專利名稱：抗禽流感特異性IgY的制備方法及其制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗體及其新型制劑，特別是涉及一種抗禽流感特異性IgY及其新型制劑，屬醫(yī)療衛(wèi)生技術領域。
背景技術：
禽流感是禽流行性感冒的簡稱(其英文為avian influenza，簡稱AI)，它是由甲型流感病毒(influenza A virus)引起的禽類感染病，主要發(fā)生在雞、火雞、珍珠鳥以及其它禽類，特別是遷徙類水禽如野鴨、天鵝等。近年來，禽流感在世界各地的侵襲日趨頻繁，不但給這些國家的家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來沉重的打擊，同時也嚴重威脅著人類的健康和生命。世界衛(wèi)生組織已將禽流感列為A類動物疫病。
鑒于禽流感的嚴重危害性，科學家們一直在探索如何去預防和治療禽流感，特別著重在疫苗上的研究。但是，由于禽流感病毒和人流感病毒一樣，其抗原性會不斷漂移與變異，而禽流感疫苗的研制速度不可能跟上病毒的變異速度，因此實際效果很不理想。目前世界各國搶購的特敏福樂感清等藥品對甲型流感有一定的治療作用，在尚無專門針對禽流感的特效藥的情況下，人們不得已先將其當成治療禽流感的權宜選擇。但是，該類藥物對中樞神經系統(tǒng)有明顯副作用，并且易出現耐藥毒珠的傳播，最近在印度尼西亞已出現了對特敏福耐藥的禽流感病毒株；因而限制了其在臨床上的應用。而且，這些藥品都不可能用于預防禽流感。
技術內容針對現有技術的上述缺陷，本發(fā)明要解決現有抗禽流感產品對中樞神經系統(tǒng)有明顯副作用、易產生耐藥性、預防效果不明顯等問題，以提供一種抗禽流感病毒特異性IgY及其制劑。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種制備抗禽流感特異性IgY的方法，其中包括以下步驟(S1)制備禽流感抗原；(S2)利用所述禽流感抗原，對產蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產的抗禽流感免疫蛋；(S3)取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黃，制備抗禽流感特異性IgY粗提物；(S4)對所述抗禽流感特異性IgY粗提物進行純化，制得抗禽流感特異性IgY純品；(S5)對所述抗禽流感特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗禽流感特異性IgY成品。
本發(fā)明中，所述抗禽流感特異性IgY可為抗禽流感病毒特異性IgY，此時，在所述步驟(S1)中，可按以下步驟制備制備禽流感病毒抗原選定有代表性、最常出現的禽流感病毒株，包括A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株；將所述H5N1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常規(guī)雞胚尿囊法，分別在雞胚尿囊中培養(yǎng)，收取含有病毒的尿囊液，以雞紅細胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化，得到純化的四種禽流感病毒；分別取所述純化的四種禽流感病毒，分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，分別制得H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種禽流感病毒裂解液；取所述四種禽流感病毒裂解液中的至少兩種，制成混合裂解液，再按1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿器中以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制得含多種禽流感病毒裂解成份的病毒復合抗原為制備抗禽流感病毒特異性IgY，在本發(fā)明的所述步驟(S1)中，還可按以下步驟制備制備禽流感疫苗抗原取現在的禽流感疫苗，加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，制得禽流感病毒裂解液；按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感復合抗原。
本發(fā)明中，所述抗禽流感特異性IgY還可為抗禽流感病毒多肽HA2特異性IgY，此時，在所述步驟(S1)中，可按以下步驟制備制備禽流感病毒多肽HA2抗原用RT-PCR方法從甲型禽流感RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段；先插入pGEM-T載體，測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接；轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株；挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜；稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)，待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達量，選表達量最高的時間收獲，離心去除細胞沉淀，上清中即含大量表達產物；經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即獲得純化的禽流感HA2抗原；以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含禽流感HA2表達蛋白的抗原。
本發(fā)明中，所述抗禽流感特異性IgY還可為抗禽流感病毒受體特異性IgY，此時，在所述步驟(S1)中，可按以下步驟制備制備禽流感病毒受體抗原取流感病毒受體，將其中的「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」表達蛋白按1∶1比例混合，制成濃度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。其中，所述流感病毒受體是通過以下步驟制得的用RT-PCR方法分別從流感病毒受體，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段；先插入pGEM-T載體，測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接；轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株，挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜；稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)，待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中受體蛋白的表達量，選表達量最高的時間收獲，離心去除細胞沉淀，上清中即含大量表達產物；經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcry1S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即分別獲得純化的流感病毒受體---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」的抗原成分。
本發(fā)明還提供一種制備抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY的方法，其中包括以下步驟(S21)按以下步驟制備繼發(fā)感染致病菌抗原將A簇B型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、MRSA金黃色葡萄球菌、以及肺結核菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，制得致病細菌混合物，再將這種致病細菌混合物按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，用高速勻漿器以8,000-30,000rpm處理，成為油包水乳液，即制得繼發(fā)感染致病菌復合抗原；(S22)利用所述繼發(fā)感染致病菌抗原，對產蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產的抗繼發(fā)感染致病菌免疫蛋；(S23)取所述抗繼發(fā)感染致病菌免疫蛋的蛋黃，制備抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY粗提物；(S24)對所述抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY粗提物進行純化，制得抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY純品；(S25)對所述抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY成品。
本發(fā)明還提供一種制備抗禽流感特異性復合IgY的方法，其中，取權利要求1-6中任一項所述方法制得的抗禽流感特異性IgY，并取權利要求8所述方法制得的抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY，按1-10∶1-10的比例混合均勻，即制成抗禽流感特異性復合IgY。
本發(fā)明還提供一種抗禽流感制劑，其中包括含量為0.01-20.0％的按權利要求1-6中任一項所述方法制得的抗禽流感特異性IgY，或者是含量為0.01-20.0％的按權利要求9所述方法制得的抗禽流感特異性復合IgY；以及含量為99.99-80.0％的輔料；所述制劑是霧化劑、鼻噴劑、滴鼻劑、滴眼劑、噴喉劑、口噴劑、口含片、口服液、膠囊、或注射劑。
本發(fā)明利用抗禽流感免疫球蛋白(IgY)保護局部粘膜(鼻腔、上呼吸道)細胞不受禽流感病毒的侵襲，這是阻斷其感染的關鍵，對禽流感病毒的吸附直接起到封閉作用，是抗禽流感特異性IgY具有預防作用的機理之一。抗禽流感特異性IgY還可對禽流感病人被侵襲局部新釋放的病毒進行中和，使其喪失再行擴散傳播的能力，因而達到既可治療又可防止禽流感傳播的雙重目的。
具體實施例方式
IgY(Immunoglobulin of yolk，即蛋黃免疫球蛋白)屬IgG類免疫球蛋白，具有中和抗體的作用，它能與相應抗原發(fā)生特異性結合，從而改變或抑制該抗原(如病毒)的狀態(tài)或活性，阻止該抗原(如病毒)吸附于易感細胞；另又，IgY與其相應的病毒結合后，可形成免疫復合物，從而易被巨噬細胞所吞噬。
如前所述，禽流感感毒的抗原會不斷漂移和變異，除了嚴重影響相關疫苗的實際效果外，也給抗禽流感特異性IgY的研制帶來一定的困難，不可沿用常規(guī)的方法。
研究揭示，跟人流感病毒一樣，禽流感病毒表面有二種多肽抗原，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)。這二種抗原結構易發(fā)生改變，即漂移或變異。其中HA是由一個重鏈(HA1)和一個輕鏈(HA2)通過雙硫鏈連接而成，它的抗體能抑制血凝及中和病毒，是最主要的保護性抗體。HA2多肽的羧基末端位于病毒包膜內，HA2多肽的氨基末端(即為融合體)藏于HA蛋白三維結構內部，當禽流感病毒接觸易感細胞時，HA的雙硫鏈斷裂，而裂解成HA1和HA2，此時HA2的氨基末端即融合體會暴露，引起病毒包膜與易感細胞膜融合，于是病毒核殼體遂進入細胞漿內，進行增殖。HA2在各型及亞型之間屬于保守蛋白，結構比較穩(wěn)定、變異小，并且又是介導禽流感病毒包膜與易感細胞膜融合的蛋白成分；因此，本發(fā)明要針對禽流感病毒的變異性，提供一種新型的抗HA2的IgY抗體，利用這種特異性抗HA2多肽的特殊抗體阻止禽流感病毒包膜與易感細胞膜的融合，使禽流感病毒不能進入細胞內，從而達到預防和治療禽流感的目的。
另外，通過大量試驗研究發(fā)現，禽流感病毒和人流感病毒一樣，在感染人體細胞時需要該病毒與靶細胞上的特異性受體結合，其中流感病毒A和B的特異性受體是「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」。根據這一特點，本發(fā)明提供一種抗感冒病毒受體的特異性IgY，只要通過噴施或口服、注射等形式讓這種特殊抗體和體內的細胞膜表面的流感病毒特異性受體結合，禽流感病毒失去了受體，就不能和靶細胞結合了，也就自然不會感染人體了。
1、由于IgY屬多克隆抗體，可以和多種病原體發(fā)生作用，這也是其優(yōu)勢之一；因此，可以制作一種抗多種亞型抗禽流感特異性IgY，而不是象目前的疫苗那樣只針對某一種亞型的禽流感病毒起作用，從而可達到更理想的實際預防和治療效果。
2、本發(fā)明中，根據最近幾年亞洲國家和歐美國家證實的人類感染禽流感亞型情況篩選分析，選定有代表性的最常出現的禽流感病毒如下A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株。
3、培養(yǎng)有代表性的禽流感病毒并提純本發(fā)明中，將H5N1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常規(guī)雞胚尿囊法，分別在雞胚尿囊中培養(yǎng)，然后收取含有病毒的尿囊液，然后以雞紅細胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化病毒。
4、制作抗原成份本發(fā)明中采用四種方法制作新型的抗原成份。
4.1、病毒裂解法制作禽流感病毒抗原成份分別取上述提純的各種禽流感病毒分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，即分別得到上述各種流感病毒裂解液。經SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢驗分析，濃縮膠4％，分離膠7％，240V，電泳30分鐘，然后經考瑪氏亮藍染色，觀察蛋白帶；檢測確定含有血凝素重鏈(HA1)、血凝素輕鏈(HA2)、神經氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P1、P2、P3)、基質蛋白(M1、M2)和非結構蛋白(NS、NS2)。與EnamiM等人主持的實驗結果一致。
4.2、基因工程重組法制作禽流感病毒多肽HA2抗原成份用RT-PCR方法從甲型禽流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接。轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株。挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達量。選表達量最高的時間收獲。離心去除細胞沉淀。上清中即含大量表達產物。經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即獲得純化的禽流感病毒HA2抗原。
4.3、基因工程重組法制作流感病毒受體抗原成份用RT-PCR方法分別從流感病毒受體，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接。轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株。挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中受體蛋白的表達量。選表達量最高的時間收獲。離心去除細胞沉淀。上清中即含大量表達產物。經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸餾水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即分別獲得純化的流感病毒受體---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」的抗原成分。
4.4、直接應用目前現成的禽流感疫苗裂解加工后作為禽流感病毒抗原成份這種疫苗已包含有H5N1禽流感病毒抗原成份，采用上述病毒裂解法裂解后，作為復合抗原的材料。
5、制作抗原5.1、病毒裂解成分復合抗原將通過上述裂解方法制備的H5N1、H5N2、H7N7以及H9N2等4種禽流感病毒裂解液，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均勻，一般取1∶1∶1∶1，制成混合裂解液；也可以從H5N1、H5N2、H7N7、H9N2中選其中二種或三種先等量混合成病毒裂解液，也可以只選其中一種作為單一病毒裂解液。再將這三種病毒裂解液中的一種按1-10∶1-10的比例(一般取1∶1)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制得含多種禽流感病毒裂解成份的病毒復合抗原。
5.2、禽流感病毒多肽HA2抗原將按4.2中的基因工程重組禽流感病毒多肽HA2所述方法而制得的純化的禽流感病毒HA2表達蛋白(200微克/mL)以1-10∶1-10的比例(一般按1∶1比例)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，采用8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含禽流感病毒HA2表達蛋白的抗原。
5.3、利用現成禽流感疫苗制作禽流感病毒抗原從香港衛(wèi)生署購置禽流感疫苗，該疫苗具有預防H5N1禽流感病毒的作用。將這種疫苗混合均勻，如前所述先采用病毒裂解法裂解，再將這種裂解液按1-10∶1-10比例，一般按1∶1的比例，加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感復合抗原。
5.4、流感病毒受體抗原5.4.1向美國病毒中心(ATCC)購買流毒病毒受體-「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」先以1∶1比例混合，配成200微克/mL濃度溶液；然后，按1-10∶1-10比例，一般按1∶1比例，加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。
5.4.2將按上述4.3基因工程重組流感病毒受體表達蛋白所述方法而制得的純化的流感病毒受體—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」表達蛋白按1∶1比例混合，制成濃度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，采用8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。
6、制備繼發(fā)感染致病菌復合抗原將A簇B型溶血性鏈球菌(2×109/mL)、肺炎鏈球菌(2×109/mL)、流感嗜血桿菌(2×109/mL)和MRSA金黃色葡萄球菌(2×109/mL)以及肺結核菌(2×109/mL)按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例，一般按等量比例，混合制備成致病細菌混合物，再將這種致病細菌混合物按1-10∶1-10比例(一般按1∶1比例)加入等量的福氏佐劑，用高速勻漿器以8,000-30,000rpm處理，成為油包水乳液，即制得繼發(fā)感染致病菌復合抗原。
7、制備抗禽流感免疫蛋將采用上述四種方法制備的四種抗原，即禽流感病毒裂解成分復合抗原、禽流感病毒多肽HA2抗原、禽流感疫苗抗原、以及流感病毒受體抗原，分別對產蛋母雞進行免疫，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產免疫蛋，并進行編碼標記。
8、制備抗繼發(fā)感染細菌免疫蛋將采用上述方法制備的流感繼發(fā)感染細菌復合抗原，對產蛋母雞進行免疫，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取免疫后的母雞所產免疫蛋。對所檢取的免疫蛋進行編碼標記。
以上免疫方法和注射頻率可根據母雞免疫應答情況適當調整和變化，也可應用上述同樣的免疫技術，采用上述不同抗原，分別對產蛋母鴨或產蛋母鵝或產蛋火雞或產蛋鴕鳥等不同蛋禽類進行免疫，得到相應的各種不同的免疫蛋。
9、抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物的制備首先根據被免疫的禽類不同以及免疫所用抗原不同，將免疫蛋分類并標記編碼。用流動水洗凈免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋機打碎免疫蛋，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用1.0N HCI溶液調pH至5.5-6.0。
將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12-24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥。
通過上述步驟，可制得三種抗禽流感特異性IgY粗提物，分別是抗禽流感病毒特異性IgY粗提物、抗禽流感病毒多肽HA2特異性IgY粗提物、抗禽流感病毒受體特異性IgY粗提物；另外，還可制得一種抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物。最后，對所制備的對應不同抗原的特異性IgY粗提物進行編碼標記。
10、抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY的純化分別將以上五種粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后分別過離子交換柱和凝膠層析柱層析，即分別制得三種抗禽流感特異性IgY純品和一種抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY純品。
11、采用美國Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細菌和病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細菌。其中，第一道細菌濾除裝置是用0.22μm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1μm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內的多種病毒。
最后可制得三種抗禽流感特異性IgY，分別是抗禽流感病毒特異性IgY、抗禽流感病毒多肽HA2特異性IgY、抗禽流感病毒受體特異性IgY；還可制得一種抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY。
利用上述抗禽流感特異性IgY、抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY，可以再加入其它化學藥品成份或中藥成份，制成各種復方藥品。
將上述各種不同的抗禽流感特異性IgY、或者抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY、或者這些IgY與化學藥品、中藥等配成的復方成份，配以蒸餾水調配成濃度0.01-20.0％的溶劑；可制成各種新型霧化劑、口噴劑、鼻噴劑、滴鼻劑、滴眼劑、噴喉劑、注射劑等劑型。由于IgY能抵抗胃蛋白酶以及腸道胰蛋白和胰凝乳蛋白酶的破壞；因此，可制成口含片、口服液或膠囊等用于口服，同樣能達到預防和治療的效果。
也可將三種不同的抗禽流感特異性IgY其中一種和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY按1-10∶1-10的比例混合均勻，制成一種抗禽流感特異性復合IgY，配以蒸餾水調配成濃度0.01-20.0％的復合溶劑，制成一種新型霧化劑。
將0.01-20.0％的抗禽流感特異性IgY，或者抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY混合而成的抗禽流感特異性復合IgY，以及這一系列IgY加上化學藥、中藥組成的復方成份，配以99.99-80.0％的輔料，可制成各種臨床可接受的劑型，如霧化劑、鼻噴劑、滴鼻劑、滴眼劑、噴喉劑、口噴劑、口含片、口服液、膠囊以及注射劑等劑型，用于預防和治療禽流感以及繼發(fā)感染。
其中的抗流感病毒受體特異性IgY除了對各種型的禽流感病毒有特異性抑制作用外，經檢測其對人流感病毒也具很高的抗體結合效價；這是因為禽流感病毒和人流感病毒兩者的特異性受體是一樣的。因此，可采用這種IgY或者再與抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY混合制成抗人流感特異性復合IgY，或者再加上化學藥、中藥組成復方成份；將其配以99.99-80.0％的輔料，制成各種臨床可接受的劑型，如霧化劑、鼻噴劑、滴鼻劑、滴眼劑、噴喉劑、口噴劑、口含片以及注射劑等劑型，用于預防和治療人流感以及繼發(fā)感染。
本發(fā)明利用抗禽流感病毒免疫球蛋白(IgY)保護局部粘膜(鼻腔、上呼吸道)細胞不受禽流感病毒的侵襲，這是阻斷其感染的關鍵，對禽流感病毒的吸附直接起到封閉作用，是抗禽流感特異性IgY具有預防作用的機理之一?？骨萘鞲刑禺愋訧gY還可對禽流感病人被侵襲局部新釋放的病毒進行中和，使其喪失再行擴散傳播的能力，因而達到既可治療又可防止禽流感傳播的雙重目的。這是其創(chuàng)新獨到之處。
由于HA2是介導流感病毒膜與細胞內小體膜融合的蛋白成份，本發(fā)明制成一種抗禽流感病毒多肽HA2的IgY，這種抗HA2的抗體可以阻止禽流感病毒包膜與細胞內小體膜融合，乃至影響禽流感病毒與細胞膜融合，致使病毒核殼體不能進入細胞內，從而，對禽流感病毒產生有效的防止作用。這樣，即使這種禽流感病毒的可變區(qū)(重鏈-HA1)發(fā)生了變異，如前所述，其保守區(qū)(輕鏈-HA2)是不變的，采用本發(fā)明的方法制備的抗禽流感病毒各個多肽抗原(包括保守區(qū))的特異性IgY或者抗HA2表達蛋白的特異性IgY仍然會對其產生有效的阻遏作用。
另外，本發(fā)明所制得的抗禽流感病毒受體特異性IgY可以和人體內細胞膜表面固有的特異性流感病毒受體結合，這樣，即使禽流感病毒入侵人體；但是，沒有了受體，這些病毒就無法復制，勢必死亡。由于不同亞型的禽流感病毒和人流感病毒其特異性受體是一樣的；因此，這種特殊的抗流感病毒受體的IgY對各種不同亞型的或者變異了的禽流感病毒以及人流感病毒之抑制效果都是一樣的，這也就以另一種巧妙的新方法解決了禽流感病毒以及人流感病毒型別很多又容易變異而難于對付的難題。
本發(fā)明的這一系列抗禽流感特異性IgY的這些特點，正好克服了禽流感疫苗對變異的禽流感病毒無效以及目前廣泛使用的抗病毒藥物對禽流感病毒實際殺滅作用不大、而對人體毒副作用又很大之不足。特別是，這種IgY具有不會誘發(fā)病毒產生突變的優(yōu)點，也不會使禽流感病毒產生耐藥性；因此，可以克服現有的特敏福樂感清已出現耐藥性的致命缺點。
本發(fā)明設計了四種不同的方法制作抗原，可根據不同情況選擇其中一種，免疫產蛋禽類(雞、鴨、鵝、鴕鳥等)，使其出現更強的免疫應答，產生種類更多、結合力更強而量又大的復合抗體。所制得的多種抗各種亞型禽流感病毒的特異性IgY，對各種常見的禽流感病毒，特別是變異了的禽流感病毒之預防作用明顯超過一般禽流感疫苗。這是因為不同亞型的禽流感病毒，均有相同的HA2保守區(qū)，而本發(fā)明的抗HA2特異性IgY可專一抗HA2保守區(qū)；另外，無論哪種型的禽流感病毒都必須依靠特異性受體才能和靶細胞結合，而本發(fā)明的特殊的抗流感病毒IgY會有效抑制這種特異性受體；因此，這兩種與眾不同的特殊IgY對不同的亞型以及變異的禽流感病毒都會有抑滅作用。同時，人體受禽流感病毒感染后，致病菌會乘虛而入，勢必引起繼發(fā)感染；本發(fā)明制備的抗多種致病菌特異性復合IgY對引致繼發(fā)感染的常見致病菌也有很好的免疫調理作用，特別是能有效殺滅普通殺菌藥無能為力的耐藥菌MRSA和肺結核菌，這是禽流感疫苗和一般抗病毒藥物所做不到的。因此，這種特異性的復合IgY不僅可以從根本上預防和治療不同國家出現的多種亞型的禽流病感病毒引致的禽流感；而且，即使當某一種禽流感病毒再又發(fā)生變異了，由這種變異的禽流感病毒所引起的新禽流感，本發(fā)明所制得的抗禽流感特異性IgY也能有效對付它。成為一種比一般禽流感疫苗更方便、更安全又有效得多的大面積預防禽流感的有力武器。
實驗例實驗例1用病毒裂解法制備的抗禽流感病毒特異性IgY以學術合作研究形式由新加坡國立大學微生物實驗室提供H5N1、H5N2、H7N7、H9N2禽流感病毒株，分別以常規(guī)雞胚尿囊法培養(yǎng)，然后純化分別得到H5N1病毒蛋白20mg、H5N2型病毒蛋白10mg、H7N7病毒蛋白10mg、H9N2病毒蛋白10mg。
1、分別取上述提純的四種禽流感病毒分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，即分別得到上述各種流感病毒裂解液。經SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢驗分析，濃縮膠4％，分離膠7％，240V，電泳30分鐘?？棘斒狭了{染色，觀察蛋白帶。檢測確定含有血凝素重鏈(HA1)、血凝素輕鏈(HA2)、神經氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、P蛋白(P1、P2、P3)、基質蛋白(M1、M2)和非結構蛋白(NS、NS2)。與EnamiM等主持實驗結果一致。由此可制得以上四種病毒的裂解液。
2、將以上四種病毒裂解液按1∶0.5∶0.5∶0.5的比例混合均勻，再按1∶1的比例加入福氏佐劑高速勻化制成禽流感病毒裂解成份復合抗原；最后，用這種復合抗原免疫產蛋母雞，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產免疫蛋，并進行編碼標記。并按以下方法提取2.1、首先用流動水洗凈免疫蛋，酒精擦洗消毒，打蛋機打碎免疫蛋，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用1.0N HCI溶液調pH至5.5-6.0。
2.2、將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-60C，靜置12-24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，40C靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥。即制備得到抗禽流感病毒特異性IgY粗提物干粉。
3、將粗提物干粉溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后分別過離子交換柱和凝膠層析柱層析。即制得抗禽流感病毒特異性IgY純品。
4、為了確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細菌；無論所制備的IgY粗制品或者IgY純品，都必須經以下過濾除菌、除病毒工序才能出廠4.1、采用美國Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細菌和病毒，4.2、第一道細菌濾除裝置是用0.22μm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1μm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內的多種病毒。
實驗例2用基因工程重組HA2表達蛋白制備得到抗HA2特異性雞IgY的活性檢測1、用RT-PCR方法從甲型禽流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接。轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株。挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。
2、待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達量。選表達量最高的時間收獲。離心去除細胞沉淀。上清中即含大量表達產物。經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即獲得純化的禽流感病毒HA2抗原。
3、將所制得的純化的禽流感病毒HA2表達蛋白(200微克/mL)以1-10∶1-10的比例(一般按1∶1比例)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，采用8,000--30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含禽流感病毒HA2表達蛋白的抗原。
4、將所制得的禽流感病毒HA2表達蛋白1.0mg按1∶1比例加入福氏佐劑，并置入高速勻漿器高速勻化，制備含HA2表達蛋白的抗原。
5、然后以這種禽流感病毒HA2表達蛋白的抗原采用試驗例1同樣的方法免疫產蛋母雞并用同樣方法制備得到抗禽流感病毒多肽HA2特異性IgY。
實驗例3用「禽流感疫苗復合抗原」制備得到抗禽流感病毒特異性鴨IgY1、向香港衛(wèi)生署購買禽流感疫苗50支，將這些禽流感疫苗混和后采用前述病毒裂解法制得裂解液，然后將這種裂解液按1∶1比例加入福氏佐劑，并置入高速勻漿器高速勻化，制備含H5N1、H5N2和H7N7、H9N2四種流感病毒抗原成份的疫苗式復合抗原。
2、采用前面所述的方法用這種「禽流感疫苗復合抗原」免疫產蛋母鴨，制備得到抗禽流感病毒特異性鴨IgY。再分別以H5N1、H5N2和H7N7、H9N2禽流感病毒作為檢測抗原，用ELISA法檢測這種抗禽流感病毒特異性鴨IgY對這四種不同抗原的抗體結合效價。
結果如下面所示


實驗例4用基因工程重組流感病毒受體表達蛋白矩抗原制備抗禽流感病毒受休特異性IgY1、可向美國病毒中心(ATCC)購買現成的流感病毒受體—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」，按1∶1比例混合，混合制成200微克/mL濃度溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，采用8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。
2、采用基因工程重組流感病毒受體表達蛋白，具體操作方法如下。
2.1、用RT-PCR方法分別從流感病毒受體—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接。轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株。挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中受體蛋白的表達量。選表達量最高的時間收獲。離心去除細胞沉淀。上清中即含大量表達產物。經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即分別獲得純化的流感病毒受體—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」抗原成分。
2.2、將制得的純化的兩種流感病毒受體—「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」表達蛋白先按1∶1比例混合制成200微克/mL濃度溶液，然后以1-10∶1-10比例，一般以1∶1比例，加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，采用8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。
2.3、然后以這種流感病毒受體表達蛋白的抗原采用試驗例1同樣的方法免疫產蛋母雞并用同樣方法制備得到抗流感病毒受體特異性IgY。
實驗例5抗流感繼發(fā)感染特異性雞IgY1、由新加坡國立大學微生物試驗室提供用常規(guī)方法培養(yǎng)好的A簇B型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，MRSA金黃色葡萄球菌、肺結核菌。將以上五種致病菌按1∶1∶1∶0.5∶0.5的比例混合，制成10mL菌液再加入10mL福氏佐劑然后置入高速勻漿器高速勻化，制得繼發(fā)感染細菌復合抗原20mL。
2、采用本文前敘同樣方法以這種含全菌的復合抗原免疫母雞，并用同樣方法制備抗流感繼發(fā)感染特異性IgY。然后將其與上述實驗例1制備的抗禽流感病毒特異性IgY按1∶1的比例混合均勻，制得抗禽流感和繼發(fā)感染特異性復合IgY。
3、最后，分別以H5N1、H5N2和H7N7、H9N2禽流感病毒以及A簇B型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、MRSA金黃色葡萄球菌、肺結核菌作為檢測抗原，用ELISA法檢測這種復合IgY對這些抗原的抗體效價。
結果如下

從以上檢測結果顯示，按本文所述的方法所制備的抗禽流感和繼發(fā)感染特異性復合IgY，對四種個亞型禽流感病毒，以及常見的幾種繼發(fā)感染致病菌都有較高的抗體結合效價。
實驗例6抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY的含量檢測應用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測定法，分別對按以上工藝所制取的不同的抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物進行檢測，結果含IgY 45-52％。IgY粗提物經二次過柱后，得到純IgY。經SDS-PAGE分析，純度達到PAGE純，如下表所示

實驗例7各種不同抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性復合IgY的活性檢測1、采用本發(fā)明人發(fā)明的特殊免疫啟動方法和改進的工藝技術所制得的抗禽流感特異性IgY和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY，采用「ELISA法」(酶聯免疫吸附試驗)進行活性檢測。
2、檢測結果顯示，所制得的各種不同抗禽流感特異性IgY，其中以裂解病毒抗原免疫所制的I型「抗禽流感病毒特異性IgY」對前述4種有代表性的H5N1、H5N2和H7N7以及H9N2禽流感病毒的抗體結合效價都達到了1∶2048以上。而以HA2表達蛋白抗原免疫所制得的II型「抗HA2特異性IgY」對H5N1、H5N2、H7N和H9N2禽流感病毒的抗體結合效價也達到1∶1,024以上；而以禽流感疫苗抗原免疫所制得的III型「抗禽流感病毒特異性IgY」對H5N1、H5N2、H7N和H9N2等四種禽流感病毒的抗體結合效價也達到1∶1024以上；而以流感病毒受體抗原免疫所制得的IV型抗流感病毒受體特異性IgY對H5N1、H5N2、H7N和H9N2等四種禽流感病毒的抗體結合效價也達到1∶1024以上。另外，如前所述，鑒于禽流感病毒和人流感病毒兩者的特異性受體是一樣的；因此，以流感病毒受體抗原免疫所制得的抗流感病毒受體特異性IgY對人流感病毒的抗體結合效價也很高，試驗結果同樣達到1∶1024。其次，抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY對有代表性的肺炎雙球菌、A簇B型溶血型鏈球菌、MRSA金黃色葡萄球菌、肺結核菌、流感嗜血桿菌的抗體效價則稍低一些，但都在1∶512以上。詳見下表所示四種抗禽流感特異件IgY效價檢測結果


抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY效價檢測結果

(注檢測用樣本濃度為1mg/mL)實施例實施例1用病毒裂解法制備抗流感病毒特異性雞IgY1、首先選定以下4種禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7株、H9N2株。
2、將以上H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒株分別采用下文所述常規(guī)雞胚尿囊法，分別在雞胚尿囊中培養(yǎng)；收取含有病毒的尿囊液，然后以下文所述雞紅細胞法粗提；再用下文所述蔗糖密度梯度超速離心法純化病毒，分別得到提純的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒懸浮液。
3、雞胚尿囊法按以下方法操作用70％酒精消毒雞胚卵氣室上部的卵殼，并在其上打1.0cm長的洞；加一滴無菌液體石蠟在胚體上方的殼膜上；用1mL的結核菌素注射器，將0.1-0.2mL的病毒標本注入尿囊腔，繼而用無菌膠布封住開口；置33-35℃孵箱培養(yǎng)2-4天；置于4℃6-18h；用75％酒精消毒氣室部卵殼，擴大蛋殼上的開口，用裝上純型的18號針頭的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50mL的離心管中。
4、雞紅細胞粗提方法按以下方法操作首先將上述收取的尿囊液于4,000rpm離心30分鐘以去除雜物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的紅細胞到最終度為2.5-3.5％，混合均勻，置于4℃約10小時；2,000rpm離心10分鐘，去上清；0℃生理鹽水洗紅細胞2次(在冰浴中進行)，每次半分鐘；2,000rpm在4℃離心5分鐘，去上清；在沉淀的紅細胞中加入原尿囊液體積五分之一的pH7.6、0.01M磷酸鹽緩沖鹽水，攪勻，置于37℃水浴3小時，2,000rpm離心10分鐘，得上液，即為粗提的流感病毒懸浮液。
5、用蔗糖密度梯度超速離心法純化流感病毒，具體方法如下取上述粗提的流感病毒懸浮液1.0mL，輕輕加到40％和60％不連續(xù)密度梯度的蔗糖液上面，經100,000g離心2小時，取蔗糖層中間區(qū)帶液，加入pH7.2、0.01M磷酸鹽緩沖鹽水1.0mL，混勻，透析除糖，即得純流感病毒懸浮液。
6、分別取提純的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒液各1.0mL(濃度4.0萬HAU，相當于病毒蛋白200微克)，分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，于37℃裂解30分鐘，即分別得到上述4種流感病毒裂解液。
7、將這4種流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均勻，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐劑，置入高速勻漿器中，以8,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制成含多種流感病毒裂解成份的病毒復合抗原，計150mL。
8、以這種復合抗原免疫健康的產蛋母雞50只，每只肌內注射1mL，每隔二周注射一次，共計三次。
9、第一次注射后第20天開始檢取免疫蛋，至第7個月將所檢得的7，500只免疫蛋用流動水沖凈，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋殼，以蛋黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水攪勻，用1.0N HCI調pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜10小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥；即制得抗禽流感病毒特異性IgY粗提物750克。
10、將以上IgY粗提物先后過離子交換樹脂柱和凝膠層析柱層析，即制得抗禽流感病毒特異性IgY純品150克。
實施例2用病毒裂解法制備抗流感病毒特異性鵝IgY1、首先選定以下4種流行性感冒病毒H5N1株、H5N2株、H7N7株、H9N2株。
2、將H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒株分別采用常規(guī)雞胚尿囊法，分別在雞胚尿囊中培養(yǎng)；收取含有病毒的尿囊液，然后以雞紅細胞法粗提；再用凝膠柱層析法純化病毒，分別得到提純的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒懸浮液，具體操作如下。
3、分別用雞胚尿囊法培養(yǎng)以上4種流感病毒，步驟如下詳述70％酒精消毒雞胚卵氣室上部的卵殼，并在其上打1.0cm長的洞；加一滴無菌液體石蠟在胚體上方的殼膜上；用1mL的結核菌素注射器，將0.1-0.2mL的病毒標本注入尿囊腔，繼而用無菌膠布封住開口；置33-35℃孵箱培養(yǎng)2-4天；置于4℃6-18h；用75％酒精消毒氣室部卵殼，擴大蛋殼上的開口，用裝上純型的18號針頭的注射器抽取含有病毒的尿囊液置50mL的離心管中。
4、分別用雞紅細胞粗提以上4種流感病毒，步驟如下首先將收取的尿囊液于4,000rpm離心30分鐘以去除雜物碎片，去沉淀；每升尿囊液加入甲醛化的紅細胞到最終度為2.5-3.5％，混合均勻，置于4℃約10小時；2,000rpm離心10分鐘，去上清；0℃生理鹽水洗紅細胞2次(在冰浴中進行)，每次半分鐘；2,000rpm在4℃離心5分鐘，去上清；在沉淀的紅細胞中加入原尿囊液體積五分之一的pH7.6、0.01M磷酸鹽緩沖鹽水，攪勻，置于37℃水浴3小時，2,000rpm離心10分鐘，得上液，即為粗提的流感病毒懸浮液。
5、別用柱層析法純化以上4種流感病毒，步驟如下取上述混懸液3-5mL加樣于SepHAdex G200凝膠層析柱(3×50cm)；用0.05M、pH7.4、PBS液洗脫；流速15-20mL/小時；每管收集5.0mL；于280nm測定洗脫曲線，并用血凝滴度測定流感病毒洗脫峰；收集病毒洗脫液，即為提純的流感病毒液。
6、分別取提純的H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種流感病毒液各10mL(濃度4.0萬HAU，相當于病毒蛋白2,000微克)，分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，于37℃裂解30分鐘，即分別得到上述4種流感病毒裂解液。
7、將這4種流感病毒裂解液按1.0∶0.5∶0.5∶1.0的比例混合均勻，制成混合裂解液，再按1∶1的比例在混合裂解液中加入福氏佐劑，置入高速勻漿器中，以8,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制成含多種流感病毒裂解成份的病毒復合抗原，計2,250mL。
8、選具高免疫應答能力的良種100只母鵝，采用上述含多種流感病毒裂解成份的病毒復合抗原，計1,500mL分別對母鵝進行免疫，每次注射5mL抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次，于第一次注射后第七個月，把這些鵝所產的蛋標記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯免疫吸附試驗)檢測所制得的IgY的效價，選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應答能力特別強的鵝，再用這批鵝所產的蛋孵出優(yōu)良鵝種，待其長大至2-3個月，選出其中50只作為優(yōu)選的高免疫應答能力的特種母鵝。
9、采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種母鵝進行免疫，每只母鵝每次注射量達5mL抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內共免疫三次；每一次免疫20天后，檢取母鵝所產免疫蛋至第7個月終止，共計檢得免疫鵝蛋7,500只。
10、將所制備的免疫蛋分別用流動水沖凈，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋殼以卵黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水攪勻用1.0N HCI液調pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜10小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，UltiporVFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即制得抗流感病毒特異性鵝IgY粗提物2,200克。
11、將以上IgY粗提物，先后過離子交換樹脂柱和凝膠層析柱層析，即制得抗流感病毒特異性鵝IgY純品400克。
實施例3用基因工程法制備抗禽流感病毒多肽HA2特異性鴕鳥IgY1、用RT-PCR方法從甲型流感病毒RNA克隆血凝素(HA2)基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接。轉化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株。挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達量。選表達量最高的時間收獲。離心去除細胞沉淀。上清中即含大量表達產物。經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸餾水透析24小時，以及SepHAcry1 S-200和SepHAcry1 S-100柱層析后，即獲得純化的流感病毒HA2抗原2,100mL。
2、選具高免疫應答能力的良種母鴕鳥50只，用上述純化的流感病毒HA2抗原1,500mL，對母鴕鳥分別免疫，每次注射10mL抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次，于第一次注射后第七個月，把這些鴕鳥所產的蛋標記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯免疫吸附試驗)檢測所制得的IgY的效價，選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應答能力特別強的鴕鳥，再用這批鴕鳥所產的蛋孵出優(yōu)良鴕鳥種，待其長大至2-3個月，選擇其中10只作為優(yōu)選的高免疫應答能力的特種產蛋鴕鳥。
3、采用以上述方法制作的HA2表達蛋白抗原300mL，應用皮下注射和翅靜脈注射相結合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種產蛋鴕鳥進行免疫，每只鴕鳥每次注射量達8-10mL抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取鴕鳥所產免疫蛋共100只。
4、將所檢取的100只免疫的鴕鳥蛋分別用流動水沖凈，75％乙醇消毒、晾干，破碎蛋殼以卵黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水攪勻用1.0N HCI液調節(jié)pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即制得抗HA2特異性鴕鳥IgY粗提物1,000克。
5、將以上IgY粗提物分別先后過離子交換樹脂柱和凝膠柱層析，即制得抗HA2特異性鴕鳥IgY純品200克。
實施例4用禽流感疫苗作抗原制備抗禽流感病毒特異性火雞IgY1、取禽流感疫苗50支(每支300μg/1.5mL)將其混和均勻，加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，于37℃裂解30分鐘，即得到流感病毒裂解液。
2、再將這種裂解液按1∶1的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器中，以8,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制成疫苗式復合抗原，計150mL。再以這種復合抗原免疫健康的產蛋火雞50只，每只肌內注射1mL，每隔二周注射一次，共計三次。
3、第一次注射后第20天開始檢取免疫蛋，至第50天，共檢取1,200只免疫蛋；將其用流動水沖凈，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋殼，以蛋黃篩濾去蛋清，留取蛋黃加5倍蒸餾水攪勻，用1.0N HCI調pH至5.5-6.0，攪拌均勻，2-6℃靜置過夜，于10,000rpm離心20分鐘，取上清進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCI2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃過夜；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥；即制得抗禽流感病毒特異性IgY粗提物120克。
4、將以上IgY粗提物先后過離子交換樹脂柱和凝膠層析柱層析，即制得一種以禽流感疫苗作抗原的抗禽流感病毒特異性IgY純品25克。
實施例5制備抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY1、制備繼發(fā)感染致病菌復合抗原將A簇B型溶血性鏈球菌(2×109/mL)、肺炎鏈球菌(2×109/mL)、流感嗜血桿菌(2×109/mL)和金黃色葡萄球菌(2×109/mL)等量比例混合制備成致病細菌混合物，再將致病細菌混合物按1∶1比例加入等量的福氏佐劑，用高速勻漿器以8,000rpm處理，即得油包水的混合菌體抗原即繼發(fā)感染致病細菌復合抗原。
2、制備抗繼發(fā)感染細菌免疫蛋應用所制備的流感繼發(fā)感染細菌復合抗原，免疫產蛋母雞5只；每只肌肉注射1mL。每隔二周再強化注射一次，計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取免疫后的母雞所產免疫蛋，至第7個月，共計檢取7,500只免疫蛋。
3、制備抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物將所檢取的免疫蛋用流動水洗凈，酒精擦洗消毒，再用打蛋機打碎免疫蛋，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用1.0N HCI溶液調pH至5.5-6.0。
將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12-24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即制得抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物，計700克。
4、抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY的純化；采用專利公開號為1307061的專利技術將所制得的抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后分別過離子交換柱和凝膠層析柱層析，即制得抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY純品150克。
實施例6用按實驗例1-4詳述的方法所制備的四種抗禽流感特異性IgY中的任意一種和抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY按2∶1比例混合成抗禽流感特異性復合IgY 200g(抗禽流感特異性IgY 133.33g、抗繼發(fā)特異性IgY 66.66g)，以此作為主要原料制成一種抗禽流感和繼發(fā)感染常壓噴霧劑。
抗禽流感特異性復合IgY200g甘油 4,000g
PEG4005,000g薄荷腦200g香精 80g乙醇 2,000mL蒸餾水加至200升抗禽流感特異性復合IgY溶于160升蒸餾水中，加入甘油混勻。薄荷腦、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混勻，在攪拌下加于上述溶液攪勻、過濾，補加蒸餾水至全量，用0.1mol、NaOH流液調pH至7.0。將藥液灌入常壓噴瓶中，每支20mL，全檢合格后包裝即得10,000支抗禽流感特異性復合IgY常壓噴霧劑。
實施例7用按實施例3詳述的方法所制備的抗禽流感病毒多肽HA2蛋白特異性駝鳥IgY 100g，作為主要原料制成一種應用基因工程的抗禽流感常壓噴霧劑。
抗流感特異性IgY 100g甘油 2,000gPEG400 2,500g薄荷腦 100g香精 30g乙醇 1,000mL蒸餾水 加至100升將抗HA2蛋白特異性駝鳥IgY溶于80升蒸餾水中，加入甘油混勻。薄荷腦、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混勻，在攪拌下加于上述溶液攪勻、過濾，補加蒸餾水至全量，用0.1mol、NaOH溶液調pH至7.0，灌裝。將藥液灌入常壓噴瓶中，每支20mL，全檢合格后包裝即得10,000支抗流感IgY常壓噴霧劑。
實施例8用按實施例1詳述的方法制備抗禽流感病毒特異性IgY 1.0克，用按實施例5詳述的方法制備抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY 1.0克，按1∶1比例混合成抗流感特異性復合IgY 2.0克，以這種復合IgY為主要原料，制成一種口含片。
抗流感特異性復合IgY 2.0g羧甲基纖維素 5.0g硬脂酸鎂 0.6g
阿斯巴甜 1.2g薄荷香精 0.8g香橙香精 1.0g乙醇(30％濃度)1,000mL山梨糖醇 加至溶解羧甲基纖維素成1％乙醇溶液共制成1,000片制備工藝如下1、山梨糖醇與阿斯巴甜充分混合均勻，過60目篩兩次備用；2、羧甲基纖維素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液。
3、將1項用適量2項制軟材，14目篩網制粒，60℃通風干燥，18目篩整粒。用40目篩篩出適量細粉與IgY充分混勻并噴入薄荷、香橙香精攪勻，再拌入硬脂酸鎂，一起與整批顆粒混合均勻，密閉4小時以上供壓片每片0.6g。檢驗合格后，供包裝，全驗出廠。
實施例9用按實施例1詳述的方法制備抗禽流感病毒特異性IgY 5.0g，并制成一種預防和治療流感的新型注射劑。
抗流感病毒特異性純IgY5gPluronic F6810g聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 10gPEG400 110g聚山梨醇酯-8010g注射用水 加至1,000mL1、注射用水，加入Pluronic和PVP，加熱溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混勻；在攪拌下加入上述混合液中；再加0.1％針用活性炭，60℃攪拌15min；脫炭過濾；濾液密閉加熱100℃30min，冷卻至室溫備用。
2、取經活性炭處理過的滅菌注射用水，于滅菌容器中加入抗流感病毒特異性純IgY凍干粉溶解，繼續(xù)攪拌下，以細流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液調節(jié)pH至6.0～7.5，用脫炭滅菌注射用水補足全量。
3、已滅菌的0.45μm串聯0.22μm微孔濾膜除菌過濾。于無菌灌封機中灌封于無菌容器中。每支2mL含純抗流感病毒特異性純IgY凍干粉5mg。燈檢、檢漏、印字、包裝即得500支IgY注射劑。規(guī)格5mg/2mL。
實施例10抗禽流感IgY手撳定量壓力噴霧罐的制作按以下配方調配200升抗禽流感特異性IgY組合溶液
抗禽流感特異性IgY 300g阿斯巴甜 240g香橙香精 600g水蜜桃香精200g薄荷香精 1,400g蒸餾水加至200升1、先取蒸餾水180升，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復合IgY；接著加蒸餾水至200升，充分攪拌均勻，測量溶液pH值，根據所測的pH值用1mol NaOH溶液調節(jié)pH至6.5-7.5；2、溶液調配好后，必須在壓力罐生產在線灌裝手動定量壓力噴霧罐20000支，每支噴霧罐灌足10ml后，必須再充入壓力氮氣或者氟里昂作為助推劑(拋射劑)，裝上定量閥門，密封，即得。
實施例11制備抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY常壓噴霧劑采用抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY 50g，作為主要原料制成一種抗繼發(fā)感染常壓噴霧劑。
抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY50g甘油 1,000gPEG400 1,250g薄荷腦 50g香精 15g乙醇 5000mL蒸餾水 加至50升將抗繼發(fā)感染細菌的特異性IgY溶于蒸餾水中，加入甘油混勻。薄荷腦、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混勻，在攪拌下加于上述溶液攪勻、過濾，補加蒸餾水至全量，用0.1mol、NaOH流液調pH至6.5。將藥液灌入常壓噴瓶中，每支20ml，全檢合格后包裝即得2,500支抗繼發(fā)感染IgY常壓噴霧劑。檢、檢漏、印字、包裝即得500支IgY注射劑。規(guī)格5mg/2ml。
權利要求
1.一種制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，包括以下步驟(S1)制備禽流感抗原；(S2)利用所述禽流感抗原，對產蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產的抗禽流感免疫蛋；(S3)取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黃，制備抗禽流感特異性IgY粗提物；(S4)對所述抗禽流感特異性IgY粗提物進行純化，制得抗禽流感特異性IgY純品；(S5)對所述抗禽流感特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗禽流感特異性IgY成品。
2.根據權利要求1所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，所述抗禽流感特異性IgY為抗禽流感病毒特異性IgY，在所述步驟(S1)中，按以下步驟制備制備禽流感病毒抗原選定有代表性、最常出現的禽流感病毒株，包括A型禽流感病毒H5N1株、H5N2株、H7N7及H9N2株；將所述HSN1、H5N2、H7N7和H9N2病毒株采用常規(guī)雞胚尿囊法，分別在雞胚尿囊中培養(yǎng)，收取含有病毒的尿囊液，以雞紅細胞法粗提，再用蔗糖密度梯度超速離心法或凝膠柱層析法純化，得到純化的四種禽流感病毒；分別取所述純化的四種禽流感病毒，分別加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，分別制得H5N1、H5N2、H7N7和H9N2四種禽流感病毒裂解液；取所述四種禽流感病毒裂解液中的至少一種，再按1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿器中以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水液體，即制得含多種禽流感病毒裂解成份的病毒復合抗原。
3.根據權利要求1所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，所述抗禽流感特異性IgY為抗禽流感病毒特異性IgY，在所述步驟(S1)中，按以下步驟制備制備禽流感疫苗抗原取現在的禽流感疫苗，加入20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2.0％，裂解30分鐘，制得禽流感病毒裂解液；按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得疫苗式的禽流感復合抗原。
4.根據權利要求1所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，所述抗禽流感特異性IgY為抗禽流感病毒多肽HA2特異性IgY，在所述步驟(S1)中，按以下步驟制備制備禽流感病毒多肽HA2抗原用RT-PCR方法從甲型禽流感RNA克隆血凝素(HA2)基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段；先插入pGEM-T載體，測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接；轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株；挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜；稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)，待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達量，選表達量最高的時間收獲，離心去除細胞沉淀，上清中即含大量表達產物；經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcryl S-200和SepHAcryl S-100柱層析后，即獲得純化的禽流感HA2抗原；以1-10∶1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得含禽流感HA2表達蛋白的抗原。
5.根據權利要求1所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，所述抗禽流感特異性IgY為抗禽流感病毒受體特異性IgY，在所述步驟(S1)中，按以下步驟制備制備禽流感病毒受體抗原取流感病毒受體，將其中的「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」表達蛋白按1∶1比例混合，制成濃度200微克/mL溶液，然后以1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，再置入高速勻漿機中，以8,000-30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得病毒受體抗原。
6.根據權利要求5所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，所述流感病毒受體是通過以下步驟制得的用RT-PCR方法分別從流感病毒受體，即「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」RNA克隆多肽抗原基因去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段；先插入pGEM-T載體，測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達載體pPIC9K連接；轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，提質粒，酶切鑒定正確后，電轉化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115；在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉化株，挑取單個菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜；稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)，待細菌濃度達到OD600的吸光值約為0.8時，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；于培養(yǎng)的不同時間采樣，用ELISA法測定上清中受體蛋白的表達量，選表達量最高的時間收獲，離心去除細胞沉淀，上清中即含大量表達產物；經50％硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時，以及SepHAcryl S-200和SepHAcryl S-100柱層析后，即分別獲得純化的流感病毒受體---「糖蛋白」和「9-O-乙酰-N-乙酰神經氨酸」的抗原成分。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的制備抗禽流感特異性IgY的方法，其特征在于，在所述步驟(S3)中，按以下步驟制備制備抗禽流感特異性IgY粗提物；取所述抗禽流感免疫蛋的蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用1.0N HCI溶液調pH至5.5-6.0；進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12-24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘，取分離所得的上清置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；加入2.0％海藻酸鈉液，至終濃度為0.1％，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，至終濃度為0.1％，攪拌均勻，4℃靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清，再經0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去病毒，再冷凍干燥，即制得抗禽流感病毒特異性IgY粗提物；在所述步驟(S4)中，按以下步驟對所述抗禽流感特異性IgY粗提物進行純化取所述抗禽流感特異性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸鹽緩沖液)液中，再先后分別過離子交換柱和凝膠層析柱層析，可制得抗禽流感特異性IgY純品；在所述步驟(S5)中，按以下步驟對所述抗禽流感特異性IgY純品進行過濾處理用0.22μm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細菌；用0.1μm膜除支原體過濾器除去支原體；用Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去包括禽流感、腸病毒在內的多種病毒。
8.一種制備抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY的方法，其特征在于，包括以下步驟(S21)按以下步驟制備繼發(fā)感染致病菌抗原將A簇B型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、MRSA金黃色葡萄球菌、以及肺結核菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，制得致病細菌混合物，再將這種致病細菌混合物按1-10∶1-10比例加入福氏佐劑，用高速勻漿器以8,000-30,000rpm處理，成為油包水乳液，即制得繼發(fā)感染致病菌復合抗原；(S22)利用所述繼發(fā)感染致病菌抗原，對產蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產的抗繼發(fā)感染致病菌免疫蛋；(S23)取所述抗繼發(fā)感染致病菌免疫蛋的蛋黃，制備抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY粗提物；(S24)對所述抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY粗提物進行純化，制得抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY純品；(S25)對所述抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY成品。
9.一種制備抗禽流感特異性復合IgY的方法，其特征在于，取權利要求1-6中任一項所述方法制得的抗禽流感特異性IgY，并取權利要求8所述方法制得的抗繼發(fā)感染致病菌特異性IgY，按1-10∶1-10的比例混合均勻，即制成抗禽流感特異性復合IgY。
10.一種抗禽流感制劑，其特征在于，其中包括含量為0.01-20.0％的按權利要求1-6中任一項所述方法制得的抗禽流感特異性IgY，或者是含量為0.01-20.0％的按權利要求9所述方法制得的抗禽流感特異性復合IgY；以及含量為99.99-80.0％的輔料；所述制劑是霧化劑、鼻噴劑、滴鼻劑、滴眼劑、噴喉劑、口噴劑、口含片、口服液、膠囊、或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗禽流感特異性IgY的制備方法及其制劑，為解決現有抗禽流感產品耐藥性和不能預防等問題，本發(fā)明中，先以多種方法制備禽流感抗原，再用制得的禽流感抗原對產蛋禽類進行注射免疫，制得抗禽流感免疫蛋，然后取其蛋黃制得抗禽流感特異性IgY粗提物，再經純化、過濾處理后，即制得抗禽流感特異性IgY成品，具體可以是抗禽流感病毒特異性IgY、抗禽流感病毒多肽HA
文檔編號A61P31/16GK1958608SQ20051011684
公開日2007年5月9日 申請日期2005年10月31日 優(yōu)先權日2005年10月31日
發(fā)明者包晟, 楊榮鑒, 王長安, 蔡婷英, 包海威 申請人:雅臣藥業(yè)集團(遠東)有限公司