fā)明中實(shí)施的優(yōu)選方法給患者提供了治療有益性，通過(guò)提供本發(fā)明的化合物來(lái)進(jìn)行，這些化合物通過(guò)結(jié)合線粒體ATP合酶復(fù)合物的寡霉素敏感性賦予蛋白(OSCP)部分來(lái)調(diào)節(jié)(例如抑制或促進(jìn))受侵害細(xì)胞或組織中線粒體ATP合酶復(fù)合物的活性。重要的是，作為OSCP、OSCP/F1接頭或F1亞單位自身沒(méi)有生物活性。
因此，在一種廣泛的含義中，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及如下發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體ATP合酶復(fù)合物，包括但不限于結(jié)合其寡霉素敏感性賦予蛋白(OSCP)成分的活性，可以治療許多特征在于細(xì)胞或組織中壞死和/或編程性細(xì)胞死亡過(guò)程失調(diào)的疾病或特征在于異常細(xì)胞生長(zhǎng)和/或過(guò)度增殖的疾病等。然而，本發(fā)明并不限于實(shí)施本文明確描述的組合物和方法。實(shí)際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本文未特別描述的許多額外的化合物(例如非-苯二氮雜類(lèi)衍生物)適用于本文披露的調(diào)節(jié)線粒體ATP合酶的活性的方法。
本發(fā)明由此特別關(guān)注目前本領(lǐng)域中公知的或隨后研發(fā)的任意數(shù)量的合適的化合物可以任選應(yīng)用于本發(fā)明的方法。例如，包括但不限于寡霉素、奧薩霉素、cytovaricin、apoptolidin、bafilomyxcin、白藜蘆醇、piceatannol和二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)等的化合物應(yīng)用于本發(fā)明的方法。然而，本發(fā)明并不限于上述具體的方法或化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可能用于本發(fā)明方法的化合物可以選自那些如科學(xué)文獻(xiàn)中所述合適的化合物(例如參見(jiàn)K.B.Wallace和A.A.Starkov，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，40353-388 A.R.Solomon等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，97(26)14766-14771 )。
在某些實(shí)施方案中，篩選針對(duì)National Cancer Institute’s(NCI-60)癌細(xì)胞系的可能用于本發(fā)明方法的化合物的功效(例如參見(jiàn)A.Monks等，J.Natl.Cancer Inst.，83757-766 ；和K.D.Paull等，J.Natl.Cancer Inst.，811088-1092 )。額外合適的篩選(例如自身免疫性疾病模型等)屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。
在一個(gè)方面中，還將典型化合物或其它合適的化合物的衍生物(例如藥物上可接受的鹽、類(lèi)似物、立體異構(gòu)體等)關(guān)注為用于本發(fā)明的方法。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與狹窄療法聯(lián)合用于治療受損(例如閉塞的)血管。在額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與狹窄療法聯(lián)合用于治療受損的心臟血管。
血管狹窄為血管(例如主動(dòng)脈瓣)變狹窄時(shí)發(fā)生的疾病。例如，主動(dòng)脈瓣狹窄是心臟左下(左心室)與稱(chēng)作主動(dòng)脈的大血管之間的瓣膜變狹窄時(shí)發(fā)生的疾病。這種變狹窄(例如狹窄)產(chǎn)生了過(guò)小的空間而使血液無(wú)法流動(dòng)至身體。一般而言，左心室將富氧的血液通過(guò)主動(dòng)脈泵送至身體，其中主動(dòng)脈支化入整個(gè)體內(nèi)的動(dòng)脈系統(tǒng)。當(dāng)心臟泵血時(shí)，主動(dòng)脈瓣的3個(gè)瓣或小葉開(kāi)放一條通道以使血液從心室流入主動(dòng)脈。在心臟搏動(dòng)之間，瓣接近緊密閉合，以便血液不會(huì)通過(guò)瓣膜反向滲漏。如果主動(dòng)脈瓣受損，那么它可以變狹窄(狹窄的)并且血流可以減少流至體內(nèi)器官，包括心臟自身。一旦癥狀發(fā)生，則患有主動(dòng)脈瓣狹窄的人的長(zhǎng)期前景是較差的?；加形粗委煹闹鲃?dòng)脈瓣狹窄的發(fā)生心力衰竭癥狀的人通常具有的預(yù)期壽命為3年或3年以下。
存在幾種類(lèi)型的治療受損瓣膜的療法(例如氣囊擴(kuò)張術(shù)、切除、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或激光治療)。對(duì)受損心臟瓣膜的一種類(lèi)型的治療在于血管成形術(shù)。血管成形術(shù)包括將氣囊-尖端化管或?qū)Ч懿迦氇M窄或阻塞的動(dòng)脈以嘗試開(kāi)放它。通過(guò)給氣囊進(jìn)行幾次加壓和放氣，臨床醫(yī)師通常能夠擴(kuò)寬動(dòng)脈。
血管成形術(shù)或瓣膜擴(kuò)張術(shù)通常的局限在于再狹窄。再狹窄為在因嘗試開(kāi)放狹窄的動(dòng)脈部分、諸如，例如通過(guò)氣囊擴(kuò)張術(shù)、切除、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或激光治療動(dòng)脈導(dǎo)致的對(duì)所述動(dòng)脈的創(chuàng)傷后的外周或冠狀動(dòng)脈再閉合。就這些血管成形術(shù)操作步驟而言，根據(jù)定義、血管位置、損害長(zhǎng)度和其它形態(tài)和臨床變量的數(shù)量的不同，再狹窄的發(fā)生率約為20-50％。認(rèn)為再狹窄為對(duì)因血管成形術(shù)操作步驟引起的動(dòng)脈壁損傷的天然愈合反應(yīng)。這種愈合反應(yīng)開(kāi)始于損傷部位上的血栓形成機(jī)制。愈合過(guò)程的復(fù)雜步驟的最終結(jié)果可能為內(nèi)膜增生、中層平滑肌細(xì)胞不受控制的遷移和增殖，合并其胞外基質(zhì)產(chǎn)生，直到動(dòng)脈再次狹窄或閉塞。
在嘗試研發(fā)再狹窄的過(guò)程中，將金屬血管內(nèi)支架持久地植入冠狀動(dòng)脈或外周血管。一般通過(guò)導(dǎo)管將該支架插入判斷可擴(kuò)充接觸動(dòng)脈壁的患病部分的血管腔，由此對(duì)腔提供機(jī)械支持。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)再狹窄仍然在這類(lèi)支架就位的位置上發(fā)生。此外，支架自身可以產(chǎn)生不需要的局部血栓形成。為了解決血栓形成問(wèn)題，接受支架的人還接受了使用抗凝藥和抗血小板藥的廣泛全身治療。
為了解決再狹窄問(wèn)題，已經(jīng)提出了接種內(nèi)皮細(xì)胞的支架(Dichek，D.A.等“給血管內(nèi)之間接種遺傳改造的內(nèi)皮細(xì)胞”-Circulation1989801347-1353)。在該實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒-介導(dǎo)的用于細(xì)菌β-半乳糖苷酶或人組織-類(lèi)纖溶酶原激活物的基因轉(zhuǎn)移的綿羊內(nèi)皮細(xì)胞接種在不銹鋼支架上并且使其生長(zhǎng)至將支架覆蓋為止。細(xì)胞由此能夠被遞送至它們可以提供治療蛋白的血管壁。諸如，在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 91/12779″管腔內(nèi)藥物洗脫假體″和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO90/13332″能夠持續(xù)遞藥的支架″中還提出了給血管壁提供治療物質(zhì)的其它方法。在這些應(yīng)用中，提示了可以將抗血小板藥、抗凝藥、抗微生物藥、抗炎藥、抗代謝藥和其它藥物提供在支架上以便減少再狹窄的發(fā)生率。此外，還可以使用其它血管反應(yīng)性活性劑，諸如氧化亞氮釋放劑。
再狹窄的另一個(gè)原因在于治療組織的過(guò)度增殖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-增殖特性抑制了再狹窄。藥物-洗脫支架為本領(lǐng)域眾所周知的(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,697,967；美國(guó)專(zhuān)利US5,599,352；和美國(guó)專(zhuān)利US5,591,227；將它們各自引入本文作為參考)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在治療受損(例如閉塞的)血管的過(guò)程中從藥物-洗脫支架上洗脫本發(fā)明的組合物。在額外的實(shí)施方案中，在治療受損心臟血管的過(guò)程中從藥物-洗脫支架上洗脫本發(fā)明的組合物。
制備藥物化合物和制劑的本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，當(dāng)篩選用于本文披露的方法中的可選化合物時(shí)，要適當(dāng)考慮包括但不限于化合物的毒性、安全性、功效、可用性和成本。
B.自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病治療應(yīng)用自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病通常因細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和/或細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的功能失調(diào)所致。線粒體在控制和執(zhí)行細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用。線粒體滲透性躍遷孔(MPTP)為跨內(nèi)和外線粒體膜(membrandes)的孔并且起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡前顆粒的功能。瞬時(shí)MPTP開(kāi)放導(dǎo)致細(xì)胞色素c和編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)因子從線粒體膜間隙釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。
寡霉素敏感性賦予蛋白(OSCP)為F0F1線粒體ATP合酶/ATPase的亞單位并且在通過(guò)線粒體膜中酶的F0扇形面的質(zhì)子梯度偶聯(lián)中起作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物結(jié)合OSCP、OSCP/F1接頭或F1亞單位，增加超氧化物和細(xì)胞色素c水平，增加細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡并且抑制細(xì)胞增殖。腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)是一種30kDa蛋白質(zhì)，其為跨內(nèi)線粒體膜并且對(duì)于線粒體滲透性躍遷孔(MPTP)來(lái)說(shuō)是重要的。硫氫基氧化或烷基化試劑為通過(guò)改變ANT矩陣側(cè)面中三個(gè)未配對(duì)半胱氨酸中的一個(gè)或多個(gè)起作用的MPTP的強(qiáng)力激活物。4-(N-(S-谷胱甘肽基乙?；?氨基)苯基氧化砷抑制ANT。4-(N-(S-谷胱甘肽基乙?；?氨基)苯基氧化砷抑制所述ANT。
本發(fā)明的化合物和方法用于治療自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病。在這類(lèi)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了患有自身免疫性疾病和/或慢性炎癥疾病的受試者和含有如下通式的組合物
其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰基的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基，腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；NR’；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐湥粠в兄辽?個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分(例如硝基，腈等)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2；其中R’如R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中所述的大于苯包括含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的任意化學(xué)基團(tuán)，并且為芳基或脂族環(huán)狀基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，R’為防止R5的氧在體內(nèi)代謝，直到化合物達(dá)到其生物靶標(biāo)(例如線粒體)的任意官能基。在某些實(shí)施方案中，R’保護(hù)基在靶點(diǎn)上被代謝，從而使R5轉(zhuǎn)化成羥基。
C.表皮增生的治療導(dǎo)致與增厚的表皮脫落相關(guān)的表皮顯著性增厚的表皮超常增生(例如過(guò)度角質(zhì)形成細(xì)胞增殖)為一種特征性疾病，諸如牛皮癬(例如，參見(jiàn)Krueger GC等(1984)J.Am.Acad.Dermatol.11；937-947Fry L.(1988)，Brit.J.Dermatol.119445-461；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)，并且還在生理?xiàng)l件下發(fā)生(例如在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中)。
使用全反式維甲酸(RA)或其前體全反式視黃醇(ROL)局部治療皮膚也會(huì)導(dǎo)致表皮增生(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol，117；1335-1341；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。盡管潛在的病因不同，但是所有這些增生可以共同使增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體活化(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341；Baker BS等(1992)Brit.J.Dermatol.126105-110；Gottlieb AB等(1988)J.Exp.Med.167670-675；Elder JT等(1989)Science 243811-814；Piepkorn M等(1998)J Invest Dermatol 111715-721；Piepkorn M等(2003)ArchDermatol Res 2727；Cook PW等(1992)Cancer Res 523224-3227；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。正常的表皮生長(zhǎng)不會(huì)表現(xiàn)為依賴(lài)于象增生性生長(zhǎng)一樣依賴(lài)于EGF受體功能(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341；Varani J等(1998)Pathobiology 66253-259；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。同樣，完整皮膚中的真皮功能不依賴(lài)于EGF受體功能(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。
EGF受體在調(diào)節(jié)超常增生性上皮生長(zhǎng)中起中心作用使得EGF受體酪氨酸激酶成為抗增殖藥的靶標(biāo)。同樣，系列信號(hào)傳導(dǎo)分子銜接的該受體的下游為角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)被中斷的額外點(diǎn)。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)被EGF受體活化(例如，參見(jiàn)Marques，S.A.等(2002)J Pharmacol Exp Ther 300，1026-1035；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。在過(guò)度增殖的表皮、但并非在正常的表皮中，胞外信號(hào)-調(diào)節(jié)的激酶1/2(Erk 1/2)在基底和上基部角質(zhì)形成細(xì)胞中活化并且促使表皮過(guò)度增殖(例如，參見(jiàn)Haase，I.等(2001)J Clin Invest 108，527-536；Takahashi，H.等(2002)J Dermatol Sci 30，94-99；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。在培養(yǎng)物模型中，通過(guò)EGF受體的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)導(dǎo)致MAPK活性增加。在角質(zhì)形成細(xì)胞中，生長(zhǎng)因子-刺激的MAPK活性也依賴(lài)于整聯(lián)蛋白銜接，并且結(jié)合整聯(lián)蛋白的胞外基質(zhì)分子能夠獨(dú)立地活化MAPKs和增加角質(zhì)形成細(xì)胞增殖(例如，參見(jiàn)Haase，I.等(2001)J Clin Invest 108，527-536；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。其它皮膚細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞的增殖對(duì)Erk 1/2活性的依賴(lài)性較低，使得Erk抑制能夠成為潛在有用的特征，以便評(píng)價(jià)可能對(duì)表皮超常增生具有應(yīng)用的前導(dǎo)化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物(例如Bz-423)用于治療表皮超常增生。Bz-423的有效抗增殖作用與其限制狼瘡疾病的表現(xiàn)及其對(duì)正常細(xì)胞功能的低毒性指數(shù)的結(jié)合可應(yīng)用于靶向存在于牛皮癬和其它皮膚病中的上皮細(xì)胞異常增殖。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物(例如Bz-423)用于治療牛皮癬。牛皮癬為常見(jiàn)的和慢性的表皮超常增生。斑塊狀牛皮癬是最常見(jiàn)類(lèi)型的牛皮癬并且其特征在于覆蓋有銀色鱗屑的紅色皮膚和炎癥。瘙癢或燒灼感的圓形至卵圓形紅色斑塊是牛皮癬的典型特征。斑片通常在臂、腿、軀干或頭皮上可見(jiàn)，并且可以在皮膚的任何部分上發(fā)現(xiàn)。最典型的區(qū)域?yàn)橄ズ椭?。牛皮癬并非接觸傳染的，但可能是遺傳的。環(huán)境因素，諸如吸煙、日光照射、酗酒和HIV感染均可能影響牛皮癬發(fā)生的頻率(how often)和發(fā)病持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。
牛皮癬的治療包括局部用類(lèi)固醇、煤焦油、角質(zhì)軟化劑、維生素D-3類(lèi)似物和局部用類(lèi)視黃醇。局部用類(lèi)固醇為用于減少斑塊形成的活性劑。局部用類(lèi)固醇藥具有抗炎作用并且可以產(chǎn)生顯著而可變的代謝活性。此外，局部用類(lèi)固醇藥改變身體對(duì)不同刺激物的免疫應(yīng)答。局部用類(lèi)固醇的實(shí)例包括但不限于0.1％曲安奈德(Artistocort，Kenalog)霜和0.05％二丙酸倍他米松(Diprolene，Diprosone)霜。煤焦油是一種涉及廣泛應(yīng)用領(lǐng)域的洗發(fā)劑或洗劑的治療上可得到的低廉的非處方藥。煤焦油特別用于帶有毛發(fā)的區(qū)域。煤焦油的實(shí)例為2-10％煤焦油(DHS Tar，Doctar，Theraplex T)-止癢劑。角質(zhì)軟化劑用于除去鱗屑、使皮膚平滑并且治療過(guò)度角化。角質(zhì)軟化劑的實(shí)例為0.1-1％地蒽酚(Drithocreme，Anthra-Derm)。維生素D-3類(lèi)似物用于帶有耐受傳統(tǒng)療法的損害或帶有在面部或皮膚變薄可能引起美容問(wèn)題的暴露區(qū)域上的損害的患者。維生素D-3類(lèi)似物的實(shí)例為卡泊三烯(Dovonex)。局部用類(lèi)視黃醇為減少濾泡上皮細(xì)胞粘著性并且刺激有絲分裂活性的活性劑，從而導(dǎo)致濾泡上皮細(xì)胞更新增加。局部用類(lèi)視黃醇的實(shí)例包括但不限于維A酸(Retin-A，Avita)和他扎羅汀(Tazorac)。
在美國(guó)約1-2％的人或約550萬(wàn)人患有斑塊狀牛皮癬?；加邪邏K狀牛皮癬的人中達(dá)30％的人還患有牛皮癬性關(guān)節(jié)炎?；加信Ｆぐ_性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體在其關(guān)節(jié)上帶有炎癥并且可能具有其它關(guān)節(jié)炎癥狀。有時(shí)斑塊狀牛皮癬可以發(fā)展成更嚴(yán)重的疾病，諸如膿皰性牛皮癬或紅皮性牛皮癬。在膿皰性牛皮癬中，皮膚上的紅色區(qū)域含有帶膿的大水皰。在紅皮性牛皮癬中，紅色和脫屑皮膚面積廣泛是典型并且可能會(huì)瘙癢和疼痛。本發(fā)明用于治療其它類(lèi)型的牛皮癬，包括但不限于滴狀牛皮癬、指甲牛皮癬、皮褶牛皮癬和頭皮牛皮癬。
VIII.ATPase抑制劑和用于鑒定治療抑制劑的方法本發(fā)明提供了靶向F1F0-ATPase的化合物。此外，本發(fā)明提供了靶向F1F0-ATPase作為治療自身免疫性疾病的化合物且特別是具有低毒性的化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定靶向F1F0-ATPase的化合物的方法。另外，本發(fā)明提供了化合物在靶向F1F0-ATPase中的治療應(yīng)用。
真核細(xì)胞內(nèi)的大部分ATP由線粒體F1F0-ATPase合成(例如參見(jiàn)C.T.Gregory等，J.Immunol.，139313-318 ；J.P.Portanova等，Mol.Immunol.，32117-135 ；M.J.Shlomchik等，Nat.Rev.Immunol.，1147-153 ；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。盡管F1F0-ATPase合成和水解ATP，但是在正常生理?xiàng)l件下，F(xiàn)1F0-ATPase僅合成ATP(例如，參見(jiàn)Nagyvary J等Biochem.Educ.199927193-99；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。線粒體F1F0-ATPase由三種主要的結(jié)構(gòu)域組成F0、F1和外周定子。F1為含有催化位點(diǎn)的酶且其位于基質(zhì)中(例如，參見(jiàn)Boyer，PD，Annu Rev Biochem.199766717-49；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。該結(jié)構(gòu)域?yàn)楦叨缺Ｊ氐牟⑶揖哂衼唵挝唤M成α3β3γδε。牛F1界標(biāo)X-射線結(jié)構(gòu)揭示出α3β3與圓柱體中心的γ亞單位形成六角形圓柱體。F0位于內(nèi)線粒體膜內(nèi)并且含有質(zhì)子通道。質(zhì)子從內(nèi)膜區(qū)易位入基質(zhì)提供了驅(qū)動(dòng)ATP合成的能量。外周定子由在外形和功能上使F0與F1連接的幾種蛋白質(zhì)組成。定子將來(lái)自F0的構(gòu)象變化傳送入調(diào)節(jié)ATP合成的催化結(jié)構(gòu)域(例如，參見(jiàn)Cross RL，Biochim Biophys Acta 20001458270-75；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。
線粒體F1F0-ATPase抑制劑對(duì)F1F0-ATPase的機(jī)理性研究而言為無(wú)價(jià)工具(例如，參見(jiàn)James AM等J Biomed Sci 20029475-87；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。因?yàn)镕1F0-ATPase抑制劑通常為細(xì)胞毒性的，所以研究研究它們作為癌癥和其它過(guò)度增殖性病癥的藥物。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(例如寡霉素和apoptolidin)為F1F0-ATPase的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(例如，參見(jiàn)Salomon AR等PNAS 20009714766-71；Salomon AR等Chem Biol 2001871-80；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)結(jié)合通過(guò)導(dǎo)致抑制F1F0-ATPase的通道阻斷質(zhì)子流的F0。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)為有效的(例如寡霉素的IC50＝10nM)并且導(dǎo)致[ATP]顯著減少。照此，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)具有不能接受的狹窄的治療指數(shù)和高度的毒性(例如寡霉素在嚙齒動(dòng)物中的LD50在0.5mg/kg下為兩個(gè)每日劑量)(例如，參見(jiàn)Kramar R等Agents & Actions 1984，15660-63；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。F1F0-ATPase的其它抑制劑包括結(jié)合F1中的OSCP的Bz-423(如本文另外部分所述)。Bz-423具有Ki～9μM。
在主動(dòng)呼吸(稱(chēng)作狀態(tài)3呼吸)的細(xì)胞中，抑制F1F0-ATPase阻斷了呼吸并且使線粒體處于靜止?fàn)顟B(tài)(稱(chēng)作狀態(tài)4)。在狀態(tài)4中，MRC比狀態(tài)3減少，這有利于在復(fù)合物III下將O2還原成O2-(例如，參見(jiàn)N.Zamzami等，J.Exp.Med.，1811661-1672 ；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。例如，用寡霉素或Bz-423處理細(xì)胞導(dǎo)致胞內(nèi)O2-升高作為抑制復(fù)合物V的結(jié)果。就寡霉素而言，使用ATP補(bǔ)充細(xì)胞防止了死亡，而抗氧化劑不會(huì)，這表明細(xì)胞死亡是因ATP下降導(dǎo)致的(例如，參見(jiàn)Zhang JG等Arch Biochem Biophys 200139387-96；McConkeyDJ等“編程性細(xì)胞死亡中的ATP轉(zhuǎn)換”-Nieminen La，ed.線粒體in pathogenesis.New YorkPlenum，2001265-77；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考)。Bz-423-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡被抗氧化劑阻斷，但不受用ATP補(bǔ)充細(xì)胞的影響，這表明Bz-423參與了ROS-依賴(lài)性死亡反應(yīng)(例如，參見(jiàn)N.B.Blatt等J.Clin.Invest.，2002，110，1123；將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考)。照此，F(xiàn)1F0-ATPase抑制劑為毒性的(例如寡霉素)或治療性的(例如Bz-423)。
本發(fā)明提供了將毒性F1F0-ATPase抑制劑與治療性F1F0-ATPase抑制劑區(qū)分開(kāi)來(lái)的方法。具有治療潛能的F1F0-ATPase抑制劑(例如Bz-423)提供了新的抑制方式。特別地，具有有益特性的F1F0-ATPase抑制劑，如Bz-423為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它僅在高底物濃度下結(jié)合酶-底物復(fù)合物，而不會(huì)改變kcat/Km之比。這一認(rèn)識(shí)形成了鑒定具有治療潛能的ATPase抑制劑并且將其與毒性化合物區(qū)別開(kāi)來(lái)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供了靶向F1F0-ATPase作為自身免疫性疾病治療的化合物。特別地，本發(fā)明提供了鑒定靶向F1F0-ATPase而不會(huì)改變kcat/Km之比的化合物。另外，本發(fā)明提供了化合物在靶向F1F0-ATPase中的治療應(yīng)用。
A.ATPase抑制化合物本發(fā)明提供了抑制F1F0-ATPase的化合物。在某些實(shí)施方案中，這些化合物不結(jié)合游離的F1F0-ATPase，而是結(jié)合F1F0-ATPase-底物復(fù)合物。這些化合物在高底物濃度下表現(xiàn)出最大活性并且在低底物濃度下表現(xiàn)出最低活性(例如F1F0-ATPase抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些化合物不會(huì)改變F1F0-ATPase的kcat/Km之比。本發(fā)明F1F0-ATPase抑制劑的特性在于與寡霉素相反，其為急性毒性和致死性的F1F0-ATPase抑制劑。寡霉素為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它結(jié)合游離F1F0-ATPase和F1F0-ATPase-底物復(fù)合物并且改變kcat/Km之比。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抑制F1F0-ATPase而不改變kcat/Km之比的化合物具有本文另外部分所述的結(jié)構(gòu)。然而通過(guò)本發(fā)明方法鑒定為治療抑制劑的其它結(jié)構(gòu)的化合物也包括在本發(fā)明中。
B.鑒定ATPase抑制劑本發(fā)明提供了鑒定(例如篩選)用于治療自身免疫性疾病的化合物。本發(fā)明并不限于特定類(lèi)型的化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包括但不限于藥物組合物、小分子、抗體、大分子、合成分子、合成多肽類(lèi)、合成多核苷酸、合成核酸、適體、多肽類(lèi)、核酸和多核苷酸。本發(fā)明并不限于鑒定用于治療自身免疫性疾病的化合物的特定方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用于治療自身免疫性疾病的化合物鑒定為具有抑制F1F0-ATPase而不改變kcat/Km之比的能力。
C.使用F1F0-ATPase抑制劑的治療應(yīng)用本發(fā)明提供了治療病癥的方法(例如神經(jīng)變性疾病、阿爾茨海默病、局部缺血再灌注損傷、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、非何杰金淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、表皮T細(xì)胞白血病、自身免疫性疾病、癌癥、實(shí)體瘤、淋巴瘤和白血病)。本發(fā)明并不限于特定的治療形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療包括但不限于癥狀改善、癥狀預(yù)防、病癥預(yù)防和病癥改善。本發(fā)明提供了治療應(yīng)用于體內(nèi)、體外和/或離體環(huán)境中的自身免疫性疾病的方法。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)抑制靶細(xì)胞治療自身免疫性疾病。本發(fā)明并不限于特定的細(xì)胞抑制形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞抑制包括但不限于細(xì)胞生長(zhǎng)預(yù)防、細(xì)胞增殖預(yù)防和細(xì)胞死亡。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制靶細(xì)胞通過(guò)使靶細(xì)胞接觸本發(fā)明的F1F0-ATPase抑制劑來(lái)進(jìn)行。在額外的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞抑制通過(guò)使用本發(fā)明的F1F0-ATPase抑制劑靶向F1F0-ATPase來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明并不限于特定的F1F0-ATPase抑制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)1F0-ATPase抑制劑具有抑制F1F0-ATPase而不改變kcat/Km之比的能力。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)1F0-ATPase抑制劑為Bz-423或本文所述的其它化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了選擇性抑制有治療需要的受試者靶細(xì)胞病理情況的方法。本發(fā)明并不限于特定的抑制靶細(xì)胞病理情況的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)給予有效量的本發(fā)明化合物抑制靶細(xì)胞病理情況。本發(fā)明并不限于特定的化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的化合物為F1F0-ATPase抑制劑。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的化合物抑制F1F0-ATPase而不改變kcat/Km之比。
實(shí)施例提供下列實(shí)施例來(lái)證實(shí)并且進(jìn)一步解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，但并不用來(lái)限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.化合物的制備使用固相或可溶性相組合合成方法并且各自基于充分建立的技術(shù)制備苯二氮雜類(lèi)化合物。例如，參見(jiàn)Boojamra，C.G.等(1996)Bunin，B.A.，等(1994)；Stevens，S.Y.等，(1996)Gordon，E.M.等(1994)；和U.S.Patent Nos.4,110,337和4,076,823，將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。為了解釋?zhuān)峁┝讼铝幸话惴椒ā?br> 1，4-苯二氮雜-2-酮化合物的制備文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了用于制備各種1，4-苯二氮雜-2-酮衍生物的改進(jìn)的固相合成方法，它們具有極高的總產(chǎn)率(例如，參見(jiàn)Bunin和Ellman，J.Am.Chem.Soc.，11410997-10998 )。使用這些改進(jìn)的方法，在固相支持體上由如下三種單獨(dú)的成分構(gòu)成1，4-苯二氮雜-2-酮類(lèi)2-氨基二苯甲酮類(lèi)、α-氨基酸和(任選)烷基化試劑。
優(yōu)選的2-氨基二苯甲酮類(lèi)包括取代的2-氨基二苯甲酮類(lèi)，例如，鹵素-、羥基-和鹵素-羥基-取代的2-氨基二苯甲酮類(lèi)，諸如4-鹵素-4′-羥基-2-氨基二苯甲酮類(lèi)。優(yōu)選的取代的2-氨基二苯甲酮為4-氯-4′-羥基-2-氨基二苯甲酮。優(yōu)選的α-氨基酸包括20種常用的天然存在的α-氨基酸以及α-氨基酸模擬結(jié)構(gòu)，諸如高苯丙氨酸、高酪氨酸和甲狀腺氨酸。
烷基化試劑包括活化和失活的親電子試劑，其中廣泛的種類(lèi)為本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的烷基化試劑包括活化的親電子試劑對(duì)-溴芐基溴和叔丁基-溴乙酸酯。
在這類(lèi)合成的第一步中，使用眾所周知的方法并且使用酸-可裂解的連接基，諸如商購(gòu)的[4-(羥甲基)苯氧基]乙酸使2-氨基二苯甲酮衍生物通過(guò)羥基或羧酸官能基與固相支持體、諸如聚苯乙烯固相支持體結(jié)合，而得到支持的2-氨基二苯甲酮(例如，參見(jiàn)Sheppard和Williams，Intl.J.Peptide Protein Res.，20451-454 )。例如在與連接試劑反應(yīng)前，優(yōu)選通過(guò)與FMOC-Cl(9-芴基甲基氯甲酸酯)反應(yīng)保護(hù)氨基二苯甲酮的2-氨基，而得到被保護(hù)的氨基2′-NHFMOC。
在第二步中，使被保護(hù)的2-氨基脫保護(hù)(例如，通過(guò)用哌啶在二甲基甲酰胺(DMF)中處理使-NHFMOC基團(tuán)脫保護(hù))，且然后使未被保護(hù)的2-氨基二苯甲酮通過(guò)酰胺鍵與α-氨基酸偶聯(lián)(例如，其氨基自身被保護(hù)為-NHFMOC基團(tuán))而得到中間體。使用用于一般固相肽合成的標(biāo)準(zhǔn)活化方法(諸如使用碳化二亞胺類(lèi)和羥基苯并三唑或五氟苯基活性酯類(lèi))以便有利于偶聯(lián)。然而，優(yōu)選的活化方法采用用α-N-FMOC-氨基酸氟化物的二氯甲烷溶液在有酸清除劑4-甲基-2，6-二-叔丁基吡啶存在下處理2-氨基二苯甲酮，以便通過(guò)酰胺鍵實(shí)現(xiàn)完全偶聯(lián)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種優(yōu)選的偶聯(lián)甚至對(duì)不起反應(yīng)的氨基二苯甲酮的衍生物而言也是有效的，對(duì)具有4-氯和3-羧基失活取代基的衍生物而言產(chǎn)生了基本上完全的偶聯(lián)。
在第三步中，首先使被保護(hù)的氨基(來(lái)源于氨基酸)脫保護(hù)(例如可以在DMF中用哌啶將-NHFMOC轉(zhuǎn)化成-NH2)并且使脫保護(hù)的Bz-423與酸、例如5％乙酸在DMF中和60℃下反應(yīng)而得到支持的1，4-苯二氮雜衍生物。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)使用這種方法使各種具有廣泛不同的立體和電子特性的2-氨基二苯甲酮衍生物完全環(huán)化。
在可選的第四步中，通過(guò)與合適的烷基化試劑和堿反應(yīng)使1，4-苯二氮雜衍生物烷基化而得到支持的完全衍生的1，4-苯二氮雜。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)烷基化方法、過(guò)量的強(qiáng)堿，諸如LDA(二異丙基氨基鋰)或NaH；然而，這類(lèi)方法可能產(chǎn)生不需要的其它酸性官能基脫保護(hù)和過(guò)度烷基化?？梢苑乐贡蕉s類(lèi)衍生物(例如，那些帶有酯和氨基甲酸酯官能基的化合物)過(guò)度烷基化的優(yōu)選堿為那些足以完全使N-酰苯胺官能基完全脫質(zhì)子化，但不足以使酰胺、氨基甲酸酯或酯官能基脫質(zhì)子化的堿。這類(lèi)堿的實(shí)例為鋰化的5-(苯基甲基)-2-唑烷酮(oxaxolidinone)，使其在-78℃下和四氫呋喃(THF)中與1，4-苯二氮雜反應(yīng)。在脫質(zhì)子化后，如上所述加入合適的烷基化試劑。
在最終的步驟中，從固相支持體上裂解完全衍生的1，4-苯二氮雜。例如，通過(guò)接觸合適的酸，諸如三氟乙酸、水和二甲硫的混合物(85∶5∶10，按體積計(jì))實(shí)現(xiàn)這一目的(同時(shí)除去對(duì)酸敏感的保護(hù)基)?；蛘撸诳扇苄韵嘀兄苽渖鲜霰蕉s類(lèi)。Gordon等在J.Med.Chem.，371386-1401 )中概括了合成方法，將該文獻(xiàn)引入作為參考。簡(jiǎn)言之，該方法包括使用適當(dāng)取代的2-氨基二苯甲酮亞胺類(lèi)使氨基酸樹(shù)脂轉(zhuǎn)亞氨化(imidating)而形成樹(shù)脂結(jié)合的亞胺類(lèi)。按照與上述固相合成類(lèi)似的操作步驟使這些亞胺類(lèi)環(huán)化并且tethered。使用上述方法制備的苯二氮雜類(lèi)的一般純度約為90％或90％以上。
1，4-苯二氮雜-2，5-二酮類(lèi)的制備1，4-苯二氮雜-2，5-二酮類(lèi)的固相合成的一般性方法具體地報(bào)導(dǎo)在C.J.Boojamra等，J.Org.Chem.，621240-1256 )中。該方法用于制備本發(fā)明的化合物。
通過(guò)使用4-羥基-2，6-二甲氧基苯甲醛鈉烷基化衍生Merrifield樹(shù)脂，例如，(氯甲基)聚苯乙烯而得到樹(shù)脂結(jié)合的醛。然后通過(guò)使用NaBH(OAc)3在DMF中1％的乙酸中的還原氨基化使α-氨基酯與衍生的支持體結(jié)合。這種還原氨基化導(dǎo)致形成樹(shù)脂結(jié)合的仲胺。
使用各種未被保護(hù)的鄰氨基苯甲酸使仲胺?；玫街С煮w結(jié)合的叔酰胺類(lèi)。通過(guò)在有碳化二亞胺和叔胺鹽酸鹽存在下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)獲得最佳的?；?。一種良好的偶聯(lián)試劑為1-乙基-8-[8-(二甲氨基)丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽。該反應(yīng)一般在有無(wú)水1-甲基-2-吡咯烷酮存在下進(jìn)行。一般將偶聯(lián)操作步驟重復(fù)1次以上以便全部完全?；?br> ?；苌锏沫h(huán)化通過(guò)堿催化的內(nèi)酰胺化，經(jīng)形成N-酰苯胺陰離子進(jìn)行，所述的N-酰苯胺陰離子與烷基鹵反應(yīng)以便同時(shí)在苯二氮雜的雜環(huán)氮的1-位上引入取代基。乙酰苯胺的鋰鹽為催化反應(yīng)的良好堿。因此，Bz-423s與乙酰苯胺鋰在DMF/THF(1∶1)中反應(yīng)30小時(shí)，隨后與合適的烷基化試劑反應(yīng)而得到完全衍生的支持體結(jié)合的苯二氮雜。通過(guò)使用TFA/DMS/H2O(90∶5∶5)從支持體上連接良好產(chǎn)率和高純度裂解化合物。
Boojamra(1996)，文獻(xiàn)同上1246頁(yè)上列出了用于本發(fā)明的α-氨基酯原料、烷基化試劑和鄰氨基苯甲酸衍生物的某些實(shí)例。額外的試劑易于確定并且可商購(gòu)獲得或易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備以便獲得本發(fā)明中披露的新取代基。
例如，從Boojamra，文獻(xiàn)同上中可以看出，可以實(shí)現(xiàn)烷基化試劑提供了R1取代基；α-氨基酯原料提供了R2取代基；且鄰氨基苯甲酸提供了R4取代基。通過(guò)使用這些適當(dāng)取代的原料，可以獲得所需的1，4-苯二氮雜-2，5-二酮。通過(guò)適當(dāng)取代的α-氨基酯原料的胺獲得R3取代基。如果立體擁擠現(xiàn)象成為問(wèn)題，那么在分離1，4-苯二氮雜-2，5-二酮后通過(guò)常規(guī)方法結(jié)合R3取代基。
實(shí)施例2.手性應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的苯二氮雜類(lèi)中的許多因手性而作為旋光異構(gòu)體存在，其中立體中心引入了α-氨基酸及其酯原料。上述一般操作步驟保護(hù)了α-氨基酸或酯原料的手性。在許多情況中，這類(lèi)對(duì)手性的保護(hù)是需要的。然而，當(dāng)α-氨基酸或酯原料的所需旋光異構(gòu)體無(wú)法得到或昂貴時(shí)，生產(chǎn)外消旋混合物，將其分離成相應(yīng)的旋光異構(gòu)體并且分離所需的苯二氮雜對(duì)映體。
例如，就2，5-二酮化合物而言，Boojamra，文獻(xiàn)同上中披露了通過(guò)下列步驟進(jìn)行完全外消旋化在添加NaBH(OAc)3前，用0.3當(dāng)量的i-Pr2EtN和樹(shù)脂結(jié)合的醛預(yù)平衡對(duì)映體純的α-氨基酯原料的鹽酸鹽。上述合操作步驟中的其余部分保持相同。如果需要，就1，4-苯二氮雜-2-二酮化合物而言，也使用類(lèi)似的步驟。
制備各苯二氮雜類(lèi)的方法為本領(lǐng)域眾所周知(例如，參見(jiàn)US3,415,814；3,384,635；和3,261,828，將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)。通過(guò)在任意上述方法中選擇適當(dāng)取代的原料，可以相對(duì)便利地制備本發(fā)明的苯二氮雜。
實(shí)施例3.試劑如上所述合成Bz-423。FK506獲自Fujisawa(Osaka，Japan)。N-苯甲?；驶?Val-Ala-Asp-氟甲基酮(z-VAD)獲自Enzyme Systems(Livermore，CA)。二氫乙啡啶(dikydroethidium)(DHE)和3，3′-二己基氧雜羰菁碘化物(DiOC6(3))獲自Molecular Probes(Eugene，OR)、FAM-VAD-fmk獲自Intergen(Purchase，NJ)。錳(III)內(nèi)消旋-四(4-苯甲酸)卟啉(MnTBAP)購(gòu)自Alexis Biochemicals(San Diego，CA)。如所述的合成苯二氮雜類(lèi)(參見(jiàn)B.A.Bunin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，914708-4712 )。其它試劑獲自Sigma(St.Louis，MO)。
實(shí)施例4.動(dòng)物和藥物遞送將雌性NZB/W小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組。對(duì)照組小鼠接受載體(50μL DMSO水溶液)且治療組接受溶于載體的Bz-423(60mg/kg)，均通過(guò)腹膜內(nèi)注射進(jìn)行。外周血液獲自尾靜脈，以便制備血清。將脾和腎的樣品保存在10％緩沖的-福爾馬林中或通過(guò)在OCT中冷凍保存。保存來(lái)自每只動(dòng)物的額外的脾切片以便制備單細(xì)胞混懸液。
實(shí)施例5.初級(jí)脾細(xì)胞、細(xì)胞系和培養(yǎng)條件通過(guò)機(jī)械破碎與等滲破裂溶解(lysis)紅細(xì)胞從6個(gè)月齡小鼠中獲得初級(jí)脾細(xì)胞。通過(guò)使用磁性細(xì)胞分選與CD4、CD8a和CD11b包被的微珠(Miltenyi Biotec，Auburn，California)進(jìn)行負(fù)選擇制備富含B細(xì)胞的級(jí)分Ramos品系購(gòu)自ATCC(Monassis，Georgia)。將細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％熱滅活的胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(290μg/ml)的RPMI中。用于初級(jí)細(xì)胞的培養(yǎng)基還含有2-巰基乙醇(50μM)。所有體內(nèi)研究均使用0.5％DMSO和2％FBS進(jìn)行。在含有2％FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。將有機(jī)化合物溶于含有0.5％DMSO的培養(yǎng)基。
實(shí)施例6.組織學(xué)使用蘇木精和伊紅(H&E)染色福爾馬林固定的腎切片并且通過(guò)使采用FI TC-綴合的山羊抗-小鼠IgG(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)染色的冷凍組織的直接免疫熒光檢測(cè)血管小球的免疫-復(fù)合物沉積。使用0-4+等級(jí)以雙盲方式分析切片的腎炎和IgG沉積。使用用H&E染色的脾切片以0-4+的等級(jí)給淋巴樣增生程度評(píng)分。為了鑒定B細(xì)胞，用生物素化的-抗-B220(Pharmingen1μg/mL)，隨后用鏈霉抗生物素-Alexa 594(Molecular Probes5μg/mL)染色切片。使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche)分析冷凍脾切片的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞并且使用0-4+等級(jí)評(píng)價(jià)。
實(shí)施例7.TUNEL染色使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)分析冷凍脾切片。以雙盲方式評(píng)價(jià)切片并且基于TUNEL-陽(yáng)性染色的量指定評(píng)分(0-4+)。通過(guò)使用生物素化-抗-B220(Pharmingen，San Diego，CA1μg/mL，1小時(shí)，22℃)，隨后用鏈霉抗生物素-Alexa 594(Molecular Probes，Eugene，Oregon5μg/mL，1小時(shí)，22℃)鑒定B細(xì)胞。
實(shí)施例8.來(lái)自治療動(dòng)物的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)分析使用熒光-綴合的抗-Thy 1.2(Pharmingen，1μg/mL)和/或抗-B220(Pharmingen，1μg/mL)檢測(cè)表面標(biāo)記(15m，4℃)。為了檢測(cè)外膜磷脂酰絲氨酸，使用FITC-綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)，按照制造商的方案(Roche Molecular Biochemicals)孵育細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞使用APO-BRDU試劑盒(Pharmingen)。通過(guò)在27℃下將細(xì)胞與10μM二氫乙啡啶和2μM 3，3′-二己基氧雜羰菁碘化物(DIOC6(3))(Molecular Probes)一起溫育30m評(píng)價(jià)超氧化物和MPT。將碘化丙錠用于測(cè)定存活率和DNA含量。用FACSCalibur流式細(xì)胞測(cè)定器(Becton Dickinson，San Diego，CA)分析樣品。
實(shí)施例9.B細(xì)胞刺激使用可溶性山羊Fab2抗-人IgM(Southern BiotechnologyAssociates，1μg/ml)和/或純化的抗-人CD40(Pharmingen，克隆5C3，2.5μg/ml)活化Ramos細(xì)胞。使用固定在培養(yǎng)孔中的親和純化的山羊小鼠抗-小鼠IgM(ICN，Aurora，Ohio20μg/ml)和/或可溶性純化的抗-小鼠CD40(Pharmingen，克隆HM40-3，2.5μg/ml)活化B細(xì)胞。以10μg/ml使用LPS。在施加刺激物后即刻將Bz-423加入到培養(yǎng)物中。在Bz-423前30m加入抑制劑。
實(shí)施例10.統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性并且通過(guò)兩種方式ANOVA評(píng)價(jià)變量之間的相關(guān)性。所有報(bào)導(dǎo)的p-值均為單-尾的并且將數(shù)據(jù)作為平均值±SEM提供。
實(shí)施例11.細(xì)胞死亡和亞二倍體DNA的檢測(cè)通過(guò)用碘化丙錠(PI，1μg/mL)染色評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。使用FACScalibur流式細(xì)胞測(cè)定器(Becton Dickinson，San Diego，CA)測(cè)定PI熒光。在4℃下DNA-標(biāo)記溶液(在含有0.2％Triton和10μg/mLRNAse A的PBS中50μg/mL的PI)中將細(xì)胞孵育過(guò)夜后進(jìn)行亞二倍體DNA測(cè)定。使用排除聚集物的細(xì)胞Quest軟件分析數(shù)據(jù)。
實(shí)施例12.O2-、ψm和胱天蛋白酶活化的檢測(cè)為了檢測(cè)O2-，將細(xì)胞與DHE(10μM)在37℃下孵育30分鐘并且通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析以便測(cè)定乙錠熒光。通過(guò)在37℃下用DiOC6(3)(20nM)將細(xì)胞標(biāo)記15分鐘對(duì)線粒體跨膜電位(ψm)進(jìn)行流動(dòng)分析。使用羰基氰化物間-氯苯基腙(CCCP，50μM)建立用于破壞ψm的陽(yáng)性對(duì)照。使用FAM-VAD-氟甲基酮進(jìn)行胱天蛋白酶活化試驗(yàn)。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)評(píng)價(jià)底物加工。
實(shí)施例13.亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級(jí)分離和細(xì)胞色素c檢測(cè)用Bz-423(10μM)或載體將Ramos細(xì)胞(250×106個(gè)細(xì)胞/樣品)處理1-5小時(shí)。使細(xì)胞沉淀，重新懸浮于緩沖液(68mM蔗糖、220mM甘露糖醇、pH 7.4 10mM HEPES-NaOH、10mM KCl、1mM EDTA、1mMEGTA、10μg/mL亮抑酶肽、10μg/mL抑肽酶、1mM PMSF)，在冰上孵育10分鐘并且勻化。在4℃下將勻化物離心2次(800g)以沉淀核和碎片并且在4℃下離心15分鐘(16,000g)以沉淀線粒體。濃縮上清液，用12％SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳并且轉(zhuǎn)至Hybond ECL膜(Amersham，Piscataway，NJ)上。在封閉(含有5％奶粉和0.1％Tween的PBS)后，用抗-細(xì)胞色素c單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA2μg/mL)，隨后用抗-小鼠辣根過(guò)氧化物酶-綴合的二次抗體，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Amersham)探查所述的膜。
實(shí)施例14.分離的線粒體中ROS的產(chǎn)生使雄性Long Evans大鼠饑餓過(guò)夜并且通過(guò)斷頭處死。將肝樣品在冰冷緩沖液A(250mM蔗糖、10mM Tris、0.1mM EGTA，pH 7.4)中勻化并且沉淀核和細(xì)胞碎片(10分鐘，830g，4℃)。通過(guò)離心收集線粒體(10分鐘，15,000g，4℃)，并且收集上清液作為S15級(jí)分。用緩沖液B(250mM蔗糖、10mM Tris，pH 7.4)將線粒體沉淀洗滌3次并且以20-30mg/mL重新懸浮于緩沖液B中。用含有2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA，1μM)的緩沖液C(200mM蔗糖，10mMTris，pH 7.4，1mM KH2PO4，10μM EGTA，2.5μM毒魚(yú)藤素，5mM琥珀酸鹽)稀釋線粒體(0.5mg/mL)。為了進(jìn)行狀態(tài)3的測(cè)定，緩沖液中包括ADP(2mM)并且在加入Bz-423前，使線粒體帶電2分鐘。為了誘導(dǎo)狀態(tài)4，向緩沖液C中加入寡霉素(10μM)。在37℃使用熒光分光光度計(jì)(λex503nm；λem522nm)監(jiān)測(cè)DCFH氧化成2′，7′-二氯熒光素(DCF)。為了檢測(cè)對(duì)O2-和δψm的作用，在37℃下將線粒體在緩沖液C中與載體、Bz-423或含有DHE(5μM)或DIOC6(3)(20nM)的CCCP一起溫育15分鐘，并且取出等分部分用于通過(guò)熒光顯微鏡術(shù)進(jìn)行分析。
實(shí)施例15.脾細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)分析通過(guò)機(jī)械破碎制備脾細(xì)胞并且通過(guò)等滲破裂溶解除去紅細(xì)胞。將細(xì)胞在4℃下用熒光-綴合的抗-Thy 1.2(Pharmingen1μg/mL)和/或抗-B220(Pharmingen1μg/mL)染色15分鐘。為了檢測(cè)外膜的磷脂酰絲氨酸，將細(xì)胞與FITC-綴合的膜聯(lián)蛋白V和PI(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN1μg/mL)一起孵育。
實(shí)施例16.ROS的體內(nèi)測(cè)定從用Bz-423或載體治療的4-月齡NZB/W小鼠中取脾細(xì)胞并且冷凍在OCT中。如E.D.Kerver等(參見(jiàn)E.D.Kerver等，Histochem.J.，29229-237 所述使用3，3，9-二氨基聯(lián)苯胺錳(II)測(cè)定ROS產(chǎn)生。
實(shí)施例17.IgG滴度、BUN和蛋白尿如P.C.Swanson等(參見(jiàn)P.C.Swanson等，Biochemistry，351624-1633 )所述通過(guò)ELISA測(cè)定抗-DNA和IgG滴度。由University of Michigan Hospital臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清BUN。使用ChemStrip 6(Boehringer Mannheim)監(jiān)測(cè)蛋白尿。
實(shí)施例18.苯二氮雜研究對(duì)動(dòng)物的苯二氮雜研究如2001年8月23日公布的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)US20010016583中所述，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
實(shí)施例19.Bz-423誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的介體為了表征由Bz-423參與的死亡機(jī)制，測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)的胞內(nèi)ROS、Δψm、細(xì)胞色素c釋放、胱天蛋白酶活化和DNA片段化(提供的結(jié)果是就B細(xì)胞而言，但確切表征的是許多不同細(xì)胞類(lèi)型中的反應(yīng))。在接觸Bz-423后檢測(cè)到的第一種結(jié)果為用二氫乙錠(DHE)，即與O2-發(fā)生特異性反應(yīng)的氧化還原-敏感性試劑染色的細(xì)胞級(jí)分增加。
O2-水平在早期最長(zhǎng)1小時(shí)處理后下降且然后在連續(xù)處理4小時(shí)后再次增加。這種雙峰型表明了限制O2-的細(xì)胞機(jī)制并且提示“早期”和“晚期”O(jiān)2-最大值是因不同過(guò)程所致。
使用DiOC6(3)，即線粒體-選擇性電位測(cè)定探檢測(cè)Δψm的塌落。梯度改變從早期O2-反應(yīng)后開(kāi)始并且在＞90％的細(xì)胞中觀察到達(dá)5小時(shí)。
通過(guò)免疫印跡胞質(zhì)級(jí)分研究細(xì)胞色素c從線粒體中的釋放，即能夠使胱天蛋白酶活化的關(guān)鍵步驟。檢測(cè)到胞質(zhì)細(xì)胞色素c的水平高于用載體處理的細(xì)胞的量達(dá)5小時(shí)。這種釋放與Δψm的破壞同時(shí)發(fā)生，并且這些結(jié)果彼此與PT孔個(gè)開(kāi)放一致。實(shí)際上，使用Δψm塌落和細(xì)胞色素c釋放追蹤的O2-晚期增加提示O2-的二次升高是因這些過(guò)程所致。
通過(guò)處理泛-胱天蛋白酶敏感性熒光底物FAM-VAD-fmk測(cè)定胱天蛋白酶活化。使用Δψm追蹤胱天蛋白酶活化，而亞二倍體DNA的出現(xiàn)比胱天蛋白酶活化稍延緩。這些結(jié)果共同表明Bz-423誘導(dǎo)線粒體-依賴(lài)性細(xì)胞凋亡途徑。
實(shí)施例20.Bz-423直接靶向線粒體由于早期O2-在其它細(xì)胞結(jié)果前出現(xiàn)，所以可能的情況是這種ROS具有調(diào)節(jié)作用。在非-胞吞細(xì)胞中，氧化還原酶與MRC均為ROS的主要來(lái)源。檢測(cè)這些系統(tǒng)的抑制劑調(diào)節(jié)Bz-423-誘導(dǎo)的O2-的能力以便確定這種反應(yīng)的基礎(chǔ)。在這些試劑中，僅主要對(duì)細(xì)胞色素c氧化酶(線粒體呼吸鏈MRC的復(fù)合物IV)起作用的NaN3和微摩爾量的阻斷通過(guò)MRC復(fù)合物III的泛醇-細(xì)胞色素c還原酶成分形成O2-的FK506調(diào)節(jié)Bz-423。這些發(fā)現(xiàn)提示線粒體為Bz-423-誘導(dǎo)的O2-的來(lái)源，并且MRC的成分涉及所述的反應(yīng)。盡管FK506的抑制作用可能是因結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白或FK506-結(jié)合蛋白所致，但是緊密結(jié)合這些蛋白質(zhì)的天然產(chǎn)物(分別為雷帕霉素和環(huán)孢霉素A)不會(huì)減少Bz-423O2-反應(yīng)。
通過(guò)Bz-423的O2-產(chǎn)生可能是因結(jié)合線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)或傳導(dǎo)線粒體信號(hào)以產(chǎn)生ROS的另一隔室內(nèi)的靶標(biāo)所致。為了在這些選擇之間進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)監(jiān)測(cè)在有和沒(méi)有Bz-423存在下2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸鹽氧化成2′，7′-二氯熒光素來(lái)檢測(cè)分離的大鼠肝線粒體的ROS產(chǎn)生。在本試驗(yàn)中，DCF的產(chǎn)率在遲滯期后增加，在遲滯期過(guò)程中，內(nèi)源性還原當(dāng)量耗盡，并且探針上的乙酸鹽部分被水解成2′，7′-二氯二氫熒光素，即氧化還原-活性種類(lèi)。在支持狀態(tài)3呼吸的需氧條件下，基于每一曲線的斜率與對(duì)照組的比較，通過(guò)抑制泛醇-細(xì)胞色素c還原酶產(chǎn)生O2-的抗霉素A和Bz-423將ROS的產(chǎn)生速率在誘導(dǎo)期后增加了近2倍。未觀察到溶脹，表明Bz-423并不直接靶向MPT孔。Bz-423和抗霉素A在亞細(xì)胞S15級(jí)分(胞質(zhì)溶膠和微粒體)中均不產(chǎn)生大量ROS，并且盡管抗霉素A在這些條件下為活性的，但是如果線粒體處于狀態(tài)4，那么Bz-423不會(huì)刺激ROS。這些實(shí)驗(yàn)共同表明線粒體含有Bz-423的分子靶標(biāo)，且狀態(tài)3呼吸是O2-反應(yīng)所需的。
實(shí)施例21.Bz-423-誘導(dǎo)的ROS來(lái)源于線粒體MRC復(fù)合物I和III為線粒體內(nèi)ROS的主要來(lái)源。上述提供的證據(jù)提示Bz-423-誘導(dǎo)的ROS來(lái)源于線粒體。為了證實(shí)這一推定，剔除MRC功能，對(duì)所得的細(xì)胞檢驗(yàn)作為對(duì)Bz-423反應(yīng)的ROS。在MRC中的復(fù)合物I-IV部分由線粒體DNA(mtDNA)編碼。在有溴化乙錠存在下延長(zhǎng)時(shí)間期限內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞除去了mtDNA，提示mtDNA編碼的蛋白質(zhì)未產(chǎn)生，并且沿MRC的電子轉(zhuǎn)移未發(fā)生(不含mtDNA和相關(guān)蛋白的細(xì)胞通常稱(chēng)作ρ0細(xì)胞)。因?yàn)殇寤义V對(duì)Ramos細(xì)胞而言是毒性的，所以使用另一種成熟B細(xì)胞系Namalwa B細(xì)胞進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。用Bz-423處理Namalwa ρ0細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生ROS反應(yīng)，正如在Ramos和Namalwa ρ+細(xì)胞中觀察到的。
由于早期ROS對(duì)Bz-423誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡而言是關(guān)鍵的，所以使用Namalwa ρ0細(xì)胞檢測(cè)到的結(jié)果從表面上來(lái)看可以預(yù)測(cè)這些細(xì)胞可以防止Bz-423的毒性作用。然而，在6小時(shí)后，引起了MPT并且Namalwa ρ0細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡作為對(duì)Bz-423的反應(yīng)。在ρ+細(xì)胞中，通過(guò)MRC的質(zhì)子泵送維持了線粒體梯度Δψm。由于功能性MRC并不存在于ρ0細(xì)胞中，所以Δψm由作為ATPase起作用的復(fù)合物V(F1F0-ATPase)支持(缺失了ρ0細(xì)胞中的亞單位6和b消除了該酶的合酶活性)。在這種情況中，抑制復(fù)合物V ATPase可以產(chǎn)生梯度塌落和隨后的細(xì)胞死亡。
實(shí)施例22.Bz-423靶向線粒體F1F0-ATPase
結(jié)合線粒體F1F0-ATPase的大環(huán)內(nèi)酯天然產(chǎn)物寡霉素誘導(dǎo)狀態(tài)3-4的過(guò)渡并且如Bz-423產(chǎn)生O2-。基于這些相似性，可能的情況是F1F0-ATPase也為Bz-423的分子靶標(biāo)。為了測(cè)試這一推定，檢驗(yàn)Bz-423對(duì)亞-線粒體顆粒(SMPs)中ATPase活性的作用。實(shí)際上，Bz-423抑制了牛SMPs的線粒體ATPase活性，具有的ED 50約為5μM。
研發(fā)了＞40種的Bz-423衍生物以便確定有關(guān)生物活性所需的這種新活性劑的原理。在整個(gè)細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡試驗(yàn)中評(píng)價(jià)這些化合物揭示出C’4位上的羥基和接近萘基部分大小的芳族環(huán)是有用的。這些類(lèi)似物在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中的功效與使用SMPs的ATPase抑制實(shí)驗(yàn)中的ED50值相關(guān)。這些觀察結(jié)果表明線粒體ATPase為Bz-423的分子靶標(biāo)。在這些衍生物為細(xì)胞毒性的濃度(80μM)下，其它苯二氮雜類(lèi)和PBR配體(例如PK11195和4-氯地西泮)不會(huì)顯著抑制線粒體ATPase活性，從而提示Bz-423的分子靶標(biāo)不同于這些其它化合物的分子靶標(biāo)。
實(shí)施例23.Bz-423結(jié)合OSCP作為Bz-423機(jī)理研究的早期組的組成部分，通過(guò)用共價(jià)結(jié)合生物素的己基氨基連接基取代N-甲基合成生物素化類(lèi)似物(這種修飾不會(huì)改變Bz-423的活性)。將該分子用于探查作為融合蛋白在T7噬菌體上部表達(dá)的人乳腺癌cDNAs(Invitrogen)的展示文庫(kù)。在按照由Austin和合作者所述的篩選方法使用生物素化形式的KF506鑒定新FK506結(jié)合蛋白后，將線粒體F1F0-ATPase的OSCP成分鑒定為Bz-423的結(jié)合蛋白(附圖1)。
為了測(cè)定Bz-423是否確實(shí)結(jié)合OSCP和相互作用的親和力，在大腸桿菌中表達(dá)人OSCP。將Bz-423的溶液逐步滴入OSCP導(dǎo)致內(nèi)在蛋白熒光猝滅并且得到200±40nM的Kd(附圖2)。還測(cè)定了幾種Bz-423類(lèi)似物的結(jié)合并且發(fā)現(xiàn)它們對(duì)OSCP的親和力與其在完整細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)與使用SMP的ATPase抑制實(shí)驗(yàn)中的功效類(lèi)似。這些數(shù)據(jù)提供了Bz-423結(jié)合線粒體ATPase上的OSCP的令人信服的證據(jù)。Bz-423為唯一已知的通過(guò)結(jié)合OSCP起作用的ATPase抑制劑。由于OSCP不含ATP結(jié)合位點(diǎn)并且它不包括質(zhì)子通道，所以可能的情況是Bz-423通過(guò)改變ATPase發(fā)動(dòng)蛋白的分子運(yùn)動(dòng)起作用。
實(shí)施例24.OSCP的RNAi剔除防止了Bz-423誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡為了上述補(bǔ)充化學(xué)和生化靶標(biāo)鑒定和驗(yàn)證研究，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以便敲除完整細(xì)胞中的OSCP。在體外，從ATPase中除去OSCP消除了合酶功能，但不改變?cè)撁傅乃饣钚?。在酵母中，OSCP敲除并非是致命性的；在這些細(xì)胞中，ATP水解為支持Δψm提供了化學(xué)勢(shì)能，由此維持了線粒體完整性。由于酵母OSCP與哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)具有有限的序列同源性(～30％)，所以在來(lái)源于人的細(xì)胞系中進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。
由于OSCP為核編碼的，所以應(yīng)用RNA干擾(RNAi)，即一種可以獲得轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術(shù)以敲除這種蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用oligofectamine，使用對(duì)OSCP序列具有特異性的三種化學(xué)合成的小干擾RNA分子(siRNA)各自轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞。通過(guò)oligofectamine以高效(90％)方式轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。通過(guò)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)的免疫印跡分析OSCP表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)時(shí)發(fā)生OSCP表達(dá)的最大沉默(64％)(附圖3)。與用不規(guī)則的序列對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，OSCP siRNA轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞具有減少的Bz-ROS和編程性細(xì)胞死亡作為對(duì)Bz-423的反應(yīng)。這些結(jié)果表明siRNA，可有效地減少OSCP并且提示Bz-423介導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)涉及OSCP。
實(shí)施例25.Bz-423對(duì)細(xì)胞增殖的作用如同大部分1，4-苯二氮雜類(lèi)，Bz-423強(qiáng)力結(jié)合牛血清白蛋白(BSA)，這就降低了藥物在溶液中游離的有效濃度。例如，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的組織培養(yǎng)基中，約99％藥物結(jié)合BSA。因此，在含有2％FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以便減少結(jié)合BSA并且增加游離的[Bz-423]。在這些條件下，劑量響應(yīng)曲線十分銳利，使得濃度范圍有效，此時(shí)Bz-423僅部分有效。由于已知某些苯二氮雜類(lèi)具有抗-增殖特性，所以謹(jǐn)慎分析Bz-423在＜ED50的濃度下的作用，并且觀察到除誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡外，Bz-423還防止了3天培養(yǎng)后的細(xì)胞生長(zhǎng)。在這些低血清條件下，細(xì)胞毒性和抗-增殖作用重疊，使得難以對(duì)每種作用進(jìn)行獨(dú)立地研究。然而，通過(guò)增加[BSA]或增加FBS至10％，劑量響應(yīng)曲線變平直(并且細(xì)胞毒性ED50增加)且Bz-423誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性可以明顯地與對(duì)增殖的作用區(qū)分開(kāi)來(lái)。在較低藥物用量(例如10-15μM)下，Bz-423具有最低的細(xì)胞毒性，而在＞20μM的濃度下，僅觀察到編程性細(xì)胞死亡(包括雙峰型ROS反應(yīng)的上述死亡途徑并且還在含有10％FBS的培養(yǎng)基中觀察到)。盡管較高用量的藥物也可以阻斷增殖，但是在觀察到對(duì)增殖的作用前，還它會(huì)導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡。劑量響應(yīng)曲線與將BSA加入到含有2％FBS的培養(yǎng)基中以模擬含有10％FBS的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，這表明抗增殖和細(xì)胞毒性不受血清中的其它成分的影響。
為了證實(shí)在3天處理后細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組細(xì)胞減少是因增殖下降而非增殖平衡的細(xì)胞死亡所致，除進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)外，還研究了細(xì)胞分裂。PKH-67為不可逆結(jié)合細(xì)胞膜的熒光探針，并且在細(xì)胞分裂時(shí)，在子細(xì)胞之間等分，從而能夠通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行定量。用PKH67染色并且用Bz-423處理的Ramos細(xì)胞在亞細(xì)胞毒性濃度下具有較少的細(xì)胞分裂，證實(shí)細(xì)胞數(shù)量減少是因抗-增殖作用而非細(xì)胞死亡所致。為了測(cè)定Bz-423誘導(dǎo)的抗-增殖是否對(duì)Ramos細(xì)胞具有特異性，在其它B細(xì)胞系和來(lái)源于實(shí)體瘤的細(xì)胞系中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。正如在表3中觀察到的，對(duì)阻斷增殖的作用并非唯一針對(duì)淋巴樣細(xì)胞，這提示通常為多組織類(lèi)型的靶標(biāo)介導(dǎo)增殖中的阻斷。
表3.在含有10％FBS的培養(yǎng)基中處理72小時(shí)的細(xì)胞的抗增殖的ED50(μM)。用于研究的細(xì)胞包括轉(zhuǎn)染以便超表達(dá)Bcl-2和Bcl-xL的Ramos細(xì)胞和克??；含有裸p53的卵巢細(xì)胞(SKOV3)；神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(IMR-32，Lan-1，SHEP-1)；和惡性B細(xì)胞系。

實(shí)施例26.用Bz-423處理的細(xì)胞的基因概況分析進(jìn)行基因概況分析實(shí)驗(yàn)以便探查Bz-423阻斷細(xì)胞增殖的機(jī)理。在使用環(huán)己酰胺作為蛋白質(zhì)合成抑制劑的研究中，發(fā)現(xiàn)Bz-423-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并不依賴(lài)于新的蛋白質(zhì)合成。因此，基因表達(dá)中的改變僅可能更與抗-增殖機(jī)理相關(guān)。為了增加檢測(cè)涉及信號(hào)-響應(yīng)偶聯(lián)而非下游作用的改變的可能性，描繪用Bz-423處理3小時(shí)的細(xì)胞的概況。這就是ROS早期最大化后，但在其它細(xì)胞改變發(fā)生，包括線粒體滲透孔開(kāi)放前的特點(diǎn)。
Bz-423對(duì)致病性細(xì)胞類(lèi)型的前-細(xì)胞凋亡、細(xì)胞毒性和生長(zhǎng)抑制特性的發(fā)現(xiàn)確定了這類(lèi)活性為針對(duì)自身免疫性疾病、癌癥和其它腫瘤性疾病的治療劑的可能性。來(lái)自由該活性劑誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變的額外實(shí)驗(yàn)證據(jù)擴(kuò)大了對(duì)該化合物作用的機(jī)理理解并且添加到了它所調(diào)節(jié)的治療作用組成中。
使用Ramos細(xì)胞進(jìn)行的體外測(cè)試以確定Bz-423誘導(dǎo)的基因表達(dá)(在mRNA水平上)通過(guò)以500,000個(gè)細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。將溶劑對(duì)照(DMSO，終濃度0.1％V/V))、Bz-423或Bz-OMe(10μM)加入到細(xì)胞中。在4小時(shí)后，收集細(xì)胞并且使用Trizol試劑(#15596-018，Life Technologies，Rockville，MD)和RNeasy Maxi試劑盒(#75162，Qiagen，Valencia，CA)，按照制造商的方案制備RNA。通過(guò)使用存在于起始總RNA樣品中的聚(A)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。將單鏈cDNA轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA且然后在有生物素化UTP和CTP存在下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以便產(chǎn)生生物素-標(biāo)記的cRNA。在有Mg2+存在下使cRNA片段化并且與人基因組U133A Genechip陣列(Affymetrix)雜交。使用GeneArray掃描儀對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行定量并且按照Affymetrix提供的說(shuō)明進(jìn)行分析。
使用代表約22,000個(gè)人基因的HGU133A Affymetrix基因芯片進(jìn)行使用RNA(分離自用Bz-423、Bz-OMe或載體對(duì)照處理的細(xì)胞)的表達(dá)概括分析。使用包括p＜0.01的標(biāo)準(zhǔn)，16個(gè)基因的表達(dá)超過(guò)對(duì)照組細(xì)胞8-倍或8-倍以上。正如基于Bz-423分子靶標(biāo)預(yù)測(cè)的，這些基因中的許多涉及糖酵解。
分析數(shù)據(jù)以便按照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因改變Bz處理，所述的標(biāo)準(zhǔn)為log-轉(zhuǎn)化的平均信號(hào)在治療樣品至少比載體對(duì)照組樣品改變4-倍，并且對(duì)照組值的變異系數(shù)(n＝4)小于10％。這些基因代表了可以介導(dǎo)治療反應(yīng)的靶標(biāo)。
Bz-423和Bz-OMe的基因表達(dá)結(jié)果各自提供了獨(dú)特的信息指紋。Bz-OMe的結(jié)構(gòu)如下 某些基因的表達(dá)在接觸Bz-423和Bz-OMe后類(lèi)似地改變。因此，通常在兩種化合物之間調(diào)節(jié)的基因?qū)斫馔ㄟ^(guò)更一般類(lèi)的化合物的基因調(diào)節(jié)而言特別相關(guān)。附圖4代表了用Bz-423和Bz-OMe處理的細(xì)胞的基因表達(dá)概況分析。
實(shí)施例27.Bz-423對(duì)ODC水平和活性的作用為了測(cè)定ODC活性和聚胺代謝是否如RNA概況分析數(shù)據(jù)提示的受Bz-423影響，與載體對(duì)照組相比直接測(cè)定用Bz-423處理的細(xì)胞中的ODC活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用3H-鳥(niǎo)氨酸對(duì)鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化成腐胺進(jìn)行定量。為了進(jìn)行對(duì)比，用載體對(duì)照或二氟甲基烏氨酸(DFMO)，即一種鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的有效抑制劑(如Bz-423，DFMO為有效的抗-增殖藥)處理對(duì)照組細(xì)胞。正如附圖3中所觀察到的，用Bz-423將細(xì)胞處理4小時(shí)以劑量依賴(lài)性方式顯著降低了ODC活性，正如RNA概況分析提示的，這一結(jié)果與抗酶蛋白1增加等的情況一致。ODC活性下降與在相同條件下測(cè)定的ODC蛋白質(zhì)水平下降類(lèi)似。
如上所述，Bz-423誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡由產(chǎn)生自MRC復(fù)合物III的ROS反應(yīng)傳導(dǎo)信號(hào)作為狀態(tài)3-4過(guò)渡的結(jié)果。接下來(lái)要探求以便確定對(duì)編程性細(xì)胞死亡而言關(guān)鍵性的ROS反應(yīng)是否也介導(dǎo)對(duì)ODC的這些作用。如果降低ODC活性需要ROS，那么它同樣涉及作為對(duì)Bz-423的抗-增殖反應(yīng)的可能組成部分。為了測(cè)試這一結(jié)果，使用Bz-423、DFMO或載體對(duì)照將Ramos細(xì)胞處理4小時(shí)。平行地用MnTBAP預(yù)孵育第二組細(xì)胞以便限制ROS且然后與Bz-423、DFMO和載體對(duì)照一起孵育。MnTBAP顯著逆轉(zhuǎn)了Bz-423對(duì)ODC的抑制。
這些數(shù)據(jù)共同提示可能的解釋在于高[Bz-423](例如＞10μM)產(chǎn)生足量的ROS，它不能被細(xì)胞抗-氧化劑解毒并且在18小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡。較低[Bz-423]按比例誘導(dǎo)不足以引起編程性細(xì)胞死亡的較小的ROS反應(yīng)。然而，在這種情況中，ROS能夠抑制ODC，否則就阻斷細(xì)胞增殖。
與這種推定一致，酚羥基被Cl取代(命名為Bz-Cl)的化合物具有最低的細(xì)胞毒性(與Bz-423相比活性下降了約80％)并且在細(xì)胞中產(chǎn)生了少量ROS反應(yīng)，同時(shí)與OSCP的結(jié)合也較為不緊密( )。該化合物還抑制了ODC活性(附圖3)，正如通過(guò)上述推定預(yù)測(cè)的。由于獲得了Bz-423誘導(dǎo)的ROS在介導(dǎo)生長(zhǎng)抑制中的提出的作用和性質(zhì)，對(duì)表2中的細(xì)胞組測(cè)試Bz-Cl并且發(fā)現(xiàn)3天后，它將增殖減少至與Bz-423相似的程度，其中ED50值相差無(wú)幾。這些結(jié)果表明可以使用阻斷增殖而不誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的Bz-423的化學(xué)類(lèi)似物獲得這些化合物的抗增殖作用。
實(shí)施例28.新的細(xì)胞毒性苯二氮雜類(lèi)的結(jié)構(gòu)活性研究基于這些Bz-423的特性，合成了一系列的Bz-423衍生物以便探查對(duì)結(jié)合和活性而言重要的這種新化合物的結(jié)構(gòu)單元。用氫取代N-甲基或氯對(duì)培養(yǎng)物中的無(wú)限增殖化Ramos B細(xì)胞或Jurkat T細(xì)胞的淋巴毒性活性幾乎沒(méi)有影響。類(lèi)似地，Bz-423的對(duì)映體為等效的，這表明Bz-423與其分子靶標(biāo)之間的相互作用涉及兩-點(diǎn)結(jié)合。與這些數(shù)據(jù)相反，除去了萘丙氨酸(參見(jiàn)，表1)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理，并且理解機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是預(yù)期用氫取代酚羥基的部分或用氫取代酚羥基消除了所有的細(xì)胞毒性活(表1)。基于這些觀察結(jié)果，研究了對(duì)C’3和C’4位的改變。用2-萘酚(2-naphtho)取代1-萘酚對(duì)殺傷細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用。類(lèi)似地，用其它相差無(wú)幾大小的疏水性基團(tuán)取代萘丙氨酸對(duì)Bz-423的細(xì)胞毒性特性幾乎沒(méi)有作用。相反，喹啉類(lèi)7-9的功效各自低于Bz-423。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理，并且理解機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是預(yù)期這些數(shù)據(jù)提示了疏水性取代基在Bz-423的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的優(yōu)選性。較小的C3取代基的活性?xún)H在一定程度上低于Bz-423，而帶有含氧的芳族基團(tuán)的化合物具有顯著低的細(xì)胞毒性。這些數(shù)據(jù)清楚地表明大的疏水性芳族取代基有用于最佳活性。
將甲基置于羥基鄰位不會(huì)改變Bz-423的活性，而除去C’4位上的羥基將功效降低了2-倍(表2)。相反，用氯或疊氮化物取代羥基或使苯酚甲基化可有效消除Bz-423的細(xì)胞毒性活性。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理，并且理解機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是預(yù)期這些數(shù)據(jù)表明位于C’4碳上的羥基是最佳活性所需的，可能在靶標(biāo)結(jié)合時(shí)成為關(guān)鍵的接觸。然而，具有苯酚亞結(jié)構(gòu)的分子還可以起MRC內(nèi)交替電子載體的作用。這類(lèi)試劑從MRC酶中接受電子并且將其轉(zhuǎn)移回具有較高還原電位的點(diǎn)上的鏈上。這種類(lèi)型的‘氧化還原循環(huán)’消耗了內(nèi)源性還原當(dāng)量(例如谷胱甘肽)與嘧啶核苷酸并且導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了在這些選擇之間區(qū)分，使用標(biāo)準(zhǔn)NADH和NAD(P)H氧化試驗(yàn)測(cè)定在有亞-線粒體顆粒存在下是否發(fā)生Bz-423氧化還原循環(huán)。不同于陽(yáng)性對(duì)照(多柔比星和甲萘醌)，Bz-423不會(huì)導(dǎo)致底物氧化，這強(qiáng)烈提示它不會(huì)發(fā)生氧化還原循環(huán)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理，并且理解機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是預(yù)期所述的數(shù)據(jù)共同表明化合物18-20的活性降低是因除去了介導(dǎo)Bz-423與其靶蛋白的相互作用所致。
細(xì)胞快速產(chǎn)生O2-作為對(duì)Bz-423的反應(yīng)并且阻斷該信號(hào)(例如通過(guò)抑制泛醇細(xì)胞色素c還原酶，即產(chǎn)生O2-作為對(duì)Bz-423反應(yīng)的酶)防止了編程性細(xì)胞死亡。為了測(cè)定Bz-423衍生物是否以與Bz-423類(lèi)似的方式殺傷細(xì)胞(推定為結(jié)合常見(jiàn)的分子靶標(biāo)的結(jié)果)，檢驗(yàn)FK506防止細(xì)胞死亡的能力，其微摩爾量有效抑制泛醇細(xì)胞色素c還原酶。僅對(duì)3-6、12、13、16和17觀察到了FK506的抑制作用( )，它們是帶有大于苯的疏水性C3側(cè)鏈的化合物。通過(guò)用18、19或20(以＞40μM)預(yù)處理細(xì)胞也抑制了由這些化合物(包括Bz-423)各自誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡( )?；衔?8、19和20對(duì)阻斷表2中所列的其它苯二氮雜類(lèi)的細(xì)胞毒性活性沒(méi)有影響( )。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理，并且理解機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是預(yù)期這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示Bz-423與3-6、12、13、16和17結(jié)合靶蛋白內(nèi)的相同位點(diǎn)，并且通過(guò)通常的機(jī)制誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。其它化合物不會(huì)結(jié)合在該位點(diǎn)上并且通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)死亡反應(yīng)。
實(shí)施例29.測(cè)定ATPase活性如上所述從新宰殺的牛的心臟中分離線粒體(例如，參見(jiàn)Graham，J.M.，“細(xì)胞器的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級(jí)和分離通過(guò)差異離心從組織和細(xì)胞中分離線粒體”-Current Protocols in Cell Biology.1999，JohnWiley & Sons，Inc；New York.p.3.3.3-3.3.4；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。所有緩沖液均含有2-巰基乙醇(5mM)。通過(guò)按照Walker等所述對(duì)牛心臟線粒體進(jìn)行聲處理制備亞線粒體顆粒(SMPs)(例如，參見(jiàn)Walker，J.E.等Methods Bnzymol，1995.260p.163-90；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)，但使用帶有0.5-in鈦探針的能量設(shè)定為8.5的Misonix超聲破碎器3000將線粒體混懸液的部分各自洗滌3次，每次40秒，在兩次聲處理之間有2分鐘間隔。通過(guò)將ADP產(chǎn)生與經(jīng)丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶反應(yīng)氧化NADH結(jié)合且然后在30℃下和340nm處通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定法監(jiān)測(cè)NADH氧化速率(rate)來(lái)測(cè)定線粒體F1F0-ATPase活性(例如，參見(jiàn)McEnery，M.W.等，J Biol Chem，1986.261(4)p.1745-52；Harris，D.A.，“分光光度測(cè)定法”-Spectrophotometry and Spectrofluorimetry，D.A.Harris，Bashford，C.L.，Editor.1987，IRL Press；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。反應(yīng)混合物(0.25mL終體積)含有Tris-HCl(100mM)，pH 8.0；ATP(0-2mM)；MgCl2(2mM)；KCl(50mM)；EDTA(0.2mM)；NADH(0.2mM)；磷酸烯醇丙酮酸(1mM)；丙酮酸激酶(0.5U)；和乳酸脫氫酶(0.5U)。樣品各自含有預(yù)先溫育的(30℃下5分鐘)SMPs(7μg)或純化的F1-ATPase(0.29μg)與不同濃度的Bz-423(或載體對(duì)照)。
實(shí)施例30.增生實(shí)驗(yàn)的試劑如上所述合成Bz-423(例如，參見(jiàn)Lattmann，E.等(2002)DrugDes Discov 18，9-21；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)，并且以20mg/ml溶于二甲亞砜水溶液(DMSO)。在所有實(shí)驗(yàn)中DMSO的存在終濃度為0.5％(v/v)或0.5％以下。所有其它用于本研究的苯二氮雜類(lèi)獲自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。RA獲自Sigma-Aldrich。以20mg/ml用DMSO中稀釋類(lèi)視色素并且冷凍貯存。在使用時(shí)，用培養(yǎng)基稀釋RA的儲(chǔ)備溶液并且以1.0μg/ml的終濃度使用。用于胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)研究的試劑包括對(duì)完全和磷酸化形式的EGF受體和所有和磷酸-Erk 1/2(獲自Cell Signaling Technologies，Inc.Beverly，MA)的抗體。對(duì)β-微管蛋白的抗體獲自Santacruz Biotech(Santa Cruz，CA)。除另有陳述外，所有其它化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich。
實(shí)施例31.用于增生實(shí)驗(yàn)的人皮膚器官培養(yǎng)物一式兩份的防曬髖皮膚的2mm全厚度鉆取活組織檢查樣品獲自年輕的成年志愿者。在本次設(shè)計(jì)中參與的人體受試者經(jīng)University ofMichigan Institutional Review Board批準(zhǔn)并且所有受試者均提供了書(shū)面的征得同意書(shū)，此后才包含的本研究中。在活組織檢查時(shí)即刻將組織進(jìn)入由角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(KBM)(Cambrex Bioscience，Walkersville，MD)組成的培養(yǎng)基中。KBM為低-Ca2+的不含血清的為高密度角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)而優(yōu)化的MCDB-153培養(yǎng)基的改進(jìn)培養(yǎng)基。給它補(bǔ)充CaCl2以使最終的Ca2+濃度達(dá)到1.4mM。在轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室的冰上后，在含有250μl Ca2+-補(bǔ)充的KBM與或不與額外的處理(例如RA和/或Bz-423)的24-孔平皿中溫育活檢樣品。將培養(yǎng)物在37℃下和95％空氣和5％CO2氣體中溫育。除將組織維持在最小體積的培養(yǎng)基中外，不進(jìn)行任何額外的處理以確保嚴(yán)格的氣-液界面。將溫育進(jìn)行8天，隔天改變培養(yǎng)基并且進(jìn)行新鮮處理。在溫育期結(jié)束時(shí)，將組織固定在10％緩沖的福爾馬林中并且在用蘇木精和伊紅染色后進(jìn)行組織學(xué)檢查。在每個(gè)組織切片的5個(gè)點(diǎn)上測(cè)定表皮厚度并且取平均值。測(cè)定未處理的、類(lèi)視色素接觸的和類(lèi)視色素+Bz-423-處理的活檢樣品的厚度平均值。在過(guò)去已經(jīng)描述了器官培養(yǎng)操作步驟(例如，參見(jiàn)Varani J等(1993)Amer.J.Pathol.142189-198，1993；Varani J等(1994)J.Clin.Invest.941747-1753；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。
實(shí)施例32.用于增生實(shí)驗(yàn)的單層培養(yǎng)物中的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞將獲自新生兒包皮環(huán)切術(shù)的包皮組織用作表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的來(lái)源。在本次設(shè)計(jì)中應(yīng)用的包皮組織均得到University of Michigan Institutional Review Board的批準(zhǔn)。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞如上所述分離包皮組織(例如，參見(jiàn)Varani J等(1994)J.Clin.Invest.941747-1753；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。將初級(jí)和早期傳代細(xì)胞維持在角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(KGM)(Cambrex Bioscience.)中。KGM含有與KBM相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，但進(jìn)一步補(bǔ)充了生長(zhǎng)因子的混合物，包括0.1ng/ml EGF、0.5μg/ml胰島素和0.4％牛垂體提取物。使獲自相同包皮組織的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在單層培養(yǎng)物中，該單層培養(yǎng)物中使用了補(bǔ)充了非必需氨基酸和10％胎牛血清(DMEM-FBS)的Dulbecco改進(jìn)的最小必需培養(yǎng)基。將角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞維持在37℃下和95％空氣和5％CO2氣體環(huán)境中。通過(guò)接觸胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并且使用第2-3代。
實(shí)施例33.用于增生實(shí)驗(yàn)的增殖測(cè)定以5×104個(gè)細(xì)胞/孔將角質(zhì)形成細(xì)胞接種在使用了KGM作為培養(yǎng)基的24-孔平板上。在細(xì)胞粘附后，洗滌它們且然后在含有不同濃度的Bz-423或其它如


中所述的苯二氮雜類(lèi)的KGM中溫育。在第3天時(shí)通過(guò)使用胰蛋白酶/EDTA釋放細(xì)胞并且使用粒子計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)對(duì)它們計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定增殖。按照相同方式進(jìn)行成纖維細(xì)胞增殖研究，但使用補(bǔ)充有1.4mM Ca2+的KBM作培養(yǎng)基。
實(shí)施例34.用于增生實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的制備和信號(hào)傳導(dǎo)中間體的免疫印跡分析以3×105個(gè)細(xì)胞/孔將角質(zhì)形成細(xì)胞在使用KGM作為培養(yǎng)基的6-孔平皿的孔中鋪板。使細(xì)胞粘附過(guò)夜。第2天洗滌它們且然后在含有或不含EGF(10ng/ml)和Bz-423(0.5或1.0μg/ml)的KBM中溫育。在溫育5或15分鐘后，使細(xì)胞在由20mM Tris-HCl(pH 7.4)、2mM釩酸鈉、1.0mM氟化鈉、100mM NaCl、1％NP-40、0.5％去氧膽酸鈉、抑肽酶、亮抑酶鈦和胃酶抑素各25μg/ml和2mM EDTA和EGTA組成的1X細(xì)胞溶解液中進(jìn)行細(xì)胞溶解。在4℃下通過(guò)將細(xì)胞刮入溶解緩沖液并且對(duì)樣品進(jìn)行聲處理進(jìn)行細(xì)胞溶解。將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物在冰上溫育30分鐘且然后通過(guò)微量離以16000g凈化15分鐘。收集上清液流體并且使用BioRad DC蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(BioRad，Hercules，CA)估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。
在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中對(duì)含有等量蛋白質(zhì)(40μg總蛋白質(zhì)/泳道)的細(xì)胞提取物進(jìn)行電泳。如上所述進(jìn)行對(duì)完全和磷酸化形式的EGF受體和所有Erk 1/2和磷酸-Erk 1/2的蛋白質(zhì)印跡(例如，參見(jiàn)Zeigler ME等(1999)J Cell Physiol 180271-284；將該文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
實(shí)施例35.用于增生實(shí)驗(yàn)的胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的檢測(cè)在各自使用前將2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA，Molecular Probes，Eugene，OR)制備成10mM在DMSO中的儲(chǔ)備溶液。給在48-孔中生長(zhǎng)的細(xì)胞中加載(30分鐘，37℃)DCFH-DA(100μM)，將它們直接加入到培養(yǎng)基中，洗滌，然后放入新鮮培養(yǎng)基中，此后進(jìn)行處理。在孵育處理后，通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，使用FACSCalibur(BDBioscience，San Diego，CA)監(jiān)測(cè)氧化產(chǎn)物2′，7′-二氯熒光素(DCF)的熒光。就每一樣品而言，記錄10,000個(gè)結(jié)果并且分析數(shù)據(jù)以便測(cè)定熒光強(qiáng)度中位值。
實(shí)施例36.Bz-423減小了用于增生實(shí)驗(yàn)的器官培養(yǎng)物中RA-處理的人皮膚的表皮厚度在來(lái)自在器官培養(yǎng)物中溫育8天的健康志愿者的人皮膚的2-mm鉆取活組織檢查樣品維持了正常皮膚的組織學(xué)特征(附圖5A & 5D)。當(dāng)將來(lái)自相同受試者的一式兩份的活檢樣品在連續(xù)存在的RA(1μg/ml，0.01％的DMSO載體的終濃度)存在下培養(yǎng)時(shí)，表皮增生發(fā)生(附圖5B &5E)。當(dāng)在含有RA(1μg/ml)和Bz-423(0.5μg/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活檢樣本時(shí)，抑制了上皮的過(guò)度增殖反應(yīng)(附圖5C & 5F)。
使用來(lái)自5位單獨(dú)的人供體的皮膚表皮厚度平均測(cè)量值揭示出Bz-423減輕了RA-誘導(dǎo)的表皮增厚(附圖5，下組)。在未處理的皮膚中，表皮厚度平均值為23±3μm2。在有RA(1μg/ml)存在下，表皮厚度增加至50±4μm2，而在有RA(1μg/ml)+Bz-423(0.5μg/ml)存在下，表皮厚度為33±3μm2(p＜0.05)(附圖5，下組)。對(duì)使用在器官中Bz-423處理的活檢樣本的謹(jǐn)慎顯微鏡評(píng)價(jià)沒(méi)有額外的歸因于Bz-423的組織學(xué)改變。特別地，鑒定了在細(xì)胞構(gòu)成或真皮結(jié)構(gòu)中沒(méi)有差異，在真皮-表皮界面上沒(méi)有改變，并且對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化和角質(zhì)化沒(méi)有影響。此外，值得注意的是Bz-423處理的樣本缺乏增加的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞。
在額外的研究中，用不同濃度的Bz-423處理RA-接觸的皮膚并且檢查表皮厚度。在0.1μg/ml下，表皮增厚為得到減輕，但低于0.5μg/ml下的水平。在較高Bz-423濃度下(例如1和5μg/ml)也觀察到表皮厚度下降。在5μg/ml，觀察到壞死。
實(shí)施例37.Bz-423增加角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的ROS在1小時(shí)處理中，Bz-423以劑量依賴(lài)性方式增加淋巴樣細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生。為了測(cè)定角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中對(duì)Bz-423的抗-增殖反應(yīng)是否類(lèi)似地涉及ROS產(chǎn)生，測(cè)定Bz-423處理的細(xì)胞中的胞內(nèi)ROS水平。正如附圖6中所示，在低至250nM的Bz-423劑量下在兩種細(xì)胞類(lèi)型中均觀察到了ROS反應(yīng)，將其評(píng)價(jià)為平均細(xì)胞熒光。ROS反應(yīng)以劑量依賴(lài)性方式在兩種細(xì)胞類(lèi)型中增加。在所有測(cè)試濃度下，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的ROS反應(yīng)均大于成纖維細(xì)胞(附圖6)。當(dāng)使用高于基線，而不是平均細(xì)胞熒光的細(xì)胞級(jí)分評(píng)價(jià)ROS產(chǎn)生時(shí)，獲得了相似的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，但是與淋巴樣細(xì)胞中在先的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，這些結(jié)果表明在接觸Bz-423時(shí)在角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中ROS水平的早期升高。照此，在上述涉及直接結(jié)合產(chǎn)生線粒體ROS的靶標(biāo)的淋巴樣細(xì)胞中測(cè)定的Bz-423作用機(jī)制涉及減少角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和表皮增生。
實(shí)施例38.Bz-423對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中EGF受體表達(dá)和Erk磷酸化的作用因?yàn)镋GF受體活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)MAP激酶途徑i)被活化作為對(duì)誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的刺激的反應(yīng)；和ii)在表皮增生的發(fā)病機(jī)制中起作用，所以推定在Bz-423處理的角質(zhì)形成細(xì)胞中，EGF受體活化和MAP激酶(Erk1/2)信號(hào)傳導(dǎo)受到影響。為了測(cè)試這種可能性，在促細(xì)胞分裂劑刺激后測(cè)定未處理和Bz-423處理的細(xì)胞中EGF受體的完全和磷酸化形式。將不含生長(zhǎng)因子的角質(zhì)形成細(xì)胞與Bz-423(0、0.5或1.0μM)一起預(yù)孵育10分鐘且然后用EGF(10ng/ml)刺激。恰在添加EGF前，對(duì)在EGF刺激后5分鐘和15分鐘由一式兩份樣品制備的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行分析A完全和磷酸化EGF受體表達(dá)；和B完全和磷酸化ERK 1/2表達(dá)。通過(guò)掃描光密度測(cè)定法(denitometry)對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)水平進(jìn)行定量。在完全或磷酸化EGF受體的水平方面未檢測(cè)到差異。類(lèi)似地，在有或沒(méi)有Bz-423存在下評(píng)價(jià)角質(zhì)形成細(xì)胞的促細(xì)胞分裂劑刺激前和之后即刻的Erk1/2的磷酸化狀態(tài)。盡管未觀察到總Erk1/2蛋白的改變，但是EGF-誘導(dǎo)的Erk-磷酸化以劑量依賴(lài)性方式被Bz-423減少。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要，盡管如此，這些結(jié)果表明Bz-423在角質(zhì)形成細(xì)胞中的抗增殖作用與減少的Erk活化相關(guān)，并且該作用為介導(dǎo)的EGF受體下游的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明Bz-423調(diào)節(jié)活化EGF受體與Erk1/2，包括Erk1/2自身之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中涉及的一種或多種激酶/磷酸酶(通過(guò)ROS直接或間接)。
實(shí)施例39.增生實(shí)驗(yàn)的討論上述研究已經(jīng)提供了令人信服的證據(jù)，即表皮增生(發(fā)生在疾病，諸如牛皮癬中，以及局部類(lèi)視色素療法的結(jié)果)涉及EGF受體的配體的皮內(nèi)產(chǎn)生和自分泌或旁分泌EGF受體活化(例如，參見(jiàn)Gottlieb AB等(1988)J.Exp.Med.167670-675；Elder JT等(1989)Science243811-814；Piepkorn M等(1998)J Invest Dermatol 111715-721；Piepkorn M等(2003)Arch Dermatol Res 2727；Cook PW等(1992)Cancer Res 523224-3227；Varani J等(1998)Pathobiology 66253-259；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。EGF受體活化和伴隨的下游信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)果提供了用于增生疾病中療法的靶標(biāo)，因?yàn)樯硇越琴|(zhì)形成細(xì)胞增殖在有EGF受體阻斷存在下持續(xù)(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341Varani J等(1998)Pathobiology 66253-259；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)，并且因?yàn)檎嫫すδ芤膊灰蕾?lài)于EGF受體活性(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341；VaraniJ等(1998)Pathobiology 66253-259；Tavakkol A等(1999)Arch.Dermatol.Res.291643-651；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，在本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)一種新的苯二氮雜類(lèi)似物Bz-423和相關(guān)化合物抑制人皮膚器官培養(yǎng)物中類(lèi)視色素-誘導(dǎo)的表皮增生，但對(duì)成纖維細(xì)胞功能無(wú)有害作用。
最初將Bz-423研發(fā)為前-細(xì)胞凋亡劑，它對(duì)自身免疫性疾病和某些惡性腫瘤具有有效性。在兩種情況中，指定靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性為目標(biāo)。在上述這些研究中發(fā)現(xiàn)除細(xì)胞毒性活性外，Bz-423在某些條件下也是細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性的。本申請(qǐng)(例如抑制表皮中的增生生長(zhǎng)，但不抑制正常的表皮或真皮情況)利用了該分子的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制潛能。
本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，Bz-423抑制增生表皮生長(zhǎng)的機(jī)理尚未得到完全理解。使用惡性B-淋巴細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，低水平的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與生長(zhǎng)抑制和具有細(xì)胞毒性的ROS大量產(chǎn)生相關(guān)。胞內(nèi)ROS產(chǎn)生作為對(duì)Bz-423的反應(yīng)也可能發(fā)生在皮膚中。誘導(dǎo)單層培養(yǎng)物中角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的Bz-423濃度與在器官培養(yǎng)物中抑制增生的濃度相同。最后，兩種透入細(xì)胞的抗-氧化劑的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)了Bz-423在角質(zhì)形成細(xì)胞中的抗-增殖作用。上述研究已經(jīng)證實(shí)，使表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接觸紫外光可以以依賴(lài)于氧自由基產(chǎn)生的過(guò)程誘導(dǎo)EGF受體磷酸化。在EGF受體磷酸化狀態(tài)中未觀察到改變作為用Bz-423處理的結(jié)果。另一方面，通過(guò)相同處理可以減量調(diào)節(jié)Erk磷酸化。Erk活化(通過(guò)磷酸化證實(shí))為EGF受體活化的下游靶標(biāo)，而且還作為大量其它受體-配體相互作用的下游結(jié)果發(fā)生(例如，參見(jiàn)Alpin AE等(1998)Pharmacol.Rev.50197-263；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，仍預(yù)期胞內(nèi)ROS產(chǎn)生使來(lái)源于不同起點(diǎn)的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)果分離。
干擾類(lèi)視色素-誘導(dǎo)的表皮增生，但不影響真皮功能的能力提供了治療途徑。一般可接受的是在局部施用RA后在皮膚中發(fā)生的增生以一定方式產(chǎn)生伴隨類(lèi)視色素處理附帶的皮膚刺激。類(lèi)視色素-誘導(dǎo)的皮膚刺激的主要表現(xiàn)為發(fā)紅和脫屑(例如，參見(jiàn)Kang S等(1995)J InvestDermatol.105549-556；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。基于刺激反應(yīng)的細(xì)胞和分子結(jié)果尚未得到完全理解。它們可以部分反映出白細(xì)胞介素-1(IL-1)和其它細(xì)胞因子在快速增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞群中的加工(例如，參見(jiàn)Maas-Szabowski N等(2000)J.Invest.Dermatol.1141075-1084；Wood LC等(1996)J.Invest.Dermatol.106397-403；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。這些細(xì)胞因子產(chǎn)生血管功能的局限化改變(例如，參見(jiàn)Nguyen M等(2001)CellBiol.33960-970；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)，由此促進(jìn)水腫和炎癥細(xì)胞流入，認(rèn)為這直接導(dǎo)致了皮膚發(fā)紅。另一方面，脫屑(flaking)可能單純反映出表皮從皮膚中過(guò)度脫落。此時(shí)，認(rèn)為類(lèi)視色素在表皮和真皮中的作用通過(guò)相同途徑發(fā)生。照此，認(rèn)為真皮中類(lèi)視色素處理的有益作用(例如成纖維細(xì)胞活化、前膠原產(chǎn)生增加和基質(zhì)金屬蛋白酶加工減少)(例如，參見(jiàn)Griffiths CEM等(1993)New Eng.J.Med.1993329530-534；Fisher GJ等Datta SC等(1996)Nature，379335-338；Varani J等(2000)J.Invest.Dermatol.114480-486；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)和皮膚刺激是不可分離的。然而，近來(lái)的研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)EGF受體酪氨酸激酶活性的拮抗作用抑制了表皮增生，但不會(huì)干擾在真皮中的有益作用(例如，參見(jiàn)Varani J等(2001)J.Invest.Dermatol 1171335-1341；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。其它研究已經(jīng)證實(shí)抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)也可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，但不會(huì)阻斷成纖維細(xì)胞功能(例如，參見(jiàn)Bhagavathula N等(2004)J.Invest.Dermatol.122130-139；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，Bz-423和相關(guān)化合物可以通過(guò)干擾引導(dǎo)EGF受體活化到增殖的途徑中的中間信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)果(Erk活化)具有類(lèi)似的作用。不一定完全抑制Erk活化以防止表皮增生。實(shí)際上，完全抑制Erk磷酸化與細(xì)胞毒性而非白細(xì)胞郁積相關(guān)(例如，參見(jiàn)Zeigler ME等(1999)J細(xì)胞Physiol.，180271-284；將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。
本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，但是干擾EGF受體-介導(dǎo)的表皮增生的活性劑用作抗-牛皮癬藥。許多手段已經(jīng)證實(shí)盡管牛皮癬中的觸發(fā)結(jié)果在于免疫系統(tǒng)缺陷(例如，參見(jiàn)Valdimarsson H等(1995)ImmunologyToday.16145-149；Austin LM等(1999)J.Invest.Dermatol.113101-108；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)，但是陷入增生的下游情況包括損害皮膚表皮中的EGF受體的自分泌或旁分泌活化(例如，參見(jiàn)Gottlieb AB等(1988)J.Exp.Med.167670-675；Elder JT等(1989)Science 243811-814；Piepkorn M等(1998)JInvest Dermatol 111715-721；Piepkorn M等(2003)Arch DermatolRes 2727；Cook PW等(1992)Cancer Res 523224-3227；VaraniJ等(1998)Pathobiology 66253-259；將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文作為參考)。
Bz-423為對(duì)培養(yǎng)中的許多細(xì)胞類(lèi)型具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的苯二氮雜類(lèi)似物。本發(fā)明并不限于特定的機(jī)理。實(shí)際上，理解該機(jī)理對(duì)實(shí)施本發(fā)明而言不一定必要。盡管如此，但是在本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用Bz-423和相關(guān)化合物處理器官培養(yǎng)物中的人皮膚抑制了因同時(shí)使用類(lèi)視色素處理導(dǎo)致的表皮增生。抑制類(lèi)視色素-誘導(dǎo)的人皮膚器官培養(yǎng)物中的增生的能力提供了用于減輕類(lèi)視色素在皮膚中的刺激反應(yīng)的組合物和方法。
將上述說(shuō)明書(shū)中提及的所有公開(kāi)文獻(xiàn)和專(zhuān)列引入本文作為參考。盡管已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限于這類(lèi)具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，為實(shí)施本發(fā)明描述的方式的各種變型對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)，它們屬于如下權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞的方法，包括a)提供含有過(guò)度增殖的上皮細(xì)胞的樣品和包含苯二氮雜類(lèi)化合物的組合物；和b)將所述的組合物施用給所述的樣品。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的組合物施用給所述的樣品減少了所述樣品中的ErK活化。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的組合物施用給所述的樣品抑制了所述樣品中的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包含局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇選自0.1％曲安奈德霜和0.05％二丙酸倍他米松霜。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包含2-10％的煤焦油。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包括維生素D-3類(lèi)似物，
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的維生素D-3類(lèi)似物為卡泊三烯。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包括角質(zhì)軟化劑。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的角質(zhì)軟化劑為0.1-1％的地蒽酚。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包含局部用類(lèi)視色素。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的局部用類(lèi)視色素選自維A酸和他扎羅汀組成的組。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的樣品為有生命的受試者。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的有生命的受試者為患有表皮增生的人。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的有生命的受試者患有牛皮癬。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的苯二氮雜類(lèi)化合物為Bz-423。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的苯二氮雜類(lèi)化合物含有如下通式 包括R和S對(duì)映體形式和外消旋混合物；其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2，其中R’如上述R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中所述的大于苯包括任意的含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的化學(xué)基團(tuán)。
18.藥物組合物，包括a)調(diào)節(jié)表皮增生的苯二氮雜類(lèi)化合物；和b)選自下組的活性劑局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇、角質(zhì)軟化劑、局部用類(lèi)視色素、2-10％的煤焦油和維生素D-3類(lèi)似物。
19.權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述的苯二氮雜類(lèi)化合物為Bz-423。
20.權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述的苯二氮雜類(lèi)化合物含有如下通式 包括R和S對(duì)映體形式和外消旋混合物；其中R1、R2、R3和R4選自下列基團(tuán)組成的組氫；CH3；帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰基的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)醚子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R5選自下列基團(tuán)組成的組OH；NO2；OR’；其中R’選自下列基團(tuán)組成的組帶有至少1個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)羥基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硫氫基子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被醛子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酮子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈，其中所述的脂族鏈被羧酸子基團(tuán)封端；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)酰胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)?；闹辨溁蛑ф湹娘柡突虿伙柡偷闹彐?；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)含氮部分的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)胺子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)鹵素子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；帶有至少2個(gè)碳且?guī)в兄辽?個(gè)硝子基團(tuán)的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；其中R6選自下列基團(tuán)組成的組氫；NO2；Cl；F；Br；I；SR’；和NR’2；其中R’如上述R5中所定義；其中R7選自下列基團(tuán)組成的組氫；帶有至少2個(gè)碳的直鏈或支鏈的飽和或不飽和的脂族鏈；且其中R8為大于苯的脂族環(huán)狀基團(tuán)；其中所述的大于苯包括任意的含有7或7個(gè)以上非-氫的原子的化學(xué)基團(tuán)。
21.權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述的藥物組合物用于治療表皮增生。
22.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述的表皮增生由牛皮癬導(dǎo)致。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的化學(xué)化合物，其發(fā)現(xiàn)方法，及其治療應(yīng)用。特別地，本發(fā)明提供了苯二氮雜類(lèi)衍生物和使用苯二氮雜類(lèi)衍生物作為治療與程序性細(xì)胞死亡、自身免疫性、炎癥和過(guò)度增殖等過(guò)程的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)相關(guān)的一系列疾病的治療劑的方法。
文檔編號(hào)A61K31/05GK101052385SQ200580029827
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者G·D·格里克 申請(qǐng)人:密執(zhí)安州立大學(xué)董事會(huì)