專利名稱：(4－烷基哌嗪基)(苯基)甲酮在治療阿爾茨海默病中的應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請參考本申請根據(jù)35 U.S.C.119(e)，要求對2004年4月15日提交的序列號為60/562,643的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是老年人中最常見的癡呆癥，影響65歲以上老人的約10％和80歲以上老人的約40％。熟悉的AD是該病的早發(fā)形式，它涉及淀粉樣蛋白前體(APP)基因的各種變異，不超過AD總病例的5％。該病的遲發(fā)形式，也稱作散發(fā)形式，占AD病例的95％以上，其起因仍不清楚。已經(jīng)確定或推測了幾種危險(xiǎn)因子。這包括載脂蛋白E基因的ε4等位基因，社會(huì)經(jīng)濟(jì)處境或先前的醫(yī)療狀況，但還未確定該病的發(fā)生或進(jìn)展的因果關(guān)系。
AD的臨床特點(diǎn)是認(rèn)知過程的逐漸和不可逆的損害以及記憶變化，并且常伴隨著非認(rèn)知性的癥狀，包括抑郁(Robert et al.，Alzheimer’sDiseasefrom moleculat biology to therapy，R.Becker et al.，eds.，(1996)，487-493)。阿爾茨海墨病(AD)神經(jīng)病理學(xué)在組織學(xué)上的特征在于，由于tau蛋白的過度磷酸化(Kosik et al.，(1986)PNAS USA834044-8)，造成腦β-淀粉樣(Aβ)肽濃度增高伴隨老年斑形成(Nikaidoet al.(1970)Trans.Am.Neurol.Assoc.9547-50)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的出現(xiàn)。Aβ是在膜酶β-和γ-分泌酶作用下β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)發(fā)生蛋白酶能而產(chǎn)生的。Aβ以最常見的40個(gè)氨基酸長度的Aβ1-40形式或42個(gè)氨基酸的Aβ1-42形式存在，據(jù)報(bào)道后者的神經(jīng)毒性比Aβ1-40更大。雖然在過去10年中對Aβ-介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的了解有了顯著的增加，但是還沒有以Aβ1-42為目標(biāo)的治療策略顯示出成功地減慢疾病的進(jìn)展。相反，目前所研究的治療AD的策略包括Aβ生產(chǎn)的抑制劑，防止其低聚或纖維化的化合物，消炎藥物，膽固醇合成抑制劑，抗氧化劑，神經(jīng)修復(fù)因子和疫苗
Selkoe，D.J.(1999)Nature399，A23-31；Emilien，G.，et al.(2000)Arch.Neurol.57，454-459；Klein，W.L.(2002)Neurochem.Internat.41，345-52；Helmuth，L.(2002)Science 297(5585)，1260-21。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過例如阻斷或抑制谷氨酸或β-淀粉樣蛋白，例如Aβ1-42、Aβ1-40或Aβ1-43，損傷哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的能力治療阿爾茨海默病的方法。因此，本發(fā)明提供了一種治療受到阿爾茨海默病威脅或折磨的哺乳動(dòng)物的方法，該方法是向所述哺乳動(dòng)物施用有效數(shù)量的式1化合物或其可藥用的鹽 其中a)R1、R2和R3分別是H，OH，鹵素，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C3-C6)環(huán)烷基，(C3-C6)環(huán)烷基((C1-C6)烷基)，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷?；?，鹵素(C1-C6)烷基，羥基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基羰基，(C1-C6)烷硫基，硫代(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷酰氧基；N(R6)(R7)，其中R6和R7分別是H，O，(C1-C6)烷基，(C3-C6)環(huán)烷基，(C3-C6)環(huán)烷基(C1-C6)烷基，苯基或芐基，或者R6和R7與它們所連接的N一起形成一個(gè)5或6元環(huán)，該環(huán)可任選地含有1-2個(gè)S、N(R6)或非過氧化物的O；或者R1和R2合起來是亞甲二氧基；b)Y和Z合起來是＝O，-O(CH2)mO-或-(CH2)m-，其中m是2-4，或者Y是H，Z是OR9或SR9，其中R9是H或(C1-C4)烷基；c)X是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羥基(C1-C6)烷基(C3-C12)烯基、(C2-C6)炔基、羧基、(C1-C6)烷氧羰基、硫代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、(C3-C12)雜環(huán)基、(C3-C12)雜環(huán)烷基(C1-C6)烷基、芳基或雜芳基，可任選地被1、2或3個(gè)R1取代。
優(yōu)選R1、R2或R3中至少一個(gè)不是H，例如R1、R2和R3中的1、2或3個(gè)不是H。
優(yōu)選R1是(C1-C6)烷氧基，例如(C1-C3)烷氧基，最好是在4-位。
優(yōu)選R1和R2是(C1-C6)烷氧基，例如(C1-C3)烷氧基，最好是在3，4-位。
優(yōu)選R1、R2和R3是(C1-C6)烷氧基，例如(C1-C3)烷氧基，優(yōu)選在2，3和/或4-位，或者R1、R2和R3中的兩個(gè)是亞甲二氧基。
優(yōu)選Z和Y合起來是＝O(氧基)。
優(yōu)選X是(C1-C6)烷基，例如(C1-C3)烷基，如CH3或CH2CH3；或者X是CH[(C1-C6)烷基][CO2Q]，其中Q是H或(C1-C6)烷基。
優(yōu)選X是(C3-C12)雜環(huán)基。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，例如單位劑型，其中含有與可藥用的稀釋劑或載體組合的式I化合物或其可藥用的鹽，它可任選地包含上述一類或多類抗AD藥物中的一種或多種抗AD藥，并可任選地含有穩(wěn)定劑、防腐劑和吸收控制劑。
另外，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(例如人)中的病理狀態(tài)或癥狀的治療方法，該病理狀態(tài)或癥狀與AD或AD的發(fā)作有關(guān)，或與病原體如β-淀粉樣肽和/或谷氨酸對哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的毒性有關(guān)，其中希望抑制所述的毒性，或者希望下調(diào)隨后誘發(fā)的病理途徑，該方法包括對需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的式I化合物或其可藥用的鹽。
因此，本發(fā)明還提供了一種治療方法，用以治療與谷氨酸網(wǎng)絡(luò)活性過高有關(guān)的神經(jīng)疾病，例如腦缺血，與艾滋病有關(guān)的癡呆，中風(fēng)，腦創(chuàng)傷或脊髓損傷等。
本發(fā)明提供了用于藥物治療(例如用于治療受AD折磨或威脅的哺乳動(dòng)物)的式I化合物，以及式I化合物在制造用于治療哺乳動(dòng)物(例如人，如AD患者)的至少一種AD癥狀的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了新的式I化合物及其中所公開的可用于制備式(I)化合物或其鹽的方法和中間體。這包括其中C(Y)(Z)基團(tuán)與R1、R2或R3的碳原子結(jié)合或與哌嗪或高哌嗪的CH2基團(tuán)結(jié)合的那些類似物。很多式I化合物還可作為中間體用于制備式I化合物。
附圖簡述

圖1描繪了普魯卡因和一些普魯卡因衍生物的化學(xué)式。SP015、SP016和SP017是用普魯卡因和普魯卡因酰胺作為亞結(jié)構(gòu)通過篩選天然化合物數(shù)據(jù)庫確定的。
圖2(實(shí)驗(yàn)組A至C)描繪了Aβ1-42對鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC 12細(xì)胞的影響；細(xì)胞生存力利用MTT試驗(yàn)(A)和測定胞內(nèi)ATP濃度(B)來確定。Aβ1-42對自由基產(chǎn)生的影響用熒光探針2，7-DCF確定(C)。將PC 12細(xì)胞暴露于濃度漸增的Aβ1-42中(C＝對照)，暴露24小時(shí)后測定各種參數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析用單向ANOVA和隨后的Dunnett試驗(yàn)進(jìn)行。平均±SD，n＝6。除非另外指明，與對照樣比較，*p＜0.05，***p＜0.001。
圖3(實(shí)驗(yàn)組A-F)描繪了普魯卡因和SP008對細(xì)胞生存力和Aβ1-42造成的PC 12細(xì)胞中ATP耗竭的影響。PC 12細(xì)胞預(yù)行用濃度漸增的普魯卡因或SP 008預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后暴露于濃度漸增的Aβ1-42中24小時(shí)。細(xì)胞生存力用MTT試驗(yàn)測定(A，B，C)，自由基的產(chǎn)生用熒光探針2，7-DCF測定(D，E，F(xiàn))。細(xì)胞生存力的結(jié)果表示成NADPH-黃遞酶活性的抑制百分?jǐn)?shù)，認(rèn)為100％抑制相應(yīng)于用Aβ1-42觀察到的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析用單向ANOVA和隨后的Dun-nett試驗(yàn)進(jìn)行。平均值±SD，n＝6。除非另外指明，與載體相比，*p＜0.05，**p＜0.001。
圖4描繪了普魯卡因和SP 008對于谷氨酸誘發(fā)的PC 12細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)作用。PC 12細(xì)胞用濃度漸增的普魯卡因或SP 008預(yù)培養(yǎng)，24小時(shí)后暴露于100μM的谷氨酸中24小時(shí)。細(xì)胞生存力用MTT試驗(yàn)測定。用單向ANOVA和隨后的Dunnett試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。平均值±SD，n＝6。與0μM相比，**p＜0.01。與對照組比較，***p＜0.001。
發(fā)明詳述已指出局部麻醉在活體試驗(yàn)中沙土鼠腦缺血期間(Fujitani et al.(1994)，Neurosci.Lett.，17991-4；Chen et al.(1998)Brain Res.，416；Adachi et al.(1999)Brit.J.Anaesth；83472)和在體外試驗(yàn)中于海馬神經(jīng)元缺氧發(fā)作期間(Lucas et al.(1989)J.Neurosci.Methods，2847；Liu et al.(1997)Anesthesiology，871470；Raley-Susman et al.，(2001)J.Neurophysiol.862715-26)，顯示出神經(jīng)保護(hù)性能。與此同時(shí)，普魯卡因和利多卡因顯示能抑制NMDA受體活性(Nishzawa et al.(2002)Anesth.Analg.，94325-30)，減小沙土鼠海馬中缺氧引起的胞內(nèi)鈣濃度增加(Liu et al.(1997)Anesthesiology，871470)和防止沙土鼠腦內(nèi)缺血觸發(fā)的胞外濃度增高。
雖然普魯卡因在血液中存在的各種酯酶的作用下代謝成對氨基苯甲酸和二乙基氨基乙醇的高代謝速度可以解釋普魯卡因在體內(nèi)在及其局麻作用時(shí)間的短暫，但它造成了用這種分子治療慢性疾病的難題。這一考慮導(dǎo)致用普魯卡因作為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)對天然化合物的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，以便鑒別穩(wěn)定的生物活性類似物和斷定具有該活性的共同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明涉及在與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸時(shí)會(huì)顯示神經(jīng)保護(hù)作用的(4-烷基哌嗪-1-基)苯基甲酮衍生物的鑒定、設(shè)計(jì)、合成和藥理活性。更具體地說，本發(fā)明提供了對于β-淀粉樣蛋白造成的毒性具有神經(jīng)保護(hù)性能的(4-烷基哌嗪-1-基)苯基甲酮衍生物。
如圖1所示，4-乙基哌嗪-1-基-(2，3，4-三甲氧基苯基)甲酮(SP008)是由局部麻醉藥普魯卡因衍生的一種共同亞結(jié)構(gòu)。這一亞結(jié)構(gòu)是從菊類植物中分離出的分子(SP015，SP016，SP017)共有的，這些分子傳統(tǒng)上用于恢復(fù)智力功能的喪失或下降。象普魯卡因和SP天然化合物一樣，SP008對于淀粉樣蛋白肽Aβ1-42和保存的Aβ1-42在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC 12細(xì)胞上引起的ATP耗竭顯示出強(qiáng)烈的神經(jīng)保護(hù)作用，意味著一種線粒體作用位點(diǎn)。普魯卡因和SP 008還抑制谷氨酸對CP 12細(xì)胞顯示的神經(jīng)毒性作用。該作用解釋了觀察到的“抗淀粉樣蛋白”作用，因?yàn)锳β1-42肽被認(rèn)為引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞中谷氨酸網(wǎng)絡(luò)的損害性活性過高。此外，還發(fā)現(xiàn)普魯卡因是一種σ-1受體配體(IC50＝4.3μM)。該受體顯示出保護(hù)線粒體的功能，并具有抗抑制劑作用。化學(xué)同源性表明SP 008這樣一種藥理型式。因此，認(rèn)為SP 008及它的或式I的類似物可用來治療AD。
這里使用的術(shù)語“阿爾茨海默的治療”包括在顯示出至少一種AD發(fā)作癥狀的對象或很可能發(fā)展成AD的對象中抑制AD的發(fā)展，以及阻?；驕p慢AD的進(jìn)展，或者減輕或緩解至少一種AD癥狀。針對任何神經(jīng)病理學(xué)所用的術(shù)語“治療”也規(guī)定以這種方式定義。
除非另外說明，均使用以下定義鹵素是氟，氯，溴或碘。烷基、烷氧基、烯基、炔基等代表直鏈和支鏈兩種基團(tuán)；但提到個(gè)別的基團(tuán)例如“丙基”時(shí)則只包括直鏈基團(tuán)，支鏈異構(gòu)體如“異丙基”則專門指出。芳基代表苯基或單邊稠合的雙環(huán)碳環(huán)基團(tuán)，其中有約9-10個(gè)環(huán)原子，而且至少一個(gè)環(huán)是芳族的。雜芳基包括通過一個(gè)單環(huán)芳族環(huán)的環(huán)碳原子連接的基團(tuán)，環(huán)中含有約5或6個(gè)環(huán)原子，由碳原子和1-4個(gè)雜原子組成，該雜原子選自非過氧化物的氧、硫和N(R6)，其中R6或是不存在，或是定義如上；還包括由其衍生的單邊稠合的含約8-10個(gè)環(huán)原子的雙環(huán)雜環(huán)，特別是苯并衍生物或通過向其稠合一個(gè)亞丙基、三亞甲基或四亞甲基雙基衍生形成的基團(tuán)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，具有手性中心的本發(fā)明化合物可以存在并分離成旋光或外消旋形式。一些化合物可顯示出多晶型現(xiàn)象。應(yīng)該清楚，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的具有本文所述有用性質(zhì)的任何外消旋的、旋光的、多晶型的或立體異構(gòu)的形式，或它們的混合物。如何制備旋光形式(例如，利用重結(jié)晶技術(shù)將外消旋形式拆解，由旋光性起始物合成，利用手性合成，或利用手性固定相進(jìn)行色譜分離)和如何利用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)或本領(lǐng)域公知的其它類似試驗(yàn)測定活性，是本領(lǐng)域中眾所周知的。
以下對基團(tuán)、取代基和范圍列出的具體的和優(yōu)選的涵義只是為了示例說明，它們不排除對基團(tuán)和取代基定義的其它涵義或在所定義范圍內(nèi)的其它涵義。
具體地說，(C1-C6)烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、戊基、3-戊基或己基；(C3-C12)環(huán)烷基可以是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)基團(tuán)，包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、雙環(huán)[2.2.2]辛基、降冰片基、金剛烷基，以及各種萜烯和類萜烯結(jié)構(gòu)。(C3-C12)環(huán)烷基(C1-C6)烷基包括以上的環(huán)烷基，可以是環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基甲基、環(huán)丙基甲基、環(huán)己基甲基、2-環(huán)丙基乙基、2-環(huán)丁基乙基、2-環(huán)戊基乙基或2-環(huán)己基乙基。雜環(huán)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基包括以上的環(huán)烷基，其中該環(huán)烷基環(huán)系是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，并任選含有1-2個(gè)S、非過氧化物O或N(R6)以及2-12個(gè)環(huán)碳原子；例如嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氫化茚基、1，3-二噻烷-2-基等。環(huán)烷基環(huán)系任選地包括1-3個(gè)雙鍵或環(huán)氧部分，并任選地被1-3個(gè)OH、(C1-C6)烷酰氧基、(CO)、(C1-C6)烷基或(C2-C6)炔基取代。(C1-C6)烷氧基可以是甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己氧基；(C2-C6)烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基或5-己烯基；(C2-C6)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基或5-己炔基；(C1-C6)烷?；梢允羌柞；?、乙酰基、丙酰基或丁?；畸u代(C1-C6)烷基可以是碘甲基、溴甲基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、2-氯乙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基或五氟乙基；羥基(C1-C6)烷基可以是被1或2個(gè)OH基團(tuán)取代的烷基，例如被1或2個(gè)OH基團(tuán)取代的烷基，如羥甲基、1-羥基乙基、2-羥基乙基、1-羥基丙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、1-羥基丁基、4-羥基丁基、3，4-二羥基丁基、1-羥基戊基、5-羥基戊基、1-羥基己基或6-羥基己基；(C1-C6)烷氧基羰基可以是甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、異丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基或己氧基羰基；(C1-C6)烷硫基可以是甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基、丁硫基、異丁硫基、戊硫基或己硫基；(C2-C6)烷酰氧基可以是乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、異丁酰氧基、戊酰氧基或己酰氧基；芳基可以是苯基、茚基、2，3-二氫化茚基或萘基；雜芳基可以是呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、唑基、異唑基、噻唑基、異噻唑基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基(或其N-氧化物)、噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、1H-吲哚基、異喹啉基(或其N-氧化物)或喹啉基(或其N-氧化物)。
式I化合物可如以下方案A所示制備。
方案A 苯基上的對SOCl2或(C(O)Cl)2有活性的基團(tuán)R1、R2和/或R3，例如含羥基或含硫基團(tuán)，可以用能去除的保護(hù)基例如乙氧基乙基、THP、(C1-C4)3甲硅烷基等保護(hù)起來。被保護(hù)的OH和羥烷基可以去保護(hù)，并用有機(jī)合成的已知方法轉(zhuǎn)化成鹵素、CN、烷氧羰基、烷酰氧基和烷?；?。被保護(hù)的氨基可以用本領(lǐng)域已知的方法去保護(hù)并轉(zhuǎn)化成N(R6)(R7)。如果需要，在這些轉(zhuǎn)化期間可以將C＝0基團(tuán)保護(hù)起來和/或還原，然后去保護(hù)和再氧化成C＝0。參見例如I.T.Harrison，Compendium of Organic Synthetic Reactions，Wiley-Interscience，N.Y.(1971)；L.F.Fieser et al.，Reagents for Organic Synthesis，John Wiley&Sons，Inc.，N.Y.(1967)，及美國專利5，411,965。
于是，在以上式I中R1、R2或R3的具體涵義是H，(C2-C4)烷基，N(R6)(R7)，(C2-C4)烷氧基或(C3-C6)雜環(huán)烷基。
N(R6)(R7)的具體涵義是氨基，二乙基氨基，二丙基氨基，環(huán)己基氨基或丙氨基，R3的一種具體涵義是NH2。
本發(fā)明的一種優(yōu)選的化合物是SP 008(圖1)。
如果化合物有足夠的堿性或酸性，能形成穩(wěn)定無毒性的酸或堿鹽，則服用鹽形式的該化合物可能合適?？伤幱玫柠}的實(shí)例是與形成生理上可接受的陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸鹽。也可以形成合適的無機(jī)鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽。
可藥用的鹽也可以用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法得到，例如，通過有足夠堿性的化合物如胺與提供生理上可接受的陰離子的合適的酸反應(yīng)得到。也可以制成堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)、堿土金屬(例如鈣或鎂)或鋅鹽。
式I化合物可以配制成藥物組合物，并以適合所選擇的用藥途徑的各式各樣的形式施用于哺乳動(dòng)物，例如人類患者，所述用藥途徑包括口服或非腸道，以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下途徑或以吸入或吹入方式給藥。
因此，本發(fā)明化合物可以與可藥用賦形劑如惰性稀釋劑或可吸收的可食載體一起，全身性用藥，例如口服。可以將其以粉末、小?；驊腋∫盒问桨庠谟不蜍洑っ髂z膠囊中，或者可壓制成片劑。為了口服治療給藥，活性化合物可以與一種或多種賦形劑一起，以可吞咽的片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。這些組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1％的活性化合物。組合物和制劑的百分含量當(dāng)然可以變化，適宜為給定的單位劑型的約2-60％重量?；钚曰衔镌谶@種用于治療的組合物中的數(shù)量應(yīng)能達(dá)到有效劑量水平。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可以含有以下成分粘合劑，例如黃蓍膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；甜味劑，例如蔗糖、果糖、乳糖或天冬甜素，或者可加入調(diào)味劑，例如薄荷、冬青油或櫻桃香精。如果單位劑型是膠囊，則除了以上各類材料外，還可以含有液體載體，例如植物油或聚乙二醇。其它各種物質(zhì)可作為包衣存在，或用來改變固體單位劑型的物理型式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用明膠、蠟、蟲膠或糖等包覆。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的羥基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和調(diào)味劑，例如櫻桃或桔子香精。當(dāng)然，在制備任何單位劑型時(shí)使用的任何物質(zhì)應(yīng)該是可藥用的，并且就其用量而言基本上無毒性。此外，活性化合物可以摻加到持久釋放的制劑和裝置中，例如貼劑、輸注泵或植入的貯庫制劑。
活性化合物也可以通過輸注或注射靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥?；钚曰衔锘蚱潲}的溶液可以在水中制備，可任選地與無毒的表面活性劑混合。分散體也可以配制在甘油、液體聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物中，以及在油中。在通常的貯存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以阻止微生物的生長。
適合注射、輸注或吸入的藥物劑型可以包括無菌的水溶液或分散體。可制備或含有活性成分的無菌粉末，它適合臨時(shí)配制成無菌的注射或輸注液或分散體，可任選地包封在脂質(zhì)體中。在任何情形，最終的劑型在制造和貯存條件下應(yīng)該是無菌的穩(wěn)定流體。液體載體或賦形劑可以是溶劑或液體分散體介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯及其合適的混合物。合適的流動(dòng)度可以通過形成脂質(zhì)體，在分散體的情形保持所需的顆粒大小，或使用表面活性劑來維持。利用各種抗菌和抗真菌劑，例如羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可產(chǎn)生阻止微生物作用的效果。在很多情形，最好是包含等滲劑，例如，糖、緩沖劑或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁、纖維素醚和明膠，可造成注射組合物的延長吸收。
無菌注射液通過將所需數(shù)量的活性化合物摻入到需要時(shí)含有以上列舉的各種其它成分的合適溶劑中，隨后過濾滅菌得到。在用來制備無菌注射液的無菌粉末的情形，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，它們產(chǎn)生其中含有活性化合物加上先前滅菌過濾液中存在的任何其它所需成分的粉末。
為了局部給藥，本發(fā)明化合物在其為液體時(shí)可以以純形式施用。然而，通常最好是以與皮膚病學(xué)可接受的載體一起，以組合物或制劑的形式施用在皮膚上，該載體可以是固體或液體。
適用的固體載體包括細(xì)分的固體，例如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等。適用的液體載體包括水、醇或二醇，或水-醇/二醇摻混物，本發(fā)明化合物可以以有效濃度溶解或分散于其中，任選地借助于無毒的表面活性劑?？梢约尤胼o劑例如香料和另外的抗微生物劑以便優(yōu)化對于指定用途的性能。所形成的液體組合物可以從用來浸漬繃帶或其它敷料的吸收墊中施加，或者用泵型或氣霧型噴霧器噴射在受感染的部位。
增稠劑，例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性的無機(jī)材料，也可以與液體載體一起使用，以便形成糊劑、凝膠、膏劑、皂等，用來直接涂敷在使用者的皮膚上。
可用來向皮膚輸送式I化合物的適用的皮膚用組合物的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的；例如，參見Jacquet等(美國專利4,608,392)，Geria(美國專利4,992,478)，Smith等(美國專利4,559,157)和Wortzman(美國專利4,820,508)。
通過比較式I化合物的體外活性和在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性，可以確定其適用劑量。將小鼠和其它動(dòng)物中的有效劑量外推至人類的方法是本領(lǐng)域已知的，例如見美國專利4,938,949。
通常，式I化合物在液體組合物(例如洗劑)中的濃度為約0.1-25％重量，優(yōu)選為約0.5-10％重量。在半固本或固體組合物(例如凝膠或粉末)中的濃度為0.1-5％重量，優(yōu)選為0.5-2.5％重量。治療中需使用的化合物或其活性鹽或衍生物的數(shù)量不僅會(huì)隨所選擇的具體的鹽而變，而且與用藥途徑、所治療的病癥的本質(zhì)以及患者的年齡和狀態(tài)有關(guān)，最終由主治醫(yī)師或臨床醫(yī)師決定。
但一般來說，合適的劑量是約0.5-100mg/kg，例如，每天每kg體重約10-75mg，比如每天每kg體重3至約50mg，優(yōu)選6-90mg/kg/天，最優(yōu)選15-60mg/kg/天。
化合物宜以單位劑型服用，例如，每單位劑型含5mg至多達(dá)1-3g，適宜為10-1000mg，最適宜為50-500mg活性成分。
理想的是，應(yīng)當(dāng)服用活性成分以達(dá)到約0.5-75μM的活性化合物峰值血漿濃度，優(yōu)選為約1-50μM，最優(yōu)選為約2-30μM。這可以通過例如靜脈內(nèi)注射0.05-5％的活性化合物溶液來實(shí)現(xiàn)，可任選地為鹽水溶液。例如，可以將多至約0.5-3g的式I化合物溶在含有例如0.9％NaCl和約5-10％葡萄糖的約125-500ml靜脈用溶液中。這種溶液可以在最多達(dá)幾小時(shí)的長時(shí)間內(nèi)輸注，任選地與其它的抗病毒藥、抗生素等一起?；钚猿煞忠部梢砸院写蠹s1-100mg活性成分的藥團(tuán)形式口服。通過連續(xù)輸注以提供約0.01-5.0mg/kg/hr的活性化合物，或間歇輸注含約0.4-15mg/kg活性化合物的輸注液，可以保持理想的血液濃度。
所需劑量可方便地表示成單一劑量或按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔服用的分劑量，例如，每天2、3、4或更多次分劑量。分劑量本身可以進(jìn)一步分成例如多次彼此大致分開的不連續(xù)的投藥，例如從吸入器中多次吸入，或向眼中施加多滴。
本發(fā)明化合物作為抗病毒劑起作用的能力可以用本領(lǐng)域公知的藥理模型或用下述試驗(yàn)確定。
下面示例說明用于人類的治療或預(yù)防的含式I化合物的代表性藥物劑型。
(1)片劑1 mg/片SP 008 100.0乳糖77.5聚乙烯吡咯烷酮 15.0交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉12.0微晶纖維素 92.5硬脂酸鎂3.0300.0(2)片劑2mg/片SP 008 20.0微晶纖維素 410.0
淀粉50.0淀粉羥乙酸鈉15.0硬脂酸鎂5.0500.0(3)膠囊 mg/膠囊SP 008 10.0膠體二氧化硅1.5乳糖465.5預(yù)膠化淀粉 120.0硬脂酸鎂3.0600.0(4)注射劑1(1mg/ml) mg/mlSP 008(游離堿形式) 1.0磷酸氫二鈉 12.0磷酸二氫鈉 0.7氯化鈉 0.41.0N氫氧化鈉溶液適量(pH調(diào)節(jié)至7.0-7.5)注射用水適量加至1ml(5)注射劑2(10mg/ml) mg/mlSP 008(游離堿形式) 0.0磷酸二氫鈉 0.3磷酸氫二鈉 1.1聚乙二醇400 200.00.1N氫氧化鈉溶液適量(pH調(diào)節(jié)至7.0-7.5)注射用水適量加至1ml(6)氣霧劑 mg/筒SP 008 20.0油酸10.0三氯一氟甲烷5000.0二氯二氟甲烷10000.0
三氯四氟乙烷5000.0本發(fā)明將參照以下詳細(xì)的實(shí)施例作進(jìn)一步的說明，其中Aβ1-42肽購自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普魯卡因酰胺、抗氧化劑叔丁基苯基硝酮(PBN)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑(+)-MK801、萊恩素和河豚毒素(TTX)購自Sigma(St.Louis，MO)。普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普魯卡因酰胺SP 015、SP 016和SP 017的結(jié)構(gòu)示于圖1。SP 008如下所述由Taros，Inc.(Marburg，Germany)合成。細(xì)胞培養(yǎng)的塑料器具購自Corning(Corning，NY)和Packard BioSciences Co.(Meriden，CT)。RNA STAT-60得自TEL-TEST，Inc.(Friends-wood，TX)。TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑、無規(guī)六聚物和SYBRGreen PCR MasterMix得自Applied Biosystems(Foster City，CA)。
方法A.用于普魯卡因衍生物的計(jì)算機(jī)篩選利用ISIS軟件(Information Systems，Inc.，San Leandro，CA)，對于天然存在實(shí)體的Interbioscreen數(shù)據(jù)庫篩選含有普魯卡因結(jié)構(gòu)的化合物。所鑒別出的乙酸7-乙酰氧基-3-(4-苯甲酰哌嗪-1-基甲基)-5-羥基-4a，8-二甲基-2-氧-十二氫薁并[6，5-b]呋喃-4-基酯(SP 105)、乙酸5-乙酰氧基-3-(4-苯甲酰哌嗪-1-基甲基)-4-羥基-4a，8-二甲基-2-氧-十二氫薁并[6，5-b]呋喃-7-基酯(SP 016)和3-(4-苯甲酰哌嗪-1-基甲基)-6，6a-環(huán)氧基-6，9-二甲基-3a，4，5，6，6a，7，9a，9b-八氫-3H-薁并[4，5-b]呋喃-2-酮(SP 017)化合物購自Interbioscreen(Moscow，Russia)(圖1)。
B.細(xì)胞培養(yǎng)和處理PC 12細(xì)胞(鼠嗜鉻細(xì)胞瘤)(ATCC，Manassas，VA)在37℃和5％CO2下于不含谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含有10％牛血清和5％馬血清。這些細(xì)胞通過神經(jīng)元表型的誘導(dǎo)可逆地響應(yīng)NGF。將PC 12細(xì)胞在96孔板(每孔5×104細(xì)胞)中用濃度漸增(1，10和100μM)的普魯卡因、普魯卡因酰胺、利多卡因、丁卡因、SP 015、SP 016、SP 017或SP 008培養(yǎng)24小時(shí)。半Aβ1-42在4℃培養(yǎng)過夜，然后以0.1、1或10μM的最終濃度加到細(xì)胞中24小時(shí)。
為研究NMDA受體在Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中所起的作用，在加入Aβ1-42之前的即刻向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度遞增的(+)-MK801。4小時(shí)后用MTT試驗(yàn)確定細(xì)胞生存力。為確定普魯卡因和SP 008對谷氨酸誘發(fā)的興奮性神經(jīng)毒性的影響，將PC 12細(xì)胞用0.3、1、3、10和30μM的普魯卡因或SP 008預(yù)處理24小時(shí)，然后用谷氨酸再處理24小時(shí)。隨后用MTT試驗(yàn)確定細(xì)胞生存力。為確定鈉通道在Aβ1-42誘發(fā)的神經(jīng)毒性中的作用，PC 12細(xì)胞用3、30或300μM的鈉通道阻斷劑TTX培養(yǎng)4小時(shí)，隨后加入Aβ1-42。24小時(shí)后用MTT法確定細(xì)胞生存力。將PC 12在10、100或500μM PBN存在下培養(yǎng)24小時(shí)，確定氧化應(yīng)激在Aβ1-42的毒性中的作用。然后向培養(yǎng)基中加入Aβ1-42。24小時(shí)后用MTT試驗(yàn)確定細(xì)胞生存力。
C.細(xì)胞生存力測定Aβ的細(xì)胞毒性如前所述(Lecanu et al.(2004)Steroids，691-16)用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)試驗(yàn)(Trevigen，Gaithersburg，MD)測定。簡言之，向在100μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中加入10μl MTT溶液。在與以上相同的條件下培養(yǎng)4小時(shí)后，加入10μl洗滌劑，將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)過夜。在600nm和690nm下用Victor分光光度計(jì)(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)定量測定藍(lán)色。Aβ1-42的作用以(DO600-DO690)表示。為比較所試驗(yàn)的化合物的保護(hù)作用，用Aβ1-42時(shí)觀察到的MTT信號的減小被認(rèn)為是NADPH黃遞酶活性的100％抑制，用該百分的增加或減少表示所試化合物的作用。
D.ATP測定ATP濃度如前所述地(Lecanu et al.，同上)用ATPLite-MTM試驗(yàn)法(Packard BioSciences Co.)測定。簡言之，根據(jù)制造商的建議，將細(xì)胞在黑色的96孔View PlateTM上培養(yǎng)，并在Top Count NXTTM計(jì)數(shù)器(Packard BioSciences Co.)上測定ATP濃度。Aβ1-42的作用以任意的單位表示。為比較試驗(yàn)化合物對ATP回收的潛在的保護(hù)作用，將Aβ1-42誘發(fā)的ATP濃度降低作為100％減小，試驗(yàn)化合物的作用表示成該百分?jǐn)?shù)的變化。
E.自由基產(chǎn)生如前所述(Lecanu et al.，同上)，使用熒光探針二羥基二氯熒光素二乙酸鹽(2，7-DCF)(Molecular Probes，Eugene，OR)通過測定自由基產(chǎn)生確定氧化應(yīng)激。對于這些實(shí)驗(yàn)，在聚賴氨酸涂覆的微型板中培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞用RPMI 1640洗一次，然后用100μl RPMI 1640替換培養(yǎng)基。將細(xì)胞在室溫下于暗處用100μl 2，7-DCF(50μM)培養(yǎng)45分鐘，用Victor多標(biāo)記計(jì)數(shù)器(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)測定熒光(激發(fā)波長λ＝485nm，發(fā)射波長λ＝535nm)。
F.放射性配體結(jié)合性研究放射性配體結(jié)合性研究用表達(dá)在Jurkat細(xì)胞中的人重組Sigma-1受體進(jìn)行。將濃度從3.0×10-10至1.0×10-5M遞增的普魯卡因在特定的8nM特異性Sigma-1受體配體[3H]-(+)-噴他佐辛存在于22℃溫育120分鐘，以確定普魯卡因的IC50和Hill值nH。
G.實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)將在6孔板中培養(yǎng)18小時(shí)的PC 12細(xì)胞用濃度遞增的普魯卡因處理所示的時(shí)間。處理后，將細(xì)胞于1μM的Aβ1-42中暴露24小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，按照制造商的說明，用RNASTAT-60(Tel-Test，Inc.，F(xiàn)riendswood，TX)萃取全細(xì)胞RNA。使用ABI Prism 7700序列測定體系(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，F(xiàn)oster，City，CA)用Q-PCR定量測定HMG-CoA還原酶mRNA。RT反應(yīng)用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑與1μg全RNA和作為各反應(yīng)的引物的無規(guī)六聚體進(jìn)行，如先前所述(Xu et al.(2003)J.pharmacol.Ther.，3071148-57)。為了用Q-PCR定量測定鼠HMG-CoA還原酶mRNA，引物按照GenBank AccessionNumber BC 019782用PE/AB引物表達(dá)軟件設(shè)計(jì)，該軟件是專門設(shè)計(jì)用來選擇引物和探針的。正向引物是5’-GAC TGT GGT TTG TGA AGCTGT CAT-3’(24個(gè)核苷酸；SEQ ID NO1)，反向引物是5’-AAT ACTTCT CTA ACC ACC TTG GCT-3’(24個(gè)核苷酸；SEQ ID NO2)。引物由BioSynthersis，Inc.(Lewisville，TX)合成。反應(yīng)在由含10μl SYBRGreen PCR Master Mix和1μl引物混合物(各5μM)的20μl溶液及2μl cDNA構(gòu)成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。循環(huán)條件為起始步驟為50℃下2分鐘和95℃下10分鐘，隨后95℃下15秒和60℃下1分鐘循環(huán)40次。將Ampli Taq Gold聚合酶在95℃活化10分鐘。同時(shí)將18S RNA擴(kuò)增并作為內(nèi)控樣使用。為消除非特異性PCR產(chǎn)物如引物二聚體的污染，在該循環(huán)方案之后對所有的最終PCR產(chǎn)物進(jìn)行解鏈曲線分析。另外，對各樣品還進(jìn)行無RT反應(yīng)的PCR反應(yīng)，以便排除基因組DNA污染。收集PCR產(chǎn)物并在3％(w/v)的瓊脂/TAE凝膠上擴(kuò)散以證實(shí)產(chǎn)物尺寸。利用PE/AB計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算18S RNA和樣品的循環(huán)閾值(Ct)。Ct被確定在該反應(yīng)的最大指數(shù)生長期。相對轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算成x＝2ΔΔCt，其中ΔΔCt＝ΔE-ΔC，ΔE＝Ct實(shí)驗(yàn)-Ct18S，ΔC＝Ct對照-Ct18S。
H.統(tǒng)計(jì)分析將數(shù)據(jù)用平均值±SD表示。用單向AVOVA對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組間評估，并用Dunnett試驗(yàn)進(jìn)行比較。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為差別是顯著性的。
實(shí)施例1.SP 008合成1.材料和方法溶劑用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。MS記錄在VG Tribid，Varian CH7上(EI)。薄層色譜分析(TLC)在層厚為0.2mm的硅膠60 F254上進(jìn)行。NMR譜Bruker AMX 300。所有共振均以ppm給出，以殘余溶劑信號(CDCl37.25 ppm)作為對照。
2.2，3，4-三甲氧基苯甲酰氯將2，3，4-三甲氧基苯甲酸(5.00g，23.6mmol)溶于無水甲苯(2mL)中，加入催化量的N，N-二甲基甲酰胺(2滴)。向該混合物中逐滴加入草酰氯(4.27g，33.6mmol)在甲苯(11ml)中的溶液，室溫下繼續(xù)攪拌3.5小時(shí)。減壓除去多余的試劑和溶劑(產(chǎn)量5.13g產(chǎn)物，94％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.82(D，1h，9Hz)，6.68(d，1H，9Hz)，3.89(s，3H)，3.80(s，1H)，MS(E1)m/z 230(M+)，212，195，179，152.
3.4-乙基-1-(2，3，4-三甲氧基苯甲酰)哌嗪SP 008在0℃向粗制的2，3，4-三甲氧基苯甲酰氯(0.93g，4.0mmol)在無水二氯甲烷(40ml)中的溶液滴加N-乙基哌嗪(0.92g，8.1mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘。用NH4Cl飽和水溶液洗該混合物。水層用二氯甲烷萃取2次，合并的有機(jī)層用鹽水洗，干燥(MgSO4)后濃縮。粗產(chǎn)物自乙醚/石油醚中重結(jié)晶，得到SP 008固體(0.63g，51％)。
1H NMR(CDCl3)δ6.88(D，1H，8.5Hz)，6.62(d，1H，8.5Hz)，3.83(s，3H)，3.81(s，3H)，3.80(s，3H)，3.76(m，2H)，3.25(m，2H)，2.43(m，4H)，2.35(q，2H，7Hz)，1.02(t，3H，7Hz)；MS(EJ)m/z 308(M+)，237，195，97.
實(shí)施例2.用MTT試驗(yàn)、ATP測定和PC 12細(xì)胞內(nèi)游離基產(chǎn)生評估Aβ1-42神經(jīng)毒性(圖2)Aβ1-42引起PC 12細(xì)胞生存力(p＜0.001)(圖2A)和胞內(nèi)ATP濃度(p＜0.001)(圖2B)的劑量依賴性降低。還觀察到在Aβ1-42為1和10μM時(shí)自由基產(chǎn)生誘發(fā)的氧化應(yīng)激顯著增高的劑量依賴性關(guān)系(分別為p＜0.01和p＜0.001)(圖2c)。
實(shí)施例3.SP 008對細(xì)胞生存力和暴露于濃度遞增的Aβ1-42中PC 12細(xì)胞的ATP濃度的影響10μM的SP 008起著對抗0.1μM Aβ1-42誘發(fā)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用(p＜0.01，n＝6)(圖3A)，雖然這一濃度不能保存Aβ1-42耗竭的ATP儲(chǔ)備液。反常的是，1和100μM的SP 008不能減小0.1μM Aβ1-42誘發(fā)的NADPH黃遞酶抑制作用(圖3A)，但它們阻止ATP減少(p＜0.05)(圖3D)。當(dāng)以1(p＜0.05)、10(p＜0.01)和100μM(p＜0.001)的用量使用時(shí)，SP 008顯示出由MTT試驗(yàn)確定的對抗1μM Aβ1-42的神經(jīng)保護(hù)作用。這一作用伴隨著與劑量有關(guān)的ATP保護(hù)作用(圖3E)。
以10和100μM的濃度服用SP 008顯示出對抗10μM Aβ1-42在PC12細(xì)胞中誘發(fā)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用；此效應(yīng)在10μM(p＜0.05，n＝6)和100μM(p＜0.01，n＝6)濃度均是統(tǒng)計(jì)顯著性的(圖3C)。SP 008的這一作用伴隨著與劑量有關(guān)的ATP水平的修復(fù)，雖然只有100μMSP 008的作用是統(tǒng)計(jì)顯著性的(p＜0.01，n＝6；圖3F)。
實(shí)施例4.普魯卡因和SP 008對谷氨酸在PC 12細(xì)胞上誘發(fā)的興奮性細(xì)胞毒性的作用谷氨酸100μM急劇降低PC 12細(xì)胞生存力(p＜0.001，n＝6；圖4)。普魯卡因以兩相方式阻止谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)毒性。在0.3和10μM觀察到最大作用(相對于對照樣，p＜0.001，n＝6)。SP 008的作用也是兩相的，在3μM達(dá)到保護(hù)峰值(相對于對照樣，p＜0.001，n＝6)，隨后在更高濃度的谷氨酸存在下其神經(jīng)保護(hù)性能下降。在相同的濃度下，SP 008的神經(jīng)保護(hù)作用比普魯卡因的作用更顯著。
討論在過去幾十年間，改進(jìn)與AD相關(guān)的膽堿能網(wǎng)絡(luò)機(jī)能不良是科學(xué)界的主要熱點(diǎn)。這導(dǎo)致以他克林為代表的乙酰膽堿酯酶抑制劑類(AchEI)治療藥物的誕生。盡管臨床數(shù)據(jù)充滿希望，但他克林的療效中等，而以加蘭他敏和多奈哌齊的代表的新一代的Ach EI與他克林相比，推遲癥狀發(fā)作的作用沒有改進(jìn)。短短的1-2年的推遲雖然對患者有其親屬很寶貴，但多半是由于膽堿能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化，是Ach EI的限制。即使AD患者的膽堿能傳遞的改進(jìn)是有關(guān)和必要的，但它肯定不足以停止或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展。此后在AD藥物開發(fā)中尚無大的進(jìn)展，雖在一種谷氨酸能NMDA-亞型受體的拮抗劑美金剛(memantine)近來被批準(zhǔn)在美國市場銷售。本發(fā)明提供了由一系天然化合物的同源結(jié)構(gòu)域衍生的一類新化合物，所述天然化保物是用普魯卡因作為起始點(diǎn)通過篩選數(shù)據(jù)庫得到的。這些分子能保護(hù)鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC 12細(xì)胞對抗Aβ1-42神經(jīng)毒性。
腎上腺激素皮質(zhì)醇被認(rèn)為通過增加神經(jīng)元死亡、改變情緒和衣發(fā)抑郁會(huì)惡化AD的發(fā)展。Xu等人近來報(bào)道一種基于普魯卡因的藥物制劑能降低應(yīng)激誘發(fā)的大鼠腎上腺皮質(zhì)類固醇功能亢進(jìn)(J.Pharmacol.Exp.Ther.3071148(2003))，因此提出普魯卡因作為一種有意義的治療AD的方法。然而，普魯卡因快速降解成對氨基苯甲酸和二乙基氨基乙醇使其難以用于AD的治療。SP 015、SP 016和SP 017是用普魯卡因作為亞結(jié)構(gòu)對天然化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選得到(圖1)，它們來源自菊科植物歐亞旋覆花和亮綠蒿。引人注目的是，蒿屬植物傳統(tǒng)上就被作為智力功能喪失或下降的修復(fù)劑(Wake et al.(2000)J.Ethnopharmacol.69105-14)。
普魯卡因能部分恢復(fù)由Aβ1-42誘發(fā)的ATP產(chǎn)生的減少，表明了對線粒體呼吸鏈的活性。在所分泌的中性化合物中，SP 017顯示出最高的保護(hù)線粒體功能的作用，這由觀察到的線粒體黃遞酶活性的變化得到證實(shí)，抑制Aβ1-42毒性的效力范圍為30-70％。有意思的是，盡管SP015和SP 016之間存在顯著的化學(xué)類似性，但在以1μM施用時(shí)，SP 016只對低Aβ1-42濃度(0.1μM)顯示出明顯的作用，而1μM的SP 015即使對所檢驗(yàn)的最高Aβ1-42濃度也具有顯著的保護(hù)作用。令人驚奇的是，這些不同化合物對PC 12在暴露于Aβ1-42后的生存力的影響與所觀察到的對ATP含量恢復(fù)的影響不完全一致。特別是，SP 015在1和10μM只對10μM Aβ1-42顯示神經(jīng)保護(hù)作用，而SP 016則觀察不到作用。這一明顯差異表明，胞內(nèi)ATP貯存物的保存不是普魯卡因和普魯卡因衍生物藉以發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)性能的唯一機(jī)制。
SP 015、SP 016和SP 017的化學(xué)結(jié)構(gòu)均有一個(gè)共同的4-乙基-1-苯甲酰哌嗪亞結(jié)構(gòu)。用SP 015和SP 017得到的神經(jīng)保護(hù)作用和由SP015、SP 016和SP 017造成的保存ATP胞內(nèi)貯存物對抗Aβ1-42的作用，導(dǎo)致以下的設(shè)想，即，這一共同的亞結(jié)構(gòu)可能至少部分地是本發(fā)明對于這些天然化合物所公開的“抗淀粉樣蛋白”作用的原因。該亞結(jié)構(gòu)經(jīng)改性后衍生出4-乙基-1-(2，3，4-三甲氧基苯甲酰)哌嗪化合物(SP008)，它可以分兩步制備。
SP 008顯示出顯著的對抗Aβ1-42的神經(jīng)保護(hù)作用，并且對于兩個(gè)最高濃度的Aβ1-42比普魯卡因更有效力。SP 008對于10μM Aβ1-42顯示出有意義的劑量-效果關(guān)系，預(yù)示著與該系列最有效的天然化合物SP017相比，在高濃度時(shí)沒有毒性。SP 008對PC 12生存力的有利作用由于它即使對于10μM Aβ1-42也能防止Aβ1-42誘發(fā)的胞內(nèi)ATP貯物耗竭而得到進(jìn)一步的證實(shí)。象普魯卡因一樣，SP 008即使在濃度低至0.3μM時(shí)也能顯著降低谷氨酸對PC 12細(xì)胞引起的神經(jīng)毒性，這大概是其對抗Aβ1-42的神經(jīng)保護(hù)作用的原因。
雖然對于NMDA受體的可能阻斷尚需澄清，但這些數(shù)據(jù)表明SP008與用于AD治療的NMDA拮抗劑美金剛有相同的藥物機(jī)制。此外，因其與普魯卡因有共同的結(jié)構(gòu)，SP 008可有與普魯卡因的某些作用有機(jī)制相同。
就像個(gè)別地并入作為參考一樣，本文中所有的出版物、專利和專利文件均被引用作為參考。本發(fā)明已參照各個(gè)具體的和優(yōu)選的實(shí)施方案及技術(shù)作了描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在保持在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的同時(shí)，可以作出很多變動(dòng)和修改。
序列表<110>Samaritan Pharmaceuticals，Inc.
Georgetown UniversityLecanu，LaurentGreeson，JanetPapadopoulos，Vassilios<120>(4-烷基哌嗪基)(苯基)甲酮<130>1941，001WO1<150>US 60/562,643<151>2004-04-15<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>1gactgtggtt tgtgaagctg tcat24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>2aatacttctc tcaccacctt ggct2權(quán)利要求
1.一種治療受阿爾茨海默病威脅或折磨的哺乳動(dòng)物的方法，包括向該哺乳動(dòng)物施用有效數(shù)量的式I化合物及其可藥用的鹽 其中a)R1、R2和R3各自為H、OH、鹵素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基((C1-C6)烷基)、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷酰基、鹵素(C1-C6)烷基、羥基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、硫代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰氧基，N(R6)(R7)，其中R6和R7分別是H、O、(C1-C6)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基(C1-C6)烷基、苯基或芐基，或者R6和R7與它們所連接的N一起形成一個(gè)5或6元環(huán)，該環(huán)可任選地含有1-2個(gè)S、N(R6)或非過氧化物的O；或者R1和R2合起來是亞甲二氧基；b)Y和Z合起來是＝O、-O(CH2)mO-或-(CH2)m-，其中m是2-4，或者Y是H，Z是OR9或SR9，其中R9是H或(C1-C4)烷基；c)X是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羥基(C1-C6)烷基(C3-C12)烯基、(C2-C6)炔基、羧基、(C1-C6)烷氧羰基、硫代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、(C3-C12)雜環(huán)基、(C3-C12)雜環(huán)烷基(C1-C6)烷基、芳基或雜芳基，可任選地被1、2或3個(gè)R1取代。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的數(shù)理對于抑制Aβ肽引起的神經(jīng)毒性是有效的。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中的數(shù)量對于抑制Aβ1-42神經(jīng)毒性是有效的。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中的數(shù)量對于抑制谷氨酸在該哺乳動(dòng)物中引起的神經(jīng)毒性有效。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中的數(shù)量對于維持該哺乳動(dòng)物中神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ATP水平有效。
6.權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)胞在體外被接觸。
7.權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)胞在體內(nèi)被接觸。
8.權(quán)利要求1-5或7的方法，其中式I化合物是施用于人。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的人是處在AD的早期階段。
10.權(quán)利要求8的方法，春中的人是AD患者。
11.權(quán)利要求1-10的方法，其中R1、R2或R3是N(R6)(R7)。
12.權(quán)利要求1-11的方法，其中R2是(C1-C6)烷氧基。
13.權(quán)利要求1-12的方法，其中R3是(C1-C6)烷氧基。
14.權(quán)利要求1-10或12-13的方法，其中R1、R2和R3均為(C1-C3)烷氧基。
15.權(quán)利要求1-14的方法，其中Y和Z合起來是＝0。
16.權(quán)利要求1-14的方法，其中Y是H，Z是OH。
17.權(quán)利要求1-16的方法，其中X是(C1-C6)烷基。
18.權(quán)利要求1-17的方法，其中X是CH3。
19.權(quán)利要求1-5和7-18的方法，其中式I化合物是口服用藥。
20.權(quán)利要求1-5和7-18的方法，其中式I化合物是腸道外用藥。
21.權(quán)利要求1-20的方法，其中式I化合物與一種可藥用的載體聯(lián)合服用。
22.權(quán)利要求21的方法，其中載體是液體、混懸液或凝膠。
23.權(quán)利要求21的方法，其中載體是固體。
24.權(quán)利要求1-23的方法，其中式I化合物是[(2，3，4-三甲氧基)苯基]-[4-乙基哌嗪-1-基]甲酮。
25.一種組合物，其中含有與可藥用載體組合的式(I)化合物。
26.一種治療與谷氨酸網(wǎng)絡(luò)或通道活性過高有關(guān)的神經(jīng)病的方法，包括向受到該神經(jīng)病威脅和/或折磨的哺乳動(dòng)物施用有效數(shù)量的式(I)化合物。
27.式(I)化合物制備用于治療至少一種AD癥狀的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于治療哺乳動(dòng)物(例如人)的阿爾茨海默癥的至少一種癥狀的治療方法，其中該癥狀涉及β－淀粉樣肽病原體對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性，并希望抑制后繼誘發(fā)的病理通道，所述方法包括向需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效數(shù)量的苯甲酰哌嗪衍生物，包括其可藥用的鹽。
文檔編號A61P25/28GK101022806SQ200580019420
公開日2007年8月22日 申請日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者L·勒卡努, J·格里森, V·帕帕多普洛斯 申請人:薩馬里坦藥品公司, 喬治敦大學(xué)